Exploration du potentiel antimicrobien et antioxydant de la Propolis d’Algérie.

(1)

FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE

THESE

Présentée à

L’Université Abdelhamid Ibn Badis-Mostaganem Spécialité : Nutrition humaine.

Pour l’obtention du titre de DOCTEUR EN SCIENCES De l’université de Mostaganem

Par

Mokhtaria Yasmina Boufadi

Exploration du potentiel antimicrobien et antioxydant

de la Propolis d’Algérie.

Soutenu le 26 Juin 2014 devant le jury d’examen composé de :

Président : Mr Lotmani Brahim, Professeur à l’univ. Mostaganem. Rapporteur : Mr Riazi Ali, Professeur à l’univ. Mostaganem.

Examinateurs : Mr Benali Mohamed, Professeur à l’univ. Sidi-Bel-abbès. Mr Slimani Miloud, Professeur à l’univ. Saida.

Mme Merzoug Hafida, Professeur à l’univ. Tlemcen. Melle Belhoucine Mansouria, MCA à l’univ. Mostaganem.

(2)

Dédicaces

Je dédie ce modeste travail à mes parents qui m’ont tout donné sans rien attendre en retour…, à mon défunt grand père, à mon adorable grand-mère, à ma sœur Fatima et mon adorable frère Mohamed, et ma tante Mokhtaria, ainsi toute ma famille.

A mon meilleur et cher ami F.L qui m’a encouragé durant ces 5 années d’études, sans lui je n’en serais pas là.

A tous mes ami(e)s.

Ce travail est également dédié à tous ces anonymes de l’ombre dont je me sens tellement proche…

Yasmina

,

(3)

Avant-propos

La présente thèse a été réalisée conjointement au sein du Laboratoire des Microorganismes Bénéfiques, des Aliments Fonctionnels et de la Santé (LMBAFS) de l’Université Abdelhamid Ibn Badis à Mostaganem, du Laboratoire de Chimie Pharmaceutique Organique (CPO) de l’Université Libre de Bruxelles (ULB), et du Laboratoire de Médecine Expérimentale, CHU de Charleroi, Belgique.

J’aimerais en tout premier lieu adresser ma plus sincère gratitude à mon directeur de thèse, Mr A. Riazi, Professeur à l’université de Mostaganem, un homme de science passionné, dévoué et perspicace qui a à cœur la formation et la réussite de ses disciples. Mille mercis pour votre soutien, vos conseils, votre enseignement et votre confiance inébranlable.

En dépit de la grande responsabilité scientifique et administrative qu’il assure, le Professeur B. Lotmani de l’université de Mostaganem, a accepté de présider mon jury de soutenance ; qu’il trouve ici l’expression de mes plus vifs remerciements.

J’exprime ma gratitude au Professeur M. Benali de l’université Djillali Liabes à Sidi Bel Abbès pour son aide matérielle précieuse, ses conseils opportuns et sa disponibilité.

Je suis très honorée par la participation de Professeur M. Slimani de l’université Moulay Tahar de Saida à mon jury d’examen malgré le temps restreint dont il dispose. Ses critiques sont fortement souhaitées et très attendues.

Je remercie également Mme H. Merzouk, Professeur à l’université Abou bakr Belkaid à Tlemcen, d’avoir aimablement accepté d’apporter ses critiques à ce travail.

Mes vifs remerciements sont également adressés au Dr M. Belhocine, Maître de conférences de classe A à l’université Abdelhamid Ibn Badis de Mostaganem, pour avoir accepté d’examiner mon travail.

(4)

Mes remerciements les plus forts sont adressés à J. Nève, P. Van Antwerpen et J. Soubhye , Professeurs à l’université Libre de Bruxelles (Belgique), pour m’avoir accueillie au sein de leurs laboratoires. Je les remercie également pour leur aide morale et la mise à ma disposition de tous les moyens dont ils disposent.

Je tiens à remercier également le Dr N. Djennas, Médecin spécialiste en Anatomie-pathologie à l’hopital Nafissa Hamoudi (ex-Parnet) d’Alger pour l’étude histo-pathologique.

Mes remerciements sont adressés à Philippe Stroot (PhD Biosécurité à Tournai, Belgique) pour son aide morale, matériellle, et ses encouragements.

J’adresse mes vifs remerciements aux personnels du laboratoire de Biotoxicologie (Université Djillali Liabes de Sidi Bel Abbès) et du laboratoire de toxicologie et d’anatomie de l’hôpital Maillot à Alger.

J’adresse un petit clin d’œil de remerciements à mes collègues du laboratoire des Microorganismes Bénéfiques, des Aliments Fonctionnels et de la Santé (LMBAFS) de l’université de Mostaganem.

Un grand merci est, également, adressé à tous ceux qui m’ont aidé de près ou de loin à mener à bien ce travail.

Mostaganem le 01 Juin2014 Yasmina

(5)

Liste des abréviations

·NO : oxyde nitrique ou monoxyde d'azote. ADN: Acide Désoxyribonucléique

AlCl3 : Chlorure d’aluminium

CAPE : Caffeic Acid 2-Phenylethyl Ester CAT : Catalase

CCl4: trichlorure de carbone. CE50 : Concentration Effective

CG-MS : Chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse CMI : Concentration Minimale Inhibitrice

CML: Cellules Musculaires Lisses DIP : Dichlorophénol-indophénol. DPPH : 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl EAG : Equivalent Acide Gallique

EAP : Extrait d’Acétate d’éthyle de la Propolis EDTA : Acide Ethylène-Diamine-Tétra-Acétique. EEP : Extrait Éthanolique de la Propolis

EOR : Espèces Oxygénées Réactives EQ : Equivalent Quercétine

ESI : Electrospray ionization GR : glutathion réductase. GSH : Glutathion réduit

GSH-PX : glutathion peroxydase. GSSG : glutathion oxydé.

H : heure.

H2O2 : Peroxyde d’hydrogène. H2SO4: Acide sulfurique. Hb : Hémoglobine

HbA1C : Hémoglobine glyquée HCl: Chlorure d’hydrogène.

(6)

HCLO : Acide hypochloreux HDL: High Density Lipoprotein HK: Hexokinase.

HO·: radical hydroxyle.

HPLC : Chromatographie en phase liquide à haute performance kg : kilogramme

LBA: Lavage Broncho-alvéolaire

LC-MS: Liquid chromatography–mass spectrometry.

LC-MS/MS: Liquid Chromatography Coupled to tandem Mass Spectrometry LDH: Lactate Déshydrogénase.

LDL: Low Density Lipoproteins.

LDL-Mox : Low-density lipoprotein oxydé log : Logarithme.

LP : Lympho Plasmocutaire LPO : lipoperoxides.

M.S : Matière Sèche.

m/z : masse/charge du pic moléculaire MDA : Malondialdehyde

MDH : Malate Déshydrogénase.

mg EG/g MS : milligramme équivalent glucose/ gramme de matière sèche. mg : milligramme min : minute ml : millilitre ml : millilitre mM : milimolaire mmol : milimole MnCl2 : chlorure de manganèse

Mn-SOD : superoxyde dismutase à manganèse MPO : Myéloperoxydase

Ms : masse molaire

NAD : nicotinamide adénine dinucléotide

(7)

NADPH: Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate. NIH: National Institutes of Health.

nm: nanomètre. nmol: nanomole. NO : Oxyde Nitrique

NOS: oxyde nitrique synthase ou monoxyde d'azote synthase. O2·ˉ: anion superoxyde.

OH : ion hydroxyde.

OMS: Organisation Mondiale de la Santé. ONOO- : peroxynitrite.

P/V : poids / volume.

PBS : Phosphate Buffered Saline PEG: Polyéthylène Glycol. pH : potentiel d’hydrogène. ppm : Particules Par Million. R·: Radical peroxyle.

ROS: Reactive Oxygen Species. rpm: Rotation Par Minute. RSA : Activité anti-radicalaire Rt : Temps de Rétention

SAB: Sérum Albumine Bovine. SD: déviation standard.

SOD : Superoxyde Dismutase TBA : Acide Thiobarbiturique.

TBARS : Thiobarbituric Acid Réactives Spaces TCA: Trichloroacetic Acid

TG : Triglycérides

TGO: Transaminase Glutamate Oxaloacétate TGP: Transaminase Glutamate Pyruvate TiOSO4: Titanium Oxyde Sulfate. TMP : Tétraméthoxypropane. TRX : Thiorédoxine

(8)

U/cg Hb : Unité/ centigramme d’hémoglobine. U/mg Hb: Unité/milligramme d’hémoglobine. UFC : Unité Formant Colonie

UV: Ultra-Violet.

UV-VIS : Ultraviolet-Visible. v/v: volume / volume.

(9)

Liste des tableaux et figures

Liste des tableaux

Partie bibliographique

Page

Tab. 1 Composition moyenne de la propolis 5

Tab. 2 Composition chimique fine de la propolis (Alencar et al., 2007) 6 Tab. 3 Les effets du stress oxydant sur les structures moléculaires (Weber, 2011) 14

Partie expérimentale

Partie matériels et méthodes T

ab. 4 Les différents échantillons de la propolis utilisés dans ce travail

2 9 T

ab. 5 Les différents types de milieux de culture

5 0

Partie résultats et discussion T

ab. 6

Les composés trouvés dans les différentes fractions de propolis (EAP1) obtenus par HPLC préparative. L'identification a été réalisée par LC-MS/MS comparant les masses avec une base de données.

5 7 T

ab. 7

Concentrations en polyphénols totaux et en flavonoïdes, activité anti-radicalaire et pouvoir de piégeage de la myéloperoxydase (MPO) des fractions HPLC obtenues à partir des extraits d’acétate d’éthyle de propolis de Tigzirt (EAP1) et de Yennarou (EAP4).

6 1

T ab. 8

Concentration efficace 50% (CE50) d’inhibition de l’activité anti-radicalaire (RSA) et de la Myéloperoxydase (MPO) des extraits éthanoliques et d’acétate d’éthyle de la propolis. La CE50 de l’activité anti-radicalaire de l’acide ascorbique est égale à 3.1 ± 0.2 µg/mL.

6 7

T ab. 9

Concentrations effectives 50 (CE50) des composés purs trouvés dans les fractions HPLC les plus actives sur la myéloperoxydase (MPO) par rapport à leur concentration dans l'extrait d'acétate d'éthyle de Tigzirt (1 mg d'EAP/ mL) et de leur concentration extrapolée à la concentration CE50 de l'extrait d'acétate d'éthyle de Tigzirt (21 µg/mL).

7 2

T Diamètres des zones d’inhibitions (mm) de quatre souches pathogènes (S1 :

(10)

ab. 10 Shigella sonnei CECT 584 et S4 : Escherichia coli ATCC 11230) et réaction de

deux souches bénéfiques (S5 : Lactobacillus rhamnosus LBRE-LSAS et S6 :

Bifidobacterium animalis ssp lactis Bb12) cultivées en présence de six

concentrations (2, 5, 10, 20, 40 et 60%/ P/V) de six extraits d’acétate d’éthyle de propolis de différentes régions d’Algérie.

06

T ab. 11

Cinétique d’amélioration (exprimée en % d’augmentation des cellules) ou d’inhibition (exprimée en % de réduction des cellules) de la viabilité de

Staphylococcus aureus ATCC 25923 en présence de différentes concentrations

des six extraits d’acétate d’éthyle de la propolis à 37°C. Les valeurs représentent la moyenne de 3 déterminations ± SD (n=3).

1 13

T ab. 12

Vitesse de croissance (exprimée en log de cellules générées/h) ou d’inhibition (exprimée en log de cellules inhibées/h) de Staphylococcus aureus ATCC 25923 en présence de différentes concentrations des six extraits d’acétate d’éthyle de la propolis à 37°C. Les valeurs représentent la moyenne de 3 déterminations ± SD (n=3).

1 15

T ab. 13

Cinétique d’amélioration (exprimée en % d’augmentation des cellules) ou d’inhibition (exprimée en % de réduction des cellules) de la viabilité de Shigella

dysenteriae CECT 524 en présence de différentes concentrations des six extraits

d’acétate d’éthyle de la propolis à 37°C. Les valeurs représentent la moyenne de 3 déterminations ± SD (n=3).

1 18

T ab. 14

Vitesse de croissance (exprimée en log de cellules générées/h) ou d’inhibition (exprimée en log de cellules inhibées/h) de Shigella dysenteriae CECT 524 en présence de différentes concentrations des six extraits d’acétate d’éthyle de la propolis à 37°C. Les valeurs représentent la moyenne de 3 déterminations ± SD (n=3).

1 20

T ab. 15

Cinétique d’amélioration (exprimée en % d’augmentation des cellules) ou d’inhibition (exprimée en % de réduction des cellules) de la viabilité de Shigella

sonnei CECT 584 en présence de différentes concentrations des six extraits

d’acétate d’éthyle de la propolis à 37°C. Les valeurs représentent la moyenne de 3 déterminations ± SD (n=3).

1 24

T ab. 16

Vitesse de croissance (exprimée en log de cellules générées/h) ou d’inhibition (exprimée en log de cellules inhibées/h) de Shigella sonnei CECT 584 en présence de différentes concentrations des six extraits d’acétate d’éthyle de la propolis à 37°C. Les valeurs représentent la moyenne de 3 déterminations ± SD (n=3).

1 26

T ab. 17

Escherichia coli ATCC 25922 en présence de différentes concentrations des six

extraits d’acétate d’éthyle de la propolis à 37°C. Les valeurs représentent la moyenne de 3 déterminations ± SD (n=3).

1 30

T ab. 18

Vitesse de croissance (exprimée en log de cellules générées / h) ou d’inhibition (exprimée en log de cellules inhibées/h) d’Escherichia coli ATCC 11230 en présence de différentes concentrations des six extraits d’acétate d’éthyle de la

1 32

(11)

propolis à 37°C. Les valeurs représentent la moyenne de 3 déterminations ± SD (n=3).

T ab. 19

Lactobacillus rhamnosus LbRE-LSAS en présence de différentes concentrations

des six extraits d’acétate d’éthyle de la propolis à 37°C. Les valeurs représentent la moyenne de 3 déterminations ± SD (n=3).

1 36

T ab. 20

Vitesse de croissance (exprimée en log de cellules générées / h) ou d’inhibition (exprimée en log de cellules inhibées / h) de Lactobacillus rhamnosus LbRE-LSAS en présence de différentes concentrations des six extraits d’acétate d’éthyle de la propolis à 37°C. Les valeurs représentent la moyenne de 3 déterminations ± SD (n=3).

1 38

T ab. 21

Bifidobacterium animalis ssp lactis Bb12 en présence de différentes

concentrations des six extraits d’acétate d’éthyle de la propolis à 37°C. Les valeurs représentent la moyenne de 3 déterminations ± SD (n=3).

1 41

T ab. 22

Vitesse de croissance (exprimée en log de cellules générées / h) ou d’inhibition (exprimée en log de cellules inhibées/h) de Bifidobacterium animalis ssp

lactis Bb12 en présence de différentes concentrations des six extraits d’acétate

d’éthyle de la propolis à 37°C. Les valeurs représentent la moyenne de 3 déterminations ± SD (n=3).

1 43

Listes des figures

Partie bibliographique

Fig. 1 propolis brute (photo de nos échantillons) 3

Fig. 2 Origine des différents radicaux libres oxygénés et espèces réactives de l’oxygène impliqué en biologie(Favier, 2003)

12

Fig. 3 Mode d’action des principaux systèmes enzymatiques antioxydants et de leurs

cofacteurs métalliques d’après (Matés, 1999)

17

Fig. 4 Formation de la plaque athéroscléreuse: vue générale et détail des étapes (CS : cellules spumeuses ; CML : cellules musculaires lisses ; LDL : Low Density Lipoprotein ; LDLox : LDL oxydée ; Lip: lipides ; PG : protéoglycanne ; TC : tissu conjonctif) (Cohen, 1997)

21

Fig. 5 Formation des composés I, II et III de l’oxydation de la myéloperoxydase par

H2O2 (Burner et al., 2000)

(12)

Partie expérimentale

Fig. 6 Protocole d’extraction et de séparation des six échantillons de la propolis (Yang et al., 2011; Bononi et Tateo, 2008)

31

Fig. 7 Structure chimique du radical libre DPPH• (2,2 DiPhenyle-1-Pikryl Hydrazyle) (Blois, 1958)

34

Fig. 8 Les chromatogrammes de quelques composés des factions par LC-ESI en mode positif : A : Chrysine, B : Kaempferol, C : Acacetine, D : Acide cinnamique et E : Acide 3.hydroxy-4- méthoxycinnamique

56

Fig. 9 Teneurs en polyphénols (mg d’équivalent d’acide gallique ou EAG/g propolis)

des différents extraits éthanoliques des six échantillons de propolis (EEP1à 6). Les valeurs représentent la moyenne (m) de 3 déterminations ± SEM (n = 3)

60

Fig. 10 Teneur en polyphénols (mg d’équivalent d’acide gallique ou EAG/g de propolis)

des différents extraits d’acétate d’éthyle des six échantillons de la propolis (EAP1à 6). Les valeurs représentent la moyenne (m) de 3 déterminations ±SEM (n = 3)

60

Fig. 11 Teneurs en flavonoïdes des différents extraits éthanoliques des six échantillons de propolis (EEP 1 à 6). Les valeurs représentent la moyenne (m) de 3 déterminations ±SEM (n = 3).

63

Fig. 12 Teneurs en flavonoïdes des différents extraits d’acétate d’éthyle des six

échantillons de la propolis (EAP 1 à 6). Les valeurs représentent la moyenne (m) de 3 déterminations ±SEM (n = 3).

63

Fig. 13 Teneurs en vitamine C des six échantillons de propolis (P1 à P6). Les valeurs représentent la moyenne (m) de 3 déterminations ±SEM (n = 3).

64

Fig. 14 Pouvoir anti-radicalaire (RSA%) des différentes concentrations 5 (■), 10 (■), 20

(■) et 50 µg/mL (■) des six extraits éthanoliques de la propolis (EEP1-6) et de l’acide ascorbique. Les valeurs représentent la moyenne (m) de 3 déterminations ±SEM (n = 3)

66

Fig. 15 Pouvoir anti-radicalaire (RSA%) des différentes concentrations 5 (■), 10 (■), 20

(■) et 50 µg/ml (■) six extraits d’acétate d’éthyle de la propolis (EAP1-6) et de l’acide ascorbique. Les valeurs représentent la moyenne (m) de 3 déterminations ±SEM (n = 3).

66

Fig. 16 Pourcentage d'inhibition de la peroxydation lipidique des différents extraits éthanoliques et d’acétate d’éthyle de la propolis. ST2 est la présence de l’extrait de propolis à l’intérieur des liposomes (■) ; ST1 représente le milieu réactionnel où l’extrait de propolis a été ajouté après la formation des liposomes et avant l’adition de H2O2 dans la solution (■). Les valeurs représentent la moyenne (m)

de 3 déterminations ±SEM (n = 3).

68

Fig. 17 Pourcentage d'inhibition de la myéloperoxydase (MPO) des six extraits éthanoliques de la propolis (EEP1-6) en présence des différentes concentrations de: 0.5 (■), 1 (■), 2 (■), 5 (■), 10 (■) et 20 (■) µg/mL. Les valeurs représentent

(13)

la moyenne (m) de 3 déterminations ±SEM (n=3).

Fig. 18 Pourcentage d'inhibition de la myéloperoxydase (MPO) des six extraits d’acétate

d’éthyle de la propolis (EAP1-6) en présence des différentes concentrations de : 0.5 (■), 1 (■), 2 (■), 5 (■), 10 (■) et 20 (■) µg/mL. Les valeurs représentent la moyenne (m) de 3 déterminations ±SEM (n = 3)

70

Fig. 19 Corrélation entre la teneur en polyphénols d' des extraits bruts ou des fractions HPLC et l'activité d'inhibition de la MPO. La teneur en flavonoïdes n'est pas corrélée à l'activité d'inhibition de la MPO (R = -0,04, p = 0,82).

71

Fig. 20 Concentrations effectives 50 (CE50) de l’oxydation de LDL-mox (■) et

l’inhibition de la myeloperoxydase MPO (■) en présence de 20 µl des six extraits d’acétate d’éthyle de la propolis (EAP1-6). Les valeurs représentent la moyenne (m) de 3 déterminations ±SEM (n = 3)

73

Fig. 21 Glycémie (g/l) chez les rats traités ou non par l’extrait d’acétate d’éthyle de

propolis de Tigzirt (l’EAP1) et/ou le chlorure d’aluminium (AlCl3). Les valeurs

représentent la moyenne (m) de 5 déterminations ±SEM (n = 5).

G1 : Traités par l’AlCl3 ; G2 : traités par l’EAP1 ; G3 : traités par l’EAP1 et

l’AlCl3 (45 jours) ; G4 : traités par l’EAP1 (30 jours) puis l’AlCl3 (15 j) ; et G5 :

traités par l’AlCl3 (30 jours) puis l’EAP (15 jours)

74

Fig. 22 Taux sériques en hémoglobine glyquée HbA1C (%) chez les rats traités ou non par l’extrait d’acétate d’éthyle de la propolis de Tigzirt EAP1 et/ou l’AlCl3. Les

valeurs représentent la moyenne (m) de 5 déterminations ±SEM (n = 5).

G1 : traités par l’AlCl3 ; G2 : traités par l’EAP1 ; G3 : traités par l’EAP1 et

traités par l’AlCl3 (30 jours) puis l’EAP1 (15 jours).

76

Fig. 23 Cholestérolémie (g/l) chez les rats traités ou non par l’extrait d’acétate d’éthyle

de la propolis de Tigzirt (EAP1) et/ou l’AlCl3. Les valeurs représentent la

moyenne (m) de 5 déterminations ±SEM (n = 5).

78

Fig. 24 Triglycéridémie (TG en g/L) chez les rats traités ou non par l’extrait d’acétate

d’éthyle de la propolis de Tigzirt (EAP1) et/ou l’AlCl3. Les valeurs représentent

la moyenne (m) de 5 déterminations ±SEM (n = 5).

traités par l’AlCl3 (30 jours) puis l’EAP1 (15 jours)

78

Fig. 25 Les teneurs sériques en LDL (g/L) chez les rats traités ou non par l’extrait

d’acétate d’éthyle de la propolis de Tigzirt (EAP1) et/ou l’AlCl3. Les valeurs

l’AlCl3 (45 jours) ; G4 : traités par l’EAP1 (30 jours) puis l’AlCl3 (15 j) ; et G5 : 79

(14)

Fig. 26 Les teneurs sériques en HDL (g/l) chez les rats traités ou non par l’extrait

d’acétate d’éthyle de la propolis de Tigzirt (EAP1) et/ou l’AlCl3. Les valeurs

79

Fig. 27 Urémie (g/L) de rats traités ou non par l’extrait d’acétate d’éthyle de la propolis

de Tigzirt (EAP1) et/ou l’AlCl3. Les valeurs représentent la moyenne (m) de 5

déterminations ±SEM (n = 5).

82

Fig. 28 Créatininémie (g/l) chez les rats traités ou non par l’extrait d’acétate d’éthyle de la propolis de Tigzirt (EAP1) et/ou l’AlCl3. Les valeurs représentent la moyenne

(m) de 5 déterminations ±SEM (n = 5).

84

Fig. 29 Les teneurs sériques en transaminase glutamate oxalate TGO (UI/l) chez les rats traités ou non par l’extrait d’acétate d’éthyle de la propolis de Tigzirt (EAP1) et/ou l’AlCl3. Les valeurs représentent la moyenne (m) de 5 déterminations

±SEM (n = 5).

traités par l’AlCl3 (30 jours) puis l’EAP1 (15 jours)

86

Fig. 30 Les teneurs sériques en transaminase glutamate pyruvate TGp (UI/l) chez les rats traités ou non par l’extrait d’acétate d’éthyle de la propolis de Tigzirt (EAP1) et/ou l’AlCl3. Les valeurs représentent la moyenne (m) de 5 déterminations

±SEM (n = 5).

86

Fig. 31 Albuminémie (g/L) de rats traités ou non par l’EAP1 et/ou l’AlCl3. Les valeurs

88

Fig. 32 Concentrations plasmatiques en MDA (Mm/L) chez les rats traités ou non par l’extrait d’acétate d’éthyle de la propolis de Tigzirt (EAP1) et/ou l’AlCl3. Les

(15)

Fig. 33 Teneurs érythrocytaires de la catalase (U/mg Hb) chez les rats traités ou non par l’EAP1 et/ou l’AlCl3. Les valeurs représentent la moyenne (m) de 5

92

Fig. 34 Teneurs érythrocytaires en superoxyde dismutase SOD (U/cg Hb) chez les rats mâles traités ou non par l’extrait d’acétaté d’éthyle de propolis de Tigzirt (EAP1) et/ou l’AlCl3. Les valeurs représentent la moyenne (m) de 5

94

Fig. 35 Teneurs érythrocytaires en Glutathion peroxydase GSH-PX (U/g Hb) chez les rats mâles traités ou non par l’extrait d’acétate d’éthyle de la propolis de Tigzirt (EAP1) et/ou l’AlCl3. Les valeurs représentent la moyenne (m) de 5

95

Fig. 36 Teneurs plasmatiques en thiols (mM/L) chez les rats mâles traités ou non par l’extrait d’acétaté d’éthyle de propolis de Tigzirt (EAP1) et/ou l’AlCl3. Les

97

Fig. 37 Coupes histologiques de foie des rats du groupe : (T) : témoins; (1) traités par l’AlCl3 ; (2) traités par l’extrait d’acétate d’éthyle de la propolis de Tigzirt

(EAP1) ; (3) : traités par l’EAP1 et l’AlCl3 ; (4) : traités par l’EAP1 (30 jours) et

l’AlCl3 (15 j), et (5) : traités par l’AlCl3 (30j) et l’EAP1 (15j).

DGH : dégénérence granulaire des hépatocytes ; C : Congestion ; N : Nucléoles ; ILP : Infiltrat lympho-plasmocytaire ; HN : Hépatocyte normale.

99

Fig. 38 Coupes histologiques des reins des rats du groupe : (T) : témoins; (1) traités par l’AlCl3 ; (2) traités par l’extrait d’acétate d’éthyle de la propolis de Tigzirt

G : Glomérules ; ILP : Infiltrat lympho-plasmocytaire ; GNI : Gloméro-néphrite interstitielle ; GN : Glomérules normaux ; MM : Elargissement de la matrice mésangiale ; TUO : Tubes urinifères œdémateux ; II : infiltrat inflammatoire ;

(16)

TUD : Tubes urinifères distendu ; K : Kistisation ; CY : Corps yalin.

Fig. 39 Coupes histologiques des poumons des rats du groupe : (T) : témoins; (1) traités par l’AlCl3 ; (2) traités par l’extrait d’acétate d’éthyle de la propolis de Tigzirt

AN : Alvéolites Normales ; AM : Alvéolites macrophagiques ; A : Alvéolites ; P : Pneumocytes ; ILP : Infiltrat lympho-plasmocytaires ; BT : Bronchioles terminales.

103

Fig. 40 Concentrations minimales inhibitrices (CMI en mg d’extrait d’acétate d’éthyle

de propolis/mL) des souches pathogènes et réaction des souches bénéfiques.

110

Fig. 41 Cinétique de croissance de Staphylococcus aureus ATCC 25923 en présence de 0 (■), 2 (■), 5 (■), 10 (■), 20 (■), 40 (■) et 60 (■) des extraits d’acétate d’éthyle des différentes propolis (EAP1, EAP2, EAP3, EAP4, EAP5 et EAP6) durant 24h de culture à 37°C. Les valeurs représentent la moyenne de 3 déterminations ± SD (n=3).

112

Fig. 42 Cinétique de croissance de Shigella dysenteriae CECT 524 en présence de 0 (■), 2 (■), 5 (■), 10 (■), 20 (■), 40 (■) et 60% (■) des extraits d’acétate d’éthyle des différents propolis (EAP1, EAP2, EAP3, EAP4, EAP5 et EAP6) durant 24h de culture à 37°C. Les valeurs représentent la moyenne de 3 déterminations ± SD (n=3).

117

Fig. 43 Cinétique de croissance de Shigella sonnei CECT 584 en présence de 0 (■), 2 (■), 5 (■), 10 (■), 20 (■), 40 (■) et 60 (■) des extraits d’acétate d’éthyle des différentes propolis (EAP1, EAP2, EAP3, EAP4, EAP5 et EAP6) durant 24h de culture à 37°C. Les valeurs représentent la moyenne de 3 déterminations ± SD (n=3).

123

Fig. 44 Cinétique de croissance d’Escherichia coli ATCC 25922 en présence de 0 (■), 2

(■), 5 (■), 10 (■), 20 (■), 40 (■) et 60 (■) des extraits d’acétate d’éthyle des différentes propolis (EAP1, EAP2, EAP3, EAP4, EAP5 et EAP6) durant 24h de culture à 37°C. Les valeurs représentent la moyenne de 3 déterminations ± SD (n=3).

129

Fig. 45 Cinétique de croissance de Lactobacillus rhamnosus LbRE-LSAS en présence de 0 (■), 2 (■), 5 (■), 10 (■), 20 (■), 40 (■) et 60% (■) des extraits d’acétate d’éthyle de s différentes propolis (EAP1, EAP2, EAP3, EAP4, EAP5 et EAP6) durant 24h de culture à 37°C. Les valeurs représentent la moyenne de 3 déterminations ± SD (n=3).

135

Fig. 46 Cinétique de croissance de Bifidobacteruim lactis Bb12 en présence de 0 (■), 2 (■), 5 (■), 10 (■), 20 (■), 40 (■) et 60% (■) des extraits d’acétate d’éthyle des différentes propolis (EAP1, EAP2, EAP3, EAP4, EAP5 et EAP6) durant 24h de culture à 37°C. Les valeurs représentent la moyenne de 3 déterminations ± SD (n=3).

(17)

Résumé

Cette étude vise la détermination de la composition chimique, du pouvoir d’inhibition de l’enzyme myéloperoxydase et de la peroxydation lipidique ; ainsi de l’effet antimicrobien de la propolis récoltée de différentes régions d’Algérie (Tigzirt, Ouled Ali, Ain-El-Arba, Yennarou, Ain Ouassara et Ksar El Hirane). L’extrait d’acétate d’éthyle de la propolis de Tigzirt a montré les meilleures propriétés biologiques in vitro (activité antioxydante, inhibition de la MPO et de l’oxydation des LDL) et a été, pour cette raison, retenu pour l’expérience in Vivo.

Des souris mâles (n = 30) ont été soumises à un stress oxydatif au chlorure d’aluminium (34 mg/kg d’AlCl3 pendant 45 jours) et traitées 45 jours avec des extraits d’acétate d’éthyle de propolis de Tigzirt (EAP1) en vue de réparer les dommages causés par l’oxydation sur l’homéostasie et l’état du foie, des poumons et des reins. Les résultats de l'inhibition de la MPO des différents extraits, ont montré que l’extrait EAP1 a la plus forte activité d'inhibition de cette enzyme, avec une concentration d’inhibition de 50% de l’activité enzymatique (IC50) de 6.95 µg/mL. L’identification des fractions HPLC de l’EAP1 par LC/MS montre la présence de composés polyphénoliques, d’acides oléique, cinnamique et ses dérivés, de tyrosol, et de nombreux flavonoïdes (chrysine, galangine, pinocembrine, quercétine, génistéine et tectochrysine). L’effet de l’extrait de propolis sur le stress oxydatif apparait chez les rats traités par la dose de 50 mg de propolis/kg de poids vif dans la mesure où il y a une amélioration de leur profil lipidique illustrée par une baisse significative (P<0.05) de la cholestérolémie à 1.38 g/L et de la triglycéridémie à 0.37 g/L. Les perturbations de l’homéostasie (augmentation de la cholestérolémie, triglycéridémie, LDL-émie, transaminases TGO et TGP, créatinémie, urémie) et les dommages occasionnés aux organes (foie, rein et surtout poumons) par le stress oxydatif ont été réparés par l’administration de propolis. Le potentiel inhibiteur des différents EAP est variable eut égard à leur CMI comprise entre 0.35 à 4.25 mg d’extrait sec/mL ; excepté celle trouvée pour Escherichia coli qui s’est avérée être la plus élevée (supérieure 5 mg/mL). Les souches les moins sensibles aux EAP sont les bactéries bénéfiques. Ces résultats montrent que la propolis renferme des substances à activité antimicrobienne avérée et constituent un prélude à des investigations visant à l’habilitation de cette substance d’abeille comme source potentielle d’agents antimicrobiens à débouchés multiples.

Mots clefs : Propolis- composés phénoliques-antioxydant-myéloperoxydase-Homéostasie - Activité antimicrobienne.

(18)

Abstract

The aim of this study is to determine chemical composition, myeloperoxydase (MPO) and lipid peroxidation inhibition and the antimicrobial activity of propolis harvested in different areas in Algeria (Tigzirt, Ouled Ali, Ain-El-Arba, Yennarou, Ain Ouassara and Ksar El Hirane). Propolis ethyl acetate extract exibit the best biological properties in vitro (antioxidant activity, inhibition of MPO and LDL oxidation) and was investigated in vitro for that purpose. Thirty male rats were subjected to oxidative stress using aluminium chloride (34 mg AlCl3/kg during 45 days) and 45 days treated with ethyl acetate extracts of Tigzirt propolis (EAP1) in order to restore the oxidative damage of homeostasis and organs such as liver, kidney and lung. The obtained results have shown that EAP1 extract of propolis exibit the highest myeloperoxidase inhibition. The 50% inhibition of the enzyme activity (IC50) was obtained with a EAP1 concentration of 6.95 μg/mL. Propolis ethyl acetate HPLC fractionation and LC/MS analysis of the different fractions revealed the presence of phenolic compounds, oleic acid, cinnamic acid ant its derivatives, tyrosol, and a numerous flavonoïds such as chrysin, galangine, pinocembrin, quercetin, genistein and tectochrysin. Effect of propolis extracts on the AlC3 induced oxidative stress in rats treated with 50 mg propolis/ kg is brought out by a significant (P<0.05) decrease of cholesterolemia and triglyceridemia to about to 1.38 and 0.37 g/L, respectively. All the homeostasis troubles generated by the oxidative stress (increase of cholesterolemia, triglyceridemia, LDL, transaminases TGO and TGP, creatinine and urea levels) and liver, kidney and lung damages were restored with propolis extract. The antimicrobial effect of the different propolis extracts is illustrated by the minimal inhibitory concentrations (MIC) ranging from 0.35 to 4.25 mg of dry propolis extract/mL with an exception of the E. coli MIC which is up 5mg/mL. The more resistant strains to the inhibitory effects of propolis extract were the beneficial bacteria. These results have shown that propolis contains antimicrobial substances which possibly could be used as antimicrobial agents in many fields.

Key words: Propolis- Phenolic compounds-Antioxidant-Myeloperoxydase-Homeostasis- Antimicrobial activity.

(19)

Table des matières

« Exploration du potentiel antimicrobien et antioxydant

de la Propolis d’Algérie »

Dédicace Avant propos Résumé ABSTRACT

Liste des abréviations Liste des tableaux et figures Table des matières

Partie bibliographique

Page

Introduction 1

Chapitre I: Généralités sur la propolis et le stress oxydatif.

I.1. La propolis 3

I.1.1. Définition 3

I.1.2. Rôle de la propolis dans la ruche 4

I.1.3. Composition chimique de la propolis 4

I.1.4. Propriétés physiques 6

I.1.4.1. Consistance 7

I.1.4.2. Solubilité 7

I.1.4.3. Caractéristiques organoleptiques 7

I.1.5. Propriétés biologiques de la propolis 7

I.1.5.1. Effet antibactérien 7

I.1.5.2. Activité antioxydante 8

(20)

I.1.5.3. Effet immuno-modulateur 9

I.1.5.4. Autres effets de la propolis 9

- Effet anti-inflammatoire 9

- Effet anticancéreux 9

- Effet digestif 9

- Effet sur la glycémie 10

- Effet sur la sphère cardiovasculaire 10

- Effet sur la sphère respiratoire 10

- Effet sur le bien être de la bouche 10

- Effet sur les soins dermatologiques et l’hygiène de la peau 11 I.2. Le stress oxydatif et le système antioxydant naturel 11

I.2.2. Les radicaux libres 11

I.2.3. Formation des radicaux libres 13

I.2.4. Systèmes antioxydants 13

I.2.4.1. Les enzymes antioxydantes 15

I.2.4.1.1. La superoxyde dismutase (SOD) 15

I.2.4.1.2. Les catalases 15

I.2.4.1.3. La glutathion peroxydase (GPx) 16

I.2.4.1.4. La thiorédoxine (TRX) 16

I.2.4.2. Les facteurs antioxydants 17

I.2.4.2.1. Le glutathion 17

I.2.4.2.2. La vitamine C 18

I.2.4.2.3. La vitamine E 18

I.2.4.2.4. Les carténoïdes 18

I.2.4.2.5. Les sélénoprotéines 19

I.2.4.2.6. Le zinc 19

I.2.4.2.7. Les polyphénols 19

I.2.5. Les retombées du stress oxydant sur la santé 20 I.2.5.1. Le stress oxydatif et les maladies cardiovasculaires 20

(21)

I.2.5.3. Stress oxydatif et arthropathies 24

I.2.5.4. Stress oxydatif et vieillissement 24

I.2.6. Le rôle des antioxydants dans la prévention des maladies 24

I.3. Le système myéloperoxydase /H2O2/Cl- 26

I.3.2. Activité de la myéloperoxydase (MPO) 26

I.3.3. Le rôle du système myéloperoxydase /H2O2/Cl- dans diverses pathologies 27

Partie expérimentale

Chapitre II : Matériels et méthodes.

II.1. Activité antioxydante in vitro de la propolis 29

II.1.1. Origine de la propolis utilisée 29

II.1.2. Préparation des extraits de propolis 29

II.1.3. Séparation des fractions par HPLC 30

II.1.4. Identification chimique par LC-MS/MS 30

II.1.5. Quantification des constituants majeurs de la propolis 31

II.1.5.1. Dosage des polyphénols totaux 31

II.1.5.2. Dosage des flavonoïdes 32

II.1.5.3. Dosage de l’acide ascorbique 33

II.1.6. Mesure du pouvoir antioxydant des EEP, EAP et des fractions HPLC de la

propolis par le test au 2,2-diphényl 1-pycrilhydrazyl (DPPH) 33

II.1.7. La peroxydation lipidique 35

II.1.8. Evaluation de l’inhibition de la MPO 36

II.1.9. Préparation de l'enzyme recombinante MPO et des lipoprotéines LDL 37 II.1.9.1. Inhibition de l’oxydation LDL

37

II.2. Activité antioxydante in Vivo de la Propolis 39

II.2.1. Animaux, conditions de l’expérience et prélèvements sanguins et d’organes 39

II.2.2. Analyse des paramètres sériques 40

(22)

II.2.2.2. Hémoglobine glyquée 40

II.2.2.3. Dosage des paramètres lipidiques 41

II.2.2.3.1. Cholestérol total 41

II.2.2.3.2. Triglycérides 41

II.2.2.3.3. Dosage du cholestérol des HDL (HDL-c) 42

II.2.2.3.4. Déduction du cholestérol des LDL (LDLC) 42

II.2.2.4. Dosage de l’urée 42

II.2.2.5. Dosage de la créatinine 42

II.2.2.6. Dosage des transaminases TGO et TGP 43

II.2.2.7. Dosage de l’albumine 43

II.2.3. Détermination du statut antioxydant 43

II.2.3.1. Dosage du malonaldéhyde (MDA) 43

II.2.3.2.Dosage de l’activité enzymatique de la catalase (CAT ; EC 1.11.1.6) 44 II.2.3.3.Dosage de l’activité enzymatique de la Superoxyde

dismutase (SOD ; EC 1.15.1.1) 44

II.2.3.4. Dosage de l’activité plasmatique de la Glutathion peroxydase 45

II.2.3.5. Dosage des thiols 45

II.2.4. Etude histologique 46

II.2.4.1. Préparation des échantillons 46

- Fixation 46 - Mise en cassette 46 - Déshydratation 46 - Clarification 46 - Inclusion 46 II.2.4.2. La microtomie 46

II.3. Activité antimicrobienne de la propolis 49

II.3.1. Nature et origine des souches 49

II.3.2. Choix des milieux de culture et conditions de croissance 49

II.3.2.1. Choix des milieux de culture 49

II.3.2.2. Les conditions de croissance 50

(23)

III.3.2.2.2. Les bactéries pathogènes 51 II.3. 3. Mise en évidence du pouvoir antimicrobien de l’extrait d’acétate d’éthyle de

la Propolis 51

II.3.3.1. Les conditions de croissance 51

II.3.3.1.1. Bactéries bénéfiques 51

II.3.3.1.2. Les bactéries pathogènes 51

II.3.4. Mise en évidence du pouvoir antimicrobien de l’extrait d’acétate d’éthyle de

la Propolis 51

II.3.4.1. Méthode de diffusion sur milieu gélose 51

II.3.4.2. Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) 52

II.3.4.3. Méthode de contact dans un milieu liquide 52

II.4. Analyse statistique 52

Chapitre III : Résultats et discussion.

III.1. Activité antioxydante in vitro de la propolis 54 III.1.1. Fractions HPLC et identification chimique par LC-MS/MS des extraits

de propolis 54

III.1.2. Teneurs en constituants majeurs de la propolis 59 III.1.2.1. Teneurs en polyphénols totaux de la propolis 59

III.1.2.2. Teneurs en flavonoïdes de la propolis 62

III.1.2.3. Teneurs en vitamine C de la propolis 64

III.1.3. Pouvoir antioxydant des extraits éthanoliques (EEP) et d’acétate d’éthyle

(EAP), et des fractions HPLC de la propolis 65

III.1.4. Pouvoir d’inhibition de la peroxydation lipidique 68 III.1.5. Pouvoir d’inhibition de la myéloperoxydase (MPO) 69 III.1.6. Inhibition de l’oxydation des lipoprotéines LDL

72

III.2. Activité antioxydante in Vivo de la Propolis 74 III.2.1. Propolis, stress oxydatif et paramètres sériques 74

III.2.1.1. Glycémie 74

(24)

III.2.1.3. Profil lipidique 77

III.2.1.4. L’urémie 81

III.2.1.5. Créatininémie 83

III.2.1.6. Etat de l’activité des transaminases hépatiques (TGO et TGP) 85

III.2.1.7. L’albuminémie 88

II.2.2. Stress oxydatif et pouvoir antioxydant de la propolis 89 II.2.2.1. Stress oxydatif, propolis et concentrations sériques en malonaldéhyde (MDA) 89 III.2.2.2. Stress oxydatif, propolis et activité enzymatique de la

catalase (CAT ; EC 1.11.1.6) 91

III.2.2.3. Stress oxydatif, propolis et activité enzymatique de la de la

Superoxyde dismutase (SOD ; EC 1.15.1.1) 93

III.2.2.4. Stress oxydatif, propolis et activité enzymatique de la Glutathion

peroxydase (GSH-Px) 95

III.2.2.5. Stress oxydatif, propolis et teneurs sériques en thiols 96 III.2.3. Stress oxydatif, propolis et histopathologie tissulaire 97

II.2.3.1. Histopathologie du foie 97

III.2.3.2. Histopathologie des reins 100

III.2.3.3. Histopathologie des poumons 102

III.2.4. Relation entre les paramètres biochimiques, le statut antioxydant et

l’histopathologie des organes 102

III.3. Activité antimicrobienne de la propolis 105

III.3.1. Activité antibactérienne des extraits d’acétate d’éthyle de la propolis 105

III.3.2. Concentration minimale inhibitrice (CMI) 109

III.3.3. Effets des extraits d’acétate d’éthyle de propolis sur la cinétique de croissance

des souches pathogènes. 111

III.3.3.1. Staphylococcus aureus ATCC 25923 111

III.3.3.2. Shigella dysenteriae CECT 524 117

III.3.3.3 Shigella sonnei CECT 584 122

(25)

III.3.3.4. Effets des extraits d’acétate d’éthyle de propolis sur la cinétique de croissance

des souches bénéfiques 134

Conclusion 148

Références bibliographiques 150

Annexes Publication

(26)

Introduction

Depuis l’aube des temps, l’homme a toujours été intrigué et intéressé par la nature qui l’entourait. Il a su tirer partie des ressources naturelles pour s’adapter à son environnement et ainsi évoluer, créant la domestication et l’agriculture. L’apithérapie est l’une des méthodes de soin naturelle, elle est basée sur les produits de la ruche tel que : le miel, la gelée royale, la propolis, le pollen, etc.

En raison des propriétés médicinales qu’elle renferme, la propolis est depuis longtemps considérée dans l’herboristerie traditionnelle comme un remède utile pour combattre les infections de toutes sortes (Cardile et al., 2003 ; Castolda et Cappaso, 2002 ; Hikmet et Mercan, 2006). Elle était, également, connue chez les anciens grecs et les prêtres égyptiens, qui l’utilisaient traditionnellement pour la momification des cadavres, en enduisant avec la propolis les bandelettes des momies, pour leur assurer une meilleure conservation, et pour soigner et anesthésier les caries dentaires (Alexandare, 1984).

Beaucoup de travaux ont montré que cette substance est composée essentiellement de flavonoïdes. Cette composition varie en fonction de son origine, de l’espèce d’abeille et du temps de la récolte (Konig, 1985; Greenaway et al., 1990; Park et al., 2002). On lui reconnait de nombreuses propriétés : antibactérienne (Ghisalberti 1979, Velikova et al 2000), antivirale (Dimov et al., 1991, Murad et al., 2002), anti-inflammatoire (Paulino et al., 2008), anti-oxydante (Nieva Moreno et al., 2000; Yousef et al., 2003a, 2003b, 2004a, 2004b), anticancéreuse (Padmavathi et al., 2006), hépatoprotective et immunostimulatrice (Kim et al., 2008), etc.

Le corps humain est le siège d’une synthèse constante d’espèces oxygénées réactives dont la production contrôlée est indispensable au bon fonctionnement de l’organisme. Cependant dans de nombreuses pathologies, il arrive qu’une production exagérée et/ou incontrôlée de ces espèces aboutisse à des dégâts oxydatifs.

De nombreux auteurs ont étudié, alors, l’effet protecteur d’agents thérapeutiques dans des modèles mimant la production incontrôlée des espèces oxygénées réactives et cherché à évaluer la capacité antioxydante de ces agents (Van antwerpen et al., 2007).

Des extraits enrichis en flavonoïdes et en polyphénols issus de la propolis présentent des propriétés Antioxydantes très importantes par inhibition de la lipopéroxydation de l’acide linoléique (Gregoris et Stevanato, 2009 ; Ghedira et al., 2009). C’est la fraction la plus

(27)

concentrée en flavonoïdes qui réduit le mieux les radicaux libres en protégeant les lipides et d’autres substances (Buratti et al., 2009).

Le spectre antibactérien de la propolis est large. Son action est puissante, elle agit en effet sur Staphylococcus aureus (Trusheva et al., 2010), Streptococcus mutans et Streptococcus

sobrinus (Kim et al., 2011), Helicobacter pylori et les microcoques (Farseni et al., 2009),

Bacillus subtilis, Bacillus alvei, Bacillus larvae, Proteus vulgaris (Donadieu, 2008),

Salmonella enterica Typhi (Orsi et al., 2011), Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli,

Streptococcus faecalis (Marcucci et al., 2001).

Cette activité antibactérienne serait imputable à l’acide cinnamique, aux molécules aromatiques, aux acides diterpéniques, aux composés phénoliques et aux nombreux flavonoïdes qui composent la propolis et en font le plus actif des produits de la ruche (Ramanauskienè et Inkènienè, 2011 ; Boukraâ et Sulaiman, 2009 ; Bankova et al., 1996).

C’est donc tout naturellement que nous avons orienté le présent travail vers l’étude des propriétés antibactériennes et antioxydantes de l'extrait de propolis de différentes régions de l'Algérie. Nos objectifs sont les suivants :

- Dosage des polyphénols, flavonoïdes et de l'acide ascorbique.

- Déterminer l'effet antioxydant de ces composés par le 2,2 -diphényl -1- picrylhydrazyl (DPPH) et le scavenging de la peroxydation lipidique, ainsi que l'inhibition de la MPO et de l'oxydation des LDL-MPO.

- Etudier l’activité antioxydante in Vivo en utilisant un modèle animal, le rat Wistar, soumis au stress oxydatif par le trichlorure d’aluminium (AlCl3).

- Evaluer l’activité antimicrobienne des différents extraits de la propolis sur les bactéries pathogènes et bénéfiques.

Cette thèse est structurée en trois chapitres dont le premier est consacré à un bref rappel de l’état des connaissances sur la propolis, sa composition et ses vertus thérapeutiques. Le second chapitre "Matériels et méthodes" décrit la manière dont sont réalisées les expériences et résume le fonctionnement des différents appareils utilisés. Un troisième et dernier chapitre présente les résultats qui y sont discutés et confrontés à ceux d’autres auteurs.

(28)

Chapitre I: Généralités sur la propolis et le stress oxydatif.

I.1. La propolis

I.1.1. Définition

La propolis ou colle d’abeille (Loiriche, 1984) est un mastic végétal (Nagai et al., 2003), qui désigne un ensemble de substances résineuses, gommeuses et balsamiques (Alexandare, 1984 ; Alin, 1996) (fig. 1) récoltées par les abeilles (Apis mellifera) butineuses (Prost, 1984) sur les écorces et les bourgeons essentiellement à partir de plantes variées telles que les bouleaux, les peupliers, les chaines, les saules, les conifères et bien d’autres encore (Debuyser, 1984 ; Bankova et al., 2000).

Figure 1 : Propolis brute (photo de nos échantillons)

La propolis est de consistance visqueuse et amalgamée à une sécrétion salivaire des abeilles, à de la cire et du pollen auxquels s’y rajoutent aussi beaucoup d’impuretés liées à l’exploitation des ruches par l’apiculteur ; d’où la nécessité de la purifier avant son utilisation (Prost, 1984). Les herboristes attribuent à la propolis plusieurs vertus qui font d’elle un remède utile pour combattre les infections de toutes sortes (Castolda et Cappaso, 2002 Cardile et al., 2003 ; Hikmet et Mercan, 2006).

(29)

Selon la nature des espèces végétales présentes en Algérie, la propolis algérienne pourrait provenir du pin (Pinus sp) qui occupe les zones semi arides, du chêne que l’on trouve au nord-est du pays, du châtaignier, du cyprès (Cupressus sp), du Casuarina, ou du peuplier (Populus sp). L’étude réalisée par Moudir (2004) sur la propolis algérienne récoltée dans quatre régions différentes (Tlemcen, Guelma, M’sila et Tizi-Ouzou) a montré qu’elle provenait surtout du peuplier (Populus nigra), exceptée celle de Tizi-Ouzou qui avait une composition différente.

I.1.2. Rôle de la propolis dans la ruche

Une fois prélevée de sa source végétale, la propolis est ramenée à la ruche pour être utilisée par l’abeille de différentes façons :

- Ciment pour colmater les fissures de leur habitat et réduire le trou de vol pour mieux contrôler le passage des intrus et pour se protéger du froid (Kolankay et al., 2002).

- Isolant thermique idéal (Jean-Prost et Le conte, 2005).

- Traitement antiseptique des cellules de cire avant la ponte de la reine par un tapissage d’une pellicule de propolis pour le développement harmonieux de l’œuf (Burdock, 1998 ;

Kolankay et al., 2002).

- Lutte biologique, en recouvrant l’intérieur de leur habitat d’une fine pellicule de cette résine, les abeilles se mettent à l’abri des maladies (Jean-Prost et Le conte, 2005) ;

- Embaumer les corps des prédateurs gourmands de miel (sphinx à tête de mort, petit rongeurs) tués par les abeilles et qu’elles ne peuvent pas évacuer compte tenu de leur poids (Jasprica et al., 2007).

I.1.3. Composition chimique de la propolis.

Elle varie selon son origine botanique (Bantrova, 2005 ; Teixeira et al., 2005 ; Banno et

al., 2007) et dépend de l’accessisibilité des plantes aux abeilles (Krell, 1996) ; dont la race constitue, également un facteur influençant cette composition chimique (Krell, 1996). La composition grossière de la propolis rapportée par divers auteurs est indiquée au tableau 1.

(30)

Tableau 1 : Composition grossière de la propolis.

Parties de la propolis constituants par groupe Références

Résines et baumes

45-55% Flavonoïdes, acides phénolique et leurs esters

(Bankova et al., 1987) (Nagy, 1989)

Cire et acide gras

20-30% Acide cinnamique, acides

linoléiques, acides propanoïques.

(Papay, 1987)

Huiles essentielles

10%

Produits volatils (Tozi et al., 2006)

Pollen

5%

Protéines (plus de 1% des acides aminés sont représentés par 6 acides aminée libres et

l’arginine et la proline représentent jusqu’à 46% du total) (Gabrys, 1986) Autres composés et minéraux 5% 14 minéraux à l’état de traces : silice, Fe, Zn, (les plus

communs) Ag, Cs, Hg, Sb Acide benzoïque et ses esters,

vitamines, sucres, cétones, lactones, etc.

(Bankova et al., 1987) (Cuellar et Hernandez,

1987)

Sur le plan de la composition chimique fine de la propolis, plus de 300 constituants différents ont été identifiés, et dont la plupart sont des substances phénoliques (flavonoïdes, acides phénoliques et leurs esters) (Bankova, 2005).

L’inventaire complet de ces constituants serait fastidieux. Citons, toutefois, la présence de plus de quarante flavonoïdes (flavones, flavonols et flavanones), des acides aromatiques, des esters aromatiques, terpénoides, acides aliphatiques, autres matières organiques et minérales et de nombreuses vitamines (dont la vitamine A et les vitamines du groupe B) (Tozi et al., 2006).

Plusieurs études ont été consacrées à la détermination de la composition chimique de la propolis dont celle d’Alencar et al (2007) sur la propolis rouge du Brésil dont les constituants

(31)

ont été identifiés par la spectrophotométrie de masse couplée à la chromatographie en phase gazeuse (tableau 2).

Tableau 2: Composition chimique fine de la propolis (Alencar et al., 2007).

N° Temps de rétention en min Composés 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 9.88 12.46 15.31 16.82 19.67 21.27 23.14 24.21 30.26 33.38 36.40 37.11 40.41 41.39 41.74 43.79 44.41 44.86 45.66 46.37

Acide Butanedioique, ester diméthyl

Acide hydroxy-butanedioique, ester diméthyl m- Gaïacol 1-Méthoxy-4-1-propenyl-benzène Méthyleugénol Methyl o-orsellinate 1,2,3-Triméthoxy-5-(2-propenyl)-benzene Méthoxyeugénol

Acide héxadécanoique , ester méthyl Acide 10- octadécanoique, ester méthyl Méthyl abietate Acide Benzoique Homoptérocarpine Médicarpine 2,4,6-Triméthylphénol 4_,7-Dimethoxy-2_-isoflavonol7,4_Dihydroxyisoflavone 2H-1-Benzopyran-7-ol 2,2,6-Beta-trimethyl-bicyclo(4.3.0)non-9(1)-en-7.alpha.-ol 1,1,2-Trimethyl-3,5-bis(1-methylethenyl)-,

(2.alpha. 3. alpha., 5.beta.)-cyclohexane

I.1.4. Propriétés physiques

La propolis est récoltée sur une grande variété d’arbres et d’arbustes. Chaque région et chaque colonie semble avoir ses propres sources de résine préférées. Ce qui explique la grande variation de la couleur et de l’odeur de la propolis(Krell, 1996).

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La consistance de la propolis est variable en fonction de la température. Elle est dure et friable à 15°C, molle et malléable aux alentours de 30°C, collante ou gluante entre 30 à 70°C. Le point de fusion est de 96°C (Krell, 1996).

I.1.4.2. Solubilité

Très peu hydrosoluble, la propolis est partiellement soluble dans l’alcool, l’acétone, l’éther, le chloroforme et le benzène. Seul un mélange adéquat de différents solvants permet de dissoudre la quasi-totalité de ses composants (Raoul, 1992).

La partie insoluble est constituée de tissus végétaux, de grains de pollen, de débris de cuticule et de soie d’abeille (Debuyser, 1984).

I.1.4.3. Caractéristiques organoleptiques

La couleur varie très fortement du brun jaune au brun vert ou du brun rouge au rouge foncé selon l’origine botanique et géographique (Tozi et al., 2006) .

I.1.5. Propriétés biologiques de la propolis. I.1.5.1. Effet antibactérien

La propolis est bactéricide vis-à-vis des germes pathogènes comme Bacillus cereus, B.

subtilis, Staphylococcus aureus, Enterrococus faecalis et Listeria monocytogenes,

Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Eschrichia coli, Salmonella typhimurium,

listeria innocua,. (Erkmen et Ozcan, 2008; Pavilonis et al., 2008).

Certaines levures comme Candida albicans, candida tropicalis, candida Krusei y sont également sensibles(Vardar-Unlu, 2008).

C’est la galangine, un des constituants de la propolis, qui semble donner l’effet anti-staphylococcique en empêchant l’adhésion de ce germe (Cushnie et al., 2007). La meilleure concentration minimale inhibitrice (CMI) de la propolis brésilienne (ou propolis rouge) vis-à-vis S. aureus ATCC 25923 et S. mutans a été celle exercée par la fraction chloroformique

(Alencar et al., 2007). La propolis de Bulgarie s’est montrée active contre Clostridium,

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La propolis est un produit qui potentialise l’effet antimicrobien de la mupirocine (un antibiotique d'origine naturelle produit par fermentation de Pseudomonas fluorescens), en particulier sur les staphylocoques résistants à la méthicilline (Onlen et al., 2007).

Cet effet antibactérien de la propolis a été soupçonné il y a plus d’un siècle par White (1906 ; cité par Debuyser, 1984) qui avait observé que l’intérieur de la colonie d’abeilles était à peu prés dépourvu de microorganismes. Il n’étudia pas la propolis mais il avait remarqué que les rayons de cire contenaient très peu de bactéries ; et contrairement à toute autre attente, il se trouve que les rayons sont recouverts d’une mince pellicule de propolis, c’est donc elle seule qui est en contact avec le miel.

I.1.5.2. Activité antioxydante

La Propolis a prouvé une activité antioxydante très forte, due à sa composition chimique, elle contient un grand pourcentage des flavonoïdes et des polyphénols qui sont très connus comme des antioxydants très forts (Takema et al., 2003).

Ce syndrome résultant d’un déséquilibre entre le système de défense antioxydante et la production des radicaux libres oxygénés. Il est la cause initiale de plusieurs maladies : cancer, cataracte, sclérose latérale amyotrophique, vieillissement accéléré, etc. C’est un facteur de la genèse des maladies plurifactorielles telle la maladie d’Alzheimer, les rhumatismes et les maladies cardiovasculaires (Favier, 1997).

Des extraits enrichis en flavonoïdes et en polyphénols issus de la propolis présentent des propriétés Antioxydante très importantes par inhibition de la lipopéroxydation de l’acide linoléique (Gregoris et Stevanato, 2009 ; Ghedira et al., 2009). C’est la fraction la plus concentrée en flavonoïdes qui réduit le mieux les radicaux libres en protégeant les lipides et d’autres substances (Buratti et al., 2009).

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La propolis a une action immuno-modulatrice en inhibant in vitro et in vivo les macrophages murins péritonéaux. Elle stimule l’effet lytique sur les cellules NK contre les cellules tumorales et inhibe la lymphoprolifération induite par l’inflammation. L’effet immunologique est patent quand la propolis est donnée aux animaux sur un court terme

(Sforcin, 2007). La propolis agit directement sur la régulation de base des fonctions des cellules immunitaires, en particulier celles qui sont liées à l’Erk2 MAP-kinase. Par là, elle a un effet anti-inflammatoire important en passant par des mécanismes faisant intervenir des cellules T-immunore gulatrices (Ansorge et al., 2003).

I.1.5.4. Autres effets de la propolis. - Effet anti-inflammatoire.

L’extrait de la propolis et le CAPE qu’elle contient inhibent l’œdème induit par la carragénine et par l’arthrite (Ghedira, 2009; Park et al., 1996). La propolis, par ses flavonoïdes, retarde l’inflammation de la pulpe dentaire qu’elle protège en la chapotant et simule la réparation de la dentaire. Cet effet est utilisé dans l’inflammation de la gencive

(Marcucci, 1995).

- Effet anticancéreux.

La teinture de la propolis à un effet cytotoxique qui permet d’inhiber les cellules tumorales Hela avec une concentration inhibitrice CI50 de 7,45 mg/ml. La propolis verte du Brésil fait l’objet de plusieurs recherches, au Japon entre autres, pour sa propriété anticancéreuse (Banskota et al., 2002).

- Effet digestif.

La propolis est inhibitrice des spasmes des voies digestives. Elle protège l’estomac contre des lésions induites par l’éthanol (Liu et al., 2002). L’extrait de propolis agirait en inhibant la lipoxygénase et protège la muqueuse gastrique du stress oxydatif.

L’ester phényléthylique du CAPE (Caffeic acid phenethyl ester) de la propolis atténue les symptômes de la colite induite par le polysaccharide peptidoglycane bactérien en inhibant les

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NF-kappa B et TNF-alpha produits dans les macrophages, réduisant ainsi la production de cytokines pro-inflammatoires (Fitzpatrick et Wang, 2001).

- Effet sur la glycémie.

Une étude récente a également confirmé que chez les patients présentant le diabète de type 2, la propolis aurait un effet hypoglycémiant et contribuerait à la diminution du risque du syndrome métabolique (Lancette, 1998). La propolis stimulerait l’activité cellulaire et accélèrerait la régénération des tissus et la réparation des cellules pancréatiques endommagées

(Chem, 1998).

- Effet sur la sphère cardiovasculaire.

La propolis aurait une influence favorable sur le cœur, les parois des vaisseaux et tous les troubles dues à l’artériosclérose (Fuliang et al., 2005).

Dans une étude menée sur 45 patients ayant un taux de cholestérol très élevé et dont certains souffraient d’infarctus et d’hypertension et qui recevaient une capsule de propolis (45 mg) 3 fois/jour pendant un mois, les résultats ont montré une baisse significative de la cholestérolémie (Fang chu, 1978).

- Effet sur la sphère respiratoire.

Selon une étude menée auprès de 46 sujets, la propolis a atténué sensiblement le nombre et la gravité des crises nocturnes d’asthme, amélioré la fonction respiratoire et diminué les mécanismes de l’inflammation (Khayyal et al., 2003).

Les résultats d’une étude polonaise menée sur 55 personnes atteintes d’une forme extrême de bronchite chronique et soumises à un traitement à base de propolis, avaient montré qu’au bout de plusieurs jours, la quantité et la viscosité des expectorations diminuèrent sensiblement et l’état général des malades s’améliora dans 70 % des cas (Sheller et Pawlak, 1981).

- Effet sur le bien être de la bouche.

Des essais in vitro indiquent que la propolis est efficace contre divers pathogènes susceptibles d’infecter la cavité buccale (bactéries et champignons) (Bruschi et al., 2006).Les vertus antiseptiques de la propolis étant bien documentées, on trouve des dentifrices et des rince-bouche qui en renferment à titre d’agent anti-carie (Park et al., 1998).