Développement et validation de méthodes HPLC-MS/MS et GC/MS-MS permettant le dosage des pesticides contenus dans les POCIS et les sédiments : application aux échantillons prélevés dans les principaux tributaires du bassin d'Arcachon

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Développement et validation de méthodes

HPLC-MS/MS et GC/MS-MS permettant le dosage des

pesticides contenus dans les POCIS et les sédiments :

application aux échantillons prélevés dans les principaux

tributaires du bassin d’Arcachon

N. Desgranges

To cite this version:

N. Desgranges. Développement et validation de méthodes HPLC-MS/MS et GC/MS-MS permettant le dosage des pesticides contenus dans les POCIS et les sédiments : application aux échantillons prélevés dans les principaux tributaires du bassin d’Arcachon. Sciences de l’environnement. 2010. �hal-02593295�

Développement et validation de méthodes

HPLC-MS/MS et GC/MS-MS permettant le

dosage des pesticides contenus dans les

POCIS et les sédiments

Application

aux

échantillons

prélevés

dans

les

principaux tributaires du bassin d’Arcachon

Rapport de master 2 MAEVA parcours Analyse

Nathalie DESGRANGES

Stage effectué au laboratoire de chimie des eaux

Groupement Cemagref de Bordeaux

Unité de recherche REBX

50 avenue de Verdun

33612 Cestas CEDEX

Sous la direction de Nicolas Mazzella

Tuteur universitaire : Laure Malleret

Juin 2010

REMERCIEMENTS

Tout d’abord, je souhaite remercier tout particulièrement Nicolas Mazzella de m’avoir accueillie au sein du laboratoire de chimie des eaux et de m’avoir consacré beaucoup d’attention malgré le travail personnel qu’il avait. Je le remercie de m’avoir transmis ses connaissances en matière de pesticides, de techniques d’analyses et de maintenance des équipements. Ses conseils avisés et son enthousiasme m’ont permis de mieux appréhender mon sujet et de développer encore un peu plus mes connaissances techniques et mon autonomie.

Je souhaite également remercier Brigitte Méchin et Brigitte Delest qui m’ont expliqué en détails le fonctionnement du laboratoire et qui m’ont expliqué en particulier la technique d’extraction sur phase solide (SPE).

Je tiens à remercier Sophie Lissalde ainsi que Vincent Fauvelle, thésards au sein du laboratoire, qui m’ont tout particulièrement permis de comprendre le fonctionnement de la chromatographie liquide haute performance couplée à un spectromètre de masse en tandem (HPLC-MS/MS) et pour les nombreux autres conseils qu’ils ont pu me donner durant mon stage.

Enfin, je remercie Muriel Bonnet et Maryse Boudigues qui, même si elles n’ont pas participé directement à mon sujet, ont su de part leur gentillesse et leur humour m’intégrer dans la grande famille de ce laboratoire.

Je salue particulièrement l’accueil qui m’a été fait au sein du laboratoire et plus généralement au sein du Cemagref et je tiens enfin à remercier les nombreuses autres personnes qui ont pu m’aider pendant mon stage :

- Catherine Ferrière qui m’a expliqué le fonctionnement administratif, - Gilles Veyssiere qui a supporté nos doléances informatiques,

- Alain, Benoit, Damien, Emilie, Florian, Gaël, Marius, Maud, Nicolas, Soizic, Sylvia, Vincent, Younès et les nombreuses autres personnes qui ont su mettre un environnement agréable autour de ce stage.

Je remercie Laure Malleret de s’être assurée depuis Marseille du bon déroulement de mon stage.

Enfin, je tiens également à remercier Pierre Doumenq qui a su encadrer ses étudiants et les conseiller au mieux pour leur stage.

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SOMMAIRE

INTRODUCTION

1. Généralités... 5

1.1. Les pesticides : définition, mécanismes de transfert et réglementation ... 5

1.2. Propriétés des substances actives étudiées ... 6

1.2.1. Les herbicides... 7

1.2.1.1. Les triazines... 7

1.2.1.2. Les chloroacétanilides et les phénylurées ... 7

1.2.2. Les insecticides ... 8

1.2.3. Les fongicides ... 8

1.3. La stratégie d’échantillonnage ... 8

1.3.1. Les prélèvements de sédiments ... 9

1.3.2. Echantillonnage des pesticides dans la colonne d’eau ... 9

1.3.2.1. L’échantillonnage passif ... 9

1.3.2.2. Les POCIS... 10

1.3.3. Les sites d’échantillonnage ... 11

2. Matériels et méthodes... 12

2.1. Mise en place des POCIS ... 12

2.2. Echantillonnage des sédiments et traitement des échantillons... 12

2.2.1. La lyophilisation... 12

2.2.2. L’ASE... 13

2.3. L’analyse en HPLC-MS/MS ... 14

2.3.1. La séparation par HPLC ... 14

2.3.2. La détection par spectrométrie de masse en tandem : source electrospray (ESI) ... 15

2.4. L’analyse en GC-MS/MS... 16

3. Résultats et discussions ... 17

3.1. Estimation des effets de matrice en HPLC-ESI-MS/MS et purification des extraits ... 17 CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref

3.2. Validation de méthodes ... 19

3.2.1. La norme AFNOR NF T90-210 ... 19

3.2.2. Validation HPLC-MS/MS... 20

3.2.3. Validation GC-MS/MS ... 23

3.3. Echantillons du Bassin d’Arcachon ... 25

3.3.1. Pesticides dans la colonne d’eau : POCIS... 25

3.3.2. Pesticides dans les sédiments ... 27

CONCLUSION

BIBLIOGRAPHIE

LISTE DES FIGURES

LISTE DES TABLEAUX

LISTE DES ABREVIATIONS

Annexe I : Liste des pesticides étudiés... 35

Annexe II : Liste des substances actives visées par la DCE ... 36

Annexe III : Préparation des échantillons ... 38

Annexe IV : Analyse HPLC-MS/MS ... 39 Annexe V : Analyse GC-MS/MS... 41 CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref

INTRODUCTION

Grâce à leur efficacité face aux parasites animaux et végétaux, les « pesticides » ou produits phytosanitaires ont connu une forte émergence à partir des années cinquante. Les pratiques agricoles, communales et des particuliers ont alors évolué et une contamination des divers compartiments de l’environnement (eau, air et sols) s’en est ressentie.

Aujourd’hui, malgré les interdictions de mise sur le marché de certains produits et la constante évolution des normes environnementales, la France n’utilise pas moins de 78 600 tonnes (UIPP 2008) de ces substances actives ce qui n’est pas sans conséquences. En effet, on recense la présence de pesticides dans 91 % des eaux de surface et dans 55 % des eaux souterraines avec, respectivement, des contaminations significatives à hauteur de 36 % et 25 % (IFEN 2007).

Il est donc impératif d’agir pour pouvoir éliminer à la source ces problèmes de pollution. Pour cela, il est nécessaire de suivre de manière constante la qualité des eaux. C’est ce qui a été instauré via la directive cadre européenne sur l’eau (Parlement Européen 2000) qui vise au bon état des ressources en eau d’un point de vue chimique et écologique d’ici 2015. Ceci se traduisant par un suivi de substances prioritaires ou dangereuses comprenant entre autres 14 pesticides (Annexe II). Un autre objectif fixé lors du Grenelle de l’environnement est de réduire de 50 % l'usage des pesticides d’ici 2018.

Or, la teneur en pesticides augmente généralement d’amont en aval des cours d’eau. Ainsi, les grands fleuves peuvent être considérés comme étant des vecteurs de contamination aux pesticides des eaux littorales (Munaron 2004). De ce point de vue, le suivi de la pollution aux pesticides du bassin d’Arcachon constitue un excellent sujet d’études puisqu’il réunit à la fois des enjeux environnementaux, sanitaires et sociaux-économiques.

Au sein de l’unité REBX (Réseaux, Epuration et qualité des eaux), le laboratoire de chimie des eaux du Cemagref de Bordeaux travaille ainsi sur cette problématique via le projet régional OSQUAR (OStréiculture et QUalité du milieu approche dynamique du bassin d’ARcachon). Il fait suite au projet ASCOBAR (Apports Scientifiques face à la problématique COnchylicole du Bassin d’ARcachon) de 2008-2009 et, concernant le volet apports continentaux, il a pour objectifs sur les années 2010-2012 :

- le suivi des pesticides dissous dans la colonne d’eau,

- le suivi du glyphosate et de son produit de dégradation l’acide aminométhylphosphonique (AMPA) ainsi que les herbicides anioniques,

- les pesticides dans les sédiments via quatre prélèvements saisonniers, - l’étude des biofilms de diatomées.

La précédente campagne avait montré des teneurs faibles en herbicides tels que le diuron ou encore le métolachlore. Or, le nombre de molécules analysées était restreint à 33 substances et métabolites. L’élargissement de la gamme d’analytes a été un des aspects traité durant ce stage.

Mon rôle au sein du projet OSQUAR est d’une part de valider une méthode préexistante de dosage de pesticides dans les sédiments à l’aide de la HPLC-MS/MS. D’autre part, j’ai été chargée de développer et de valider le même type de méthode mais en chromatographie gazeuse couplée à un spectromètre de masse en tandem (GC-MS/MS). Les deux méthodes ayant été également appliquées au dosage des Polar Organic Chemical Integrative Samplers (POCIS) pour ce qui est de la colonne d’eau. Suite à cela, une comparaison des teneurs dans

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les sédiments et la colonne d’eau sera faite pour mieux appréhender la dynamique de transfert des pesticides.

1. Généralités

1.1. Les pesticides : définition, mécanismes de transfert et réglementation

Sous le terme « pesticides » se cache une large étendue de composés destinés à lutter contre les parasites animaux ou végétaux ou simplement qui permettent d’avoir un contrôle sur la croissance des végétaux de manière sélective. Ils sont en majeure partie utilisés par les activités agricoles mais aussi pour les activités non agricoles telles que la maintenance des voiries ou tout simplement le jardinage. Ils forment une famille très hétérogène tant du point de vue de leurs mécanismes d’action que du point de vue de leurs caractéristiques physicochimiques. On distingue ainsi trois grandes catégories :

- les herbicides parmi lesquels on retrouve les groupes des amides, acides aryloxyalkanoïques, diphényl-éthers, urées, sulfonylurées, triazines et carbamates, - les insecticides parmi lesquels : les carbamates, pyréthroïdes, et organophosphorés et, - les fongicides comme les triazoles, les dithiocarbamates, les strobilurines …

Depuis l’apparition dans les années 50 des premiers pesticides de synthèse, la production n’a cessé d’augmenter et de nouveaux produits encore plus actifs sont apparus sur le marché. S’en est alors suivi la découverte de problèmes toxicologiques et écologiques liés à ceux-ci.

Il est important de noter que la majeure partie des pesticides utilisés sont les herbicides. Ceci est nettement visible au niveau français car cela représente 872 millions d’euros (UIPP 2008) de chiffre d’affaire soit près de la moitié du chiffre d’affaire total. Or, les herbicides sont beaucoup plus persistants dans les sols que les deux autres familles de pesticides et ils possèdent des sous-produits de dégradation stables qui peuvent s’avérer plus toxiques que la molécule parente elle-même (Andreu and Picó 2004). C’est le cas par exemple pour les produits de dégradation de l’atrazine que sont la déséthylatrazine (DEA) et la déisopropylatrazine (DIA).

Ceci démontre bien l’importance de connaître les mécanismes de transfert de ces polluants dans les différents compartiments de l’environnement pour savoir à quel moment on pourra parler de contamination.

Du fait d’une large gamme de polarité couverte par les phytosanitaires (molécules apolaires à hautement hydrosolubles), les possibilités de contamination sont très différentes. En effet, les molécules hydrosolubles présentent le risque le plus élevé en termes de transfert car elles peuvent constituer une contamination directe via les phénomènes de lessivage des sols, d’infiltration et de ruissellement (Andreu and Picó 2004).

La contamination se fait aussi indirectement via les retombées atmosphériques. En effet, d’autres mécanismes de transfert de pesticides existent (Waxman 1998) :

- dans l’air : via les particules, les gouttelettes rejetées lors de l’application des pesticides ou même par les vapeurs de pesticides,

- mais aussi via des organismes vivants qui ont pu les absorber ou tout simplement les transporter.

Ainsi, les pesticides constituent la principale source de pollution diffuse dans l’environnement. Toutefois, il ne faut pas négliger les pollutions ponctuelles liées au stockage

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dans les cours d’eau dépend des périodes d’application (essentiellement printemps) et de la saisonnalité (épisodes orageux, crues, etc.). Une fois leur transfert effectué dans les divers compartiments de l’environnement, leur devenir peut être varié : ils peuvent être biodégradés ou dégradés chimiquement (par photolyse, hydrolyse, oxydation et réduction) (Andreu and Picó 2004). Tout ceci est résumé sur la Figure 1. Selon le temps de demi-vie, on aura une tendance à retrouver leurs métabolites en plus grande concentration. Donc, une pollution diffuse s’installe dans les eaux de surface et ce avec des molécules bien plus persistantes et polaires que leurs molécules parentes.

Figure 1 : Le devenir des pesticides dans les sols (Andreu and Picó 2004).

A noter que les pratiques agricoles et l’occupation des sols sont en cours de recensement autour du bassin d’Arcachon. Le choix des différents pesticides à étudier a donc été fait en fonction de leur comportement et de leurs usages connus par ailleurs (la liste des analytes sera étendue et affinée ultérieurement).

1.2. Propriétés des substances actives étudiées

Les molécules choisies pour être analysées lors de mon stage ont des caractéristiques physicochimiques assez différentes mais peuvent être considérées globalement comme étant moyennement polaires et mobiles. La polarité est définie par le coefficient de partage octanol/eau KOW sachant qu’une molécule sera dite polaire pour un log KOW inférieur à 1 et

apolaire s’il est supérieur à 3. La mobilité est quant à elle indiquée par le coefficient de partage carbone organique/eau KOC (Wauchope, Yeh et al. 2002). Les valeurs de log KOW et

de KOC ainsi que les temps de demi-vie et la PNEC (Predicted No Effect Concentration) sont

données dans le Tableau 7 en Annexe I. Le log KOW indique la propension à se bioaccumuler

mais aussi si la molécule est préférentiellement analysée en HPLC-MS/MS ou en GC-MS/MS.

Parmi tous les pesticides étudiés, nous allons développer plus en détails certaines des familles représentées. CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref

1.2.1. Les herbicides

Parmi les substances actives auxquelles nous nous sommes intéressés, il y a des herbicides plus hydrophobes que les autres : la trifluraline, la pendiméthaline et l’aclonifène. Les autres principales familles d’herbicides comportent davantage de composés hydrophiles.

1.2.1.1. Les triazines

Elles comprennent des substances actives comme l’hexazinone mais aussi l’atrazine, la simazine, la terbuthylazine et enfin leurs métabolites respectifs la DEA, la DIA et la déséthylterbuthylazine (DET). Les triazines sont d’importants inhibiteurs du transport des électrons lors de la photosynthèse et empêchent ainsi la photolyse de l’eau dans la cellule végétale. Elles sont donc utilisées en agriculture ; principalement pour le désherbage des cultures de maïs (Alvarez 1999).

L’atrazine était la plus utilisée des triazines et possède un temps de demi-vie dans les sols assez court puisqu’elle se dégrade rapidement en DEA et DIA. Ce dernier composé est également un produit de dégradation de la simazine. Du fait de la contamination importante et généralisée des eaux de surface et souterraines qui a été observée, sa mise sur le marché a été interdite en 2001 avec une date butoir d’utilisation des stocks le 30 juin 2003 (Dagnac, Bristeau et al. 2005). Il en a été de même pour les autres triazines excepté pour l’hexazinone qui n’a été interdite qu’à partir de 2007. L’atrazine et la simazine sont inscrites dans la liste des substances prioritaires fixée par la DCE (Parlement Européen 2000) (voir Annexe II). Le Tableau 1 présente les principales caractéristiques des triazines citées.

Tableau 1 : Caractéristiques physicochimiques et écotoxicologiques des principales triazines.

Atrazine Simazine Terbuthylazine

log Kow 2,61 2,18 3,21

Koc 55-135 103-377 166-443

Solubilité (mg.L-1) 33 6,2 11,5

Demi-vie (jours) 40 60 46

Stabilité dans l’eau Stable à tout pH 1-14 jours (hydrolyse)

30-100 jours (photolyse) Stable à tout pH

PNEC * (µg.L-1) 0,3 0,3 Non déterminé

* Predicted No Effect Concentration

Pour palier le manque, certaines chloroacétanilides ont remplacé les triazines.

1.2.1.2. Les chloroacétanilides et les phénylurées

Les chloroacétanilides dont font partie l’alachlore, l’acétochlore, le métolachlore et le métazachlore sont actuellement utilisées dans les cultures de maïs (excepté l’alachlore qui a fait l’objet d’une interdiction récente (31/12/2007)). Le métolachlore est généralement l’herbicide de cette famille le plus utilisé.

Nous avons également les phénylurées parmi lesquelles le diuron, l’isoproturon et le linuron. Leurs utilisations sont diverses : désherbage des cultures de blé et d’orge d’hiver pour

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dégradent dans les sols et sédiments pour donner leurs métabolites : le DCPMU (1-(3,4-dichlorophényl)-3-(méthyl)-urée) pour le diuron et l’IPPMU (1-(4-isopropylphényl)-3-(méthyl)-urée) pour l’isoproturon. De ce fait, ils ont fait l’objet d’interdictions progressives d’utilisation (diminution des quantités appliquées et utilisation en association). Le diuron, l’isoproturon et l’alachlore sont inscrits dans la liste des substances de l’annexe X de la DCE (Parlement Européen 2000) (voir Annexe II). Le diuron est quant à lui interdit depuis 2008… Le Tableau 2 présente les principales caractéristiques des phénylurées citées et de l’alachlore. Tableau 2 : Caractéristiques physicochimiques et écotoxicologiques des principales phénylurées et de l’alachlore.

Diuron Isoproturon Linuron Alachlore

log Kow 2,68 2,87 3,20 2,80

Koc 480 80-230 400 102-150

Solubilité (mg.L-1) 42 70 64 135

Demi-vie (jours) 90-180 12-45 60 30

Stabilité dans l’eau Stable à tout

pH Stable à tout pH Stable à tout pH Stable à tout pH

PNEC (µg.L-1) 0,2 0,3 0,7 0,3

1.2.2. Les insecticides

Lorsque la persistance des organochlorés et la toxicité des organophosphorés ont été mises à jour, il a fallu trouver une échappatoire en employant des pesticides qui se dégradaient plus rapidement, qui étaient plus polaires et moins persistants. La solution est venue des carbamates et de certains organophosphorés. Ces premiers ont été mis à la vente dans les années cinquante et leur utilisation n’a cessé de croître depuis du fait de leur panel de cibles variées et de leur grande efficacité. Les principales propriétés de ces pesticides sont leur polarité, leur hydrosolubilité et leur instabilité thermique (Carabias-Martínez, García-Hermida et al. 2005). Il est à noter que la plupart des carbamates et des organophosphorés ne sont plus homologués (hormis le pyrimicarbe, le chlorpyriphos et le diméthoate) depuis 2008 et donc interdits d’usage. Malgré ces retraits d’usage, des carbamates tels que le carbaryl et le pyrimicarbe, et deux organophosphorés (chlorpyriphos et chlorfenvinphos) ont fait l’objet d’un suivi poussé car ces organophosphorés font partie de la liste des substances prioritaires de l’annexe X de la DCE (Parlement Européen 2000) (voir Annexe II).

1.2.3. Les fongicides

Parmi eux, la principale famille les constituant est celle des triazoles. Les triazoles étudiées sont le cyproconazole, le tébuconazole et l’époxiconazole. Ils sont principalement utilisés dans le traitement du blé et du maïs. Les fongicides tels que l’azoxystrobine, le dimétomorphe et la procymidone sont essentiellement utilisés pour les vignes.

1.3. La stratégie d’échantillonnage

En ce qui concerne mon étude, il y a deux types de matrice à échantillonner et à analyser : les sédiments et l’eau. Ceci implique des techniques d’échantillonnage différentes.

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1.3.1. Les prélèvements de sédiments

Les contaminants présents dans l’eau se répartissent en fonction de leurs caractéristiques physicochimiques que ce soit dans la fraction liquide ou sur les particules solides entraînées par le flux. Ce sont ces dernières qui vont constituer le sédiment suite à leur décantation. Ainsi, il y a un stockage, temporaire ou définitif des contaminants dans la matrice.

Le sédiment va donc concentrer les polluants dans l’espace et le temps : il constitue une matrice plus intégrative que l’eau qui ne peut que témoigner de pollutions ponctuelles. Le sédiment est en contact permanent avec l’eau ce qui peut s’assimiler à un lessivage permanent. Ainsi, les pesticides seront fortement liés à la matrice et formeront une fraction non extractible à l’eau et par extension aux solvants polaires. Il existe donc que peu d’études et de données en ce qui concerne les composés polaires. C’est dans le but d’en apprendre plus que nous étudions ce type de substances.

1.3.2. Echantillonnage des pesticides dans la colonne d’eau

Afin de pouvoir avoir une évaluation fiable de la quantité de pesticides dans les eaux, deux techniques d’échantillonnage existent : l’échantillonnage actif et l’échantillonnage passif. L’échantillonnage actif comprend trois techniques différentes : le prélèvement ponctuel, automatique intégré à pas de temps fixe et automatique intégré à volume passé fixe. Les prélèvements ponctuels ne sont pas vraiment représentatifs car ils peuvent nous faire manquer une forte augmentation des teneurs en pesticides pendant des épisodes de crue par exemple. En ce qui concerne les mesures intégrées, elles sont bien sûr plus fiables mais nécessitent de traiter un très grand nombre d’échantillons et donc nécessitent des coûts et durée d’analyses plus élevés. C’est pour cela que le laboratoire a plutôt opté pour l’échantillonnage passif.

1.3.2.1. L’échantillonnage passif

Il permet de suivre - de manière intégrée et sur une période définie - les teneurs des molécules cibles (organiques ou inorganiques) dans le milieu considéré. Les échantillonneurs passifs sont généralement constitués d’un adsorbant (ou absorbant) qui va permettre de piéger les contaminants chimiques sans mécanisme d’extraction actif. Il se produit alors un phénomène constant de diffusion des composés cibles du milieu vers l’échantillonneur jusqu’à arriver à un équilibre (qui n’est en fait pas atteint étant donnée l’échelle de temps sur laquelle on se place). Du fait de l’accumulation, cette technique permet d’analyser des composés à l’état de traces.

Il a fallu attendre les années 70 pour voir apparaître les premiers échantillonneurs passifs destinés au captage des composés organiques et, ce, pour observer la qualité de l’air (Kot-Wasik, Zabiegala et al. 2007). Quant aux premiers échantillonneurs pour les molécules organiques hydrophobes contenues dans les eaux, ils n’ont été usités qu’à partir de 1987 (Södergren 1987). S’en est alors suivi le développement croissant des techniques d’échantillonnage passif.

Aujourd’hui les systèmes les plus connus étant les DGT (Diffusion Gradient in Thin-film) pour les métaux, les SPMD (Semi-Permeable Membrane Devices) pour les molécules organiques apolaires (Huckins, Manuweera et al. 1993) et les POCIS pour les molécules organiques polaires (Alvarez 1999). Ces derniers sont ceux que l’on utilise pour capter les pesticides de la colonne d’eau.

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1.3.2.2. Les POCIS

Il existe deux types de configuration pour les POCIS : pesticides et pharmaceutiques. La différence se situe dans l’adsorbant employé. Suite à une étude réalisée au sein du Cemagref, il a été décidé d’utiliser la configuration pharmaceutique (Mazzella, Dubernet et al. 2007). Le POCIS permet d’échantillonner en théorie des molécules avec un log KOW inférieur à 4. Il

est constitué de deux membranes de polyéthersulfone entre lesquelles on ajoute environ 200 mg d’un adsorbant microporeux : c’est le même adsorbant que celui utilisé pour la SPE c'est-à-dire la phase Oasis HLB (Hydrophilic Lipophilic Balance) constituée d’un co-polymère poly[divinylbenzène]-co-N-vinylpyrrolidone. Tout ce dispositif est alors maintenu par deux anneaux en inox (Figure 2).

Figure 2: Conception d’un POCIS.

Les membranes en polyéthersulfone permettent une relative inertie chimique et donc les interactions avec les molécules polaires sont limitées. De plus, la formation de biofilms est elle aussi limitée. Cependant, il est important de noter que du fait de la porosité de 0,1µm seules les molécules présentes dans la fraction dissoute peuvent être échantillonnées.

En supposant des isothermes linéaires, l’accumulation dans le temps des analytes dans le POCIS est proportionnelle à la concentration dans l’eau Cw (µg.L-1) et, inversement, la

désorption de ces mêmes molécules est proportionnelle à la concentration dans le POCIS CPOCIS (µg.g-1). En prenant comme modèle une cinétique d’ordre 1 et en considérant la masse

d’adsorbant MPOCIS, le temps d’exposition (j) et le taux d’échantillonnage RS (L.j-1), on peut

utiliser la relation (Obeidy 2007) :

POCIS S W POCIS M t R C C = × ×

Ainsi, il est possible de calculer les concentrations moyennes dans l’eau sur la durée d’exposition par la relation suivante :

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t R M C C s POCIS POCIS W × × =

Avec Cw la concentration dans l’eau pondérée selon la durée la d’exposition t. Les taux

d’échantillonnage Rs ont été précédemment déterminés lors d’expériences de calibration en

microcosmes au laboratoire avec des conditions de température, de vitesse de courant et d’obscurité contrôlées (Mazzella, Dubernet et al. 2007; Fauvelle 2009).

1.3.3. Les sites d’échantillonnage

Pour réaliser un « screening » des niveaux de contamination en pesticides dans le Bassin d’Arcachon, 9 sites de prélèvements pour les sédiments et POCIS ont été choisis (Figure 3).

Figure 3 : Localisation des points d’exposition des POCIS et de prélèvement des sédiments (1. Craste de Nézer, 2. Canal des Landes, 3. Bourg, 4. Leyre, 5. Ponteils, 6. Lanton, 7. Betey, 8. Cirès, 9. Canal des Etangs).

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2. Matériels et méthodes

2.1. Mise en place des POCIS

Les POCIS ont été disposés dans des cages de polyéthylène afin d’éviter le dépôt de macrodébris. Ces cages permettent le passage de l’eau à une vitesse de courant réduite. Elles ont été placées sous la surface dans des stations homogènes représentatives de la masse d’eau étudiée. Les POCIS ont été exposés 28 jours, ce qui permet également de préconcentrer encore plus d’analytes et baisser les limites de détection de la méthode. On a procédé de cette manière en sachant que les eaux sont légèrement acides (pH = 5,5-6,5) et plutôt chargées en matière organique (COD = 3,4 à 20 mg.L-1).

Au laboratoire, les POCIS sont démontés et l’on récupère la phase adsorbante dans des cartouches qui sont alors éluées pour récupérer les molécules d’intérêt. Ces éluats sont ensuite analysés en HPLC-MS/MS et GC-MS/MS.

2.2. Echantillonnage des sédiments et traitement des échantillons

Les prélèvements se font dans des bocaux en verre préalablement rincés avec l’eau de la station d’échantillonnage. La quantité de sédiments prélevée est prévue de manière à avoir la quantité nécessaire aux analyses qui vont y être appliquées (minimum 10 g). De manière générale, on remplit les bocaux pour d’une part limiter la quantité d’air et donc d’oxygène qui peut contribuer au développement des microorganismes ; d’autre part, l’excès de sédiments pourra servir à des études ultérieures. Lorsque l’on effectue le prélèvement on essaie également d’avoir le moins d’eau possible pour toujours limiter le développement bactérien et également pour faciliter la préparation de l’échantillon avant analyses (congélation puis lyophilisation plus rapide). Les prélèvements se font en surface (sur les 2-3 premiers centimètres) afin d’échantillonner les dépôts les plus récents et les métabolites produits en conditions aérobies.

Enfin, il est important de perturber le moins possible le milieu lors du prélèvement. En effet, si l’intégrité du sédiment est compromise, on peut avoir des problèmes de fiabilité vis-à-vis des études toxicologiques car on modifierait les caractéristiques tant physicochimiques que biologiques et donc les phénomènes de partage, de complexation, de spéciation et de biodisponibilité des substances toxiques (Environnement Canada 1994).

Suite au prélèvement, les sédiments sont transportés dans une glacière avant d’être mis au congélateur à -18°C au laboratoire.

2.2.1. La lyophilisation

Avant de pouvoir procéder à l’extraction, il est nécessaire de lyophiliser les sédiments.

La lyophilisation est le procédé le plus doux pour déshydrater les produits chimiques et biologiques. Le séchage est alors réalisé sans passer par un état liquide mais directement par sublimation. Pour cela, les sédiments préalablement congelés sont placés dans une enceinte sous vide (1 mbar). Le condenseur (à -50°C) agit alors comme une « pompe à vapeur » car il gèle l’humidité qui s’évapore par sublimation sous vide. Il faut savoir que la pompe à vide va uniquement pomper l’air de la chambre de dessiccation et non pas les vapeurs. La lyophilisation présente ainsi l’avantage de pouvoir sécher sans dénaturer les composants chimiques. Il n’y aura ainsi aucune modification qualitative ou quantitative.

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La lyophilisation se fait en deux étapes avec un lyophilisateur «ALPHA 1-2 LDplus CHRIST »:

- La dessiccation primaire au cours de laquelle il faut amorcer le phénomène de sublimation en apportant de la chaleur. Cette première étape va retirer l’eau « libre » de l’échantillon. La durée de cette phase est variable selon l’épaisseur de la couche d’échantillon, la quantité de matière solide dans celui-ci, la chaleur appliquée pendant la lyophilisation ainsi que la pression dans la chambre pendant la lyophilisation. Pour les bocaux de sédiments, cette phase a duré environ 18 heures.

- La dessiccation secondaire va quant à elle éliminer l’eau liée par adsorption et ce grâce à la mise en place d’un vide très poussé (0,040 mbar). Cette phase a duré environ 6 heures ce qui porte la durée du processus de lyophilisation pour les sédiments à 24 heures.

Une fois les sédiments lyophilisés, l’extraction par solvant sous pression ou « accelarated solvent extraction » (ASE) a été réalisée.

2.2.2. L’ASE

La méthode de référence d’extraction des analytes d’une matrice solide est le Soxhlet qui consiste en des percolations répétées (cycles) avec un solvant plus volatil que les analytes. Ainsi le solvant non chargé en analytes va s’évaporer sous un chauffage à faible température et petit à petit la concentration en analytes augmente. Mais cette technique nécessite l’emploi d’une quantité importante de solvant (de 200 à 500 mL) et prend beaucoup de temps (48 à 72 heures). De nouvelles techniques ont alors émergé en jouant sur deux paramètres importants : la température et la pression.

L’ASE va permettre l’extraction rapide et efficace des analytes contenus dans une matrice solide (les sédiments) à l’aide de solvants organiques. Pour cela, on se place à haute température ce qui provoque une meilleure solubilisation des analytes et une meilleure diffusion dans la couche organique. Et l’on se place également à haute pression ce qui permet d’atteindre des températures hautes sans vaporisation des solvants.

Le solvant est mis sous pression avec une pompe. Il va alors percoler dans la cellule d’extraction en inox placée dans un four. L’ajout de solvant se fait dans la technique utilisée en mode statique (c'est-à-dire que l’on a un même volume de solvant pendant toute la durée d’un cycle d’extraction). En fin de cycle, la cellule est purgée par balayage d’un gaz inerte (le diazote) et l’on récupère l’extrait dans un flacon (Figure 4).

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Figure 4 : Schéma de principe de l’ASE.

Les paramètres d’extraction utilisés pour l’ « ASE 200 DIONEX » avaient été optimisés auparavant en laboratoire au moyen d’un plan d’expérience. Les paramètres ont été fixés ainsi :

- pression : 100 bars, - température : 115°C,

- solvant : mélange binaire 85% méthanol/15% dichlorométhane, - 2 cycles d’extraction,

- 30% flush (c'est-à-dire la quantité de solvant nécessaire pour chaque cycle et exprimée en pourcentage de volume de la cellule).

Après extraction, les extraits sont purifiés. La préparation de l’échantillon à l’ASE et le protocole de purification sont exposés en Annexe III.

2.3. L’analyse en HPLC-MS/MS

2.3.1. La séparation par HPLC

L’HPLC est une technique qui a été mise au point en 1967 par Huker et Hulsman et a très vite fait concurrence à une autre technique chromatographique : la chromatographie en phase gazeuse (GC). En effet, contrairement à la GC qui ne permet d’étudier que des molécules volatiles, l’HPLC peut pratiquement s’appliquer à tous les mélanges sans avoir besoin de faire de dérivation. Elle est donc toute indiquée dans l’analyse multirésidus en particulier en ce qui concerne les molécules thermosensibles ou de haute masse moléculaire et/ou polaires. De

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plus, le fait que l’on puisse jouer sur la sélectivité des molécules par le choix de la colonne et la composition de l’éluant, fait de l’HPLC un formidable outil.

Les détails de la méthode HPLC sont explicités en Annexe IV.

2.3.2. La détection par spectrométrie de masse en tandem : source electrospray (ESI)

La spectrométrie de masse repose sur l’ionisation et la fragmentation des molécules. L’ionisation va permettre d’augmenter l’énergie des molécules qui, en se dissipant va provoquer la rupture des liaisons interatomiques. On obtient alors des ions fragments caractérisés par leur rapport masse sur charge m/z. Ceux-ci sont alors accélérés puis séparés via un analyseur en fonction de ce rapport et sont détectés en fonction de leur abondance relative. Les performances analytiques d’un spectromètre de masse étant caractérisées par la limite en masse, le pouvoir de résolution (c'est-à-dire la capacité à séparer deux molécules caractérisés par des rapports m/z assez proches) et la sensibilité.

La source ESI est bien adaptée au couplage de l’HPLC avec le spectromètre de masse. Cette technique atteint des sensibilités très élevées. Ce mode d’ionisation s’effectue à pression atmosphérique et à une température de source de 450°C: c’est une technique d’ionisation douce. L’échantillon en solution est introduit dans l’appareil par l’intermédiaire d’un capillaire dont l’extrémité traverse une aiguille métallique portée à un potentiel de plusieurs kilovolts. Il en résulte alors la formation de gouttelettes monochargées (ionisation négative) ou polychargées (ionisation positive) qui conduisent, par désolvatation (due à l’augmentation progressive de la tension électrique et à la circulation d’un gaz de nébulisation : le diazote) à des ions en phase gazeuse. À quelques millimètres de l’aiguille se situe une contre électrode qui dirige le faisceau ionique vers l’interface (orifice conique). Un flux d’azote à contre courant du trajet des ions permet de sécher les solvants résiduels. Au fur et à mesure de l’évaporation du solvant, la taille des gouttelettes diminue jusqu’à explosion coulombiennes (Figure 5).

Figure 5 : Principe de l’electrospray (http://www.bio.espci.fr/fr/perso/vinh/ch3_esi.pdf).

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L’analyseur est du type triple quadripôle ce qui permet la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS). Il consiste en 3 quadripôles en série : Q1, Q2 et Q3. Le principe est le suivant : suite à la désolvatation par la source ESI, les ions sont séparés selon leur rapport m/z dans Q1 aussi nommé quadripôle de tri. Un ion précurseur ou « ion parent » est alors isolé. C’est ce même ion qui va être fragmenté dans le quadripôle de collision Q2 dans lequel circule un flux d’argon et soumis à une énergie de collision ; on obtient alors un ou des « ion(s) fils ». Enfin, Q3 va balayer les ions fils qui sont à leur tour séparés selon leur rapport m/z.

La sélection simultanée d’un ion parent et d’un ion fils caractéristique correspond à une transition (notée Q1>Q3) qui permet une détection spécifique et un rapport signal sur bruit (S/N) très élevé. Ceci correspond au mode d’acquisition « Selected Reaction Monitoring» (SRM) qui est privilégié pour les approches quantitatives telles que les analyses multirésidus.

2.4. L’analyse en GC-MS/MS

Comme on a pu le constater précédemment, la séparation en HPLC est un outil de choix et recouvre également le domaine d’application de la chromatographie gazeuse (GC). Cependant, dans ce même domaine, la GC est beaucoup plus résolutive et efficace. Il est donc intéressant d’étudier les teneurs en pesticides grâce à cette technique lorsque cela est envisageable. La GC consiste en un partage des solutés entre la phase mobile (hélium) et la phase stationnaire.

En ce qui concerne la détection, on a encore affaire à la spectrométrie de masse à analyseur triple quadripôle. En revanche, la technique d’ionisation est différente. Pour la GC, on utilise en effet la méthode la plus répandue : l’ionisation par impact électronique. Ce mode d’ionisation fonctionne sur le principe suivant : les molécules de la chambre d’introduction sont bombardées par un flux d’électrons de forte énergie. Quelques molécules sont alors ionisées selon la réaction : M + e- M+. + 2 e- où M+. est l’ion moléculaire. Puis suite à des réactions secondaires et à des réarrangements, on obtient de nombreux fragments ce qui est bien différent de l’ESI où l’on obtient uniquement l’ion moléculaire majoritaire.

Etant donné la récente acquisition de cette GC-MS/MS, la méthode de quantification des pesticides n’existait pas en mode SRM (méthode pré-existante en full-scan avec une trappe ionique). Il a donc fallu transposer et développer la méthode en utilisant les essais de transitions qui avaient déjà été faits en amont (fournisseur) et que nous avons dû ensuite optimiser pour certains composés. Ainsi nous avons donc dû déterminer les transitions pour les molécules à étudier.

C’est le cas par exemple de trois des étalons internes (chlorpyriphos D10, métolachlore D6 et tébuconazole D6). Pour ce faire, nous avons dans un premier temps procédé à un balayage MS/MS en mode full scan. Le mode full scan permet l’acquisition de façon répétée des spectres de masse complets entre deux masses extrêmes et on totalise les courants de tous les ions arrivant au détecteur pendant chaque acquisition. Ceci permet de sélectionner des transitions possibles. Ces transitions ont alors ensuite été testées en mode SRM. On a alors choisi une transition sur les deux imaginées en choisissant celle où on obtenait un pic avec le meilleur rapport signal sur bruit (et si possible l’abondance la plus élevée). Enfin, les énergies de collision ont été optimisées en essayant chacune des transitions choisies avec une énergie de collision différente. Nous avons donc obtenu après cela les transitions de l’ensemble des molécules (Tableau 11 en Annexe V). Une fois toutes les transitions déterminées, nous avons optimisé les conditions d’injection. Dans un premier temps, nous avons modifié la résolution en passant d’une résolution unitaire de 0,7 FWHM (Full Width Half Maximum ou largeur à mi-hauteur) à 0,4 FWHM afin de gagner éventuellement en spécificité et de réduire le bruit de

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fond. La spécificité n’était pas réellement différente avec la résolution la plus basse et les résultats apparaissaient légèrement moins satisfaisants en termes d’abondance des ions. Suite à cela il a été décidé d’utiliser une résolution de 0,7 FWHM. Toutes ces manipulations ont été faites avec l’injecteur en mode « CT (Constant Temperature) splitless ». Ce mode permet l’injection de tout l’échantillon car il n’y a pas de division du flux. Ensuite, nous avons décidé de tester et d’optimiser le mode PTV (Programmable Temperature Variations) splitless car en théorie cela devrait réduire les risques de décomposition des composés thermolabiles. Or, en pratique, le mode « CT splitless » s’est avéré plus intéressant (sensibilité accrue). Le « CT splitless surge » consiste à appliquer une surpression ce qui permet d’injecter des volumes plus importants. De plus, cela augmente le débit de la phase mobile et donc permet un transfert dans la colonne beaucoup plus rapide ce qui limite les interactions analytes/insert. Le temps de surpression peut être optimisé mais pour nos analyses il a été choisi d’appliquer le même temps que le temps de splitless, soit 0,5 minutes. On a également appliqué un « stop purge time » qui peut être intéressant pour les molécules thermolabiles. Il s’est avéré que ce mode était plus efficace que le mode « CT splitless » simple et que le PTV. Donc c’est le « CT splitless surge » qui a été choisi par la suite.

Comme on est en mode splitless et que tout est injecté dans la colonne, alors beaucoup de solvant est aussi injecté. Il est alors nécessaire de resserrer la bande d’injection ce qui est fait en installant une pré-colonne d’un diamètre interne supérieur à celui de la colonne (retention gap). On a alors obtenu des résultats bien meilleurs en termes de symétrie et largeur de pics (surtout pour les plus volatils et les plus polaires).

Enfin, un dernier paramètre a été testé : l’injection en aiguille chaude ou l’injection rapide. Cela consiste à laisser l’aiguille dans l’injecteur pour la chauffer avant l’injection ce qui permet une évaporation douce. Ceci est très intéressant pour les molécules thermolabiles. Les résultats obtenus ont été très satisfaisant. L’injection en aiguille chaude a donc été adoptée. Les paramètres de la méthode finale sont exposés en Annexe V. Suite à cela, la méthode de quantification a également été mise au point avec le choix des transitions de quantification et de confirmation et le choix des étalons internes appropriés (Annexe V).

3. Résultats et discussions

3.1. Estimation des effets de matrice en HPLC-ESI-MS/MS et purification des extraits

Les sédiments constituent une matrice solide chargée en matière organique. Or, c’est sur cette matière organique que se fixent les pesticides (Villaverde, Hildebrandt et al. 2008). Il a été démontré, par exemple, qu’il existait une corrélation entre la matière organique contenue dans les sédiments et les organochlorés (Gonzalez Farias, Hernandez-Garza et al. 2006).

C’est cette matière organique qui peut alors provoquer des effets de matrice. En effet, les échantillons réels vont contenir des interférents qui peuvent ne pas être complètement séparés des analytes pendant la purification des extraits bruts surtout en ce qui concerne les méthodes multirésidus (Godula, Hajslova et al. 1999). Pour estimer les effets de matrice, des ajouts dosés post-extraction de 20 µg.L-1 ont été faits dans les extraits des sédiments des stations 2 et 3 prélevés au cours de la campagne de l’année précédente. On a ainsi pu évaluer les rendements des dopages obtenus après analyse en HPLC-MS/MS. Le Tableau 3 montre les teneurs obtenues après analyse et les rendements associés.

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Tableau 3 : Estimation des effets de matrice lors de l’analyse HPLC-MS/MS des sédiments.

Sédiment station 2 Sédiment station 3

Concentrations (µg.L-1) Rendements (%) Concentrations (µg.L-1) Rendements (%) Azoxystrobine 4,1 21 4,0 20 Carbendazime 9,5 48 8,5 43 Carbofuran 16,3 82 17,5 88 3-hydroxy-carbofuran 13,9 70 14,8 74 Chlortoluron 14,9 75 13,8 69 DCPMU 20,5 102 26,2 131 DCPU 19,4 97 22,6 113 Diméthoate 13,3 67 14,3 72 Dimétomorphe 8,0 40 7,5 37 Diuron 22,2 111 23,4 117 IPPMU 15,4 77 15,0 75 IPPU 20,1 101 23,7 119 Isoproturon 16,2 81 14,7 74 Linuron 21,1 106 19,4 97 Méthomyl 19,7 99 21,5 108 Métoxuron 11,7 59 10,6 53 Pyrimicarbe 19,8 99 20,3 101 Thiodicarbe 16,2 81 14,6 73

On admet qu’il n’y a pas d’effets de matrice significatifs en considérant une erreur maximale tolérée (EMT) de +/- 20 % pour les rendements des ajouts dosés. Les EMT ayant été définies à partir de calculs d’incertitude antérieurs. On voit que pour certaines molécules, l’effet de matrice est assez faible puisqu’on approche 80% de rendement. En revanche, d’autres composés comme l’azoxystrobine, la carbendazime, le dimétomorphe et le métoxuron sont très touchés par les interférences. Il est donc nécessaire d’effectuer une étape de purification (pour éliminer les acides humiques et fulviques) dont les étapes sont spécifiées en Annexe III. Deux purifications différentes ont été testées : la purification sur cartouche Oasis MAX (Mixed-mode Anion eXchange) et sur cartouche NH2 (échangeurs d’anions faibles). Elles ont

été faites sur le sédiment de la station 3 (matrice pour laquelle on a observé le plus d’interférences) et en trois réplicats pour chaque cartouche. Puis nous avons réalisé de nouveau un ajout dosé de 20 µg.L-1 après la purification. Les cartouches Oasis MAX sont constituées d’une phase non polaire de poly[divinylbenzène]-co-N-vinylpyrrolidone sur laquelle une amine quaternaire constamment chargée (pKa>18) est greffée. Elles vont donc avoir une forte rétention pour les acides et seront a priori plus efficaces que les cartouches NH2 qui sont composées de silice greffée avec un groupement aminopropyl (pKa=9,8). Ces

dernières étant chargées qu’en milieu acide ou neutre.

Le Tableau 4 donne les teneurs et rendements obtenus suite aux purifications effectuées.

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Tableau 4 : Estimation des effets de matrice lors de l’analyse HPLC-MS/MS des

sédiments suite aux purifications sur cartouches NH2 et Oasis MAX.

Rendements Oasis Max (% C.V.) Rendements NH2 (% C.V.)

Azoxystrobine 50 (6) 48 (15) Carbendazime 56 (4) 47 (6) Carbofuran 125 (5) 80 (2) 3-hydroxy-carbofuran 106 (5) 80 (5) Chlortoluron 82 (5) 75 (7) DCPMU 94 (8) 88 (5) DCPU 99 (9) 93 (10) Diméthoate 106 (2) 76 (7) Dimétomorphe 47 (6) 50 (10) Diuron 90 (7) 81 (2) IPPMU 72 (8) 70 (7) IPPU 77 (11) 82 (2) Isoproturon 73 (3) 70 (5) Linuron 87 (6) 87 (3) Méthomyl 115 (8) 82 (4) Métoxuron 61 (2) 66(3) Pyrimicarbe 110 (4) 78(3) Thiodicarbe 80 (30) 84 (13)

On remarque que les effets de matrice subsistent pour les molécules indiquées précédemment mais qu’ils sont déjà beaucoup moins importants (par exemple, nous obtenons un rendement post-purification plus de deux fois supérieur à celui sans purification pour l’azoxystrobine et nous avons même éliminé l’effet de matrice sur le diméthoate). Ainsi, une étape de purification sur cartouche Oasis MAX après extraction sera mise en place pour le traitement ultérieur des sédiments.

3.2. Validation de méthodes

3.2.1. La norme AFNOR NF T90-210

Afin de connaître les performances et l’applicabilité des méthodes utilisées au laboratoire, une validation de celles-ci est nécessaire. Dans le cadre de ce stage, nous nous sommes intéressés à la validation d’une méthode préexistante de dosage de 33 herbicides en HPLC-MS/MS et ensuite à la méthode développée pour le dosage de 30 pesticides en GC-MS/MS. Pour cela nous nous sommes appuyés sur la norme AFNOR NF T90-210 « Qualité de l’eau – Protocole d’évaluation initiale des performances d’une méthode dans un laboratoire » qui a été révisée en mai 2009. Du fait du temps imparti, tous les aspects de la validation de méthode n’ont pu être traités. Grâce aux recommandations de la norme en ce qui concerne les plans d’expérimentation et les outils statistiques à utiliser, nous avons toutefois pu étudier :

- Etude de la fonction d’étalonnage : elle permet d’évaluer la capacité d’une méthode d’analyse à fournir une réponse instrumentale proportionnelle à la quantité d’analyte à

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concerne l’HPLC-MS/MS : 1-50 µg.L-1 et pour la GC-MS/MS : 1-500 µg.L-1). Le choix de l'intervalle considéré étant de la responsabilité du manipulateur. Lorsqu’un modèle basé sur une régression linéaire est employé (ce qui est préférable et a été mis en œuvre ici), le contrôle de la linéarité se fait sur un minimum de 5 niveaux de concentrations et 5 répétitions par niveau dans des conditions de répétabilité. La validation du modèle de régression met en œuvre un test statistique de Fisher qui va comparer les écarts entre les moyennes des points expérimentaux et la droite estimée, à l’erreur résiduelle par une analyse de variance. Ceci va ainsi permettre de préciser le domaine d’utilisation de la méthode en fonction de l’ « erreur de linéarité » que l’on est prêt à accepter. Par ailleurs, la distribution et la dispersion des résidus sont étudiées et des EMT de +/-20 % ont été choisies pour tous les points de la gamme hormis le niveau le plus bas (EMT de +/- 40 %). Ceci permet de définir une tolérance pour les points de contrôle (e.g. injection régulière de deux étalons à 5 µg.L-1 et 25 µg.L-1 lors d’une séquence HPLC-MS/MS). La linéarité n’a été vérifiée que pour la méthode GC-MS/MS car cela avait déjà été fait pour la méthode HPLC-GC-MS/MS.

- la spécificité : on considèrera qu’une méthode est spécifique lorsqu’elle produit une réponse uniquement pour l’analyte d’intérêt. Elle se détermine après optimisation de la méthode d’extraction sur 10 essais. Elle consiste en l’étude du recouvrement d’ajouts dosés post-extraction sur des échantillons représentatifs du domaine de linéarité de la méthode. Pour ce faire, un test bilatéral de Student est réalisé.

- les rendements : Ils sont réalisés lorsque la méthode est spécifique en effectuant 5

extractions avec un même échantillon dopé à deux niveaux de

concentration correspondant à 20 et 80% de la gamme d’étalonnage. Pour notre étude seule la limite haute a été faite avec un dopage pour l’HPLC-MS/MS et la GC-MS/MS de respectivement 40 et 400 µg.L-1. La moyenne et l’écart-type sont alors déterminés. - les limites de quantification (LOQ) : Elles représentent la plus petite quantité d’analyte

qui peut être quantifiée avec un niveau de confiance donné. Elles sont également à réaliser lorsque la méthode est spécifique. Elles se déterminent à partir d’un unique dopage (à la concentration suspectée d’être la LOQ) en vérifiant qu’elles se trouvent bien dans les zones EMT (+/- 60 % d’après la norme). Par manque de temps, les LOQ ont été déterminées de manière qualitative en faisant le calcul suivant :

LOQ = teneur observée/rapport signal sur bruit

Ce ne sont donc que des estimations à confirmer ultérieurement avec des dopages. D’autres paramètres de validation existants n’ont pas été vérifiés et seront abordés également ultérieurement : exactitude et calculs d’incertitude.

3.2.2. Validation HPLC-MS/MS

Le Tableau 5 montre les résultats concernant la validation de la méthode pour 18 des 33 pesticides dosés en HPLC-MS/MS (seulement 18 car ce sont celles qui sont quantifiées dans les sédiments pour le projet Région Aquitaine OSQUAR et que certaines d’entre elles seront préférentiellement étudiées en GC-MS/MS).

On considèrera qu’une molécule est spécifique (vert dans le Tableau 5) si la pente de droite de recouvrement des ajouts dosés est non significativement différente de 1, soit encore que l’intervalle de confiance de la pente (valeur de la pente a +/- t.Sa avec Sa l’écart-type de la pente et t la valeur tabulée de Student pour un intervalle de confiance à 99 %) encadre cette

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valeur de 1. L’origine b est testée de la même manière avec une valeur idéale de 0. Si la méthode n’est pas spécifique pour une molécule donnée (rose dans le Tableau 5), dans ce cas on ne détermine ni le rendement ni la LOQ à quelques exception près.

Tableau 5 : Paramètres de validation des molécules dosées en HPLC-MS/MS. Spécificité

Pesticides Familles log

KOW Pente (Sa)a Origine (Sb)a Rendementb (% C.V.) LOQ (ng/g sédiment) Acétochlore Chloroacétanilide 3,03 0,6725 (0,055) 1,6715 (1,424) 59 (23,8) 0,17 Azoxystrobine Strobilurine 2,50 0,6472 (0,056) 1,1874 (1,449) Carbendazime Carbamate 1,52 0,9352 (0,065) 3,2097(1,691) 63 (22,4) 0,01 Carbofuran Carbamate 2,32 0,8260 (0,047) 0,4360 (1,234) 91 (25,7) 0,04 3-hydroxy-carbofuran Carbamate 0,76 0 ,7868 (0,036) 1,3743 (0,930) 84 (19,9) 0,07 Chlortoluron Phénylurée 2,41 0,7689 (0,049) 2,4715 (1,272) 77 (22,8) 0,03 DCPMU Phénylurée 2,46 0,9461 (0,085) -0,0700 (2.221) 90 (20,8) 0,18 DCPU Phénylurée 2,00 1,0362 (0,068) -0,3533 (1,769) 89 (17,3) 0,40 Diméthoate Organophosphoré 0,78 1,0988 (0,047) -2,0471 (1,217) 55 (25,3) 0,04 Dimétomorphe Morpholine 2,68 0,8174 (0,046) -0,0772 (1,193) 79 (20,7) 0,01 Diuron Phénylurée 2,68 0,9303 (0,055) 0,8874 (1,429) 84 (22) 0,12 IPPMU Phénylurée 2,63 0,8765 (0,05) 2,0855 (1,326) 68 (19,8) 0,03 IPPU Phénylurée 2,16 0,9627 (0,041) 0,4292 (1,075) 77 (19) 0,25 Isoproturon Phénylurée 2,87 0,7413 (0,045) 2,7544 (1,184) 62 (19,3) 0,01 Linuron Phénylurée 3,20 0,7461 (0,055) 2,4976 (1,431) 75 (26,1) 0,13 Métazachlore Chloroacétanilide 2,13 0,8813 (0,042) 0,1567 (1,102) 79 (29,1) 0,01 Méthomyl Carbamate 0,60 0,9238 (0,070) -0,2687 (1,826) 22 (41,6) 0,05 Métoxuron Phénylurée 1,64 0,6812 (0,045) 1,7557 (1,165) Pyrimicarbe Carbamate 1,70 0,9016 (0,036) 0,3705 (0,949) 78 (24,9) 0,01 Thiodicarbe Carbamate 1,70 1,0069 (0,075) -1,0377 (1,959) 1 (37,4) 0,01 CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref

On remarque que sept molécules présentent un défaut de spécificité. Cependant, il faut relativiser ces résultats. En effet, on pourra considérer que l’acétochlore, le 3-hydroxy-carbofuran, le chlortoluron, l’isoproturon et le linuron peuvent être spécifiques car l’écart-type indique que la limite haute de l’intervalle de confiance (a+t.Sa) est très proche de 1. Les pentes sont proches de 0,75 et il apparaît que le test de Student n’est pas acceptable essentiellement à cause du faible écart-type (le cas contraire étant aussi envisageable et montre les limites et précautions à prendre avec ce type de validation). Le défaut de spécificité étant un légèrement plus important pour l’acétochlore, l’azoxystrobine et le métoxuron.

Ces défauts de spécificité peuvent s’expliquer en partie par les effets de matrice. En effet, lorsque que nous avons estimé ceux-ci avant le développement de la méthode GC-MS/MS, on a pu remarquer que même après l’étape de purification il subsistait de forts effets de matrice en ce qui concerne l’azoxystrobine et le métoxuron (Tableau 4). En revanche, l’effet de matrice n’était pratiquement plus visible après purification pour l’isoproturon. Ainsi, on observe une tendance identique ce qui montre une corrélation entre l’effet de matrice et la spécificité. En effet, la réponse avec l’ionisation electrospray est affectée par les interférents ionisables et polaires qui peuvent être présents dans la matrice et qui peuvent ainsi perturber le processus d’ionisation. Ainsi pour remédier à ces défauts de spécificité, on va pouvoir agir sur l’effet de matrice. Une solution aurait été de revoir la purification mais cette approche est longue à développer et rarement efficace pour toutes les molécules, voire un risque de perte de rendement. Ainsi la solution la plus simple qui semble se dégager est d’agir sur le choix des étalons internes.

Lors d’un étalonnage, il n’est pas rare que la réponse du détecteur ne soit pas parfaitement proportionnelle à la concentration de l’analyte dans la gamme de concentration choisie. L’étalonnage interne va reposer sur l’ajout en quantité connue, dans la gamme étalon et les échantillons, d’une molécule qui sera prise comme référence et permettra de corriger les écarts à la linéarité. L’étalon interne est ajouté avant injection afin de s’affranchir des pertes qui peuvent justement provenir des étapes d’extraction et de purification. Aucun traceur n’a été employé (ajout initial dans l’échantillon) mais il est envisagé d’en utiliser ultérieurement. Les molécules marquées avec un isotope stable (deutérium dans notre cas) peuvent être utilisées comme étalon interne et/ou traceur lorsqu’on a une détection par spectrométrie de masse. L’étalon interne ne doit pas être un composant de l’échantillon, doit être différentiable des molécules à quantifier et surtout avoir des propriétés physicochimiques très proche de ceux-ci. Or, cette dernière caractéristique n’est pas très bien remplie en ce qui concerne l’étalon interne associé au métoxuron : le diuron D6. En effet, même s’ils font tous deux partie de la famille des phénylurées, ils ont des polarités assez différents ce qui a une influence notable car les interférents sont polaires et donc il va y avoir une différence de comportement entre la molécule et son étalon interne. Il en est de même en ce qui concerne l’azoxystrobine bien qu’il faille aussi noter une différence de structure par rapport à l’atrazine D5, son étalon interne. Une solution serait de changer par la suite d’étalon interne pour être mieux adapté.

Sur le Tableau 5, on remarque également que l’on a des rendements faibles, voire très faibles en ce qui concerne le thiodicarbe et le méthomyl. Ainsi, leur quantification ne sera pas vraiment significative même en appliquant des facteurs de correction, il serait donc préférable de les exclure de la méthode. Enfin, la méthode n’est pas actuellement validée pour l’acétochlore, l’azoxystrobine et le métoxuron à cause d’un défaut de spécificité. Ainsi seuls des rendements apparents prenant en compte ces écarts de justesse et valables uniquement pour les matrices d’intérêt peuvent être appliqués.

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3.2.3. Validation GC-MS/MS

Le Tableau 6 montre les résultats pour la validation de méthode en GC-MS/MS. Les critères d’acceptation étant les mêmes que pour la HPLC-MS/MS. Dans le tableau, le vert représente le fait que l’on est linéaire et/ou spécifique, le rose représentera quant à lui le fait que l’on n’est pas linéaire et/ou non spécifique.

Tableau 6 : Paramètres de validation des molécules dosées en GC-MS/MS. Spécificité Pesticides Familles Gamme de linéarité (µg.L-1) Pente (Sa) Origine (Sb) Rendements (% C.V.) LOQ (ng/g sédiment) Acétochlore Chloroacétanilide 2 – 500 a 0,721 (0,024) -4,730 (10,899) 58 (9) 0,71

Aclonifène Diphényl éther

5 – 500 Erreur de domaine 3,424 (0,306) -95,853 (140,317) Alachlore Chloroacétanilide 1 – 500 a 0,835 (0,027) -2,521 (12,393) 59 (13) 0,76 Atrazine Triazine 5 – 500 a 0,921 (0,016) -0,482 (7,297) 59 (11) 0,66 Azoxystrobine Strobilurine 5 – 500 a 1,459 (0,070) -14,669 (32,071) Carbaryl Carbamate 2 – 500 Erreur de domaine 3,892 (0,067) 1,314 (30,813) Chlorfenvinphos Organophosphoré 2 – 500 a 0,993 (0,004) -0,137 (1,892) 56 (8) 0,82 Chlorpyriphos Organophosphoré 1 – 500 b 1,013 (0,003) -0,434 (1,344) 36 (10) 0.33 Cyproconazole Triazole 2 – 500 a 0,931 (0,060) 9,195 (27,451) 72 (11) 3,57 DEA Triazine 5 – 500 a 0,950 (0,017) -4,690 (7,942) 55 (10) 2,04 DET Triazine 2 – 500 a 0,891 (0,010) -1,658 (4,755) 54 (9) 0,98 DIA Triazine 5 – 500 a 0,951 (0,008) -3,776 (3,834) 58 (9) 0,80 DIA D5 Triazine 5 – 500 a 0,968 (0,009) -1,473 (4,322) 57 (10) 1,88 Diflufenican Carboxamide 2 – 500 a 1,016 (0,007) -4,299 (3,212) 84 (15) 1,29 Dimétomorphe Morpholine 1 – 500 c 1,269 (0,034) -8,584 (15,535) 98 (15) 1,56 Époxiconazole Triazole 1 – 500 c 0,350 (0,025) -7,318 (11,659) CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref

Flusilazole Triazole 2 – 500 b 1,008 (0,011) -6,520 (5,028) 68 (12) 3,37 Hexazinone Triazine 2 – 500 a 1,018 (0,004) 1,051 (1,930) 61 (6) 1,95 Iprodione Dicarboximide 5 – 500 c 1,548 (0,060) -7,005 (27,348) Kresoxim méthyl Strobilurine 1 – 500 a 0,952 (0,020) -7,333 (9,182) 77 (15) 2,53 Métazachlore Chloroacétanilide 2 – 500 b 0,492 (0,022) -6,573 (9,886) Métolachlore Chloroacétanilide 2 – 500 a 0,844 (0,016) -6,377 (7,381) 53 (11) 0,42 Norflurazon Pyridazinone 2 – 500 b 1,019 (0,008) -2,397 (3,604) 84 (16) 1,55 Oxadiazon Oxadiazole 2 – 500 a 0,940 (0,024) -0,257 (10,817) 65 (11) 0,48 Pendiméthaline Dinitroaniline 2 – 500 c 1,077 (0,023) -9,743 (10,658) 88 (10) 0,54 Procymidone Dicarboximide 1 – 500 a 0,932 (0,023) -2,294 (10,593) 63 (9) 0,92 Pyrimicarbe Carbamate 1 – 500 a 0,981 (0,018) -1,192 (8,059) 59 (17) 0,47 Simazine Triazine 2 – 500 a 0,957 (0,020) 0,887 (9,139) 61 (8) 2,20 Tébuconazole Triazole 2 – 500 a 1,015 (0,008) -0,353 (3,444) 71 (10) 3,23 Terbuthylazine Triazine 2 – 500 a 0,946 (0,023) -4,031 (10,575) 55 (8) 0,44 Trifluraline Dinitroaniline 1 – 500 c 0,922 (0,044) -26,321 (20,371) 52 (18) 0,09 a

Validation avec 5 gammes sur les 5 préconisées

b

Validation avec 4 gammes sur les 5 préconisées

c

Validation avec 3 gammes sur les 5 préconisées

D’après ce tableau, on remarque que deux molécules (carbaryl et aclonifène) ne sont pas linéaires et également non spécifiques. Ensuite, on remarque que cinq autres molécules présentent un défaut de spécificité (un faible défaut de spécificité pour l’acétochlore, l’azoxystrobine, l’iprodione et un défaut très important en ce qui concerne le métazachlore et l’époxiconazole). Chacune de ces molécules font partie de familles différentes mais le défaut de spécificité est parfois dû au fait que les molécules sont thermolabiles. En effet, il est connu que les carbamates sont des composés polaires, hydrosolubles et thermolabiles (Carabias-Martínez, García-Hermida et al. 2005) et il en est de même pour l’iprodione (Walorczyk and Gnusowski 2006). En effet, les composés thermolabiles seront sujets aux effets de matrice suite à leur dégradation dans le port d’injection : les carbamates seront dégradés pendant l’injection et pendant l’élution le long de la colonne (Walorczyk and Gnusowski 2006). De plus, le sédiment est une matrice très chargée et donc des dépôts se forment rapidement sur la paroi de l’insert malgré l’étape de purification qui ne retire que les acides humiques et fulviques (il reste donc probablement des composés plus hydrophobes comme des lipides ou

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des phéopigments). Ceci va alors désactiver l’insert, ce qui provoque une augmentation du signal (effets de matrice liés au fait qu’on injecte davantage dans le cas d’un échantillon réel). Par exemple, le pic du carbaryl va être assez intense dans ces conditions alors qu’il est thermolabile (tout comme le pyrimicarbe) et quasiment non observable avec un insert propre. L’effet de matrice est parfois assez important (augmentation de plus de 200 % du signal) et pour améliorer cela on peut choisir des étalons internes représentatifs de la gamme d’analytes. Ceux-ci doivent en théorie avoir un comportement similaire dans l’injecteur afin de corriger convenablement les résultats. Ainsi, sur les quatre étalons internes testés, nous en avons retenu trois : l’atrazine D5, le métolachlore D6 et le tébuconazole D6. Quelques ajustements seraient cependant envisageables afin d’améliorer la correction par étalonnage interne.

D’autres solutions existent à ces problèmes d’effet de matrice : on peut par exemple passer par une injection splitless pulsée (Godula, Hajslova et al. 1999) qui va consister à augmenter la pression en tête de colonne pendant une courte période durant l’injection ainsi le débit de gaz vecteur s’en retrouve augmenté et le transports des vapeurs d’échantillon est plus rapide vers la colonne. Ainsi, le temps de résidence de l’analyte dans la chambre d’injection sera plus court et permettra la suppression significative de la discrimination, de l’adsorption et de la dégradation des analytes dans l’injecteur. Mais ce mode correspond déjà au mode « CT splitless surge » utilisé donc il faut trouver un autre moyen de remédier à ces effets de matrice. Pour minimiser la décomposition des composés thermolabiles on peut également utiliser des systèmes PTV mais là aussi cela n’a pas montré de différences significatives. Une solution reste encore possible : la dérivation. Mais cette méthode rend l’étape de préparation de l’échantillon un peu plus « lourde » et peut introduire davantage d’incertitude dans les résultats.

Ainsi en mettant en parallèle les deux validations, on va préférer faire la quantification du métazachlore et de l’acétochlore en HPLC-MS/MS et on va éliminer l’aclonifène, le carbaryl, l’iprodione, l’azoxystrobine et l’époxiconazole de la liste.

Ainsi, nous avons pu analyser les sédiments et les POCIS par la méthode GC-MS/MS et HPLC-MS/MS.

3.3. Echantillons du Bassin d’Arcachon

Les analyses ont été effectuées sur les échantillons prélevés lors des missions terrain du 22 mars et du 19 avril. Cette période recouvre la principale époque d’épandage agricole sur cultures printanières (maïs, tournesol, cultures légumières, etc.) et il n’a pas été observé d’épisode de crue par ailleurs.

3.3.1. Pesticides dans la colonne d’eau : POCIS

Les POCIS ont été exposés dans le réseau des 9 stations (décrites dans la partie 1.3.3.) situées à l’aval des principaux tributaires du bassin d’Arcachon. La conductivité a été mesurée sur chaque station afin de s’assurer de l’échantillonnage en eaux douces continentales des POCIS. Nous ne disposons dans l’immédiat que de résultats semi-quantitatifs, ainsi les Figure 6 et Figure 7 nous donnent les teneurs observées dans les tributaires en ng/g de phase via l’analyse GC-MS/MS, puis HPLC-MS/MS. CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref