Les vertébrés terrestres ont-ils joué un rôle dans l’épidémie de chikungunya dans
l’Océan Indien ?
a
INRA, UR346 Epidémiologie Animale, Clermont-Ferrand
b
ENVA, UMR956 BIPAR, Maisons-Alfort
c
INRA, UR892 Virologie et Immunologie Moléculaires, Jouy
d
INRA, UR1037 Gestion des populations invasives, Rennes
e
AFSSA, UR Rage et Maladies Emergentes, Nancy
f
AFSSA, UMR 1161 Virologie, Maisons-Alfort
g
INRA, Département Santé Animale, Tours
Gwenaël VOURC’H a , Amélie DESVARS a , Lénaïg HALOS a,b , Thomas DUVAL a,c , Clément PUNELLE c , Michel PASCAL d , Monique
LEBERRE c , Frank BOUÉ e , Sylvie LECOLLINET f , Stéphan
ZIENTARA f , Axel BOUDER c , Gilles AUMONT g , et Michel BRÉMONT c
Colloque Chikungunya, déc. 07 – CHIKANI 2
Le chikV pourrait infecter les animaux
Pourquoi s’intéresser aux animaux ?
L’intervention des animaux dans le cycle a des conséquences sur l’épidémiologie humaine
ChikV isolé chez des primates, un écureuil (Xerus erytrhopus), une chauve-souris (Scotophilus sp), un oiseau (Passer sp) et une souris “sentinelle”
Etudes des 60-70’s : séroconversions chez des rongeurs, oiseaux, reptiles, animaux domestiques
Les alphavirus affectent diverses espèces
Quelles sont les conséquences des résultats aux
questions précédentes sur la dynamique de transmission du virus ?
Objectif du projet
Est-ce que les vertébrés domestiques et sauvages ont joué un rôle dans la circulation du virus
chikungunya dans l’Océan Indien ?
Peut-on détecter le virus chez certaines espèces ? Si oui, y a-t-il adaptation/évolution virale ?
Les animaux ont-ils été en contact avec le virus ?
Colloque Chikungunya, déc. 07 – CHIKANI 4
Méthodes
Constitution d’une biothèque (sérums et organes) durant 2 campagnes d’échantillonnage :
mai-juillet 2006
janvier-avril 2007
Recherche des anticorps par séroneutralisation et ELISA
Recherche du virus par qRT-PCR
(Pastorino et al 2005)
2006
2006-07
2006-07 2007
Méthodes (suite)
Stratégie d’échantillonnage
¾ Par zones
Colloque Chikungunya, déc. 07 – CHIKANI 6
¾ Par zones
¾ “Foyer”: animaux des personnes récemment malades (protocole CURACHIK)
¾ “Suspicion” de chikungunya posée par les vétérinaires
¾ “Naïfs”: non exposés au virus chikungunya
Méthodes (suite)
Stratégie d’échantillonnage
Méthodes (suite)
¾ Par zones
¾ “Foyer”
¾ “Suspicion”
¾ Macaques crabiers en 2006
¾ “Naïfs”
Stratégie d’échantillonnage
¾ 2006 : lémurs
¾ 2007 : lémurs, chiens, rats et chauves-souris
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Methodes (suite)
¾ Sérums (ou sang total) – tubes secs et buvards
¾ Organes (foie, rein, rate, globe oculaire) pour rongeurs et musaraignes
Prélèvements
Fiche de prélèvement
Individus échantillonnés
Carnivores domestiques
2007 2006
120 148
2006 2007 37
dont 16 suspicions
& 11 foyers
dont 10 suspicions
& 5 naïfs
2006
via les vé téri nai res pra tici ens
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Individus échantillonnés
Carnivores domestiques
Animaux de rente et de loisirs
2007 2006
120 148 632 835
2006 2007 2006 37
dont 137 naïfs
via le
Individus échantillonnés
Carnivores domestiques
Animaux de rente et de loisirs
2007 2006
120 148 632 835 217 365
Avifaune sauvage
2006 2007 2006 37
Bulbul orphée Pycnonotus jocosus
Foudi rouge
Foudia madagascariensis
Moineau
Passer domesticus Tisserin
Ploceus culcullatus
via la
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Individus échantillonnés
Carnivores domestiques
Animaux de rente et de loisirs
2007 2006
120 148 632 835 217 365
Avifaune sauvage
274 308
Rongeurs, musaraignes, tangues
2006 2007 2006 37
160
Musaraigne Suncus murinus Rat noirs
Rattus rattus
Rat surmulot R. norvegicus
Souris Mus musculus
Tangue Tenrec ecaudatus
via la Brigade Nature
Individus échantillonnés
Carnivores domestiques
Animaux de rente et de loisir
2007 2006
120 148 632 835 217 365
Avifaune sauvage
274 308
Rongeurs, musaraignes, tangues
40 -
Chauves-souris
2006 2007 2006
99 37
160
Petit molosse Roussette Molosse
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Individus échantillonnés
Carnivores domestiques
Animaux de rente et de loisirs
2007 2006
120 148 632 835 217 365
Avifaune sauvage
274 308
Rongeurs, musaraignes, tangues
40 -
Chauves-souris
85 214
Reptiles et amphibiens
2006 2007 2006
99 37
160
Gecko
Hemidactylus sp. Chamaeleo pardalis
Crapaud
Bufo gutturalis
Individus échantillonnés
Carnivores domestiques
Animaux de rente et de loisir
2007 2006
120 148 632 835 217 365
Avifaune
274 308
Rongeurs, musaraignes, tangues
40 -
Chauves-souris
85 214
Reptiles et amphibiens
5
Primates
2006 2007
-
2006
99
61 50 134 37
160
Lémur brun Eulemur fulvus
Macaque crabier Macaca fascicularis 1 macaque à queue
de cochon Macaca nemestrina
1 cercopithèque de Campbell Cercopithecus campbelli 2 babouins hamadryas
Papio hamadryas
Zoo de St Denis ONCFS Fermes d’élevage
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Individus échantillonnés
Carnivores domestiques
Animaux de rente et de loisirs
2007 2006
120 148 632 835 217 365
Avifaune sauvage
274 308
Rongeurs, musaraignes, tangues
40 -
Chauves-souris
85 214
Reptiles et amphibiens
5
Primates
2006 2007
-
2006
99
61 50 134
37
160
1 879
1 502 61 346 134
TOTAL = 3 922
Recherche d’ARN viral
807 sérum prélevés en 2006
Tous négatifs
Test de séroneutralisation
J-1Cellules réparties dans les puits de plaques P96
J 0 Serum décomplémenté 30 mn à 56°C (2 fois 50 µl)
Dilution au ½ avec milieu
Répartition des les puits En diluant de 2 en 2 avec Milieu 2% sérum
Addition d’une dose fixe de virus
Incubation 1hr à 37°C
Dépôt des dilutions + virus sur les cellules.
Incubation 48hr à 37°C
Lecture après coloration au bleu de methylène
Problème (a)
Les contrôles négatifs=animaux naïfs de métropole et de la Réunion donnent des résultats inattendus
Ex: Certains sérum sont 100% neutralisants à des dilutions >1000ème
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Problème (b)
L’activité neutralisante n’est pas dirigée contre tous les virus enveloppés
Ainsi: Il y a neutralisation d’autres alphavirus mais pas par ex des rhabdovirus
L’activité neutralisante « non spécifique » ne concerne pas les sérums
de primates (homme, lémuriens…)
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ELISA
•« Coating » de 10
6particules CHIK/puit de P96. Incubation 1 nuit à 4°C.
•Lavage 5 fois avec PBS-Tween 0,1%.
•Saturation avec PBS-Tween 0,1%+3% lait
•Incubation 1hr à 37°C puis 4 lavages avec PBS-Tween 0,1%.
•Dilution des sérum à tester au 1/100° et 1/500° en solution de saturation
•Dépôt dans les puits et incubation 1hr à 37°C puis 4 lavages.
•Incubation avec anticorps secondaires (anti chien, anti chat) couplé HRP
•Incubation 1hr à 37°C, puis 8 lavages.
•Révélation avec TMB (tétraméthylbenzidine).
•Stop de la réaction avec acide phosphorique. Lecture de DO à 420nm.
Colloque Chikungunya, déc. 07 – CHIKANI 26
Le test de séroneutralisation est ininterprétable et donc abandonné
Par les tests ELISA, le bilan provisoire est que:
Les quelques espèces animales qui ont été analysées sont majoritairement négatives lémurs, chiens, chats, volailles, caprins, rongeurs et musaraignes
Conclusion provisoire
Fermes d’élevage : Bioculture
Société d’Etudes Ornithologiques de La Réunion (SEOR)
Office National de la Chasse et de la Faune Sauvage (ONCFS) / Brigade Nature OI (BNOI) Groupement Régional de Défense Sanitaire du Bétail Réunionnais (GRDSBR)
Cliniques vétérinaires privées
Laboratoire Vétérinaire Départemental (LVD)
Direction Régionale des Affaires Sanitaires et Sociales (DRASS) Parc Zoologique du Chaudron
Direction Interarmées du Service de Santé des Forces Armées dans la Zone Sud de l’OI Direction Régionale de l’Environnement (DIREN)
Centre de Coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement (CIRAD)
Institut de Recherche pour le Développement (IRD)
ONCFS – Brigade Nature Mayotte
Laboratoire Vétérinaire Départemental (LVD) Direction des Services Vétérinaires (DSV) Clinique Vétérinaire de Mamoudzou
Sincères remerciements !
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