HAL Id: hal-01454147
https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-01454147
Submitted on 6 Jun 2020
HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers.
L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés.
Caractérisation microscopique et macroscopique de matrices fromagères modèles et étude de la diffusion des
FITC-Dextrans
Guillaume Lollia
To cite this version:
Guillaume Lollia. Caractérisation microscopique et macroscopique de matrices fromagères modèles et étude de la diffusion des FITC-Dextrans. 2011, pp.1-42. �hal-01454147�
1
Caractérisation microscopique et
macroscopique de matrices fromagères modèles et étude de la diffusion des
FITC-Dextrans.
Maitre de stage : Madame Juliane Floury Stagiaire : Monsieur Lollia Guillaume
Début de stage : 21/02/11 Fin de stage : 21/08/11
2
Résumé
L’affinage est une étape clé du processus de transformation du lait en fromage. Elle conditionne la texture et les aromes du fromage. Cette étape qui intervient juste après la coagulation du lait est le résultat de l’activité métabolique des colonies microbiennes immobilisées au sein des matrices fromagères. Les substrats doivent alors diffuser dans la matrice pour atteindre les colonies et les métabolites produits vont alors diffuser au sein de la matrice. Peu d’études ont été menées sur la diffusion de ces solutés dans des fromages. En revanche, de nombreuese études ont été menées sur la diffusion du sel et de l’eau. Ces études ont montré que la teneur en eau fait varier les propriétés de diffusion dans les matrices fromagères. De plus, aucune étude connue à ce jour n’a permis de lier les propriétés macroscopiques et et microscopiques du fromage aux propriétés diffusionnelles des solutés.
Pour cela, nous avons alors étudié deux types de matrices fromagères modèles gélifiées à partir de présure. Nous avons alors tenté de lier les propriétés mécaniques de la matrice (TPA, rhéologie) aux propriétés de diffusion de solutés modèles de différentes tailles, à savoir des FITC-dextrans de 4 à 150 kDa. Nous avons étudié deux matrices de compositions différentes : une matrice témoin composée de rétentat UF de lait écrémé , et une matrice rétentat UF contenant de la gélatine. Cette dernière matrice a été faite pour modifier macroscopiquement et microscopiquement la structure du réseau protéique.
Ces matrices fromagères ont été fabriquées de telle sorte que leur teneur en eau et leur activité d’eau soit les mêmes. Elles permettent aussi d’éviter la synérèse du gel forméLes coefficients de diffusion des FITC-dextrans ont été obtenus grâce à la technique de FRAP en microscopie confocale, qui présente l’avantage de caractériser la diffusion in situ dans la matrice. C’est la première fois qu’une telle technique est utilisée pour caractériser des propriétés de diffusion dans des matrices alimentaires.
Pour quantifier la diffusion, nous avons utilisé le modèle de Braga et al (2004) quipermet de prendre en compte la diffusion pendant la phase de photoblanchiment, ce qui est crucial pour des petits solutés diffusant rapidement.. Nous avons démontré que les coefficients de diffusion des FITC-dextran sont divisés par 3 dans la matrice contenant de la gélatinecomparé à la matrice sans gélatine. La viscoélasticité de ces matrices est aussi divisée par 3. La réponse mécanique (G’) sous des contraintes de cisaillement de la matrice avec gélatine est 3 fois plus forte que celle sans. D’après la littérature, ces effets peuvent se traduire par une migration en forme de sphères au sein des pores de la solution pour la matrice témoin et ellipsoïdale pour la matrice emprésurée avec gélatine.
3
ABSTRACT
Ripening is a key step in the process of turning milk into cheese. It determines the texture and flavor of the cheese. This step just after the coagulation is the result of activities of immobilized microbial colonies within the cheese matrix. The substrates then have to diffuse in the matrix to reach the colonies and the metabolites produced will then diffuse within the matrix. Few studies have been conducted on the diffusion of solute in food matrices. However studies have been conducted on the diffusion of salt and water. These studies have shown that when the water content makes vary the diffusion in cheese matrices. Moreover, no known study to date has linked the macroscopic properties of cheese during ripening and the microscopic properties and diffusional small solutes. For this, we then studied two types of cheese matrices models coagulated by rennet. We then try to link the mechanical properties of the matrix (TPA, rheology) by the diffusion properties of FITC-dextrans of 4-150 kDa. One witness matrix coagulated with retentate UF and the other one w with gelatin plus retentate UF by rennet. This matrix was made to change macroscopically and microscopically the witness matrix . These cheese matrices were created such that their water content and water activity are the same. They also prevent syneresis of the gel formed. Analyses of diffusion coefficients were made by the technique of FRAP using the model of Braga. This model allows to take into account diffusion during the photobleaching. In addition, the FRAP is then an optical technique and very little used advantageous for the study of small solute in cheese matrices. We have notices a decreasing of diffusion coefficient for the matrix gelled with gelatin over the matrix without gelatin. We have shown Viscoelasticity is also divided by 3. The mechanical response (G ') under shear stress of the matrix with gelatin is stronger than without. These effects result in a migration in the form of spheres through the solution to the witness matrix and ellipsoids for the matrix with gelatin and retentate UF .
4
Remerciements
Tout d’abord, je souhaite remercier Juliane Floury et Sylvie Lortal pour m’avoir accueilli au sein de l’UMR INRA-Agrocampus Ouest 1253 Science et Technologie duLait et de l’œuf dans l’équipe « Dynamiques Diffusionnelles et Réactionnelles » au sein des matrices laitières.
Je tiens également à remercier les Sophie Jeanson et Valérie Gagnaire pour leur conseils et leur encadrement tout au long du stage .
Merci à toutes les équipes qui ont permis les différentes analyses des composés obtenus sur du matériel de qualité. Je pense particulèrement à Marie Noelle Madec pour la microscopie confocale et Marie-Hélène Famelart pour la rhéologie.
Je n’oublie bien sur pas les autres membres de l’équipes qui, de part leur
enthousiasme et leur bonne humeur, m’ont permis de vivre un stage très
agréable
5
Abreviations
Aw : activité en eau (sans unité) (sans unité) D :Coefficient de Diffusion (µm2.s-1)
Deau : Coefficient de diffusion théorique de l’eau (µm2.s-1) Da : Dalton (g/mole)
DMatrice 1 : Coefficient de diffusion théorique de la matrice 1 (µm2.s-1) DMatrice 3 : Coefficient de diffusion théorique de la matrice 1 (µm2.s-1)
DExpéri Braga : Coefficient de diffusion déterminée dans l’expérience de Braga sur l’eau (µm2.s-1) CMP :Caséinomacropeptique
EST : Extrait Sec Total (g.kg-1) Kim :Efficacité du bleach
Wim : rayon du profile de la gaussienne suivant la direction du plan (µm) FITC : Fluoresceine isothiocyanate.
FRAP : Fluorescent recovery after photobleaching FCS : Fluctuation Confocale Spectroscopy RMN : Résonnance magnétique nucléaire UF : Ultrafiltration
ROI : Region of interest (Région d’interet) R2 : Coefficient de Correlation
wB : rayon de la région d’iintérê (µm) ws : rayon de la zone photoblanchie ((µm)
zim : rayon du profile de la gaussienne suivant la direction perpendiculaire au plan.
6
Introduction
... 8II. Bibliographie ... 12
A. Le lait et ses propriétés. ... 12
II.A.1. La matière grasse du lait (les lipides)... 12
II.A.2 La solution colloïdale (Matière azotée, éléments salins) ... 13
B. Transformation du lait en fromage ... 15
II.B.1. La coagulation ... 15
II.B.2. L’égouttage ... 17
II.B.3. L’affinage ... 17
C. La technique de Recouvrement de Fluorescence Après photoblanchiment (FRAP). ... 18
III. Matériels et méthodes. ... 22
A. Les solutés fluorescents FITC-Dextrans (Fluoresceine Isothiocyanate-Dextran) ... 22
III .A.1 Structure ... 22
III.A.2 Propriétés physiques ... 23
III.A.3 Propriétés de Fluorescence ... 23
B. Fabrication des matrices fromagères modèles ... 24
III.B.1 Préparation des gels cassettes ... 24
III.B.2 Composition chimique du rétentat ... 24
III.B.3 Protocole de coagulation et analyse des échantillons ... 24
C. Caractérisation des matrices modèles ... 27
III.C.1 Caractérisations physico-chimiques (pH, Aw, EST) ... 27
D. Caractérisation mécanique (TPA, Rhéologie) ... 27
III.D.1 Etude rhéologique ... 27
III.D.2 Analyse de la texture en double compression (TPA) ... 28
E. Caractérisation microscopique (Coloration du réseau protéique au Bleu de Nile 1% (NB H20) ) 29 F. Détermination des coefficients de diffusion par la technique de FRAP ... 29
III.F.1 Expérience de FRAP ... 29
III.F.2 Modélisation des coefficients de diffusion. ... 30
IV. RESULTATS ... 31
A. Caractéristiques physico-chimiques des matrices ... 31
IV.B Microstructure des matrices... 32
C Rhéologie ... 34
IV.D ) Validation du protocole de FRAP ... 37
7
E. Coefficients de diffusion des FITC-dextrans dans les différentes matrices. ... 38
V. Discussion... 39
A. Comparaison de la matrice 1 à l’eau ... 39
B. Effet de l’ajout de gélatine ... 39
Conclusion et perspective………42
Références : ... 43 Annexe
8
Introduction
L'affinage d’un fromage est un processus naturel au cours duquel des réactions microbiennes et enzymatiques se produisent dans le fromage, depuis la coagulation du lait jusqu’à la consommation du produit. L'affinage résulte en effet de l'activité métabolique des colonies microbiennes immobilisées dans la matrice lipoprotéique au moment de l’étape de coagulation. Cette activité métabolique conduit à la formation des arômes du fromage (Fox et al., 1995). Il s’agit donc d’une étape clé, spécifique à chaque variété de fromage, pour le développement de la saveur, de la texture et de l’aspect final du produit. La structure et la composition de la matrice fromagère varient tout au long du processus d’affinage, conduisant à l'élaboration des propriétés organoleptiques du produit fini.
Enfin, chaque variété de fromages possède ses propres conditions d'affinage afin de développer des caractéristiques distinctes.
Les bactéries présentes dans la matrice fromagère, qu'elles soient issues de la population indigène du lait ou bien ajoutées lors de la fabrication, sont les principales actrices de l'affinage du fromage. Quelle que soit la technologie fromagère, les bactéries sont immobilisées dans la matrice laitière et se développent sous forme de colonies au cours de l’étape de coagulation. Les réactions biochimiques et enzymatiques survenant au cours de l’affinage du fromage sont donc catalysées par l'activité métabolique de ces colonies immobilisées et de leurs enzymes. Certains substrats vont devoir diffuser dans la matrice pour atteindre les colonies bactériennes, et les métabolites produits vont ensuite diffuser des colonies bactériennes vers le réseau lipoprotéique. Des limitations de transfert de substrats et/ou de produits sont alors susceptibles d’entrainer des problèmes de limitation de la vitesse des réactions enzymatiques, de la croissance des bactéries immobilisées et/ou de leurs activités métaboliques.
La diffusion des petits solutés au sein d’une matrice fermentée (lactate, peptides, vitamines, bases azotées, molécules du quorum sensing,…) de même que celle des ions (Mg, Mn, Fe… dont certains sont des co-facteurs d’enzymes) est donc au coeur de la dynamique d’affinage. Cependant les propriétés de transfert de solutés dans les fromages n’ont pas fait l’objet de travaux publiés, mis à part les études concernant le sel et l’eau. La plupart des coefficients de diffusion effectifs ont été obtenus à l’aide de la méthode classique dite «des profils de concentration», méthode macroscopique présentant l’inconvénient d’être lourde et destructive. D’autres techniques, telles que la résonance magnétique nucléaire (RMN) ou la redistribution de fluorescence après photo-blanchiment (FRAP), sont utilisées dans le domaine médical pour mesurer des propriétés de transfert de solutés à une échelle microscopique. Cependant, elles sont encore peu (RMN) ou pas appliquées à des matrices complexes comme le fromage (Floury et al, 2010).
Le phénomène de diffusion de particules est le plus souvent décrit par la première loi de Fick : )
, ( . c r t D
j
où avec c(r,t) qui représente la concentration à la position r et à l’instant t, D le coefficient de diffusion de l’espèce chimique en m2.s-1 et
l’opérateur gradient. Il s’agit de la tendance naturelle d’un système à rendre homogène les concentrations des espèces chimiques en son sein et est un processus irréversible.
Dans le schéma ci-dessous est représenté un exemple de processus de diffusion dans un milieu B quelconque. A l’étape initiale, on introduit une espèce chimique A dans le milieu, qui va présenter un gradient de concentration c'est-à-dire une différence de concentration dans le milieu B. Au cours du temps, cette espèce chimique A va diffuser afin d’obtenir une répartition homogène de l’espèce chimique dans le milieu.
1
9 .Dans les liquides newtoniens, le coefficient de diffusion des particules D (m².s-1) est déterminé par la loi de Stocke-Einstein D=kBT/6πηr avec η la viscosité de la solution (Pa.s), T la température (K), r le rayon de la particule qui diffuse (m) et kB la constante de Boltzmann (1.38 10-23 J.K-1). Cette loi décrit la relation entre les forces induites par des mouvements erratiques du à des fluctuations thermiques et les forces de frottements que subissent les particules. Cette équation suppose que les particules soient sphériques.
D’autres lois régissent la diffusion dans les biomatériaux (Phillies and al, 1989) avec des coefficients de diffusion qui diminuent de manière exponentielle avec l’augmentation de la concentration. Dans le cas d’espèces diffusantes de formes linéaire(Zimm-Rouse and al, 1953). La diffusion suit alors une loi de puissance en fonction de la masse. Même si certains de ces modèles (Phillies and al, 1989 ) ne sont pas totalement validés et ne relient pas à des paramètres physiques, de nos jours la plupart des auteurs affirment que la diffusion agit comme un tamis et les mouvements se passent dans les ouvertures qui sont assez larges pour permettre la traverser. (Niklas lorèn and al, 2010).
Plusieurs techniques non destructives ont été mises au point pour déterminer les coefficients de diffusion.
- Les méthodes par RMN (Résonnance Magnétique Nucléaire) qui consistent à regarder comment diffusent les solutés lors de la relaxation des spins magnétiques après retrait des champs magnétiques appliqués. Le processus d’équilibre se joue entre les espèces magnétiques et les espèces non magnétiques, mais les méthodes par RMN nécessitent des analyses de données complexes dans les systèmes alimentaires et des équipements très lourds. (Colsenet 2005)
Il existe aussi des méthodes optiques telles que :
- -La méthode FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy) souvent dite « méthode de la molécule unique » qui consiste à mesurer dans une zone de très faible concentration comment fluctue cette molécule par la fluorescence dans cette espace. Cette méthode s’effectue sur des microscopes confocaux à balayage laser. Elle nécessite des réglages de paramètres importants tels que la puissance du laser, la
Gradient(c(r,t) De
concentration.
Milieux hétérogènes correspondant à deux phases distinctes, les billes en rouge A et le solvant B dans la solution en bleu.
Milieu homogène après diffusion des billes rouges dans l’eau, il y a pratiquement plus de gradient de concentration
10 Figure (1) Image montrant la fluctuationde la fluorescence dans une zone d’illumination (en vert) du aux va et vient de la molécule fluorescente (petite boule aux contours jaunes) prise dans (Van dem Wildenburg and al 2010)
- la méthode de FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) qui consiste à regarder le retour de la fluorescence après avoir éteint une zone fluorescente. La diffusion s’effectue alors entre les espèces non fluorescentes et les espèces fluorescentes (Figure 2)
Figure (2) Principe de la technique de FRAP . Après avoir éteint la sonde fluoresente (en vert) , les fluorophores non éteints diffusent dans la zone éteinte. Le retour de l’intensité de la fluoresence dans la zone photoblanchie est alors mesuré au cours du temps par un laser (Van dem Wildenburg and al 2010)
Le principal objectif de ce stage est d’arriver à mieux cerner le phénomène de diffusion de solutés modèles de différentes tailles, en relation avec la composition et la microstructure de la matrice fromagère en utilisant la technique de FRAP (Fluorescence recovery After Photobleaching).
Cette méthode a pour avantage principal de permettre l’étude de la diffusion de solutés de taille variable, préalablement marqués par une sonde fluorescente, in situ et à l’échelle microscopique dans la matrice.
Cependant, la quantification des coefficients de diffusion à partir de la courbe de redistribution de la fluorescence nécessite des modèles adaptés au retour de fluorescence.
Afin de mieux contrôler, voire d’optimiser à terme le transport de matière dans les fromages au cours de l’affinage, nous chercherons donc à déterminer s’il existe un lien entre les caractéristiques macroscopiques (dureté, viscoélasticité) et la structure des matrices et les propriétés de transfert des solutés en fonction de leur taille. Des études préalables ont aussi montré que la teneur en eau influence la diffusion des solutés (Colsenet, 2005). Nous analyserons alors la diffusion sur deux gels modèles obtenus à partir de lait écrémé concentré et emprésuré, et dont la teneur en eau et l’activité d’eau sont maintenues constants, Nous effectuerons ces mesures de coefficients de diffusion par la technique de FRAP en microscopie confocale sur des solutés modèles
11 fluorescents de différentes tailles, à savoir des FITC-Dextrans de 4 à 150 kDa. Nous effectuerons aussi des observations microscopiques des gels ainsi que des mesures mécaniques (rhéologie et analyse de compression mécanique) pour caractériser leurs propriétés micro- et macrostructurales. Et pour finir nous discuterons alors des résultats.
12
II. Bibliographie
A. Le lait et ses propriétés.
Tout comme certaines solutions produisant des polymères et les solutions fabricant les céramiques, le lait est avant tout une solution colloïdale. C'est-à-dire une solution possédant des molécules en suspension non dissoutes dans la solution. Il en résulte alors que certaines propriétés physico-chimiques découleront essentiellement de l’interface liquide/molécule en suspension. Mais le lait est avant tout un milieu multiphasique, avec un milieu contenant principalement de la matière grasse en émulsion dans la phase aqueuse contenant les protéines, les sucres, les sels minéraux. Même si son caractère basique (pH compris entre 6.4 et 6.7 pour les laits de vache et de brebis) et son caractère rhéologique (viscoélasticité) du lait sont déduites pratiquement directement de la solution colloïdale, il n’en est pas moins que chaque phase joue un rôle pour assurer les qualités et la stabilité nutritionnelles nécessaires pour l’homme au quotidien
.II.A.1. La matière grasse du lait (les lipides)
La matière grasse du lait est le composant le plus variable en proportion et en quantité (35-45 g.kg-1) selon l’alimentation des vaches. Comme dit précédemment, c’est la phase d’émulsion du lait, c'est-à-dire qu’elle se présente sous forme d’une phase discontinue de fines gouttelettes dans du lait écrémé.
L’élément le plus représentatif en quantité dans cette phase est alors le « globule gras » en émulsion dans une phase constituée de lait écrémé Tableau 1. C’est une matière faite d’acides gras saturés ou insaturés formant une structure similaire à un globule. En effet dans un litre de lait, on peut trouver 1.5 à 1012 globules gras et leur taille varie de 0.1 à 20 µm comparées aux minéraux et à la phase colloïdale dont la taille varie de la centaine de nm à l’ordre de l’Angstrom. Cette taille du globule gras varie en fonction de nombreux facteurs : l’animal, la race, le stade de lactation, l’état sanitaire,… ; Toutefois dans le cas de notre étude, on ne s’attardera pas sur cette partie pour des raisons propres à nos matrices fromagères modèles qui ne possèdent pas de matière grasse.
Tableau 1. Répartition de la teneur en g/L des principaux constituants du lait de vache et brebis. (Mahaut et al, 2002)
Constituants Concentration (g/L)
Eau 870
Glucides (lactose) 46
Matière grasse 33-47
Protéines:
-caséines
32-35 26-28
13
Protéines solubles 6
Matière Saline 7
II.A.2 La solution colloïdale (Matière azotée, éléments salins)
La solution colloïdale est composée d’éléments allant de 600 à 10-9 m. On retrouve les matières azotées, les glucides et les protéines solubles et avec en plus grosse partie celle qui donne la couleur blanchâtre dans cette phase la caséine avec différentes conformations de celle-ci. Ce sont des molécules riches en acides aminés, elles possèdent un pouvoir de fixation du calcium du à leurs nombreuses charges négatives et possèdent une forte proportion en résidus apolaires et la caséine (κ) est la seule présentant des glucides. Il existe quatre formes de caséines, couramment appelées (αS1, αS2, β, κ). Le tableau 2 montre les différences entre ces protéines, qui s’expriment principalement par leurs résidus apolaires (résidus de cystéines et d’acides aminés), leurs groupements phosphoséryls, leur glucides et enfin leur sensibilité au calcium.
D’autre part, bien que les éléments salins soient en proportions mineures dans la solution colloïdale et soient importantes, la matière azotée telle que la caséine et ses micelles de caséines occupent une bonne partie de la solution colloïdale La micelle de caséine est une particule sphérique d’un diamètre de 30 à 300 nm, formée par l’association des différentes caséines et de composants salins dont les 2 principaux sont le phosphate (P) et le calcium (Ca). Selon Schmidt (1980), la micelle serait formée de sous unités non uniformes.
Ces sous unités seraient formées par la partie apolaire des caséines créant le cœur hydrophobe et les parties polaires hydrophiles donnant les résidus phosphosériques. Figure 3. D’autres modèles beaucoup plus récents existent mais placent toujours la caséine κ à la fin du réseau de réticulation. Le modèle de Schmidt a été choisi afin d’illustrer le processus de gélification partie II.B, transformation du lait en fromage
Figure 3. Représentation selon Schmidt de la micelle de caséine
De cette représentation selon Schmidt, on peut s’apercevoir que plusieurs facteurs contribuent à conférer aux micelles leur stabilité : les principaux sont leur charge électrique, leur degré d'hydratation et leur charge minérale.
La charge électrique des micelles du lait frais est fortement négative ; ce caractère résulte de la présence de
14 nombreux groupements COO-, correspondant aux aminoacides dicarboxyliques constituant en particulier la caséine K. Puisque les micelles peuvent être assimilées à de gros ions chargés négativement, leur dispersion dans le lactosérum résulte de la forte répulsion électrostatique qui s'exerce entre particules voisines.
Le degré d'hydratation des micelles est élevé : 1 g de protéines fixe environ 2,5 g d'eau. Ce caractère très hydrophile de la micelle correspond à la présence à sa périphérie d'une couche d'eau liée, étroitement fixée aux protéines, et d'une couche d'eau d'hydratation à structure moléculaire plus lâche, et moins orientée. Ces enveloppes d'eau contribuent à stabiliser fortement la micelle.
Et enfin, les sels minéraux, notamment Ca et P, se trouvent dans le lait sous des formes variées que l'on a coutume de classer en formes solubles et insolubles ou colloïdales. L'équilibre existant dans le lait frais correspondant à la répartition donnée dans le Tableau 2.
Tableau 3. Propriétés de la micelle de caséine. (Mahaut and al, 2002)
Paramètres Valeurs
Diamètres 13-160.10-9 m
Surface 8.10-14
Volume 2.1*10-18
Masse volumique (hydratée) 1063.2 kg .m-3
Hydratation 3.7 g H2O/g protéines
Masse moléculaire (hydraté) 1.3*109g/mol
Tableau 2. Equilibre salin dans le lait pour la stabilité de la micelle de caséine en g.100- 1g de caséines (Mahaut and al, 2002)
Caséines Composants salins
αS1 33 Calcium 2.9
αS2 11 Magnésium 0.2
Β 33 Phosphate inorganique 4.3
Κ 11 Citrate 0.5
Ǜ 4
Total caséines 92 Total composants salins 8.0
15
Masse moléculaire (déshydraté) 5*108 g/mol
Nombre de particules par ml de lait 1014_1016
Distance libre moyenne 0.24.10-6 m
B. Transformation du lait en fromage
Le lait, par ses grandes qualités nutritionnelles (vitamines, lactose) , a toujours été considéré comme un aliment à part entière, mais sa consommation a toujours été limitée en raison de sa grande instabilité (Michel Mahaut and al, 2002). L’homme s’aperçu rapidement que la déstabilisation du lait par maturation ou par ajout de sécrétion gastrique facilitait l’expulsion de l’eau et créait des conditions favorables à la conservation. Le fromage est né.
Au cours des siècles, les méthodes de fabrication du fromage ont évolué et de nombreux types de fromages se sont développés selon l’origine du lait et la technologie fromagère appliquée. Il existe des pâtes fraîches (ex : fromages blancs), des pâtes molles (ex : camenbert), des pâtes dures (ex : comté), des fromages à croute lavée ou non, etc…, Cependant, dans tous les cas, le processus global de transformation du lait en fromage reste le même, il comprend 3 phases bien distinctes qui sont la coagulation, l’égouttage, et l’affinage.
II.B.1. La coagulation
La coagulation correspond à un seuil de percolation des liaisons des micelles de caséines. Elle possède des propriétés intéressantes pour la physique des transitions de phases. En effet la coagulation est une transition sol- gel, à partir d’une certaine concentration des micelles ou des polymères on peut alors forcer cette solution en jouant sur des paramètres chimiques (concentration) ou physiques (T,P) en formant des liaisons entre ces polymères cas du schéma ci-dessous (physique des transitions de phases) lorsque toute les polymères ou les molécules sont liées entre-elles à partir d’une certaine valeurs de paramètres physique le système se trouve alors à l’état de gel et ce seuil est appelée seuil de percolation. « Les molécules du polymère et du solvant forment un réseau tridimensionnel qui est une structure continue et qui est en quelque sorte l’équivalent d’un agrégat » (Papon et al 2000). La Figure 4 montre globalement la gélification pour des molécules portant une fonction d’alcool et qui possède la probabilité p de se lier par une fonction acide.
16 Source : De Gennes (1976), p. 924.
Figure 4 : Image d’un processus de gélification (Pajot et al , 2001) Il existe trois principaux modes de coagulations du lait :
La coagulation acide
La coagulation acide s’effectue par l’action d’acide (l’acide gluconique) ou de ferment lactique qui a pour but de transformer le lactose en acide lactique. L’acide lactique et/ou gluconique va alors acidifier le lait et va entrainer une diminution des charges négatives des micelles et donc une diminution de la couche d’hydratation et des répulsions électrostatiques. Cette acidification provoque aussi une perte du calcium et du phosphate au sein des micelles de caséines entrainant une déstructuration des micelles de caséines avec réorganisation protéiques, pour former un réseau puis un gel à pH=4,6. Ce pH correspond aux points isoélectriques des micelles de caséines. Les micelles sont alors regroupées sous forme de réseau d’amas fini.
La coagulation par voie enzymatique (action par la présure)
Cette méthode de coagulation consiste à transformer le lait de l’état liquide à l’état de gel par action d’enzymes protéolytiques, le plus souvent d’origine animale. Le plus utilisé est généralement la présure (Mahaut et al, 2002)
Trois phases caractérisent cette coagulation.
La phase primaire ou enzymatique. Elle correspond à la libération de la caséinomacropeptique hydrophile (CMP, fragment 106-109), composé de 7 fractions qui se distinguent entre elles par leur taux de glycosylation et jouent un rôle dans la stabilité de la micelle. On le retrouve après hydrolyse dans le lactosérum
La phase d’agrégation des micelles déstabilisées. Elle commence lorsqu’à pH=6.6 80 à 90% de la caséine k est hydrolysée. Le CMP se détache de la caséine k et la micelle perd son caractère hydrophile ; il y a diminution de son degré d’hydratation et de son potentiel de surface. Des liaisons hydrophobes et électrostatique s’établissent alors entre les micelles modifiées et vont entrainer la formation du gel.
La phase tertiaire. Les micelles agrégées subissent de profondes réorganisation par la mise en place de liaisons phosphocalcique et peut être des ponts disulfures entre les paracaséines.
De ces deux coagulations résultent alors deux types de gels
Pour la coagulation acide on a alors un gel dont les micelles de caséine sont regroupées en amas. Le gel présente alors une perméabilité satisfaisante, mais une friabilité élevée avec une élasticité et plasticité pratiquement nulles dues au manque de structuration du réseau. (Michel Mahaut and al, 2002)
Alors que pour la coagulation par voie enzymatique par l’intermédiaire le plus souvent de présure, le gel dont les micelles de caséines sont regroupées en réseau, présente une cohésion, une élasticité et une porosité forte mais une perméabilité faible.
17 De ces deux types de modes on en déduit une coagulation mixte qui permet de palier aux défauts des 2 gels.
C’est la multitude de combinaisons conduisant à différents états d’équilibre spécifiques qui est à l’origine de la grande diversité de fromages. D’ailleurs ce type de coagulation est d’avantage utilisé dans l’industrie afin d’avoir un meilleur rendement fromager.
II.B.2. L’égouttage
L’égouttage consiste à enlever une solution ce qui signifie que le lactosérum (le lait sans les micelles de caséines) se retire petit à petit pour laisser place au (l’égouttage mixte) caillé qui sera donc le fromage. Malgré son apparente simplicité, l’égouttage est un phénomène complexe dont les mécanismes sont peu connus. Il est toutefois généralement admis que l’égouttage est un phénomène regroupant à la fois un mécanisme actif qui est la synérèse et un mécanisme passif résultant de la porosité et de la perméabilité du coagulum. La synérèse est due à une contraction beaucoup plus importante des micelles de caséines . De cette manière le lactosérum se retire aux profits de la contraction du réseau. Pour la coagulation acide l’égouttage s’écoulent alors lentement et spontanément du à la structure particulière en amas tandis que les laits gélifiées par voie enzymatique donne naissance à de petites cavités vide qui retiennent le lactosérum, l’aptitude à l’égouttage spontané de ces gels est faible. Selon le type d’égouttage et de coagulation on peut alors définir différentes classes de fromage :
Les cailles lactiques qui restent très humides (pâtes fraiche)
Les caillés mixtes à dominante lactique (pâte molle) ;
Les caillés mixtes à dominantes présure (pâte pressée non cuite) Les caillés présurent de type pâte dure et pâte pressée cuite.
II.B.3. L’affinage
Enfin l’affinage qui correspond à une phase de digestion enzymatique par les bactéries, elles modifient la texture (propriétés mécaniques et sensorielles) du fromage. Ce sont des colonies immobilisées dans la matrice fromagères quelque soit la matrice fromagères. Des substrats vont devoir diffuser afin d’atteindre les bactéries et les métabolites produits vont devoir diffuser donner naissance à la texture. C’est un écosystème complexe et un bioréacteur imparfait dont les mécanismes ne sont pas toujours connu. De ce fait certains substrats sont susceptibles de subir des limites diffusionelles qui peuvent par la suite influencer la texture des produits. Des récapitulatifs concernant les agents d’affinages, la durée des étapes de coagulation sont présentés. Le Tableau 3 donne un ordre d’idée de type de pâte obtenue (Mahaut al, 2002).
Tableau 4. Type de pate formée selon le temps de coagulation le temps d’affinage et le temps d’égouttage (Mahaut et al, 2002) Catégories
fromages
Temps de Coagulation
Durée d’égouttage Affinage
Pâtes fraîches 16–48 heures 24–48 h Exceptionnel
18
Pâtes molles 45 mn - 2 h 16–24 h 0,5–2 mois
Pâtes pressées
• non cuites 30 mn - 1 h 5–16 h 0,5–2 mois
• cuites 20–45 mn 2–16 h 3–24 mois
Il faut néanmoins savoir que pour chacune des étapes de transformation des accidents de fromagerie existent qui se traduisent par des défauts sur le produit fini. Ces défauts peuvent intervenir à toute étape du fromage. Par exemple des défauts de texture et de gonflements au niveau de l’affinage. Ces défauts sont la cause de la perte du rendement fromager.
C. La technique de Recouvrement de Fluorescence Après photoblanchiment (FRAP).
Comme dit précédemment la FRAP signifie Fluorescence Recovery After photobleaching qui se traduit par recouvrement ou retour de la fluorescence après photoblanchiment. Une lumière (laser) de forte intensité est utilisée pour détruire les molécules fluorescentes dans une région d’intérêt (ROI) (cette phase est appelée photoblanchiment ou bleach en anglais). Immédiatement après, le retour de la fluorescence du à la diffusion des molécules environnantes (celles qui n’ont pas été blanchies) est alors mesuré au moyen d’un faisceau laser de faible intensité (phase de recouvrement ou recovery en anglais). La diffusion s’effectue en respectant le principe d’équilibre entre les molécules qui ont été blanchies et celles qui n’ont pas été blanchies. La Figure 5 montre les différentes étapes du processus de FRAP.
A l’origine cette technique était aussi bien utilisée pour déterminer la mobilité de molécules au sein de membrane cellulaire que pour étudier la mobilité de molécules au sein de gels et de solutions aqueuses.
Néanmoins elle était juste un outil pour caractériser qualitativement la mobilité des molécules. Axelrod et al (1976) ont été les premiers à proposer un traitement quantitatif des expériences de FRAP pour modéliser la diffusion des molécules, modèle appelé diffusion dominant. Leur modèle est basé sur la loi de Fick, par ajustement des équations théoriques de la diffusion à la courbe de de recouvrement obtenue expérimentalement.
Ces équations supposent de respecter les hypothèses suivantes :
Le recouvrement de fluorescence est le résultat d’unphénomène de diffusion pure des solutés en dimension 2D
Le faisceau laser possède une intensité de profil Gaussien et est utilisé pour le photoblanchiment et la détection
Le photoblanchiment s’effectue comme une réaction irréversible du premier ordre
la durée de l’impulsion permettant le photoblanchiment est courte comparée au temps caractéristique de recouvrement.
19 Ainsi, pendant les 20 premières années du développement de cette première méthode, le processus de photoblanchiment était effectué avec un faisceau laser stationnaire centré sur des échantillons très fins qui permettait de considérer la diffusion pratiquement comme une diffusion en 2D. (Figure 5)
De plus, ce dernier ne s’adaptait pas pour un parfait suivi de la fluorescence dans une région donnée (Braekman and al 2003, Blonk and al, 1993) L’apparition du microscope confocal à balayage laser a permis l’apparition de nouvelles méthodes permettant de balayer point par point et ligne par ligne l‘intensité du retour de fluorescence au sein d’une région donnée et qui donne ainsi un meilleur ratio signal bruit. Ceci a permit la détermination de mobilité de macromolécules fluorescentes telles que la GFP (Green Fluorescent Protein) au sein de cellules vivantes (Braga and al, 2004 )
Figure 5. Allure de la courbe de recouvrement de fluorescence au cours du temps obtenu par la technique de FRAP (http://www.embl.de/eamnet/html/teaching_modules.html)
Il existe de nombreux modèles permettant d’ajuster la courbe de recouvrement, qui sont permettent de caractériser le phénomène de diffusion ainsi que les phénomènes d’interactions des solutés avec la matrice.En effet,a plupart des techniques de FRAP sont utilisées dans les cellules vivantes. Or les cellules vivantes sont des milieux très complexes, et lors de la caractérisation de la diffusion des espèces fluorescentes par la technique de FRAP il est possible que des molécules restent accrochée à la paroi ou à des microcavités. Certaines de ces cavités bloquent le processus de diffusion. Il est alors indispensable d’utilisrun modèle dit de diffusion-réaction pour caractériser la mobilité des solutés fluorescents (Mai and al 2011, Li and al, 2011). Ce type de modèle est très complexe et permet surtout de déterminer le taux de fraction non libre des molécules fluorescentes (c'est-à- dire celle qui restent accrochées à la membrane cellulaire). Il existe d’autres modèles où c’est le processus de diffusion-réaction qui est- dominant. Ces modèles consistent à regarder d’avantage la cinétique de réaction des
20 molécules photoblanchies bloquées. Ceci suppose alors que le phénomène de diffusion n’est pas limitant devant les constantes de réaction des molécules photoblanchies.
Mais dans notre cas, nous utiliserons simplement un modèle dit à diffusion dominante décrit par la 2ème loi de Fick, car il n’y a pas d’interactions, ni de réactions, entre les FITC-Dextrans et la matrice fromgère modèle.
Selon Seiffert tOpperman (2005), il est possible de déterminer la dimension du processus diffusionc’est-à-dire s’il s’agit d’une diffusion en 1D, 2D ou, 3D. Cela nécessite de disposer d’un microscope confocal à faible ouverture numérique et, des temps de retour à la fluorescence suffisamment longs pour permettre l’ajustement de la courbe de recouvrement au modèle de diffusion. Ce modèle nécessite aussi une parfaite détermination du centre photoblanchiment.
Bien qu’il existe des modèles plus récents (Waharte etal, 2010, Vilaseca et al, 2011nous avons choisi d’ utiliser le modèle de Braga and al (2004). En effet, ce modèle a été développé pour modéliser les coefficients de diffusion de sondes fluorescentes FITC-dextrans dans des cellules vivantes et dans une solution acqueus. Ce modèle possède l’avantage d’être applicable sur tous types de microscope confocale à balayage. Son avantage majeur est qu’il permet aussi de prendre en compte le processus de diffusion entre la phase de photoblanchiment et la première prise de photo lors de la phase de recouvrement de fluorescence. Cependant, cette méthode nécessite de réaliser des essais préliminaires pour déterminer le protocole de FRAP (i.e. choix de la taille de la zone d’intérêt et de la durée du photoblanchiment) qui permette d’obtenir des coefficients de diffusion expérimentaux des solutés FITC-Dextrans proches de ceux obtenus théoriquement grâce à la loi de Stokes- Einstein. La taille des solutés étudiés par Braga et al (2004) était de 20, 40, 70, 500 kDa. Lescoefficients de diffusion obtenus étaient respectivementde 70.6, 52.9, 39.3 et 17.8 µm.s-1, avec unezones de photoblanchiments de 1µm2 .Ce modèle s’adapte aussi bien en 2D qu’en 3D. Le modèle de José Braga est décrite principalement par les équations.(2) et (3)
Figure 6. Profil d’une zone photoblanchite. (Braga et al, 2004)
2 1 2
2 ) 1
! ( ) ( 2
1 2
2 n
w w n im S
tot im im
S im
n e n K w
F w 2
21
) 2 2
exp(
exp(
) ,
( 2
2 2
2 0
im im
im z
r w
K r F
z r
F
tot
Fim
représente l’intensité de fluorescence normalisée émise de la phase de photoblanchiment jusqu’à la prise de la photo finale.
F(r,z) représente le profil de l’intensité.
Kim représente l’efficacité du photblanchiment, wim et zim l’étendu spatiale du photoblanchiment qui correspond au profil de la gaussienne respectivement dans le plan et dans la direction perpendiculaire . Et enfin ws qui représente le rayon de la zone photoblanchie et wB le rayon de la région d’interet (ROI)c’est à dire. (le rayon de la zone qu’on a voulu photoblanchir).
L’équation 3 permet d’ajuster le profil de bleach lors de la première prise de photo après le photoblanchiment, tandis que la courbe de recouvrement de fulorescence est modélisée grâce à l’’équation 2
Un récapitulatif des conditions expérimentales utilisées par différentes équipes lors de leurs expérineces de FRAP en microscopie confocale est présenté dansle tableau 4. On constate que le protocole donné par Braga et al (2004) est celui qui possède l’une des plus faibles acquisitions d’images pour suivre le retour à la fluorescence.
Tableau 4. Acquisition d’images au retour de fluorescence selon les auteurs dans la littérature.
Modèles à diffusion dominant Auteur Acquisition
image
excitation Ouverture
numérique
Objective fluorophores
Braga and al 2004
256*30 pixels 488 nm à (25% de 25 mW) 1.4 63X FITC-Dextrans (10mg/ml) Wahart and al
2010
512*128 pixels Largeur de bande 500 à 600 nm
1.4 63X-OIL FITC-Dextrans (15mg/ml)
Seiffer and Opperman
2004
256*256 pixels 543 nm (0,22 mW) 0.3 10X Rhodamines B-PMMA
E.vilesca and al
512*512 488nm 1.25 63X-
water
FITC
Hatzigrigoru and al 488 nm 1.4 63X-OIL PA 6
Perry and al
256*256 512*512 126*126
488 nm 0.3 10X FITC-Dextrans
3
22
III. Matériels et méthodes.
Afin de caractériser les propriétés de diffusion des solutés dans les fromages modèles, des tests de FRAPs sont effectués sur 5 mini gels cassettes (Figure 9 et Figure 10) différents correspondant à différentes masses de FITC-Dextrans (4, 20, 40, 70, 150 kDa).
A. Les solutés fluorescents FITC-Dextrans (Fluoresceine Isothiocyanate- Dextran)
Dans la bibliographie (Tableau 4) la plupart des solutés fluorescents étaient la FITC ou le FITC-Dextran. Le dextran est marqué par la FITC (Figure 7) . Le dextran permet de faire varier le poids moléculaire du fluorophore FITC. Le FITC-dextran est une molécule neutre et soluble dans l’eau. , il est aussi facilement purifié, biocompatible et biodégradable. Nous avons choisi d’étudiés 5 tailles de FITC-Dextrans différentes : 4 kDa, 10kDa, 20kDa, 40kDa, 70kDa et 150 kDa, provenant de chez SIGMA et livrés sous forme de poudre. Nous avons préparé une solution mère de chaque FITC-Dextran à 50 mg/mL par dissolution d’une masse précise de poudre dans de l’eau pure stérile. Un récapitulatif de la structure des FITC-Dextrans est présenté ci-après .
III .A.1 Structure
Le dextran est un polymère d’anhydroglucose. Il est composé d’approximativement 95% de liaisons alpha-D- (166). Le reste des liaisons sont responsable de l’attachement au dextran. Des données contradictoires sur les longueurs des branches impliquent que la longueur moyenne des branchements est moins de 3 unités de glucose.
Cependant d’autres méthodes indiquent que les branchements plus grands que cinquante unités de glucose existent. Les dextrans de poids moléculaire le plus faible montreront légèrement moins de branchement et ont une plus large gamme de distribution en poids moléculaire. Les dextrans avec des poids moléculaires plus grands que 10.000 g/mole se comporte comme si ils étaient complètement liés. Quand le poids moléculaire augmente, les molécules de dextrans possèdent une plus grande symétrie. Les Dextrans avec un poids moléculaire de 2.000 to 10.000 g/mole montrent les propriétés d’une bobine étirable. Pour un poids moléculaire en dessous de 2000 le dextran est considéré comme une canne.
23
Figure 7 Structure de la molécule de FITC-Dextran, avec l’encerclement (montrant uniquement la molécule de FITC)
III.A.2 Propriétés physiques:
Dans le tableau ci-dessus sont représentés les rayons de Stockes-Einstein nécessaires pour calculer le coefficient de diffusion théorique des FITC-dextrans dans l’eau en fonction de leurs poids moléculaires pour la validation du protocole de FRAP.
Tableau 6. Rayon FITC-Dextranssuivant leurs masses moléculaires moyennes (source SIGMA)
4.000 Da 10.000 Da 20.000 Da 40.000 Da 70.000 Da
1.4 nm 2.3 nm 3.3 nm 4.5 nm 8.5 nm
III.A.3 Propriétés de Fluorescence.
Le maximum d’absorption de la fluorescéine est d’environ 490 nm. Le maximum d’émission de fluorescence est d’environ 520 nm. Sa fluorescence dépend énormément du pH avec une émission minimal à pH 4 et une émission maximum à pH 8. Comparé à d’autres molécules c’est aussi la moins photostable. Et c’est aussi elle qui possède les plus basses propriétés de « quenching ». Le quenching est la propriété d’une molécule à perdre de la fluorescence en fonction du nombre de molécule à laquelle elle est attachée. Ce qui correspond parfaitement à l’attachement des dextrans. Les propriétés de cette molécule font d’elles pratiquement la seule à correspondre le plus idéalement possible pour le photoblanchiment. Les FITC-dextrans son conservés au congélateur à une concentration de 50 mg/mldans des eppendorfs. Ils sont décongelés 10 à 15 minutes à 19°C avant utilisation.
24
B.
Fabrication des matrices fromagères modèles
III.B.1 Préparation des gels cassettes
Les gels cassettes® sont des systèmes d’étude du développement de moisissures par microscopie confocale importés d’Angleterre (système breveté). Un gel cassette® a la forme d’une cassette et il possède deux parallélépipèdes extrudés collés entre eux et ouvert à une extrémité afin d’introduire le gel. Le gel cassette possède alors un volume d’introduction de gel de 30*15*2 mm. Avant l’introduction du gel des « spacer » sont placés sur le contour de la partie supérieure pour permettre de coller une lamelle. (Figure 8 et Figure 9)
III.B.2 Composition chimique du rétentat
Les matrices modèles sont issues d’une technologie fromagère de type MMV. Un préfromage liquide est obtenu par ultrafiltration (filtre les masses supérieures à 4 kDa) de lait écrémé, puis emprésuré et directement moulé en gel casette. Cette technologie permet d’éviter la phase d’égouttage du lactosérum et de coaguler le gel de manière homogène dans la géométrie souhaitée. Ce préfromage liquide est appelée retentat UF. Il s’agit d’un lait écrémé et concentré environ 5 fois par ultrafiltration. Le lait a été également microfiltré (membrane de 0.8 µm) pour enlever la flore endogène. Ce produit dont la composition est donnée dans le tableau 7 a été préparé par la plateforme du STLO et il est stocké à -20°C pour utilisation ultérieure. La composition chimique du rétentat qui a été utilisée est résumée dans le tableau ci-dessous.
Tableau 7. Composition chimique du Rétentat UF modèles.Floury et al, 2010)
Matière sèche Azote total Azote non caséinique Azote non protéinique
Retentat UF 223g/kg 159.7g/kg 29g /kg 1.8g/kg
III.B.3 Protocole de coagulation et analyse des échantillons
Figure 8. Vue de bais du gel cassette Figure 9. Vue de dessus du gel cassette avec introduction d’un gel coloré en rose
30 mm
15 mm 15 mm 30 mm
25 De ce retentat, deux matrices gélifiées à partir d’une concentration de 0.03% de présure (coagulant agent MAXIREN 180,DSM FOOD Specialities. France) dans le rétentat ont été étudiées. La composition des matrices est la suivante :
. La matrice 1 qui correspond à la au gel de retentat UF pur.
Dans la matrice 3, nous avons remplacé 10 % de l’extrait sec du concentré de lait par son son équivalent en gélatine La solution de gélatine a été préparée à une concentration de 22% et un pH de 6,5 à partir de gélatine en poudre (gélatine de type B from bovine skin, Bloom 225, sigma Aldrich, Germany), soit avec un même extrait sec et un même pH que la matrice 1. On espère ainsi modifier la structure de la matrice modèle, en gardant des caractéristiques physico- chimiques si possible contantes (pH, EST, aw).
.
Pour coaguler ces matrices, 250 ml de rétentat UF ont été décongelés la veille au réfrigérateur. On liquéfie ensuite ce rétentat par chauffag dans un bain marie à 48°C pendant 5 à 15 minutes. Pour éviter au maximum l’évolution du gel dans le temps, nous avons aussi dénaturé les protéines sériques par traitement thermique (15 min à 100°C), ce qui augmente fortement leur capacité de rétention de l’eau et limite ainsi le phénomène de synérèse. A la fin du traitement thermique une masse de 0.5 g/L d’azide de sodium est introduite pour éviter toute contamination microbienne.
Les différents gels sont moulés soit dans des gels cassettes pour les observations au microscope confocal, soit dans des cylindres en plastique de 3 cm de diamètre pour les caractérisations physico-chimiques (pH, Extrait sec, Activité de l’eau) et de macrostructure (analyse de texture)Pour la caractérisation rhéologique des gels, le moulage a lieu directement dans le cylindre coaxial du rhéomètre, 1 minute après emprésurage.
Pour les études de diffusion en FRAP, la solution de FITC-Dextran est ajoutée à une concentration de 0,5 mg/ml dans les gels immédiatement après emprésurage, juste avant le moulage dans les gels cassettes (à raison de 1 type de FITC-dextran par gel cassette).
La coagulation a lieu à l’étuve à 30°C pendant 1 heure, et les analyses sont effectués après repos des matrices pendant 2h à 19°C. Un schéma de synthèse de la préparation des échantillons est présentéFigure 11
26
Figure 11. Etape de coagulation et préparation des échantillons d’analyses.
Réfrigération de 250 ml de rétentat UF à 5 °C, une journée avant
Liquéfaction du rétentat UF à 48 ° C , pendant 5 à 15 minutes dans un bain marie
Traitement thermique de 100°C pendant 15 minutes et refroidissement 2 à 3 minutes dans un bain d’eau glacé pour dénaturer les protéines sériques et introduction de 0.5g/L d’azide de sodium pour éviter toute autre type de croissance
Ajout de gélatine de type bovine pour la matrice 3 préalablement chauffé à 30°C sans gélatine matrice 3.
Sans gélatine il s’agit de la matrice 1 directement l’ajout de présure
Coagulation en ajoutant la présure à une concentration finale de 0.03% à t=t0 sous agitation magnétique
1 minute après l’addition de la présure
Etape de coagulationPréparation des échantillons d’analyses
Coulage et moulage du reste dans des tubes cylindriques de 3 cm de diamètres et de 6 cm de hauteur (Boudin)
10 µL de FITC- Dextran à 50 mg/ml sont prélevés et mélangés à 990 µl de matrice.La
concentration finale est 0.5 mg/ml.
Moulage dans les gels cassettes
Caractérisation TPA , Aw, Extrait Sec, Microstructure 10 ml de la
matrice sont prélevés pour l’analyse
rhéologique.
