Evaluation du stress oxydatif chez l'homme

République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de /'Enseignement Supérieur

et de la Recherche Scientifique

Université de Jijel

. Faculté des Sciences

Département de Biologie Cellulaire et Moléculaire

0

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Mémoire ~

De Fin d'Etudes en Vue de /'Obtention du Diplôme d 'Etudes Supérieures (D.E.S) en Biolo/!ie

Option : Biochimie

Thème

Evaluation du stress

oxydatif chez /'homme

Membres du jury : Présenté par :

•:. Encadreur :

BENGUEDOUAR L > BOUGHLEF Mounira )- BELABED Mouna

+ Examinatrice : M.,"' ROUIBAH H. &~·~ ^{". ? BAZIZ /lhura}

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Promotion Juin : 2007

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* Nous tenons à remercier en premier lieu Dieu , de nous avoir donné la ~

* force et la volontlj pour réaliser ce modeste travail. ~

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îf et Mlle Rouibah d'avoir accépté de l'examiner notre travail. 1

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* En fin nous remercions tous ceux qui ont participé de prés ou loi; ~

* ^à la réalisation de ce travail. ~

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GLOSSAIRE

Apoptose : l'apophase ou mort cellulaire programmée est un processus physiologique par le quel des cellules surnuméraires ou dysfonctionnements sont éliminés de l'organisme.

Carcinogenèse : naissance d'un cancer à partir d'une cellule transformée par plusieurs mutations (SYN : cancérogenèse

oncogenèse).

Cytokines : molécule sécrétée par les lymphocytes et les macrophages et impliquée dans le

•

développement et la régulation des

immunitaires.

Dyslipidémies : anomalie de taux de lipides dans le sang.

Electromagnétiques : qui concerne l'électromagnétisme (étude des relation existant entre l'électricité et le magnétisme).

Hémolyse : destruction des globules rouges du sang.

Homodimére : protéine contenant deux chaînes polypeptidique identiques, ou un dimère de résidus identiques

lschémies/reperfusions: une ischémie entraîne un défaut l'apport en oxygène et une altération du métabolisme.

Repèrfusion: repère: marque qui permet de se retrouver ou de s'y retrouver.

Fusion: passage d'un corps solide à l'état liquide par l'action du feu.

Isoprostane: marqueur de la peroxydation lipidique.

Microglie: est une sorte de tissu conjonctif que l'on trouve dans le cerveau et dans la molle épinière.

Phagocytose : Physiol, fonction des phagocytes (globule blanc).

Radical libre : espèce chimique possédant un électron non apparié.

Synovie : liquide incolore transparent et filant sécrété par la synoviale, qui lubrifie les surfaces

articulaires.

LISTE DES ABRÉVIATIONS

ADMA: Asymmetric timothy argentine ADN : Acide désoxyribonucléique AJR: Apports Journaliers recommandés A VC : Accidents vaxulaires cérébraux CAT: Catalase

CG-MS : Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectroscopie de masse COQ : Ubiquinone

DNPH : Dinitro Phéyl Hydrazine EO.t\,: Espèce oxygène Activé

G-6-P-D : Glucose 6 phospho dihydrognase GPX : Glutathion peroxidase

GR : Glutathion réductase GSH : Glutathion

GSSG : Glutathion disulfure GST: Glutathion transférase H

0

Peroxyde d'hydrogène HCLO : Hypochlorite

4HNE: Hydroxynonénal

BOO· : Radical hydroperoxyde

HPLC : Chromatographie liquide à haute performance L'apo LDL: Protéine low donsity lipoprotine

LDL : Low density lipoprotéin LH : Acide gras insaturé MC: Maladies coronariennes MDA : Malonyl dialdéhyde MPO : myéloperoxydase

NADP+ : Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate oxydé NADPH : Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate réduit NO· : Monoxyde d'azote

NOS: NO synthase 0•

Anion superxyde

0

Oxygène singulet

0

Ox:ygéne

·OH: Radical hydroxyle ONOO· : Peroxonitrique

PIXE : Emission de particules induits par rayons X PRX : Peroxyde redoxines

RL : Radical libre

ROO·: Radical peroxyle

ROS : Réactive oxygène species

SNGPX : Sporm nucleus glutathione peroxides SOD : Super oxyde dismutase

TBA:ThioBarbituric Acid

THCY: Homo Cystéine Totale

Sommaire:

Page

Introdùction ... 1

Chapitre 1 Le Stress Oxydatif. 1-1- Définition du phénomène « stress oxyda tif» .•... 3

1-2- L'origine du stress • oxydatif ...•...•... 4

1-3- Les espèces réactives de l'oxygènes .•...•....•...•....•..•... · ··· · · · ·· .5

1-4- Sources des dérivés réactifs de l'oxygène ...•... 6

1-4-1- Sources exogènes des ROS ...•.•.•...•....••..•...•...•.•.•... 6

1-4-2- Sources endogènes des ROS •...•... 7

1-4-2-1- NAD PH oxydase .••.••...•...•....•...•...•... 7

1-4-2-2- La NO synthase ••.•••••.•••...•..•••.•..••..•...•..•.••...•... 7

1-4-2-3- La xanthine oxydase ...•...•... 8

1-4-2-4- Les ions métalliques .•...••...•...•••...•...•..•.•... 8

1-4-2-5- Les péroxysomes ...•..•... 8

1-4-2-6- La mitochondrie ... 8

1-S- Dommages oxydatifs ...•.•.•...•... 9

1-5-1- Dommage oxydatif au niveau des protéines ... 9

1-5-2- Dommage oxydatif au niveau de I' ADN ... 9

1-5-3- Peroxydation lipidiques •....•...•...•...•... 10

1-5-4- Oxydations des carbohydrates ...•... 11

1-6- Les radicaux libres sont- ils indispensables à la vie ? ... 11

Chapitre II Systèmes de Défense Antioxydants. 11-1- Les Défenses Antioxydantes ...•... 13

11-1-1- Mécanisme d'action des antioxydants •••••...•..•...•..•.... 15

11-1-1-1- Systèmes antioxydants enzymatiques ..•.•.•••...• 15

a- Les SuperOxyde Dismutase (SOD) .•••...•...•..•... 15

b- La Catalase (Cat) .•...•...•...•...•.. · ·. · · ... 16

c- La glutathion peroxydase (GPx) ...••...•... · · .. 16

d- La glutathion transferase (GPT) ...••...•...•.. 17

e- Les peroxyredoxines (Prx) ...•...•....•...••.•... 18

11-1-1-2-Systèmes antioxydants non enzymatiques ...•... 18

a- Le glutathion ...•...•... • ·. · ... 18

b- Les vitamines ...•...•...•..•....•... 19

c- L'ubiquinone ou le CoQ ••••..•...•.•••.•••....•.•••...•••.•....•... 21

d-

cytochrome C •••••••.••••••••••••••••••••••••••.••••••••••••••.•••••...•••••.•••• 21

e- Le ^NADPH ···•••!••···21

f- Les flavonoïdes et les béta-carotènes ... 21

g- Acide uriq ne ....•...•...•.•...•...•... · .. 21

111-1-1-3-Les oligoéléments •.•••••.••.•..•....••.•.•.•...•.•..•.•••.••..•..•....•.. 22

a- Le fer et le cuivre •..•.•..•.•...•....••...•...•.•...•..•...•...• 22

b- Les autres oligoéléments •••.••••••••.••.••.•.•••••••..•...•••...• 22

Chapitre III : Evaluation du Stress Oxydant. , 111-1- Mesure des dérivés de la peroxydation des lipides ••...•.•... 24

ID-1-1- Les marqueurs intéressants de la peroxydation lipidiques ... 25

III.-1-1-1- Isoprostanes ••.••••••••••...••••..••.•.••..••..•..•.•....•..••..••..•.• 25

ID-1-1-2- Les anticorp anti-LDL-oxydées ...•... 25

ID-1-1-3- Le malonyl dialdéhyde (MDA) ...•...•..•... 26

ID-2- Mesures d'oxydation des protéines ..•..•••...••..•....•...•...•...•...•. 26

ID-2-1- Les marqueurs intéressant de l'oxydation protéique ....•... 26

ID-2-1-1- Asymmetric dimethylarginine (ADMA) .•.•....•...•... 26

ID-3- Mesure d'oxydation del' ADN ... 27

ill-3-1- Le 8 OHdG urinaire .•...•...•...•.•... 27

ill-4- L'analyse des antioxydants et oligoéléments ...•. 28

111-4-1- L'analyse des antioxydants .•..••.•...•..••...•... 28

a- SOD ....•...••..•...•...•...•. 28

b- Catalase .••...•...•... 28

c- (j.J:>:x ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 29

ill-4-2- L'analyse des oligoéléments ••...•...•...•.••....•... •..•... 29

a-Le sélénium ... 29

b- Bilan ferrique ...•...•...•...•...•... . ... 29

ill-4-3- Activation des neutrophiles ... 30

ill-4-~

Capacité antioxydante globale •••...•..••...•.•....•...•.... 30

Chapitre IV : Pathologies liées au Stress Oxydant IV-1- Le Diabète .... : ..••..••..••..••.••.•.••...••.••••..•••.••...•..•..•...•••.•••.••.•.•. 33

IV-2- Le Cancer •...•...•...•... : ...•..•...•... 33

IV-3'- La Sclérose ••.••••...•.•...•..•...•.••...•....•...•••.•..•...••..•... 34

IV-4- Le Vieillissement ...•...••••...••...•.•..•....•.••••....•...•...•...••... 34

IV-5- La Maladie d' alzheimer ...•.... 34

IV-6- L'lschimie de myocarde ... 35

IV-7- Comment lutter contre le stress oxyda tant ? ...•...•.. 36

IV-7-1- Intervention pour réduire les dégâts oxydatifs sur l'ADN ... 36

IV-7-2- Intervention pour réduire les dégâts oxydatifs sur les protéines ... 37

IV-7-3- Intervention pour réduire les dégâts oxydatifs sur les lipides ... 37

D . .

ISCUSSIOn •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 39

Conclusion ... ⁴³

Références bibliographiques.

Liste des figures

Page

Figure 1 : Déséquilibre de la balance entre antioxydants et pro-oxydants ... 3

Figure2 : Origine des différents radicaux libres oxygénés et espèces réactives de l'oxygène impliqués en biologie ... 5

Figure 3: ProductÏOJ\ de ROS au niveau de la chaîne respiratoire mitochondriale ... .. 9

Figure 4: Mécanismes de la

des lipides par les radicaux libres ... .... 10

Figure 5: Rôle central des enzymes antioxydants dans la cascade oxydante ... 14

/

Figure 6: Schéma montrant les formes oxydée et réduite de la SOD /Zn-Cu ... 15

Figure 7 : Elimination du H

0

par les réactions enzymatiques combinées de la GPx et de laGR ... 17

Figure 8 : Différents systèmes antioxydants associés au glutathion ... . 18

Figure 9: Métabolismes et fonctions antioxydantes du GSH dans la cellule ... 19

Figure 10: Exemple de réactions antioxydantes en chaîne mettant enjeu les vitamines E et c ... ²⁰

Figure 11: Positionnement du CoQ ou ubiquinone (UQ) dans le transport des électrons de la chaînes respiratoire mitochondriale ... ... 20

Figure 12 : Les étapes de la formation des radicaux libres oxygénés (ROS), enzymes et antioxydants endogènes intervenant dans leur neutralisation ... 22

Figure 13 : Méthodologies permettant d'évaluer l'état de stress oxydatif chez

l'homme ... 24

Liste des tableaux

Page

Tableau 1: Principaux ROS et comparaison des pouvoirs oxydants ... 6

Tableau II : Les concentrations moyennes, déviations standards ainsi que les valeurs de référence calculées pour les vitamines A, C, E, le sélénium ainsi que les enzymes antioxydantes (SOD),Gpx et catalase) ... .... ... 30

Tableau III : Exemples de quelques pathologies humaines associées avec des

modifications de la concentration en antioxydants ... ... 36

Introduction

Le stress oxydatif se définit comme un déséquilibre profond de la balance entre les pro-oxydants et les antioxydants en faveur des premiers. Ce déséquilibre peut avoir diverses origines : déficit nutritionnel en antioxydants, surproduction endogènes comme des réactions inflammatoires, exposition environnementale à des facteurs pro-oxydants, ce qui conduit à des dégâts cellulaires irréversibles. La réduction univalente de l'oxygène se traduit par la formation d'espèces oxygénées activées (EAO) dont font partie les radicaux libres (anion superoxyde, radical hydroxyle), le peroxyde d'hydrogène et l'oxygène singulet.

Toutes ces espèces sont potentiellement toxiques pour l'organisme car elles peuvent inactiver des enzymes, modifier les structures primaires et secondaires des protéines, induire dès cassures au sein de l'acide désoxyribonucléique (ADN) avec, comme conséquence, une altération du message génétique, une dégradation des sucres, une oxydation des lipides au sein de la membrane cellulaire en s'attaquant aux acides gras poly insaturés, il est toutefois bon de rappeler que les EOA sont produites en permanence par notre organisme et que, dans certains cas, elles peuvent jouer un rôle

Cette production naturelle est toutefois parfaitement régulée par notre organisme qui a développé des moyens de protection. Ceux-ci se divisent en un système de défense primaire composé d'enzymes (les superoxydes dismutase Cu-Zn et Mn, la catalase, les glutathions peroxydases, le couple thiorédoxine-tiorédoxine réductase), de molécules antioxydantes de petite taille(glutathion, acide urique, bilirubine, le groupe des vitamines A, C, E, caroténoïdes, ubiquinone, et oligoéléments (sélénium, zinc, cuivre) et un système de défense secondaire composé d'enzymes protéolytiques dont le rôle consiste à empêcher l'accumulation dans la cellule de protéines ou d'ADN oxydés et à dégrader leurs fragments toxiques.

Le présent travail consiste à évaluer un état de stress oxydatif chez un individu.

L'exploration de ce type de déséquilibre se résume à estimer l'efficacité du système de détoxification enzymatique par mesure des activités de la SOD, Catalase, GPx cytosolique et mitochondriale d'une part, et l'évaluation des lésions induites par la présence d'un excès de radicaux libres (RL ). Pouvant s'agir de lésions au nivaux des molécules réactives de l'organisme tel que les protéines et les lipides qui sont les cibles privilégiées des EOA et plus particulièrement des radicaux libres.

Un certain nombre de marqueurs biologiques permettent l'exploration biologique et biochimique du stress oxydatif chez un patient. Ces paramètres estiment les degrés de lésions moléculaires (protéiques, nucléotidique et lipidiques) et donc tissulaire.

Cette appréciation est orientée par l'évaluation des éléments intervenant dans les mécanismes de défense antioxydante (enzymes, substrats, oligoéléments, vitamines . . . ) ou au contraire prooxydante par l'établissement du degré de production des espèces réactives de l'oxygène.

Cette hyper production de RL est à l'origine de plusieurs dysfonctionnements. Le stress oxydant qui en résulte constitue la cause initiale de plusieurs maladies : cancer, sclérose latérale amyotrophique, vieillissement accéléré. Il représente un facteur de la genèse des 1 maladies plurifactorielles telle la maladie d'Alzheimer, les rhumatismes et les maladies cardiovasculaires.

1

Chapitre ^I :Stresse oxydant

• Définition du Stress Oxydant.

• Origine de Stress Oxydant.

• Les Espèces Réactives De L'oxygène.

• Les Sources des Dérivés Réactives de L'oxygène

• Dommage Oxydatif.

Chapitre! le stress oxydatif Depuis quelques années, le monde des sciences biologiques et médicales est envahi par un nouveau concept, celui du "stress oxydant", c'est-à-dire d'une situation où la cellule ne contrôle plus la présence excessive de radicaux oxygénés toxiques, situation impliquée dans la plupart des maladies humaines (Favier, 2003).

1-1- Définition du phénomène «Stress Oxydant>>

Dans les conditions normales, il existe un équilibre entre la production des radicaux libres et les défenses antioxydantes. Lorsqu'un déséquilibre survient, soit une production des radicaux libres augmente par rapport aux capacités antioxydantes intactes, soit un état déficient de ces derniers, soit ces deux situations cumulées, alors les radicaux libres vont immédia\ement réagir et altérer les molécules de la cellule avec des conséquences qui peuvent être

; cette situation définit : le stresse oxydant ( Andreyev et al., 1995). Produites en trop grande quantité, les espèces oxygénées activées (EOA) peuvent en effet entraîner de profondes modifications dans la structure de substrats biologiques comme les protéines, les lipides, les lipoprotéines ou l'acide désoxyribonucléique (ADN).

De manière générale, le stress oxydant se définit comme le résultats d'un déséquilibre entre la balance des pro-oxydants et des antioxydants, avec comme conséquence, l'apparition de dégâts souvent irréversibles pour la cellule (Figure 1) (Pincemail et al., 2000).

LE STRESS OXYDANT

EOA

Figure 1 : Déséquilibre de la balance entre antioxidants et pro-oxydants (Pincemail et al., 2000).

1-2- Origine du Stresse Oxydant

La découverte d'espèces chimiques radicalaires, présente normalement dans l'organisme a bouleversé notre compréhension des mécanismes biologiques. Ces radicaux libres sont produits par divers mécanismes physiologiques car ils sont utiles pour l'organisme à dose raisonnable : mais la production peut devenir excessive ou résulter de phénomènes toxiques exogènes et l'organisme va devoir se protéger de ces excès par différents systèmes antioxydants.

3

Chapitre/ le stress oxydatif Dans les circonstances quotidiennes nonnales, des radicaux libres (RL) sont produits en pennanence en faible quantité comme les médiateurs tissulaires ou les résidus des réactions énergétiques ou de défense, et cette production physiologique est parfaitement maîtrisée par des systèmes de défense, d'ailleurs adaptatifs par rapport au niveau de radicaux présents. Dans ces circonstances nonnales, on dit que la balance antioxydantslprooxydants est en équilibre. Si tel n'est pas le cas, que ce soit par déficit en antioxydants ou par suite d'une surproduction énorme de radicaux, l'excès de ces radicaux est appelé« stress oxydant».

Cette rupture d'équilibre, lourde de conséquence, peut avoir de multiples origines.

L'organisme peut avoir à faire face à une production beaucoup trop forte pour être maîtrisée ; elle sera o),servée dans les intoxications aux métaux lourds, dans l'irradiation, et dans les ischémies/reperfusions sujvant des thromboses. La rupture d'équilibre peut provenir d'une défaillance nutritionnelle ou de la carence en un ou plusieurs des antioxydants apportés par la nutrition comme les vitamines ou les oligoéléments. Enfin, la mauvaise adaptation peut résulter d'anomalies génétiques responsables d'un mauvais codage d'une protéine (Favier, 2003).

1-3- Les Espèces Réactives de l'Oxygène

Parmi toutes les espèces radicalaires susceptibles de se former dans les cellules, il convient de distinguer un ensemble restreint de composés radicalaires qui jouent un rôle particulier en physiologie et que nous appellerons radicaux primaires. Les autres radicaux libres, dits radicaux secondaires, formés par réaction de ces radicaux primaires sur les composés biochimiques de la cellule (Yoschikawa et al., 2000).

Un radical libre est une espèce caractérisée par la présence au niveau d'un atome, d'un électron non apparié au niveau de son orbitale électronique périphérique (Gray, 1994). Tel l'anion superoxyde 0-

et le radical hydroxyle ·OH, ou de l'azote tel le monoxyde d'azote NO· (Y oschikawa et al., 2000).

D'autres espèces dérivées de l'oxygène comme l' oxygéne singulet

0

le peroxyde d'hydrogène H202 ou le nitroperoxyde ·ONOOH, ne sont pas des radicaux libres, mais, sont aussi réactifs et peuvent en être des précurseurs. L'ensemble des radicaux libres et de leurs précurseurs est souvent appelé espèces réactives de l'oxygène (figure2).

4

Chapitre/ Le stress oxydatif

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Figure 2: Origine des différents radicaux libres oxygénés et espèces réactives de l'oxygène impliqué en biologie (Favier, 2003).

Il ne faut pas penser que tous les radicaux de l'oxygène sont extrêmement réactifs, cette réactivité étant très variable selon la nature du radical (tableau I).

5

Chapitre!

Tableau 1 : Principaux ROS et comparaison des pouvoirs oxydants (Crompton, 1999).

Anion Superoxyde o·-2

Radical hydroxyle ·OH

Radical hydroperoxyde HOO·

Radical peroxide ROO·

Radical alkoxyle RO·

~

Peroxyde d'hydrogène H202

Radical oxyde nitrique NO·

Peroxonitrite ONOO·

Hydrochlorite HClO

Pouvoir oxvdant : ·OH> RO· > HOO· > ROO· >NO·

Ainsi panni les radicaux formés chez les êtres vivants, l'anion radicalaire superoxyde (0·2) comme le monoxyde d'azote (NO-) ne sont pas très réactifs, mais constituent des précurseurs d'autres espèces plus réactives. La faible réactivité de ces deux radicaux permet d'ailleurs leur utilisation par l'organisme comme médiateurs régulant des fonctions biologiques telles la vasodilatation capillaire, la prolifération cellulaire, le message de neurone.... En revanche des radicaux comme les radicaux peroxyde (ROO·) ou surtout le radical hydroxyle "HO·" sont extrêmement réactifs, ils ne sont pas uniquement toxiques, mais au contraire, ils sont produits par divers mécanismes physiologiques afin de détruire des bactéries au sein des cellules phagocytaires (macrophages, polynucléaires) ou pour réguler des fonctions cellulaires létales telle la mort cellulaire programmée ou apoptose (Favier, 2003).

1-4- Sources des dérivés réactifs de l'oxygène

Nos cellules sont continuellement agressées par des radicaux libres, essentiellement des espèces réactives de l'oxygène, dont la formation est liée aussi bien à des facteurs exogènes qu'endogènes.

1-4-1- Sources exogènes

Les rayonnement électromagnétiques, certains métaux de transition, les fumées de combustions (de cigarette, de bois, de matériaux de constructions), les produits chimiques (antiseptiques, médicaments, pesticides, produits toxiques tel le CC1

et les solvants, les poussières d'amiante et de silice), sont autant de facteurs qui contribuent à la genèse des radicaux libres. Les particules inhalées de silice et d'amiante sont des sources de radicaux libres parce qu'elles exercent la phagocytose, d'autres part parce que leur surface est tapissée de sel de fer, des rayonnement sont capables de produire des radicaux libres, soit en oxydant la molécule d'eau lorsqu'il s'agit des rayons ionisants X, y , soit en activant

. 6

Chapitre/

stress oxydatif des molécules photosensibilisantes lorsqu'il s'agit des rayons ultraviolets qui vont par ce mécanismes produire des anions superoxydes et de l'oxygène singulet. Signalons également qu'un stress intellectuel ou thermique, agent infectieux ainsi qu'un exercice physique intense mal géré peuvent générer un stress oxydants (Castronovo, 2003; Favier, 2003). La prise des médicaments, notamment les anticancéreux, est un inducteur puissant du stress oxydant (Sies, 1999 ; Dardik et al., 2000 ; Castronovo, 2003).

1-4-2- Sources endogènes des ROS

Au niveau cellulaire, il existe plusieurs sources potentielles des radicaux libres, que ce soit au niveau des mitochondries, des membranes, du réticulum endoplasmique ou tout simplement du cytosol.

D'une manière générale, toute réaction biochimique faisant intervenir de l'oxygène moléculaire est susceptible d'être à l'origine d'une production de radicaux libres oxygénés enzymatiques (Thannickal & Fanburg, 2000; Servais, 2004) nous pouvons citer:

1-4-2-1- NADPH oxydase

C'est une oxydase liée à la membrane plasmique, elle a été initialement décrite dans les cellules phagocytaires ou elle joue un rôle fondamental dans la réponse immunitaire, dans la lutte contre les micro-organisme. Elle est spécialisée dans la production du radical superoxyde selon la réaction suivante :

202 + NADPH NADPHœd&ce • 20i+ NADPW + W

Cette enzyme normalement dormante est activée lorsque la cellule phagocytaire est stimulée. La forte consommation d'oxygène qui en résulte est appelée "respiratory burst" dans la littérature internationale. Cette production du superoxyde est à l'origine de la synthèse des molécules comme l'H

0

et l'hypochlorite (HClO"), indispensables à la destruction du matériel phagocyté cette voie de production est particulièrement stimulée au cours des processus infectieux (Rahman et al., 1996 ; Aurousseau, 2002 ; Servais, 2004).

1-4-2-2- La NO Synthase

Beaucoup des Cellules sont capables de produire du monoxyde d'azote (NO) à partir de l'arginine et de l'oxygène, dans une réaction catalysée par la NO synthase (NOS), selon la réaction ci-dessus :

NOS

L.Argenine + 02 + NADPH----• L.Citruline + ^NO + NADP

En effet, les études réalisées à l'aide des enzymes purifiées, ont montré que la NOS est capable de générer des anions superoxydes dans des situations de déficit de son substrat la L.argénine comme substrat ou de ces cofacteurs d'activation. (Xial et al., 1998 ; Servais, 2004; Haton, 2005).

7

Chapitre/

1-4-2-3- La Xanthine oxydase

C'est une enzyme soluble qui génère les ROS en réduisant l'hypoxanthine et la xanthine en acide urique. Cette enzyme est présente dans le sang, les cellules endothéliales des capillaires et de façon très importante dans le foie et les intestins. Dans les conditions basales, la production de ROS par la xanthine oxydase est faible,mais elle jouerait un rôle important dans l'ischémie/reperfusion (Servais, 2004).

1-4-2-4- les ions métalliques

Des ions métalliques comme le fer et le cuivre, sont de remarquables promotteurs de processus radicaiairs. Ils transforment l'H

0

en radical hydroxyle encore plus toxique, selon la réaction de fenton :

- - - . O H + ·oa ^{+ Fe}

En situation physiologique, la concentration libre de fer ou de cuivre est particulièrement basse, ces métaux étant séquestrés par des protéines spécialisées de telle sorte que cette réaction n'a pas lieu en revanche, la destruction cellulaire (hémolyse, cytose hépatique) entraînant une libération de ces métaux pouvant engendrer un stress oxydant (Stohs & Bagehi, 1995 ; Girotti, 1998 ; Brunet, 1999 ).

1-4-2-5- Les peroxysomes

Le peroxysome est une source importante dans la production cellulaire des ROS, car cet organite contient de nombreuses enzymes générant du peroxyde d'hydrogène. Ce dernier est utilisé comme substrat par la catalase peroxysmale afin de réaliser les processus de détoxification présents dans le foie et le rein. Il semble cependant que seule une faible quantité de H

0

pourrait échapper à la catalase (Servais, 2004 ).

1-4-2-6- La mitochondrie

La source endogène prépondérante des RL est cependant liée à l' activité des mitochondries. Cet organite est considéré comme la principale source de ROS dans la cellule par le fonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale. Essentiellement à travers la fuite des électrons au cours de leurs transferts au niveau de la chaîne respiratoire mitochondriale (figure 3).

8

Chapitre! Le stress oxydatif

N40H NAO

~4:· ^fi

F AOH; FAO

Figure 3 : Production de ROS au niveau de la chaîne respiratoire mitochondriale (Morin et al., 2004).

1-S- Dommage oxydatif

1-5-1- Dommages oxydatifs au niveau des protéines

En présence d'EOA, les protéines peuvent se dénaturer, se fragmenter ou perdre leurs structures primaires et secondaires. Les dommages oxydatifs au niveau des protéines (et des acides aminés) peuvent se manifester de diverses manières. (Davies, 1987; Davies, 1999) : apparition de groupements hydroperoxyde (·OOH), oxydation du squelette carboné et apparition de groupements carbonyles, oxydation des chaînes latérales des acides aminés avec formation de ponts disulfure, de méthionine sulfoxyde et de groupement carbonyles, formation de dérivés chlorés (.3-chlorotyrosine, 3,5- dichlorotyrosine) et nitres (nitrotyrosine). Les deux principaux marqueurs biologiques de l'oxydation des protéines sont la formation de carbonyles et de groupes nitrotyrosine.

(Pantk:e et al., 1999).

1-5-2- Dommage oxydatif au niveau de l'ADN

Comme les protéines, l'ADN est vulnérable aux oxydations, mais il existe des mécanismes enzymatiques sophistiqués pour réparer les dommages sur l'ADN (Rehman et al., 1999). Sans de tels mécanismes, la stabilité génomique sur l'ADN est ainsi corrigée sans créer de maladie, mais les dégâts sur l'ADN peuvent être utilisés comme marqueurs du stress oxydatif. Les dégâts sur l'ADN peuvent résulter en des cassures de brins, de

!'enchaînements croisés protéines-ADN et des modifications de bases. Chacune de ces réactions est potentiellement mutagène et peut bloquer la réplication de l'ADN. Ces facteurs peuvent en partie expliquer l'augmentation du risque retrouvée chez les patients diabétiques (Collins et al, 2000).

9

Chapitre!

I-S-3- Peroxydation lipidique

Les lipides ont de nombreux rôles : molécules énergétiques, réserves d'énergie, molécules signale et font partie intégrante des membranes cellulaires. Parmi les lipides membranaires, les phospholipides sont les plus abondants. La partie hydrophobe des phospholipides est liée à la présence d'acides gras qui peuvent être saturés ou polyinsaturés. Les acides gras polyinsaturés sont plus susceptibles aux attaques radicalaires et génèrent des peroxydes lipidiques qui sont eux-mêmes très réactifs quel que soit l'événement déclencheur, la séquence par laquelle la lipoperoxydation survient peut se résumer en trois étapes distinctes : la phase d'initiations, la phase de propagation et la phase de terminaison (figure: 4) (Brunet, 1999; Per, 1991).

~

l.H n"Jr-t'.

Ho~

, . . 1

LOOll> l_H

Figure 4 : Mécanismes de la peroxydation des lipides par les radicaux libres.

La peroxydation lipidique est une réaction en châme, initiée par l'attaque d'un radical R tel que le radical hydroxyle sur un acide gras insaturé (LH) par abstraction d'un atome d'hydrogène dans un environnement aérobie, l'oxygène s'additionne par oxydation sur le radical lipidique (L • ) pour donner le radical peroxyle (LOO•). Une fois initié, le radical peroxyle peut propager la réaction en chaîne de production par abstraction d'un atome d'hydrogène d'un autre acide gras insaturé. Les hydroperoxydes formés (LOOH) peuvent subir plusieurs modes d'évolution :

Etre réduits et neutralisés par la glutathion peroxydase, ou continuer à s'oxyder et à se fragmenter en aldéhydes acides et en alcanes (éthane, éthylène, pentane ... ) qui de par leur volatilité, sont éliminés par voie pulmonaire. (Aurousseau, 2004; Servais, 2004).

La peroxydation des lipides fournit ainsi une grande variété de produits, dont certains peuvent réagir avec les protéines et l'ADN. Parmi les produits formés lors de la peroxydation lipidique, l'isoprostane, la malondialdéhyde (MDA) et le 4-hydroxynonénal (4-HNE) ont été très étudiés comme marqueurs de la peroxydation lipidique. Ces deux derniers produits réagissent avec les protéines et l'ADN (Marnett, 1999).

' 10

Chapitre/ Le stress oxydatif

1-5-4- Oxydation des carbohydrates

Si la chimie de l'attaque radicalaire des carbohydrates a été beaucoup moins étudiée que celle des autres macromolécules, il n'en demeure pas moins que les ROS attaquent les mucopolysacharides et notamment les proteoglycanes du cartilage. Le radical 'OH réagit avec les carbohydrates en enlevant un proton hydrogène d'un atome de carbone formant ainsi un radical carbonicentré. Par ailleurs le glucose peut s'oxyder dans les conditions physiologiques, en présence de traces métalliques, en libérant des cétaldéhydes, H

0

et 'OH; qui entraîneront les coupures de protéines ou leurs glycation par attachement au cétoaldéhyde (conduit chez les diabétiques à la fragilité de leurs parois vasculaires et de leur rétine) (Favier, 2003).

'

1-6-Les radicaux libres sont- ils indispensables à la vie ?

Le paradoxe des radicaux libres en biologie est qu'ils constituent des espèces

extrêmement dangereuses, tout en étant des espèces indispensables à la vie. Ils

remplissent en effet de très nombreuses fonctions utiles qui, à part la phagocytose, ont été

découvertes récemment. Les radicaux libres participent au fonctionnement de certaines

enzymes, à la transduction de signaux cellulaires, la défense immunitaire contre les

agents pathogènes, la destruction par apoptose des cellules tumorales, la régulation de la

dilatation capillaire, la fécondation de l'ovule, l'absorption de l'eau dans le tractus

digestif, la régulation du métabolisme cellulaire et à la modulation de l'expression de

gènes codant pour les enzymes antioxydantes. Chez l'homme, les gènes antioxydants les

plus inductibles par un stress oxydant sont ceux de la SOD à manganèse, de la catalase,

de la thioredoxine et HSP70 alors que ceux de la SOD /Cu-Zn et la glutathion peroxydase

sont peu inductibles. Mais les ROS peuvent ainsi activer des gènes de fonctions

cellulaires autres que ceux de la lutte contre les RL, ceci par l'intermédiaire de facteurs

redox sensibles comme NF-KB qui aboutit à l'activation des gènes impliqués dans la

réponse immunitaire. Ayant besoin d'une certaine quantité d'espèces réactives de

l'oxygène, l'organisme ne cherche pas à les détruire mais à contrôler leur niveau pour

éviter le stress oxydant (Favier, 2003 ; Holgrim, 2003 ; Coline, 2005).

Chapitre U:Systeme de Défense Antioxydant

• Les Défenses Antioxydants

• Mécanisme D'action des Antioxydants

• Systèmes Antioxydants Enzymatiques

• Systèmes Antioxydants Non Enzymatiques

Chapitre// le système de defense antioxydant Dans les conditions physiologiques, l'oxygène élément indispensable à la vie, produit en permanence, au niveau de la mitochondrie, des espèces oxygénées activées (EOA) particulièrement toxiques pour l'intégrité cellulaire. Ces EOA, dont font partie les RL, sont dotées de propriétés oxydantes qui les amènent à réagir dans l'environnement où elles sont produites avec toute une série de substrats biologiques (lipides, protéines, ADN, glucose). Au niveau moléculaire, les EOA peuvent aussi agir comme messagers secondaires et activer différents facteurs ou gènes impliqués dans le développement de diverses pathologies.

Pour se protéger contre cet effet toxique de l'oxygène, l'organisme a développé des systèmes de défense qui permettent de réguler la production des EOA. Ces systèmes sont composés d'antioxydarits (le groupe des vitamines A, C et E) d'oligoéléments et de protéines qui empêcheront le fer de déclencher une production d'EOA, des enzymes protéolytiques dont le rôle consiste à dégrader les substrats oxydés.

11-1- Les Défenses Antioxydantes

L'équilibre entre les effets passifs et négatifs des EOA est donc particulièrement fragile. La production des EOA sera strictement régulée par notre organisme, qui a développé des défenses antioxydantes pouvant le protéger contre les effets potentiellement destructeurs des EOA. Ces systèmes se composent:

- D'enzymes (superoxydes dismutases Cu-Zn et Mn, catalase, glutathion peroxydases, couple thiorédoxine-thiorédoxine réductase, héme oxygénase, heat shock protéines).

- De protéines transporteuses de fer et de cuivre (transferrine, ferritine, céruléoplsmine ).

- De molécules antioxydantes de petite taille (glutathion, acide urique, bilirubime, glucose, vitamine A, C, E, ubiquinone, caroténoïdes, flavonoïdes).

- D'oligo-éléments (cuivre ou zinc, sélénium)

Indispensables pour l'activité des enzymes antioxydantes. Un système de défense

secondaire, composé d'enzymes dont le rôle consiste à empêcher l'accumulation dans la

cellule de protéines ou d'ADN oxydés et à dégrader leurs fragments toxiques, complète la

panoplie des moyens de protection contre les EOA (figure 5) (Pincemail et al ,1999).

Chapitlf'e P -

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OiiÎiN'wll'flmfmt~

Fllf!JMt-k.IONlrt

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le système- de defense antio:Xydant

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OH·

LOOH

FiguO' 5: Rôle central des enzymes antioxydantes dans la cascade oxydante (Fridovicb, 1995).

14

Chapitre Il

11-1-1- Mécanisme d'action des antioxydants

Le maintien d'un niveau cytotoxique de ROS est assuré par des systèmes antioxydants. Un antioxydant peut être défini comme toute substance qui est capable de se combiner avec d'autres substrats oxydables et ainsi en retarder ou empêcher l'oxydation (Mates, 1999; Camhair, 2002; Droge, 2002)

11-1-1-1- Systèmes antioxydants enzymatiques

Les principales enzymes antioxydantes sont : la superoxyde dismutase, la catalase et la glutathion peroxydase. Plus récemment d'autres enzymes ayant des propriétés antioxydantes ont été révélés telles les peroxyredoxines.

a- Les SuperOxydes Dismutases (SOD)

Les son ont été les premières enzymes capables de métaboliser les ROS qui ont été découverts (Cord et al., 1969). Ces enzymes catalysent l'élimination par dismutation des anions superoxydes (Braun & Fridovich, 1980) en faisant apparaître de 1'0

et de l'eau oxygénée H

0

composé stable et moins toxique, ce sont des métallo enzymes au sein desquelles le métal du site catalytique est successivement réduit puis oxydé par O· -

Chez les eucaryotes, deux types de son sont capables de transformer l'anion superoxyde en H202 (Das et al., 1997).

SOD

Oxygen

Oxidized SOD Reduced SOD

Figure 6 : Schéma montrant les formes oxydée et réduite de la SOD /Zn-Cu

Il existe trois isoformes de son chez les mammifères: une forme cytosolique et nucléaire associée aux ions cuivre et Zinc (SOn cyto ), et une forme extramitochondriale associée au manganèse (Son Mn) et une forme extracellulaire (SOn-EC) (Li, 1995). Cette dernière est située sur la face externe de la membrane plasmique. Elle se retrouve dans les espaces interstitiels des tissus et dans les liquides extracellulaires (plasma, lymphe et synovie).

15

Chapitre II le système de defense antioxydant

Si les formes mitochondriales et cytosoliques sont régulées par leurs substrats, la SOD-EC serait régulée par des cytokines plutôt que par les ROS (Mates, 1999). Seul le cuivre participe au processus catalytique, le zinc ne contribuant qu'à la stabilité de l'enzyme. Une production excessive de H

0

qui par l'intermédiaire de OH serait à l'origine d'une intense lipoperoxydation.

La réaction catalysée par la SOD est très efficace, elle n'est donc limitée par le phénomène de diffusion. Dans la mitochondrie, l'anion superoxyde est formé, en relativement, grande quantité au niveau de la chaîne respiratoire. La SOD mitochondriale est induite par le stress oxydant, contrairement à la forme cytosolique, et par la thioredoxine (Das et

1997).

b- La catalase (CAT)

Le résultat de la dismutation par la SOD de l'anion superoxyde étant le H

0

celui-ci est convertit en H

0 à l'aide de la catalase. Cette enzyme est un homodimère de 56 KDa, essentiellement localisé dans les peroxysomes, cette enzyme est présente en forte concentration dans le foie et les globules rouges. Dans le tissu cardiaque il est censé que la catalase existe seulement, au niveau des mitochondries avec une activité très basse par rapport à la glutathion peroxydase (Andreyev et al., 2005 ; Coline, 2005).

La catalase est une enzyme tétramérique, chaque unité portant une molécule d'hème et une molécule de NADPH. La fixation du NADPH par la catalase la protège de l'inactivation et augmente son efficacité (Kirkman et al., 1999). Dans les cellules de mammifères sa principale localisation subcellulaire est le peroxysome, où elle catalyse la dismutation du peroxyde d'hydrogène.

Catalase

2H20 "' H201 + 02

La catalase possède également la propriété de détoxifier différents substrats, tels que les phénols et les alcools, via un couplage avec la réduction du peroxyde d'hydrogène :

Catalase

L'un des rôles antioxydants majeurs de la catalase est donc de diminuer la formation de radicaux hydroxyles (Fridovich, 1999).

c- Glutathion Peroxydase (GPx) et Réductase (GR)

La GPx fait partie d'un système complet qui joue un rôle central dans le mécanisme d'élimination du H

0

Ce système prend en charge des lipides peroxydés. La GPx est l'enzyme clé du système et nécessite la présence du glutathion disulfite (GSSG) qui ainsi produit est à nouveau réduit par la glutathion réductase (GR) qui utilise le NADPH comme donneur d'électron. Le rapport GSH/GSSG est un de l'état d'oxydation dans la cellule (figure 7) (Mates, 1999; Omhaur, 2002) .

. 16

Chapitre Il le système de defense antioxydant

Figure 7 : Elimination du H

0

par les réactions enzymatiques combinées

~

de la GPx et de la GR

La glutathion réductase (GR) focalisée également dans le cytosol et dans les mitochondries, quand à elle, a pour rôle de régénérer le GSH à partir du GSSH. Au cours de cette réaction, la glutathion réductase utilise un cofacteur, le NADPH (Brunet, 1998 ; Andreyev et al., 2005). La NADP+ qui sera régénéré en NADPH pour une utilisation ultérieure par une autre enzyme, la G6PD (Glucose 6- P- Dihydrogénase).

G6PD

NADP+ ----+ NADpB

Au niveau de la mitochondrie, la NADPH est renouvelée par une enzyme appelée isoforme déshydrogénase NADP+ dépendante (Smith et al., 2003 ).

Il existe plusieurs isoformes de GPx contenant du sélénium :

* La GPx cytosolique et mitochondriale, présente dans la plupart des tissus.

* La GPx phospholipide - hydroperoxyde (HPGPx) se trouve dans le cytosol et peut directement réduire les phospholipides hydroperoxydes, et les hydroperoxydes de cholestérol.

* La GPx extracellulaire (Mates, 1999 ; Courhair, 2002).

L'activité de la GPx mitochandriale est la plus haute dans le foie, le rein et le cœur, et s'abaisse légèrement dans la mitochondrie du cerveau et des muscles squelettiques

(Andreyvetal , 2005). "

* ^La Sn GPx (Sperm nucleus GPx) étant la dernière GPx découverte, c'est une scléroprotéine de 34 KDa qui est fortement exprimée dans la condensation chromatique lors de la spermatogenèse et la protection de l'ADN contre les dommages oxydatifs (Pfeifer et al., 2001).

d- Glutathions Transférases (GST) :

Ces enzymes constituent une classe formée d'un très grand nombre d'isoenzymes.

Elles détoxfient un très grand nombre de composés électrophiles (médicaments, agent cancérigènes ... ), en les conjuguant au glutathion réduit. Les conjugués du glutathion formés sont ensuite métabolisés par coupure du glutarate et du glucose, et acétylation du groupe thiol de la cystéine. Les dérivés acides mercapturiques résultants sont excrétés.

Les GST possèdent également une activité peroxydasique vis-à-vis des peroxydes organiques mais, pas vis-à-vis de H

0

(Van Bladeru, 2000) (figure 8).

' 17

---

Chapitr.e II

. NA.DPH

+ H'"'

osso -- --- --- - --

-_ l"bO

/~//'

Figure 8

Différents systè$es anti;oxydants assoc-iés au glutathion (Mates et al,, 1999) •

. e- Les- Peroxyrédoxiaes (PRx)

j.,es · peroxyiredo~~,. ou thioredoxine petoxydas~, ont été· découvertes récemment et

l '.objet . qe ;-nombreux. travàtix .

leurs ronctions antioxydantes (Wood, 2003 ). jElles·~ son~ au · Dombre de 6 cheZ' les mani!!}i. fères eî sont localisées dans le cytosole, les Intt<;>chonôtl~&, ·les peroxysomes, ~sociées au- ~oyau et aux membranes. Ces protéül~~~e~~rc~ilt:l~ur rôl~iantiex)rdâb.t~ dans là : ëellule, ~- travers une activité peroxydase, _ ou J1

©7 ,:l eJ1erqxy.tdtrite· et

dC?"" nomlireux hydroperoxy4es en sont les substrats. Malgré leur -p~~

i'whle'.~'.efli~acité _çâtalytiqù'ê '-par rapport à lai GPx et la CAT, ces protéines poll$i'ent jouer un fôle majeür {fans-l'élimination des l l_lydroperoxydes, du fait de leur qua.D.ti~é : importante (0,1 à 0,8 % des protéines sol~bles cellulaires) et leur large clistribiition dans -la _ cellule, de plus, les PRx joueràî~t un rôlei significatif lors du développement' du poumon et en réponse à un stress oxydant pulmonaire (Kim, 2001 ).

. -

11-1-1-2- Systèmes antioxydants non enzylllatiques

Les antiox.ydants . non · enzymatiques · réagissent -directement avec les agents oxydru)ts et les désactiverit,__ Patmi les antioxydants . non enzymatiques certains sont synthétisées par nos cellules comme le CoQlO; etle glu'tathion. Beaucoup d ' antioxydants sont Cependant de_ s vitamines · qui doivent nécessairement être apportées par l'alimentation, il s:'agit, entre autre, de la vitamine C, de la vitamine E, de carotènes, de la vitamine A et des flavonoïdes. La défense non enzymatique comprend des substances liposolubles (Vitamine E, B, carotène et bilirubines) et des substances hydrosolubles (Vitamine C, glutathion) (Favier, 2003; Laurent, 2004).

a- °L(.Glutathion

Le

est un tripeptide simple . (L y-GluUµnyl- Cystéinyl- glycine) présent dans toute les cellules· des mammifères, et dans un grand- nombre de types cellulaires chez les autte_ s espèces animales, les propriétés du glutathidn sont principalement due à la présence du groui:»ement foâcâonriel sulfhydrile, c'est pourquoi- le glutathion réduit est

~

18

Chapitre li le système de defetise antioxydant

. souvent écrit «,GSH » · et le· glutathion oxydé formé de deux molécules de GSH

« ossp ^{», ·} plus de 90 % du glutathion existe sous la fonne réduite (Peter et al., 2002).

,. ! La' mitocJiondrie contif.mt environ 10 à 12 % ! ^{de .} lif quantité totale du GSH ceUu1d4:e;· mais Yu· le volume telativement petit de la - ~~trioe, la cot)centration en GSH mitôcliondrial' est: dans la gannhe 4e ^{2 à 14 mM~ Ces} cù~centrations changent selol). _ l'état,

1 . ; . 1

l'âge ÎHe tissu mé~ho1ique~ La ~ochon<l?e est dépoUfU~ des e~~s nécessaires à la

synthè~e

de ce · peptide, le GSH nutochondrial est donc ttanSporté a partir 4u cytosol et ce en util~sant_ plus'~eµrs systèmes de transport, tels que les !transporteurs spécialisés à faible e_t à h'aute affinité et les porteurs, dicarboxyliques et ·2 ox()glutarate {Andryev et al., 200, S).'

J Le. GSH est coil~idé~é ^{comme le} principale . ~tioxygant ^{propre à} la cellule en se liant dJrectenierit par son pôle : SH aux :radicaux libres,

il est principalement utilisé

comm~ ~~_µbstrat

' de,

glutathion peroxydase et

donc.· l'élimination du peroxyde - d'~gène · et ·des hydropétÎoX:ydes, prévenant ainsi ! la peroxydation lipidique, une

/déPfé~on

du.

·est létale alors que qelle du cytosol n'affecte pas la

· · variabilités cèUulal.re (Brunet, 1'999 ; Andryev et al., 2005).

Le méfàbolisîne: ét les· fonctions antioxydantes du GSH s~>Iit représentés dans la figure 9.

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:Figure 9 : MétabalisÙie et fonctio11s antio~dantes du GSH dans la cellule (Martin, 2003).

b· Les vitamines

• La vitamine E :

La vitamine E ou a Repèrfusion : repère : marque qui permet de se

retrouver ou de s'y retrouver.

'

-tncophérol est fi~ée aux membranes et stoppe la · chaîne de réaction de peroxydation des UpideS'. en capturant un radical lipidique peroxyde (LOO•).

- ' 19

Chapitr.f!

il le système de defense antioxydant . La viufmine E devi~nt alors à son tour un radical,. me~- réactif que le LOO~, qui pourra être priS e11 charge par ,·up.e autre molécule antioxydante. Cependant, à forte concentration, la vitahmle E oxydée peu faire office de molécule prb~oxydante, fi~ 10 (Cillard,

1 '

1980) . .

• La vitamine-C :

Peut

1'0

Cette vitamine pourrait ' aussi avoir des propriétés pro- oxydarttes, figure 10 (Cillard, 1'980)~

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Fig~re :ro· : · Exe•pl~ ^de réaction~ ·antioxrdantes ^{en chatne}

_ .. mëttant en jeu les vitamines Eet C (Cillard, 1980).

. . '

iA ces deux vitalnines nous: pouvons-ajauter de:ncl>mbreux autres antioxydants non enzytajitiques (ex : B - carotène, urate, gluèosé, bilirubine, taurine, albumine ... ).

, i~and_, I,e;. fm~le équij.ibre .e~tre· production· et ~~ati~n des RO~ ~st perturbé, le

surplus

des b1omolécules co111lne·

protémes, les lipides et l' ADN,

c~ qui J : péut.avak un- impact iinportabt sur le fonctionrlement cellulaire figure 11 (Pré,

-1992). i ... . . . '

1 . - " .

HlbH\

HADJ

Figure 11

Positionnemènt du CoQ ou . ubiquinone (UQ) dans le transport des électrons de la chaînes - respiratoire mitochondriale (Pincemail et al., 1999) •

. . 20-

Chapitre II le système de defense antioxydant

c-L'Ubiquinone ou le CoQ:

L'ubiquinone est connu pour son rôle vital dans la production d'énergie. Il transfert les électrons entre le complexe I et le complexe III de la mitochondrie (figure 11 ). Il possède également des propriétés antioxydantes intéressantes en protégeant les protéines et les lipides des membranes mitochondriales et cellulaires contre la propagation de la peroxydation lipidique tandis que la vitamine E inhibe seulement la peroxydation. L'étude du rapport CoQ H

CoQ est nécessaire pour évaluer l' importance de CoQ La protection contre l'agression par les ROS (Achon et al., 2000 ; Aurousseau, 2004).

•

d- Le Cytochrome c :

' L'espace intermembranaire contient 0,7 mm de cytochrome C (Cyt c) qui peut être réduit alternativement par les électrons de la chaîne respiratoire ou par le superoxyde. Vu le rôle antioxydant du Cyt c , la perte de ce dernier conduit à une production massive des ROS dont la relation exacte entre eux reste à être élucidée (Atlante et al. , 1995 ; Andreyev et al.,2005).

e-LeNADPH:

Quelques auteurs présument que le NADPH peut servir comme antioxydant non enzymatique direct. Les mitochondries des mammifères contiennent des concentrations élevées du NADPH (environs 3-5 mm de chacun), qui en captent les radicaux centrés de l'oxygène, empêchent les dommages aux protéines et à l'ADN mitochondrial (Andreyev et al., 2005).

f- Les Flavonoïdes et les p-Carotènes :

L'activité antioxydante des flavonoïdes a été décrite par Kandsuvami et Middleton. La béta-carotène « la provitamines » et un piégeur d'oxygène singulet ; une seule molécule peut inactiver des centaines de molécules de ce dernier (Middleton &

Kandaswami, 1992 ; Belizzi, 1994 ). De nombreuses molécules, à savoir la transferrine, la céruloplasmine et l'albumine, la lactoferrine et bien d'autres, permettent de chélater les métaux de transition impliqués dans la formation de radicaux hydroxyles alors des réactions concomitantes de Haber-Weis et Fenton. Elles sont réparties dans l' organisme et permettent de diminuer la production des radicaux libres (Demoffarts et al., 2005).

g- L' Acide Urique :

Produit terminal majeur du métabolisme des purines, possèdant une activité antioxydante majeur, il peut interagir à concentration physiologique, avec les ROS et notamment en piégeant 1'0°"

et OH, il apparaît comme étant l'antioxydant plasmatique le plus efficace en terme de réactivité avec les ROS, toutefois, il n'est pas actif contre les radicaux lipidiques (Krinsky, 1992)

21

Chapitre Il le système de defense antioxydant

ID-1-1-3- Les Oligo-Élements:

a- Le Fer et le Cuivre :

Le fer et le cuivre sous forme libre étant particulièrement promoteurs de dommages radicalaires, ces métaux sont physiologiquement séquestrés et transportés grâce à des protéines dites chélateurs des ions, comme la transferrine, la ferritine, la lactoferrine, la ceruloplasmine et l'albumine ... qui agissent en tant qu'antioxydants primaires (Buettner & Juriewicz, 1996 ; Herbert et al., 1996).

b- Les autres oligo-éléments :

"

Les oligo-éléments qui ont une ongme nutritionnelle (zinc, sélénium, magnésium .... ) participent au processus de défense contre les ROS comme cofacteurs d'enzymes antioxydants.

Le déficit en un ou plusieurs de ces éléments résulte généralement en une sensibilité plus accrue au stress oxydant et au développement des maladies liées aux radicaux libres.

Ces antioxydants sont complétés par l'apport alimentaire d'autres substance telles, les caroténoïdes et les flavonoïdes essentiellement. Il en résulte, grâce à ces agents protecteurs une certaine tolérance de l'organisme vis-à-vis du stresse oxydatif (Brunet,

1999) figure 12.

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Albumine,

ur;que

Figure 12 : Les étapes de la formation des radicaux libres oxygénés (ROS), enzymes et antioxydants endogènes intervenant dans leur neutralisation

(Pincemail & Olivier, 2003)

22

• Mesure des Dérivés de la Peroxydation des Lipides.

• Mesure de l'Oxydation des Protéines.

• Mesure de l'Oxydation del' ADN.

• L' Analyse des Antioxydants et Oligoéléments.

Chapitre III Evaluation du stress oxydatif Le stress oxydant aboutit à une attaque des composés cellulaires. Les molécules biologiques peuvent soit être oxydées sur des sites spécifiques, soit clivées ou au contraire polymérisées par l'effet direct des radicaux oxygénés. Mais elles peuvent aussi subir l'attaque chimique des composés issu de l'oxydation des lipides (peroxydes ou aldéhydes) créant les composés d'addition. Les composés sont eux même antigéniques et leur apparition sera responsable de la formation d'auto-anticorps; l'oxydation des protéines et l'oxydation de l' ADN.

Toutes ces lésions de composés biologiques sont utilisables pour évaluer un stress oxydant (Slater, 1984). Un très grand nombre de techniques (Montagnier et al., 1996;

Pryor et Godber, 1991) sont actuellement disponibles pour explorer le stress oxydant, qui ont fait l'objet d'ouvrages de synthèse auxquels le biologiste pourra se référer (Favier &

al., 1995; Greenwald, 1995) (figure: 13) .

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Figure 13: Méthodologies permettant d'évaluer l'état de stress oxydatif (Pincemail et al., 1999).

ill-1 Mesures des dérivés de la peroxydation des lipides:

Dans le sang, les diènes conjugués, les hydroperoxydes (Rida et al., 1994 ). Et surtout les aldéhydes peuvent être mesurés. Les alcanes (éthane, pentane) résultant de cette peroxydation sont éliminés par voie pulmonaire et peuvent être mesurés après recueil des gaz respiratoires, des malades. La mesure des gaz respiratoires si elle est intéressante pour mesurer un stress brutal, elle présente autant d'artefacts que les autres paramètres (Kneepens et al., 1994 ). Une augmentation du pentane exhalé a été observée chez les fumeurs, après infarctus, dans la démence d'Alzheimer ou lors d'arthrite rhumatoïde.

La mesure des aldéhydes peut être réalisée globalement par réaction avec l' acide thiobarbiturique sous le nom de dosage des TBARS (thiobarbituric acide réactant substances) se terminant par une mesure de la coloration du conjugué. Des aldéhydes

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