Apport de la biologie moléculaire au diagnostic bactériologique

(1)

RÉPUBLIQUE ALGÉRIENNE DÉMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTRE DE L'ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR

ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

Université de Jijel

Faculté des sciences exacte et des sciences De la nature et de la vie

DEPT : Biologie Moléculaire et Cellulaire

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Mémoire de fin d'étuae

En vue de L'obtention du Diplôme des Etudes

Supérieures (D.E.S) en Biologie

Option : microbiologie

Thème

Apport de la

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molécillaire au diagnostic

.

bactériologique

Membres

du Jury

_{Présenté par:}

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BENSEGHIER Salima

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Examinateur : ADJEROUD Nawel

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Session : Juin 2009/2010

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(3)

SOMMAIRE

Introduction .. . . .. . .. .. .. .. .. . . .. . . . .. . . .. . . . .. . . .. . . . .. . . .. . .. . . .. . . .. .. . .. . . .. 1

Chapitre 1 : Généralités 1.1. La naissance de la biologie moléculaire . . . .. 2

I.2. Les bases fondamentales de la biologie moléculaire . . . ... 2

1.3. Les avantages et les inconvénients de la biologie moléculaire . . . 3

1.4. Les principes applications de la biologie moléculaire . . . 4

I.4.1. Le Domaine médical . . . 4

I.4.2. Le Domaine agroalimentaire . . . .. . . .. ... .. . . .. .. . . .. . .. . . .. . . .. . . . .. . 4

I.4.3. Le domaine toxicogénomique... ... .. .... .... .. .. ... ... ... .. . .. .. .. .. . .. .. ... .. .... 4

I.4.4. Le domaine de l'environnement... 5

I.4.5. Le domaine de la microbiologie . . . 5

Chapitre II: Quelques techniques de base de biologie moléculaire II. l. Hybridation moléculaire . . . 7

11. l. l . La température fusion de l' ADN . . . 7

II.1.2. Limites de l'identification de séquence nucléique par l'hybridation moléculaire 8 II.1. 3. Application de l'hybridation... 9

Il .2. Amplification génétique . . . 10

II.2.1. La technique de PCR . . . . .. .. . . .. . .. . . . .. . . . .. .. . . . .. . . .. . .. . . .. . . .. . .. . . .... 10

II.2.2. Quelque variantes de la PCR . . . ... 11

11.2.3. LCR (Ligase Chain Reaction) ... . . .. . . . ... .. . . .. . .. .. . .. ... . . .. ... . .. . . . .. . . .. . .. 12

II.2.4. La technique NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) .. .. . .... 13

II.2.5.TMA (Transcription-Mediated Amplification) . .. . . . .. . . .. .. . . .. ... . .. . .. .. . ... . .. . . .. 13

II.3.Technique de séquençage de l'ADN ... 13

II.3.1. Méthode de Sanger ... 13

II.3.2. Méthode de Maxam et Gilbert... 14

II.3 .3. Autres méthodes de séquençage . . . 14 Chapitre III : Application des méthodes de biologie moléculaire au diagnostique

bactériologique

III. l. Méthodes classiques d'identification des bactéries ... ..

111.1.1.

Les différents types de prélèvements utilisés pour le diagnostic des maladies Infectieuses ... . lll.1.2. Identification macroscopique ... .

16

(4)

III.1.3. Identification microscopique . . . 18 III.1.4. Identification biochimique . . . 20 III.1.5. Les tests de sensibilités aux antibiotiques . . . .. 22 III.2. Méthodes d'identification des bactéries par la biologie moléculaire . . . 24 III.2.1. Le typage bactérien . . . 24 III .2.2. Détection de la résistance aux antibiotiques, basée sur l' ADN . . . 26 III.2.3. Les puces à ADN . . . 26

Chapitre IV: Diagnostic moléculaire de quelques maladies infectieuses

IV .1. Diagnostic moléculaire de la tuberculose . . . 27 IV.2. Le diagnostic moléculaire de l'endocardite infectieuse .. . .. . .. . . .. . . .. . . .. . .. 28 IV.3. Le diagnostic moléculaire de listériose . . . .. . . .. . . .. .. . . . .. .. . .. . .. . . .. . .. . . .. 29

Conclusion . . . 31

(5)

ADN ARN ARNm ARNr ATB CMI

LCR

PCR

pH SPH

Tm

LCR

TMA NASBA OGM

Liste des abréviations

Acide DésoxyRiboNucléique Acide RiboNucléique

ARN messager ARN ribosomique Antibiotique

Concentration Minimale Inhibitrice Liquide CéphaloRachidien

Polymèrase Chain Réaction potentiel Hydrogène

Séquençage Par Hybridation Température melting

Ligase Chain Reaction

Transcription-Mediated Amplification Nucleic Acid Sequence-Based Amplification Organismes Génétiquements Modifies

(6)

La Liste des figures

Figure 01. Détection de bactéries pathogènes dans un échantillon biologique... 5

Figure 02. le Principe d'hybridation moléculaire... 7

Figure 03. Mise en évidence de la séparation des deux brins d'un ADN et 8 mesure de la température de fusion (Tm) ... . Figure 04. le principe de PCR... 11

Figure 05. Le trouble... 17

Figure 06. Hématurique .. . . .. . . . .. . .. . . .. .. . .. .. .. . . . .. . .. . . .. . .. . . .. . .. . . .. .. . . ... 17

Figure 07. Coloration anormale... 17

Figure 08. L'odeur... 18

Figure 09. Les colonies... 18

Figure 10. L'observation microscopique à l'état frais... 18

Figure 11. L'observation microscopique après coloration simple... 19

Figure 12. L'observation microscopique après la coloration de Gram... 20

Figure 13. L'observation microscopique après coloration de Ziehl-Neelsen... 20

Figure 14. La structure du gène de l'ARN16S... 25

(7)

(8)

Introduction

La biologie moléculaire consiste à étudier la structure des gènes, leur expression et le contrôle de leur expression.

Depuis l'invention de la technique d'amplification par PCR (polymérase chain réaction) en 1983, la biologie moléculaire s'est implantée rapidement dans les laboratoires de microbiologie clinique. En effet, bien que de nombreuses techniques de microbiologie demeurent traditionnelles (examen macroscopique, examen microscopique, culture bactérienne, tests biochimiques ... ), la biologie moléculaire a pu trouver sa place en routine dans un grand nombre de laboratoires d'analyses médicales. L'étude des agents infectieux à l'aide des outils de biologie moléculaire est ainsi devenue indispensable dans certaines indications.

La biologie moléculaire regroupe un ensemble des techniques comme l'amplification génétique, l'hybridation moléculaire et le séquençage, ces techniques sont basées sur l'étude,

la détection et la modification des acides nucléiques. Le rôle du laboratoire de bactériologie clinique repose sur l'isolement et l'identification de l'agent pathogène, l'étude de la résistance aux agents antibactériens ainsi que l'étude du lien de clonalité. Selon le germe en cause, le délai de réponse peut prendre plusieurs jours voire des semaines ou même des mois. Le traitement est donc souvent instauré uniquement sur les données cliniques sans l'aide du diagnostic bactériologique. Avec des techniques de biologie moléculaire qui sont des tests d'identification rapides, sensibles et spécifiques pour la plupart des microorganismes. Les techniques de biologie moléculaire sont de nouveaux outils qui complètent les méthodes classiques de diagnostic bactériologique.

La biologie moléculaire présente un certain nombre d'avantages et d'inconvénients par rapport aux techniques classiques utilisées au cours du diagnostic des maladies bactériennes (tuberculose, endocardite infectieuse, listériose ... etc.).

Dans notre travail, nous allons essayer de montrer, qu'il ne s'agit pas de vouloir absolument utiliser la biologie moléculaire, ni même remplacer les techniques traditionnelles,

mais que la biologie moléculaire peut compléter très efficacement les techniques classiques dans le diagnostic bactériologique.

(9)

CHAPIRTEI

GÉNÉRALITÉS

(10)

Chapitre 1 Généralités

La biologie moléculaire est une expression qui en elle-même n'a pas une grande signification, mais qui est maintenant consacré par l'usage, et que l'on utilise dans le sens de

«biologie moléculaire des gènes

».

La biologie moléculaire consiste en effet à étudier la structure des gènes, leur expression et le contrôle de leur expression. Elle entraîne donc à travailler essentiellement avec des molécules d' ADN et d' ARN (Etienne, 1999). Elle va expliquer les relations qui existent entre la structure et la fonction des molécules biologiques et la manière dont elles contribuent à l'opération et au contrôle des processus biochimiques (Turner et al., 2000).

1.1. La naissance de la biologie moléculaire

Le 20éme siècle coïncide avec la naissance de la génétique : débutant avec la redécouverte des travaux de Mendel précisément en 1900, qui est le premier qui a établit les lois de l'hérédité, se poursuivant par le développement de la théorie chromosomique de l'hérédité avec les travaux de Morgan sur la drosophile : les gènes sont alors localisés sur les chromosomes. Moran avec Sturtevant ont constitués les premières cartes génétiques à partir du développement des procédures de mutagenèse expérimentale par Muler (Alibert, sans année).

Les premières phénomènes qui allait permettre de progresser dans l'identification du support de l'hérédité est celui de la transformation bactérienne, rapporté en 1928 par Griffith. Ce phénomène représente alors un test d'activité biologique, grâce auquel il est possible de déterminer la nature du matériel génétique. Ce test ne sera pas mis à profit par Griffith lui-même, mais en 1944 par Avery qui l'utilise pour élucider la nature biochimique du matériel génétique: il s'agit de l' ADN (Alibert, sans année). A la suite, la biologie moléculaire a connu une explosion qui a abouti à la découverte de la structure en double hélice de l' ADN par Crick et Watson en 1954, à celle du code génétique et des mécanismes de la transcription et de la traduction des protéines (Swynghedauw et Silvestre, 2008). Vers la fin des années 1970, une autre étape importante dans la génétique a été atteinte ; les chercheurs ont découvert qu'il était possible de manipuler des molécules d' ADN dans un tube à essai(in vitro) en « clonant

»

le premier gène, cette découverte a permis d'autre avancées en génétique moléculaire comme le développement de technique de recombinaison de l' ADN (génie génétique) et l'essor de l'industrie des biotechnologies (Ebord et Stansfield, 2003).

1.2. Les bases fondamentales de la biologie moléculaire

De manière générale les acides nucléiques sont des macromolécules constituées de chaines de nucléotides. Selon le sucre dont il est composé on distingue deux types d'acides nucléiques :

)> L' ADN (acide désoxyribonucléique) est une longue molécule ressemblant à une

échelle dont les deux brins seraient enroulés en une double hélice. Chaque brin de l'hélice est une molécule linéaire faite de l'assemblage d'éléments appelés nucléotides. Il existe quatre types de nucléotides chaque type est porteur d'une des quatre bases azotées possible, A (adénine), G (Guamine), T (Thymine) et C (ytosine). Ces quatre bases constituent l'alphabet génétique à partir duquel est constitué, par combinaison adjacents sous forme de triplets. Le code génétique assurant la correspondance entre l'information génétique et les chaines peptidiques. Deux brins d' ADN étaient complémentaires de sorte que les barreaux de l'échelle en double hélice sont toujours de type A=T ou G=C. Cette complémentarité joue un rôle à la fois dans la duplication de l' ADN et dans l'expression des gènes. Dans les deux processus, un ou les deux brins d' ADN servent de matrice pour la synthèse d'un brin complémentaire (Spencer et al., 2006).

)> L' ARN (acide ribonucléique) est un autre type d'acide nucléique qui est chimiquement

(11)

base uracile remplace la thymine. Par ailleurs, contrairement à l' ADN qui est formé de deux brins complémentaire enroulés en double hélice par appariement, l' ARN n'est constitué généralement que d'un seul brin. Cependant, il convient de noter qu'un ARN et un brin d' ADN pourront localement, très ponctuellement, s'apparier pour former une structure complémentaire (Spencer et al., 2006).

1.3. Les avantages et les inconvénients de la biologie moléculaire

Les techniques d'identification ainsi que les critères de classification mis à la disposition des microbiologies évoluent sans cesse. Le développement des techniques de biologie moléculaire à en particulier, introduit de nouveaux critères d'identification basés sur l'étude de la présence de certaines gènes sur l'étude de leur séquence .... , l'extrême variété des génomes a permis la différenciation de germe jusqu'alors confondus ( Durand et Frezet, 2003). Bien que les nombreuses techniques soient différentes, elles présentent toutes des avantages et des inconvénients communs

1.3.1. Les avantages

La biologie moléculaire représente un ensemble d'outils dont le but est la mise en évidence des acides nucléiques (ADN ou ARN). L'étude de la littérature internationale sur ce sujet montre sa puissance d'analyse. Tous les agents infectieux connus (bactéries, virus, champignons, parasites, .... ) sont détectables par cette méthode. La biologie moléculaire est aussi parfois le seul outil capable de détecter des nouveaux agents pathogènes. Comparée aux techniques de microbiologie classiques, la biologie moléculaire présente de nombreux avantages: le résultat est sensible, rapide et spécifique, permet la confirmation du diagnostic, un traitement adapté et une hospitalisation plus,

courte les infections nosocomiales peuvent être dépistées pluttôt, la source d'infection identifiée, le traitement et la prophylaxie ajustés. Enfin, l'automatisation se développe progressivement, facilitant ainsi la mise en place de ces techniques et améliorant ses performances (notamment sa rapidité d'analyse) tout en diminuant ces inconvénient (Lamoril et al., 2007).

La biologie moléculaire présente aussi plusieurs avantages dans le domaine de l'agriculture. Certains de ces avantages liés au développement accru de la transgénèse en tant que composante particulière des biotechnologies pourraient s'avérer riches de conséquences en général: il ne s'agit moins, en effet que de modifier l'économie mondiale par l'amélioration des systèmes de bioconversion des matières renouvelables, face à la diminution des réserves fossiles, de permettre l'utilisation de procédés moins consommateur d'énergie (transformation des produits agricoles par les biocatalyseurs ) ou encore d'assurer un meilleur respect de !'environnements (Académie des sciences, 1993).

1.3.2. Les inconvénients

L'inconvénient principal de la biologie moléculaire est la contamination aboutissant à de faux positifs. Les techniques de biologie moléculaire faisant le plus souvent appel aux méthodes d'amplification génique. A l'opposé, dans certain cas des inhibiteurs d'amplification peuvent être présents aboutissant alors à de faux négatif, les contrôles sont donc importants. Par ailleurs, dans certains cas, la mise en évidence d'un acide nucléique ne permet pas d'affirmer la viabilité de l'agent infectieux. Enfin, la biologie moléculaire nécessite un ensemble d'appareils et de kits couteux, un personnel spécialisé et entrainé, et des locaux spécifiques (Lamoril et al., 2007).

(12)

1.4. Les principales applications de la biologie moléculaire

Depuis la découverte de la technique d'amplification génique par PCR, les applications de la biologie moléculaire ont connu un essor spectaculaire. Le séquençage du génome humain et d'un certain nombre d'agents infectieux, le décryptage en cours de nombreux autre génomes, les apports de la génomique et de la protéomique, la compréhension croissante des mécanismes physiologiques et physiopathologiques montrent l'implication importante de la génétique moléculaire dans de nombreuses pathologies et dans l'étude des facteurs de risques de nombreuses maladies. Par conséquent, la génétique moléculaire et dans son ensemble, la biologie moléculaire prennent une place de plus en plus importante dans le domaine de la médecine (Bougard et al., 2005).

1.4.1 Domaine médical

1.4.1.1. Identification des cibles pour la recherche thérapeutique

Dans la biologie moléculaire, on utilise plusieurs techniques tel que la PCR classique, et le séquençage. Parmi ces techniques les puces à ADN au séquençage, leurs contribution s'accompagne d'une aide à la compréhension plus fine du génome et de sa régulation ainsi, grâce au puces à ADN ont été mis en évidence de nouveaux gènes spécifiques s'exprimant dans le tissu cérébral de l'enfant ou apparaissant associés à des pathologies inflammatoires rhumatismales ou intestinales.

Les puces à ADN devraient contribuer à l'identification de cible thérapeutique pour la recherche pharmaceutique. Elles servirent aussi à déterminer la résistance aux antibiotiques de certaines souches microbiens pour permettre de mieux lutter contre celles-ci (Kruschina et al., 2002).

1.4.1.2. Pharmacogénomique

La pharmacogénomique consiste à identifier les gènes impliqués dans l'efficacité (ou l'inefficacité) d'un produit ou ces effets indésirables. Elle conduit à une meilleure compréhension des mécanismes d'action des médicaments, en montrant qu'une molécule sur une action variable, la puce à ADN ouvre le champ des potentiels thérapeutiques. Elle permet aussi d'identifier les effets secondaire d'un produit et, lors des essais cliniques, de faire des mesures de toxicité (Kruschina et

al., 2002).

1.4.1.3. Analyse de mutation

A coté de la séquence sauvage on utilise plusieurs sondes identiques à une mutation prés.

Les sondes vont couvrir l'ensemble des mutations potentielles (substitution, délétion, addition) de manière générale. L'analyse de substitution (pour une positon donné) impliqué donc l'utilisation de quatre sondes une pour la séquence sauvage et trois pour chacun des nucléotides pouvant se substituer au nucléotide originale. Cela permet ainsi de repérer des séquences mutantes dans un échantillon test (Krushina et al., 2002).

1.4.2. Domaine agroalimentaire

Les techniques de biologie moléculaire peuvent être utilisés dans la détection des séquences provenant d'organismes génétiquements modifies (OGM) dans les semences ou dans certains aliments, dans la détection d'agents infectieux dans l'aliment comme la Salmonelle ou la Listeria et dans le contrôle des microorganismes utilisé dans certaine fabrication (Krushina et al., 2002).

1.4.3. Le domaine toxicogénomique

Dans le cas de l'analyse de la réponse toxicologique, les techniques de biologie moléculaire sont plus utilisés tel que la puce à ADN, on doit au départ faire l'hypothèse que l'effet toxicologique, direct ou indirect d'une substance résulte de la modification de l'expression de

(13)

certains gène ou des moins qu'il lui est associé. Les mesures consistent alors à évaluer l'expression différentielle de gènes de deux échantillons, grâce à un marquage par fluorescence en deux couleur cela permet de comparer les profils d'expression génique de deux tissus différents (Krushina et al., 2002).

1.4.4. Le domaine de l'environnement

La détection des agents infectieux dans l'alimentation, l'air ou l'eau (Salmonella, Listeria, Legionnella). Le contrôle de la qualité de l'eau passe aujourd'hui par l'analyse de 64 paramètres de qualité dont certains doivent être surveillés en permanence, par exemple les puces à ADN permettent de détecter la présence, même entrés une faible quantité d'un microorganisme en le reconnaissant à travers son empreinte génétique, l'utilisation de puce ADN permet un diagnostic et donc une intervention plus rapide (figure 01) (Krushina et al., 2002).

..._._._{. .}.._.... _{. .}_._._._._{. . .}_. . _.. _.. _{. . . .}. . . _{. . . .}. . . . _._.. _.. _.. _. . _.... . . . . . _._._.. _.. _{. . .}. .

.

_.. . . . _._._._{. .}. . _{. .}. Révél tion Caractérisation rapide du ou des pathogènes présents dans le prélèvement résultat obtenus en 24h)

Puce à ADN contenant des sondes dirigé contre les ARN 16s de Plusieurs Bactéries pathogènes (Salmonelle, Legionelle,

Staphylocoque ... .)

Hybri

Eau, produit alimentaire, tissus infectés

prélèvement

Amplification des gènes d' ARN 16s présente

+

Marquage

FigureOl : Détection de bactéries pathogènes dans un échantillon biologique (Krushina et al., 2002).

1.4.5. Le domaine de la microbiologie

Ce demaine représente la bactériologie, virologie, parasitologie et mycologie. Dans ce domaine, la littérature est abondante et rapporte l'étude d'un nombre très important d'agents infectieux. Parmis les nombreuses techniques employés dans ce domaine, la PCR reste la technique d'amplification la plus utilisée (Bogard et al ., 2005). Ainsi la détection de microorganismes (présente, mutation, capacité à résistance à certains antibiotiques ou à des inhibiteurs d'enzymes,

identification des espèces) par exemple, des matrices des sondes ont développé l'identification de pathotype d' Escherichia coli et des gène de virulence associé (Bekal et al., 2003), de Mycobactérium tuberculosis résistantes à la rifampin(Troesh et al., 1999), de bactéries de la flore intestinale et d'autres cibles importantes pour le diagnostic clinique (Westin et al., 2001).

(14)

La bactériologie clinique est l'étude des germes responsable d'infection chez l'homme. Ces

infections peuvent être de nature diverse, respiratoire, digestive, urinaire, génitale . .. etc. (Serre et

al., 2002).

Le diagnostique bactériologique est un ensemble de moyens permettant de confirmer telle ou telle étiologie infectieuse d'origine bactérienne. Ces moyens sont variés et caractérisent soit le diagnostic direct soit indirect.

~ Diagnostic direct : la mise en évidence de la bactérie elle-même, donc de son culture ou de son isolement qui permettra l'identification ultérieur ainsi que de préciser sa sensibilité aux antibiotique.

~ Diagnostic indirect: la mise en évidence de la réponse de l'organisme à l'infection par la

présence d'anticorps spécifiques, le plus souvent sérique ou plus rarement par une réponse

d'hypersensibilité, dite allergique (Anonyme, 2002).

Bien que le diagnostic bactériologique repose encore aujourd'hui sur les techniques

classiques telles que la culture, l'isolement et l'observation microscopique après la coloration ... , les

méthodes de biologie moléculaire permettent dans certain cas d'identifier plus rapidement et plus

précisément le germe en cause. La recherche quantitative des acides nucléique bactérienne (ADN et

ARN) directement dans le prélèvement clinique peut être effectuée. Cependant, pour les germes a

croissance rapide, ce mode de détection reste limite a quelques laboratoires spécialisés (Serre et al.,

(15)

CHAPITRE II

QUELQUES TECHNIQUES DE BASE DE

,

(16)

Chapitre II Quelques techniques de base de biologie moléculaire

11.1 Hybridation moléculaire

Beaucoup de méthode de biologie moléculaire repose sur le principe de l'hybridation moléculaire, il s'agit de la propriété qui présente une molécule d' ADN monobrin de s'associer spontanément, de façon spécifique et réversible à autre molécule monobrin. Si celle-ci est complémentaire, schématiquement l'hybridation est la capacité d'appariement d'une molécule d' ADN simple brin avec son brin complémentaire, alors qu'elle est incapable de s'apparier avec une séquence non complémentaire (Gelehrter et al., 1991)

~ Principe

Les méthodes d'hybridation utilisent des acides nucléiques marqués, nommés sondes, cette appellation provient du fait que cette sonde placée dans un milieu très complexe contenant de nombreuses molécules non marquées d'acide nucléique, ne s'associera pas que avec ceux qui ont une homologie de séquence (complémentaire). Ces sondes servent à identifier une séquence nucléique dans un milieu complexe (figure 02) (Lamoril et al., 2005).

,

5'A TCAGTACCTTATACGCTTCGT 3'

3, T AGTCA TGGAA TA TGCGAAGCAA 5'

•

Chauffage refroidissement Dénaturation renaturation 5' ATCAGTTACCTTATACGCTTLGTT3' 3'TAGTCATGGAATATGCGAAGCAA5' 5'~ ATCAGTTACCTTATC 3' sonde L'hybridation ~ 1J 5'ATCAGTTACCTTATC 3' TAGTCAAGGAATAGCGAAGCAA 5' 3'

Figure 02: le Principe d'hybridation moléculaire

11.1.1. La température fusion de l' ADN

La température de fusion de l' ADN appelée également température de demi dénaturation. Lorsqu'un ADN bicaténaire est chauffé à une température supérieure à la température de fusion (Tm), les deux brins de la molécule se séparent par suite de la rupture des liaisons hydrogènes (liaison faibles) qui les maintiennent appariés. Le passage de la forme bicaténaire à la forme simple brin est brutal pour une très faible variation de température autour de la Tm du fait du caractère coopératif de la réaction. Le passage de la forme bicaténaire à la forme monocaténaire s'objective très facilement par mesure de la

(17)

monocaténaire étant sensiblement plus élevé que celui de l' ADN bicaténaire (effet

hyperchrome).

nm

cœ

(

.. - - - -

l

C

01

..__ _ _ _ ...L. _ _ _ _ . . . ,

Tœnpërr:rur

Tm

Figure 03 : Mise en évidence de la séparation des deux brins d'un ADN et mesure de la température de fusion (Tm) (Kaplan et Delpech, 2007).

11.1.2. Limites de l'identification de séquence nucléique par hybridation moléculaire

Le diagnostic par sonde nucléique est une méthode d'identification dont on peut

mesure à l'heure actuelle la remarquable efficacité. Le principe est simple: il consiste, si l'on

prend l'exemple d'une application en microbiologie, à démontrer dans un milieu biologique la

présence d'un acide nucléique (ADN ou ARN) dont la séquence est spécifique du germe

recherché, c'est -à-dire qu'elle n'existe qu'au sein du génome de ce germe. Ceci impose la

connaissance préalable de la séquence nucléique que

r

on cherchera à repérer, ainsi que la

vérification de sa spécifique. Ce type de diagnostic fait appel à l'hybridation moléculaire:

pour détecter une séquence cible donnée dans un prélèvement biologique, on ajoute une sonde

de séquence complémentaire que s'y s'associe si ceHe-ci est présente dans l' ADN à analyser.

Après avoir éliminé les sondes non fixées au cible, il est nécessaire de détecté les

hybridations formés. Le moyen le plus simple est de recourir au marquage, en fixant un

élément générateur de signal sur la sonde. Ce générateur est de nature soit isotopique, soit

enzymatique (phosphatase alcaline ou peroxydase), soit fluorescente. Cependant,

l'hybridation moléculaire est confTontée

à

la marque de sensibilité du signal produit: il est

difficile de la détecter s'il y a peu de cibles présentes dans le milieu à analyser. Bien que

quelque trousses de détection par hybridation moléculaire aient ainsi été commercialisées,

notamment pour la recherche de Chlamydia.tracomatis, il n'est d'une manière générale,

intéressant de mettre en ouvre ce système que sur des milieux préalablement amplifiées par

des cultures in vitro, le milieu contenant au bout d'un certain temps un nombre suffisant de

(18)

Chapitre Il Quelques techniques de base de biologie moléculaire

germes, donc de séquences cibles à hybrider avec les sondes ajoutées au milieu. L'apparition des techniques d'amplification génique, dont la polymérase chaine réaction (PCR), fortement potentialisées la sensibilité du diagnostic par sondes reproduisant de façon accélérée le processus de culture, la PCR permet d'obtenir un nombre considérable de copies de séquences nucléiques identiques. L'augmentation considérable de sensibilité offerte par cette technique permet de détecter de très faibles quantité de séquences cibles, ce qui évite dans de très nombreux cas d'avoir recour aux isotopes. Mais l'intérêt de la PCR ne réside pas uniquement en un système puissant de détection de séquences cibles (Bogard et al., 2005).

II.1.3. Application de l'hybridation moléculaire

L'hybridation moléculaire est la base de très nombreuses techniques tel que : • Southern blot

Cette technique permet la détection d'un fragment d' ADN génomique spécifique, au sein d'un mélange d'environ lmillion de fragment. Dans cette technique l' ADN génomique d'un individu est dégerée par une enzyme de restriction. Les multiples fragments qui en résultent sont séparés selon leur taille par électrophorèse sur gel, et l' ADN est transféré sur un filtre de nitrocellulose puis hybridé avec une sonde marqué. Seuls les fragments d' ADN contenant les séquences homologues à la sonde seront détectés (Gelebrter et al., 1991). • Nortbern blot

Cette technique permet de détecter une molécule d' ARN spécifique au sein d'un mélange complexe. Dans cette technique les ARN messagers sont préparés à partir du tissu à étudier est séparés selon leur taille sur un gel. L' ARN peut être transféré sur un filtre est hybridé avec une sonde d' ADN (Gelehrter et al., 1991).

• Reverse blot

Cette technique appelée hybridation inverse, son principe est basé sur l'utilisation de sondes spécifique d'allèle qui sont préalablement immobilisées sur un support qui peut être une microplaque ou une membrane de nylon (Lamoril et al., 2005).

• Dot -blot (ou reverse dot-blot)

Cette technique est utilisée pour quantifier un ARN donné (dont on possède la sonde) au sien d'une population hétérogène d'ARN sans séparation préalable. Avec le développement des techniques de PCR, voir même l'utilisation des puces à ADN qui peuvent conduire dans certaines conditions expérimentales à des résultats quantitatifs (Kaplan et Delpecb, 2007).

• Puces à d' ADN

Une puce à ADN ou microarray est un outil d'analyse des acides nucléiques composé d'un support solide, qui ont disposés à des positions spécifiques (Schena, 2003). Le principe de la puce à ADN est basé sur la technique d'hybridation, immobilisée sur un support solide,

des oligonucléotides (simple brin) spécifique de différents gène ou ADNc connus constituent les sondes dans le rôle est de détecter les cibles marqués complémentaire, présents dans le mélange complexe à analyser (ARNm extraits de cellules, tissus ou organismes entièrs et couverts ADNc). Les sondes sont greffées sur support par un bras robotique, les signaux d'hybridation sont détectés selon le type de marquage, et la lecture nécessite des méthodes optiques sophistiquées (balayage laser, camera, ... etc) (Krushina et al., 2002).

(19)

II .2. Amplification génétique

L'amplification génique multiplie de manière exponentielle un fragment d' ADN cible:

la quantité de fragments identique générés est en suite aisément détectée à l'aide de sondes. Afin d'amplifier le signal obtenu, lors d'une hybridation moléculaire entre la cible et la sonde marquée, il est nécessaire de multiplier le nombre de systèmes générateurs de signal. Pour ce la il est possible d'agir à trois niveaux.

~ Amplification de cibles

Les méthodes telles que la PCR consistent à générer à partir d'une matrice cible un

nombre considérable de copies identique, jusqu'à 109molécules environ dont la détection et

l'analyse seront ainsi simplifiées.

~ Amplification de sondes

L'amplification de sondes multiplie le nombre d'acides nucléiques sondes, aboutissant à une quantité de copies du même ordre de grandeur que ce qui est obtenu par amplification de cible.

~ Amplification du signal

Ce procédé consiste en une augmentation de la capacité du système à générer un signal

par hybridation avec un nombre élevé de sondes marquées, sans modifier la quantité des

molécules cibles présentes initialement. Cette méthode n'est pas un système d'amplification

génique, mais elle exploite un système originale de sondes nucléique branchées qui leur

confère une sensibilité supérieure aux sondes traditionnelles, ses applications recouvert le même domaine que l'amplification génique (Bogard et al., 2005).

11.2.1. La technique PCR

La réaction en chaine par polymérase est une technique puissante qui a rapidement devenue l'une des techniques les plus largement utilisées en biologie moléculaire, car elle est

rapide, simple et peu couteuse. La technique amplifie les fragments d' ADN spécifiques

d'infimes (Anonyme, 2003).

~ Principe

La technique PCR consiste à amplifier une séquence d' ADN en présence des amorces.

Ces dernier peuvent s'apparier avec des séquences complémentaires situés sur chaqu' un des

brins d' ADN de part et d'autre de la région à amplifier. Après une dénature de la séquence

cible. Les amorces s'hybrider avec la séquence complémentaire pendant la renaturation. Une

ADN polymérase thermorésistante permet la synthèse d'ADN à partir de l'amorce (étape

élongation). Le cycle est répété 20 à 30 fois, a chaque cycle la quantité d' ADN synthétisé est doublée (figure 04) (Vildé et Nauceil, 2005).

(20)

Chapitre II

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Quelques techniques de base de biologie moléculaire

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Figure 04

:

le principe de PCR

II.2.2. Quelque variantes de la PCR

II.2.2.1. La RT-PCR (Reverse-transcription PCR)

Le meilleur reflet du nombre initial de copie d'une séquence nucléique présente dans

un

échantillon donné est sans conteste la cinétique d'amplification par

PCR

(précédée de

transcription inverse, s'il s'agit de quantifier le nombre de copies d' ARN messager). Après

extraction d'un ARN, celui-ci est transformé en ADN complémentaire (ADNc) par

transcription inverse. Dans un second temps, 1' ADNc est amplifié par

PCR

(Bainque et al.,

2008).

II.2.2.2. La nested-PCR

Il s'agit d'une PCR avec deux couples d'amorces, un couple d'amorce (couple

externe) effectuant une première PCR suivie d'une second PCR à J'aide d'un second couple

d'amorce (couple interne) s'hybridant à l'intérieur du première couple. Deux PCR successives

sont donc réalisées. Cette PCR «nichée» (nested) permet d'augmenter la sensibilité du

système ainsi d'augmenter considérablement le risque de contamination (Deybach et al.,

2007).

(21)

11.2.2.3. La PCR-Elisa

Le produit amplifie est marqué au cours de la PCR grâce à une des deux amorces marquées (par exemple, par un résidu de digoxygénine). Après fixation en microplaque à l'aide d'une sonde capture, la révélation est effectuée à l'aide d'un anticorps spécifique (par exemple, antidigoxygénine) (Dey hach et al., 2007).

11.2.2.4. PCR en temps réel

La technologie de la PCR en temps réel est basée sur la détection et la quantification d'un« reporter »fluorescent est directement proportionnelle à la quantité d'amplicons générés durant la réaction de PCR. En observant la quantité de fluorescence émise à chaque cycle, il devient possible de suivre la réaction PCR durant sa phase exponentielle ou la première augmentation significative dans la quantité d'amplicons est en corrélation direct avec la quantité initiale de la matrice originale cible. Plusieurs instruments de PCR en temps réel sont commercialisés. Ces appareils utilisent généralement un système en tube fermés et la quantification ne requiert aucune manipulation post-amplification, ce qui minimise ou élimine les problèmes de contamination par les amplicons suite à la réaction de PCR et réduit le temps d'analyse. Le processus complet est donc automatisé du début à la fin rendant ainsi cette technologie intéressante pour les applications d'analyse à grand échelle (Houde et Poitras, 2002)

11.2.2.5. La PCR multiplex

Plusieurs couples d'amorce sont ajoutés dans un même tube et la PCR s'effectue en même temps pour chaque couple d'amorce. La PCR multiplex permet donc la mise en évidence de plusieurs cibles dans un seul tube. Elle peut être réalisée de manière conventionnelle (PCR classique), par PCR-Elisa ou par PCR en temps réel (Lamoril et al., 2007).

11.2.2.6. La PCR longue (long PCR)

Dans une PCR classique, il est difficile d'amplifier des fragments dont la longueur entre 2 et3 kb, surtout s'ils contiennent beaucoup de G et C. L'optimisation des conditions expérimental et l'utilisation d'autres polymérase, que la Taq polymérase ont permis de mettre au point une procédure appelée longue PCR, qui permet d'amplifier des fragments dans la longueur peut atteindre 40kb. L'incubation doit être effectuée a un pH plus élève que dans une PCR normale, il faut ajouter du glycérol, déminuer la durée de l'étape de dénaturation et d'augmenter celle de l'étape d'élongation. Enfin, et surtout, il faut utiliser deux polymérases,

la première est une polymérase déletée de sa partie N-terminale et de ce fait diminuée l'activité 5~ 3'exonucléasique, la seconde est une polymérase à haute fidélité, qui sont des polymérases capable de corriger les erreurs grâce à leur activité 3,__. 5' exonucléasique qui les caractérisent (Kaplan et Delpech, 2007).

11.2.3. LCR (Ligase Chain Reaction)

Il s'agit d'une technique d'amplification de sondes. Après hybridation de quatre sondes adjacentes (deux sondes spécifiques du brin sens et deux spécifiques du brin antisens),

Les sondes sont collées à l'aide d'une ligase à condition que la complémentarité soit absolue (absence de misappariement). Plusieurs cycles permettent ainsi l'amplification des sondes

«

collées ». Ses performances sont similaires à celles de la PCR (Lamoril et al., 2007).

(22)

11.2.4. La technique NASBA

NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) Cette technique permet

l'amplification à partir d' ADN ou d' ARN. Son principe est basé sur la transcription d' ARN

produit-en de nombreux exemplaires au cours de la réaction. Trois enzymes sont utilisées à

cet effet, une transcriptase inverse, une RNase H et une T7 ARN polymérase. 100 copies à

1000 copies d' ARN sont obtenues à chaque cycle (la PCR ou la LCR en produisent deux à

chaque cycle). La sensibilité de la NASBA est similaire à celle de la PCR. Cette technique a

été couplée à la détection par des balises moléculaires (Lamoril et al., 2007).

11.2.5. TMA (Transcription-Mediated Amplification)

Cette technique est proche de la NASBA et donne des performances similaires. Elle

utilise le même principe, la différence résidant dans l'utilisation de deux enzymes au lieu de

trois, la reverse transcriptase possédant aussi une activité RNase H (Lamoril et al., 2007).

11.3. Technique de séquençage de l' ADN

Le séquençage est une méthode qui consiste à déterminer la succession de nucléotide

sur l' ADN. Ce procédé permet de déterminé les différentes anomalies responsable de

maladies génétiques ou de réaliser des études d'épidémiologie moléculaire en microbiologie

ou dans d'autre domaines. En 1977, deux principales méthodes ont été initialement

développées : la méthode chimique, qui fut décrite par Maxam et Gilbert, et la méthode

enzymatique décrite par Sanger, il y a d'autres techniques récente comme le séquençage

automatisé de l' ADN, séquençage en cycle, le séquençage par hybridation, ces techniques ont

été utilisés et appliqués à l'analyse des génomes (Bogard et al., 2005).

11.3.1. Méthode de Sanger

Actuellement, la technique enzymatique de Sanger, dite aux «didésoxynucléosides

triphosphates» (ddNTP) qui est la plus utilisée pour effectuer le séquençage d'un segment

d'ADN. Le principe général de cette technique est d'effectuer la synthèse d'un brin d'ADN

qui soit radioactif et complémentaire du brin dont on veut déterminer la séquence.

L'originalité consiste à utiliser des didésoxynucléotides, et à ce que le brin d' ADN à

séquencer soit inséré dans un vecteur de clonage (Beaumont, 2006).

L' ADN monocaténaire à séquencer sert de brin matrice pour la synthèse d' ADN in

vitro en présence d'une amorce. L'amorce est un oligonucléotide synthétique marqué au bout 5' (figure 04), on effectue quatre réactions de polymérisation séparées, chacune en présence d'une faible concentration d'un des quatre ddNTP, en concentration équivalente et plus

élèves des quatre désoxynucléosides (dNTP). Dans chaque tube à réaction, le ddNTP

s'incorpore au hasard dans les positions du dNTP correspondant, car l'absence de groupe

hydroxyle en 3'empêche l'addition du nucléotide (Lodish et al., 1997).

Les produis de ces quatre réactions sont ensuite séparés par électrophorèse, sur quatre

couloirs parallèle d'électrophorèse en gel de polyacrylamide, les fragments nouvellement

synthétisé sont repérés grâce au marqueur incorporé dans l'amorce, dans chacun des couloirs,

les bandes représentent les différents fragments qui se sont terminés à l'un des nucléotides

donné, mais à des positions différents sur l' ADN. En lisant ensuite les bondes dans l'ordre à

partir de bas du gel et à travers les quatre couloirs, on peut déterminer la séquence exacte de

(23)

11.3.2. Méthode de Maxam et Gilbert

C'est une méthode chimique basée sur le fait que certaines réactions rompent l' ADN préférentiellement au niveau d'une des bases. Le démithylsulfate libère la guanine, lorsqu'en milieu acide il libère l'adénine. L'hydrazine libère la thymine et la cytosine, en milieu saline elle libère uniquement la cytosine (Pierre, 1993).

En peut décomposer ce séquençage chimique en six étapes successives :

);;>- Marquage

Les extrémités des deux brins d' ADN à séquencer sont marquées par un traceur radioactif (P32). Cette réaction se fait en général au moyen d' ATP radioactif et de poly

nucléotide Kinase.

);;>- Isolement du fragment d' ADN à séquencer

Celui-ci est séparé au moyen d'une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide. Le fragment d' ADN est découpé au gel et récupère par diffusion.

);;>- Séparation de brins

Les deux brins de chaque fragment d' ADN sont séparés par dénaturation thermique, puis purifiés par une nouvelle électrophorèse.

);;>- Modification chimique spécifique

Les ADN simple brin sont soumis à des réactions chimiques spécifiques des différents types de bases. Walter Gilbert a mis au point plusieurs types de réactions spécifiques effectuées en parallèle sur une fraction de chaque brin d' ADN marqué. Par exemple une pour le G (alkylation par le diméthyle-sulfate), une pour G et les A (dépurination) une pour les Cet une pour les C et les T (hydrolyse alcaline), ces différents réactions sont effectuées dans des conditions très ménagées, de sorte qu'en moyenne chaque molécule d' ADN ne port que zéro ou une modification.

);;>- Coupure

Après ces réactions, l' ADN est clivé au niveau de la modification par réaction avec une base, la pipéridine.

);;>- Analyse

Pour chaque fragment, les produits des différentes réactions sont séparés par électrophorèse et analysés pour reconstituer la séquence d' ADN recherché. Cette analyse est analogue à celle que l'on effectue pour la méthode de Sanger (Ronaghi, 2000).

11.3.3. Autres méthodes de séquençage

11.3.3.1. Séquençage automatisé de l' ADN

Actuellement, les séquençages manuels utilisant le marquage radioactif est de moins en moins utilisé: il est remplacé par le séquençage automatique .Dans ce cas, il est possible de remplacer la radioactivité par un marquage non radioactif, en général, un marqueur émettant une fluorescence (Lamoril & al., 2005).

(24)

Dans la pratique, des marqueurs fluorescents sont attachés aux nucléotides terminateurs de chaine chacun des quatre didésoxynucléotides porte un fluorophore de spectre caractéristique. Le marqueur est incorporé dans la molécule d' ADN par l' ADN polymérase qui effectue ainsi deux opérations simultanées pour terminer la chaine et attacher le fluorophore à l'extrémité 3 'de la molécule. On peut aussi utilisée des amorces fluorescentes avec des didésoxynucléotides non marqués. En utilisant quatre colorants fluorescents différents. Il est possible d'effectuer l'électrophorèse des produits des quatre réactions de terminaison de chaine déférentes sur la même piste d'un gel de séquençage. Les bandes d' ADN sont détectées par leur fluorescente caractéristique quant elles passent devant un détecteur (Primrose et al., 2004).

11.3.3.3. Séquençage par hybridation (SPH)

Le SPH par lecture de petits blocs. L'analyse porte sur des sous séquences chevauchantes qui sont lues et réassemblées au moyen d'un programme informatique qui reconstitue la séquence étudiée. En pratique, le fragment est amplifié par PCR puis marqué à la fluorescence. Le fragment marqué est ensuit mis en contact avec la puce sur laquelle sont fixés plusieurs sondes de séquences connus. Après l'étape d'hybridation, plusieurs lavages sont réalisés pour éliminer toutes les cibles non hybridées à la puce. La lecture de la puce est ensuite réalisé par les systèmes de détection de fluorescence liés à une caméra CCD ou par microscope confocal (Amaziane et al., 2005).

(25)

<CHAPITRE III

APPLICATION DES MÉTHODES DE BIOLOGIE

MOLÉCULAIRE AU DIAGNOSTIQUE

(26)

Chapitre III Application des méthodes de biologie moléculaire au diagnostic bactériologique

Traditionnellement, la première étape consiste à obtenir une culture pure; ensuite après

certains testes et observations on peut avoir de nombreuses espèces connues, jusqu'à ce qu'on

en trouve une qui corresponde. Tout cela peut prendre beaucoup de temps, aussi actuellement

des méthodes d'identification rapide sont mis au point pour les déterminations médicales et

vétérinaires (ou un diagnostic précoce peut être crucial) et aussi pour l'industrie alimentaire,

l'identification rapide est basée sur les acides nucléiques (Singleton, 1999).

Les méthodes traditionnelles sont largement employés et elles sont utiles pour illustrer

les caractéristiques distinguant les bactéries l'une de l'autre, ensuite les méthodes moléculaire

sont indispensable parce que ces techniques prennent une place plus importante dans la

stratégie diagnostique.

III.1. Méthodes classiques d'identification des bactéries

Les études qualitatives et quantitatives, ainsi que la manipulation même des bactéries,

font appel à des techniques classiques de laboratoire particulières, diversifiées et rigoureuses.

Leur mise en oeuvre dépend autant de la nature des échantillons que des objectifs recherchés

(Bousseboua, 2005).

III.1.1. Les düférents types de prélèvements utilisés pour le diagnostic des maladies infectieuses

Le résultat des examens bactériologiques dépend pour une grande part des conditions

de prélèvement et de transport de l'échantillon. Les prélèvements doivent être effectués en

principe avant l'administration d'antibiotiques. Tous les prélèvements sont évidement réalisés

avec du matériels stériles. La nature du prélèvement est fonction du siège de l'infection:

• Lorsque l'on soupçonne une septicémie ou une endocardite, c'est le sang qui est prélevé

(hémoculture). Après une désinfection cutanée soigneuse, le sang est recueilli, puis

ensemencé dans un flacon «aérobie» et un flacon «anaérobie», afin de permettre la

croissance d'un large éventail de bactérie. La densité bactérienne étant souvent faible, il faut

inoculer un volume de sang d'au moins lüml par flacon chez l'adulte. Les hémocultures

doivent être répétées au moins 3 fois pour augmenter les chances de succès et faciliter leur

interprétation.

• Le recueil d'urines est effectué en milieu de jet, après une toilette locale.

• Les prélèvements profonds sont généralement recueillis par ponction. Les prélèvements

superficiels (cutanés ou muqueux) sont le plus souvent recueillis à l'aide d'un écouvillon.

• Pour les prélèvements génitaux, il ne faut pas utiliser d'écouvillon en coton.

• Les sécrétions bronchiques peuvent être recueillies par expectoration, ce qui entraine une

contamination salivaire (se traduisant par la présence de cellules épithéliales). Un prélèvement

de bonne qualité est celui contenant de nombreux polynucléaire et peu de cellules épithéliales.

On obtient de meilleurs résultats en ayant recours à diverses techniques plus ou moins

invasives: aspiration bronchique, prélèvement distal protégé, brossage bronchique ou lavage

broncho-aléatoire.

(27)

L'acheminement au laboratoire doit être le plus rapide possible. En effet beaucoup de prélèvements sont contaminées par la flore commensale et ces prélèvements sont laissés assez longtemps à température ambiante, les bactéries se multiplient et peuvent fausser l'interprétation des résultats. Par ailleurs certaines bactéries sont fragiles. Leur exposition à

l'air

et

la dessiccation (très rapide sur les écouvillons) peuvent les tuer

.

C'est pourquoi

il

existe des milieux de transport permettant la conservation des bactéries fragiles ou des anaérobies strictes (Nauceil, 2000).

IIl.1.2.

Identification macroscopique

Toute infection bactérienne s'accompagne, outre la présence de bactéries, de signes biologiques liés

à

l'inflammation avec l'éventuelle présence de leucocytes, notamment de polynucléaires. Ces éléments peuvent entraîner au delà d'un seuil, une modification visuelle,

clairement perceptible

à

l'oeil nu, qui signe une anomalie patente. Divers éléments sont alors obtenus après la croissance sur milieu nutritif comme le montrent les exemples suivants :

-Le trouble du milieu liquide (urine, liquide pleural ou articulaire) (figure 05). -Hématurique : urine, LCR (liquide cephalo rachidien) (figure 06).

-Coloration anormale (figure

07).

-Odeur: une odeur caractéristique lors d'une infection à germes anaérobies stricts dans un liquide pleural (figure

08).

-Consistance: on observe cette consistance dans le cas d'une selle diarrhéique. -L'observation des colonies differenciées sur le milieu solide (figure09).

ARTICULAIRE

Figure 05 : Le trouble

Figure 06 : Hématurique Figure 07 : Coloration anormale

(28)

Chapitre Ill Application des méthodes de biologie moléculaire au diagnostic bactériologique

Figure 08 : L, odeur Figure09 : Les colonies

111.1.3.Identification microscopique :

L'examen microscopique a un intérêt diagnostique au delà d'un

certain

seuil, donc souvent, on notera aucune anomalie macroscopique, d'où la nécessité de rechercher des bactéries et des éléments cellulaires de type polynucléaire au microscope optique.

111.1.3.1.Etat frais :

Pour observer des germes à l'état frais on utilise généralement le grossissement de 400. Une préparation est obtenue avec le dépôt d'une goutte de suspension entre lame et lamelle, puis on observe au microscope d'une part, la présence éventuelle de bactéries (coque, diplocoque, chaînette, coccobacille), d'autre part le type de mobilité comme celle des rameurs ou celle en"en vole de moucheron". Par ailleurs, lors de cette observation, seront évaluées les cellules avec une appréciation semi-quantitative (rares, peu nombreuse, nombreuse, très nombreuse) ou mieux quantitative, exprimée par nombre d'éléments\mm3 ou ml ou par champ

(figaft

10) (Anonyme, 2002).

Figure 10: L'observation microscopique à l'état frais

(29)

III.1.3.2. Après coloration

On recourt souvent à la coloration pour détecter classer ou identifier les bactéries ou pour observer des composants bactériens particuliers. Dans la plupart des cas, les cellules sont tuées et fixées avant d'être colorées.

Les colorants sont habituellement appliqués à un mince film de cellules étalées sur une lame de microscope. On peut examiner les cellules d'une culture pure en pratiquant comme ceci: au moyen d'une boucle d'inoculation, on dépose un peu d'eau sur une lame porte -objet propre, puis on mélange à cette eau un tout petit

peu

de matériel prélevé sur une colonie pour obtenir une suspension de cellules. Avec la boucle encore, on étale cette suspension sur une surface d'un ou deux centimètres carrés et on laisse sécher ce

qui

donne un frottis. Le frottis est

ensuite fixé par deux passages rapides dans la flamme d'un Bec Bunsen, il est ainsi prêt pour la coloration et à l'examen au microscope (Singleton,

2005).

A. La

coloration simple

Le frottis

fin

est traité par un

seul

colorant basique (bleu de méthylène). Cette technique est rapide, peu courante, à l'exception de l'examen de pus urétral pour la recherche de gonocoque (diplocoque en grain de café intracellulaire) (figure 11) (Anonyme,

2002).

Figure

11:

L'observation microscopique après coloration simple. B. La coloration de Gram

Un frottis fixé à la chaleur est coloré pendant une minute au violet de cristal ; il est ensuite rincé rapidement à l'eau courante, traité pendant une minute par la solution de lugol (solution aqueuse d'iode et d'iodure de potassium) et de nouveau rincé rapidement. On souvent alors le frottis coloré à une étape de décoloration en le traitant avec un solvant comme l'éthanoL l'acétone, ou l'acétone iodée. Il s'agit là de l'étape critique: la lame est maintenue inclinée et on fait couler le solvant sur le frottis pendant 1 à 3 secondes seulement, jusqu'à ce que le colorant cesse de s'échapper librement du frottis.

Celui-ci est alors immédiatement rincé à l'eau courante. A ce stade, les cellules Gram- seront incolores, les cellules gram+ violettes. On soumet ensuite le frottis à une contre coloration de 30 secondes à la fuchsine basique diluée, pour coloré en roses les cellules gram négatives

(30)

présentes. Après un bref rinçage, on sèche le frottis au buvard et on l'examine à l'objectif à

immersion

(figure 12).

•

8 Figure 12

:L'observation microscopique après la coloration de Gram

C. La

coloration de Ziehl-Neelsen

Les bactéries «acido-résistantes

»

différent de toutes les autres bactéries. En ceci: une

fois qu'elles ont été colorées par la fuchsine basique concentrée, chaude, ensuite les décolorer par les acides minéraux ou par des mélanges d'acide et d'éthanol. On cite parmi ces bactéries,

Mycobactérium tuberculosis

.

Un frottis fixé à la chaleur est recouvert d'une solution concentrée de fuchsine basique ensuite

la lame est chauffée jusqu'à ce que la solution se mette à fumer; elle ne devrait pas bouillir.

On maintient la lame chaude pendant environ 5 minutes, on la laise refroidir puis on la rince à

l'eau courante. L'étape de décoloration consiste à passer la lame dans des bains successifs

d'acide-alcool (par exemple 3%

VN

d'acide chlorique concentré dans l'éthanol à 906/o).

Après un lavage à l'eau, le frottis subit une contre coloration avec un colorant de contraste (comme le vert de malachite, puis la lame a nouveau lavée et séchée). Les cellules

acido-résistantes se colorants en rouge, les autres en vert

(figure 13) (Singleton, 2005).

Figure 13:

L'observation microscopique après coloration de Ziehl-Neelsen

fill.4. Identification biochimique

Après examen des caractéristiques microscopiques et de croissance d'une bactérie, des tests biochimiques spécifiques peuvent être effectués. Ces tests représentent la méthode la

plus courante pour l'identification des bactéries. Les principaux tests biochimiques sont:

(31)

111.1.4.1. Test au rouge de méthyle

C'est un test qualitatif de la production d'acides par des bactéries après croissance

en milieu MR VP. Après l'addition de quelques gouttes de rouge de méthyle, une couleur

rouge brillante indique un test positif; l'apparition d'une couleur jaune ou orange indique une

réponse négatif utilisé pour séparer les bactéries entériques (Prescott et al., 2003).

111.1.4.2. La réaction de Voges-Proskauer

Les bactéries VP-positives produisent de l'acétone ou de l'acétyl méthyl carbonyl, qui

donne une couleur rouge avec les réactifs. Cette réaction est utilisé pour différencier les

bacilles des bactéries entériques (Prescott et al., 2003).

111.1.4.3. Hydrolyse de l'amidon

Après incubation d'une gélose à l'amidon, la boite est couverte d'une solution d'iode.

Un test positif est indiqué par la zone décolorée qui entoure les colonies bactériennes. Cette

réaction est utilisé pour détecter la production d'amylase par certaines bactéries (Prescott et

al., 2003).

111.1.4.4. Test de catalase sur lame

A l'aide d'une tige en bois ou d'une boucle en nickel-chrome, une colonie isolée

prélevée d'une gélose, est déposée dans une goutte d'eau oxygénée sur une lame en verre.

L'apparition de bulles d'air indique une repense positive; un test de catalase négatif est

indiqué par l'absence de bulle (Prescott et al., 2003).

111.1.4.5. La réaction du nitrate

Après 24 à 48 heures d'incubation, du nitrate est ajouté aux culture en tube, la

formation de gaz indique une réaction positif de réduction du nitrate, le virage de couleur de

milieu en rouge indique une réduction du nitrate en nitrite (Prescott et al., 2003).

111.1.4.6. Test de l'indole

Certaines bactéries transforment le tryptophane en indole. La présence d'indole est

mise en évidence par l'addition du réactif de kovacs. L'apparition d'une couleur rouge à la

surface indique un test indole positif, et la couleur jaune orange est une réponse négative

(Prescott et al., 2003).

111.1.4.7. Test de l'oxydase

Ce test met en évidence l'existence du cytochrome oxydase, enzyme caractéristique

d'un métabolisme respiratoire aérobie, spécifique de la réduction de l'oxygène moléculaire. Il

est pratiqué usuellement à l'aide d'un disque oxydase. Le matériel bactérien est alors étalé sur

le disque à l'aide d'une anse métallique. Les bactéries oxydase positive donnent une

coloration violette au disque, normalement dans les 10 secondes (Bousseboua, 2005).

(32)

111.1.4.8. Test de désamination de la phénylalanine

Lorsqu'on ajoute une solution de chlorure ferrique 10% à une gélose inclinée

contenant de la phénylalanine, l'apparition d'une couleur verte foncé indique la présence de

l'enzyme (test positif). L'absence de couleur verte, le test est négatif (Prescott et al., 2003).

111.1.4.9. Production d'uréase

La gélose inclinée à l'urée de Christensen. Des bactéries uréase-positives hydrolysent

l'urée en ammoniaque, qui fait virer l'indicateur de pH. Le rouge de phénol, rechange vers le

rouge-violet. Le contrôle négatif pas inoculé, si la couleur ne change pas, la réaction sera

retardée plus de 24 heure (Prescott et al., 2003).

111.1.4.10. Réaction de fermentation

Ce test est réalisé sur milieu MEV AG dans les tubes à essai, le test est positif lorsque

la production d'acide qui donne une couleur jaune et de gaz dans la cloche de Durham. S'il

n'y a pas production ni d'acide ni de gaz donc il n'y' a pas de fermentation de sucre (test

négatif) (Prescott et al., 2003).

111.1.5. Les tests de sensibilités aux antibiotiques

L'antibiotique est un agent antimicrobien à action spécifique qui inhibe la croissance

ou détruit les bactéries. Dans la majorité des traitements, l'antibiotique est utilisé pour aider le

patient, c'est-à-dire pour éviter une dissémination du foyer infectieux en attendant que les

défenses de l'organisme se chargent de détruire le germe. On peut effectuer des tests pour

déterminer la sensibilité d'un agent pathogène à une série d'antibiotiques le profil des

sensibilités d'une souche donnée s'appelle un antibiogramme. Les résultats de tels tests

peuvent permettre au clinicien de choisir le ou les antibiotiques et d'éviter les antibiotiques

auquel le pathogène est résistant (Singleton, 2005).

111.1.5.1. Les méthodes par diffusion en gélose

On ensemence une suspension bactérienne sur une plaque de gélose, puis on dépose,

sur la gélose ensemencée, une série de disques de papier filtre imprégnés d' A TBs

(antibiotique sensibles). Enfin, on incube la boite de gélose à 37°è pendant 18 à 24 heures

(en pratique, une nuit) (Darbas, 2007).

L'interaction entre la bactérie et l' ATB s'exprime par une zone d'inhibition dont le diamètre

est une expression indirecte de la CMI (concentration minimale inhibitrice). Grâce à des

études comparatives portant sur un grand nombre de souches appartenant à des espèces

bactériennes différentes, des droites de régression liant pour un antibiotique donné les CMI

aux diamètres d'inhibition correspondants ont été tracées. Il existe ainsi deux diamètres

critiques D et d correspondants respectivement à la concentration critique minimale et

maximale: le diamètre étant calculé suivant la fonction : D=f (de CMI). Ils permettent de

classer une réaction bactérienne en fonction du diamètre d'inhibition dans la catégorie

sensible (S), résistance (R), ou sensible intermédiaire (I). La lecture de l'antibiogramme de la

bactérie isolée d'un foyer infectieux consiste en la mesure des défférents diamètres des zones

d'inhibition entourant les disques d'antibiotiques testés. Ils sont comparés aux deux diamètres

critiques de l'antibiotique correspondant portés sur une table de lecture. La réponse est soit S,

Apport de la biologie moléculaire au diagnostic bactériologique

-

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Mémoire de fin d'étuae

En vue de L'obtention du Diplôme des Etudes

Supérieures (D.E.S) en Biologie

Option : microbiologie

Thème

Apport de la

biolo~e

molécillaire au diagnostic

.

bactériologique

Membres

du Jury

Présenté par:

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BENSEGHIER Salima

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BOUDADI

Nabila

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Examinateur : ADJEROUD Nawel

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remerciements

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SOMMAIRE

111.1.1.

LCR

_{Présenté par:}

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