Pathogenèse des encéphalopathies spongiformes transmissibles : apports des modèles cellulaires

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Pathogenèse des encéphalopathies spongiformes transmissibles : apports des modèles cellulaires

Didier Vilette, Hubert Laude

To cite this version:

Didier Vilette, Hubert Laude. Pathogenèse des encéphalopathies spongiformes transmissibles : apports

des modèles cellulaires. Productions animales, Institut National de la Recherche Agronomique, 2004,

17, pp.31-36. �hal-02670094�

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1 / Modèles cellulaires et prions : une histoire déjà longue

La mise au point de systèmes cellulaires sensibles à l’infection est d’une importance capitale dans l’étude et la lutte contre les agents infectieux, qu’il s’agisse de les isoler, d’analyser leur mode de réplication ou encore d’étudier les conséquences de l’infection au niveau cellulaire. L’enjeu est en effet de mieux comprendre la nature des interactions entre la cellule hôte et le pathogène afin de pouvoir établir des stratégies de lutte rationnelles.

Dans le domaine des maladies à prions, les premières tentatives d’obtention des cultures cellulaires capables de propager ces agents remontent à la fin des années 60. Cependant, force est de constater que le nombre très res- treint de modèles cellulaires disponibles est loin de refléter les efforts développés au

cours des trente dernières années (Race 1991). Les raisons de cet insuccès relatif sont obscures, ce qui limite singulièrement la mise en œuvre d’approches rationnelles visant à établir des modèles cellulaires pertinents.

Jusqu’au début des années 2000, l’essentiel des travaux sur cultures cellulaires infectées reposait sur l’utilisation de deux lignées cellu- laires murines (la lignée de neuroblastome N2a et la lignée neuronale GT1), qui permet- tent la multiplication d’un nombre restreint (trois) de souches de prions adaptées expéri- mentalement à la souris. La démonstration du statut infecté des cultures repose sur la mise en évidence de l’accumulation de protéine prion anormale (PrPsc) par immunoblot et d’infectiosité par inoculation d’extraits de cellules à la souris (figure 1A). Ces modèles ont, incontestablement, permis certaines avancées dans notre connaissance des mécanismes moléculaires et cellulaires asso- ciés aux Encéphalopathies Spongiformes Transmissibles (EST) et à leurs agents (Harris 1999). On peut mentionner, à titre d’exemple, l’identification de composants cellulaires importants pour la conversion de la forme normale de la protéine prion, PrP, en forme anormale, PrPsc, l’étude des conséquences de l’infection sur les propriétés fonctionnelles de la PrP ou sur la biologie de la cellule infectée.

Enfin, l’utilisation de cultures cellulaires infec- tées pour identifier des molécules à potentiel thérapeutique est un autre exemple de l’inté- rêt de ces cultures infectées (figure 1B).

Il n’en reste pas moins que ces modèles souffrent d’insuffisances notables. Ils sont peu nombreux, le maintien du statut infecté est souvent délicat et les titres infectieux obtenus sont peu élevés. Enfin, ces lignées cellulaires ne sont infectables que par des souches expérimentales de prions : aucune souche naturelle, qu’elle soit d’origine humai- ne, bovine ou ovine n’a jamais pu être trans- mise à des cultures cellulaires. Ces INRA, Virologie et Immunologie

Moléculaires, Domaine de Vilvert, F-78352 Jouy-en-Josas Cedex

Courriel : vilette@jouy.inra.fr ; laude@jouy.inra.fr

Résumé

Malgré des efforts répétés et soutenus lors des 30 dernières années, le nombre de modèles permettant l’étude en culture cellulaire de la multiplica- tion des prions était, jusqu’à récemment, extrêmement restreint. Il s’agissait, pour l’essentiel, de quelques lignées cellulaires, ne permettant la multiplica- tion que de rares souches expérimentales de prions. Pour tenter de pallier ces insuffisances, un projet a été initié en vue d’établir des modèles capables notamment de permettre la multiplication et l’étude de souches naturelles de prions. Quatre nouveaux modèles cellulaires ont été obtenus. S’ils sont tous permissifs à la multiplication du prion ovin, chacun d’entre eux présente des caractéristiques originales qui permettront une étude approfondie de divers aspects de la pathogenèse de ces maladies à l’échelon cellulaire. L’approche développée ici avec succès pourrait être appliquée à l’établissement de modèles permettant la multiplication de prions bovins ou humains. Des études sont menées actuellement à partir de ces modèles cellulaires, et por- tent sur les conséquences de l'infection sur l'activité neuronale, l'identifica- tion de cellules responsables de la multiplication de l'agent dans le système nerveux périphérique, l'interaction entre prion pathogène et cellule cible, l'analyse de la dérégulation de certains gènes de la glycosylation en cas d'in- fection, l’identification de molécules ayant une activité antiprions, et le rôle du polymorphisme de la PrP ovine dans réplication du prion pathogène.

Encéphalopathies Spongiformes

Transmissibles : apports des

modèles

cellulaires

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limitations, très dommageables à l’avancée des connaissances sur ces agents, justifiaient que des efforts soient poursuivis dans ce domaine et l’INRA, le Ministère de la recherche à travers le Groupement d’Intérêt Scientifique (GIS) « Infections à Prion », et l’Union Européenne ont encouragé les efforts visant au développement de modèles cellu- laires présentant des potentialités complé- mentaires à celles des modèles existants.

Tirant parti notamment de sa compétence dans le domaine de la génétique de la suscep- tibilité à la Tremblante ovine, l’Institut a mobilisé et focalisé un effort de recherche sur cette maladie animale, qui sert en outre de modèle pour l’étude des EST humaines.

Quatre modèles cellulaires sensibles aux prions ovins ont à ce jour été développés dans l’Unité de Virologie et Immunologie Moléculaires (VIM) de l’INRA de Jouy-en-

Josas. L’originalité de ces modèles tient au fait qu’ils sont les seuls qui permettent la mul- tiplication d’une souche naturelle d’EST.

Chacun de ces modèles possède ses caracté- ristiques qui lui sont propres (tableau 1) et leur complémentarité représente un atout important dans l’étude de certains aspects de la pathogenèse des EST. Cellules en culture primaire ou en lignée, leur espèce d’origine est variée (cellules ovines, de lapin ou murines), ainsi que leur phénotype et leur ori- gine tissulaire. Ces cultures expriment la PrP ovine, soit de façon constitutive, soit de façon inductible, après ajout de doxycycline dans le milieu de culture.

Un certain nombre d’aspects relatifs à la pathogenèse des maladies à prions a pu être abordé à l’aide de ces modèles cellulaires.

Figure 1. Culture cellulaire des prions : principe et apports potentiels.

A) L’infection d’une culture de cellules établies en lignée stable s’obtient en incubant les tapis cellulaires avec un homogénat préparé à partir de tissu infecté. Si les cellules sont permissives à l’infection, l’ana- lyse des cultures après un à quelques repiquages révélera l’accumulation de PrP anormale (PrPres) et d’infectiosité. La PrPres, résistante à la digestion protéolytique contrairement à la PrP normale, est détectée par analyse en immunoblot d’extrait cellulaire traité à la protéinase K, et l’infectiosité est quan- tifiée par inoculation intracérébrale et transmission de la maladie à des souris réceptives.

B) L’intérêt des modèles ex vivo d’infection à prion est d’ordre à la fois cognitif – étude de la biologie de l’agent à l’échelon de la cellule – et appliqué, par exemple le criblage à large échelle de substances d’intérêt thérapeutique, incompatible avec l’utilisation d’un modèle animal.

Dénomination Espèce Nature Type Expression PrP ovine

Rov

(Vilette et al 2001) Lapin Lignée Epithélial Inductible

MovS Neuroglial

Constitutive (Archer et al 2004) Souris Lignée

(cellules de Schwann) CGN

³³⁸

(Cronier et al 2004) Souris Cultures primaires Neurones et astrocytes Constitutive A15

(Vilette et al 2000) Ovine Lignée Astrocytaire Constitutive

Tableau 1. Caractéristiques de quatre systèmes de culture cellulaire aptes à propager l’agent de la

tremblante ovine, développés à l’INRA.

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2 / Pathogenèse in vitro

La modélisation de la neurodégénérescence observée dans les EST a jusqu’à présent consisté en (1) des cultures primaires de neu- rones traitées par des peptides dérivés de la séquence de la PrP et (2) la recherche d’évé- nements apoptotiques induits par la multipli- cation de souches expérimentales de prions de rongeur dans des lignées cellulaires chro- niquement infectées.

(1) Par analogie avec les propriétés neuro- toxiques du fragment Abéta4 de la protéine responsable des fibres amyloïdes observées dans la maladie d’Alzheimer, il a été postulé que les dépôts de PrPsc ou de certains de ces fragments pourraient être responsables de la neurodégénérescence observée dans les EST.

L’effet neurotoxique de différents peptides synthétiques dérivés de la structure primaire de la PrP a été testé et certains (les peptides 106-126 et 118-135) présentent une activité neurotoxique vis-à-vis de cultures primaires neuronales (Forloni et al 1993). Selon les cas, cet effet est lié ou non à la tendance de chaque peptide à polymériser en structures de type amyloïde riches en feuillets bêta et peut nécessiter que les cellules cibles expri- ment la PrP. Les mécanismes impliqués ne sont pas encore élucidés, et la pertinence bio- logique des propriétés neurotoxiques de ces peptides, non retrouvés à ce jour dans le cer- veau d’individus atteints, demeure sujette à discussion.

(2) La multiplication active des souches se propageant dans les lignées cellulaires per- missives n’a, de façon surprenante, que peu de conséquences sur la viabilité des cellules infectées. Tout au plus ont été décrites une augmentation faible et inconsistante de la proportion de cellules apoptotiques dans la lignée GT1 (Schatzl et al 1997) ou encore, dans la lignée N2a, une légère sensibilisation à des stimuli pro-apoptotiques (Hetz et al 2003). L’accumulation de la PrP anormale dans des cellules en lignée – y compris d’ori- gine neuronale – n’a manifestement pas d’ef- fet cytotoxique majeur. Les éventuels désordres liés à l’accumulation de cette pro- téine anormale pourraient être plus subtils et/ou ne se manifester que dans certains types cellulaires particuliers.

Des cultures primaires de neurones en grains du cervelet ont été réalisées (S.

Cronier, VIM, Jouy-en-Josas) à partir de sou- ris transgéniques exprimant la PrP ovine. Ces cultures primaires, mises en présence d’une souche de prion ovin, propagent activement l’agent infectieux et convertissent la PrP cel- lulaire ovine en PrP anormale (Cronier et al 2004). Les premiers résultats indiquent que la multiplication de l’agent dans ces cultures primaires induit un effet cytopathogène. Ces résultats encourageants soulignent la perti- nence de ce modèle d’infection de cultures neuronales post-mitotiques pour l’étude des conséquences d’une infection à prion sur le fonctionnement et la survie neuronale.

3 / Modélisation du franchissement de la barrière digestive et de la propagation périphérique

des prions

Le « Follicule Associated Epithelium » (FAE) surmontant les formations lym- phoïdes de l’intestin grêle (plaques de Payer) et comportant des cellules M spé- cialisées dans le transfert de nombreux agents infectieux pourrait être impliqué dans le franchissement de la barrière épi- théliale intestinale par les prions lors d’une contamination par voie orale. Le travail développé par K. Kacem (UMR 1161, Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort) a pour objet d’étudier le rôle de la PrP comme récepteur aux prions pour franchir la barrière intesti- nale. Le schéma expérimental consiste à injecter dans les plaques de Payer un adé- novirus vecteur exprimant la PrP de ham- ster ou à infecter un modèle cellulaire de plaques de Peyer (obtention de cellules M par cocultures de cellules Caco2 avec des lymphocytes murins) par ce même adéno- virus afin de déterminer si l’expression de la PrP peut moduler le franchissement de cette barrière par les prions.

Si l’importance du Système Nerveux

Périphérique (SNP) lors de la phase de neu-

roinvasion n’est plus discutée (Kimberlin

et Walker 1988), l’identification des cel-

lules responsables de la multiplication de

l’agent au sein du SNP ainsi que les méca-

nismes mis en jeu restent à établir. Des

clones cellulaires, appelés MovS et présen-

tant des caractéristiques de cellules de

Schwann, ont été isolés à partir de gan-

glions dorsaux de souris transgéniques

exprimant la PrP ovine. Ces cultures se

sont révélées particulièrement permissives

à une souche de prion ovin (F. Archer, VIM,

Jouy-en-Josas). Ces cultures peuvent être

infectées par de faibles doses d’agent infec-

tieux, les titres infectieux, déterminés par

bio-essai chez la souris transgénique, peu-

vent atteindre plusieurs DL50 par cellule et

la PrP anormale s’accumule en quantités

importantes (Archer et al 2004). Ces résul-

tats indiquent que des cellules gliales du

SNP peuvent être le siège d’une multiplica-

tion active de l’agent infectieux, d’autant

que la PrP anormale a pu également être

visualisée in vivo, dans des cellules gliales

de ganglions dorsaux de souris transgé-

niques infectées par voie périphérique. La

poursuite de ce travail visera à déterminer

dans quelle mesure un phénomène similai-

re à celui décrit dans les cellules MovS par-

ticipe à la propagation des prions le long

des nerfs périphériques. L’approche rete-

nue repose sur l’obtention de souris trans-

géniques dans lesquelles l’expression de la

PrP sera sélectivement inactivée dans les

cellules gliales du SNP.

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4 / Interaction précoce entre PrPsc exogène et cellule cible, étude des sites subcellulaires de la conversion de la PrPc en PrPsc

De façon assez surprenante, les phases pré- coces qui aboutissent à l’infection d’une cellu- le cible permissive sont très mal documentées.

Quelles sont les modalités d’interaction entre la PrPsc d’un inoculum infectieux et la cellule cible ? L’interaction de la PrPsc exogène avec la PrP cellulaire se produit-elle à la membrane plasmique ou en un site intracellulaire après internalisation de la PrPsc ? Autant de ques- tions importantes pour lesquelles les données existantes sont parcellaires voire même contradictoires puisque certains travaux sug- gèrent que la conversion s’effectuerait à la membrane plasmique (Weissmann et al 2002) tandis que d’autres semblent indiquer qu’elle serait postérieure à l’internalisation de la PrPsc (Caughey et al 1991).

Pour tenter d’apporter des éléments de cla- rification, S. Paquet (VIM, Jouy-en-Josas) a initié un projet utilisant le modèle cellulaire Rov. Après avoir démontré que la PrP est essentiellement localisée au niveau de la sur- face apicale des cellules Rov (Paquet et al 2004), elle a entrepris d’analyser la nature des interactions entre les cellules Rov et la PrP anormale présente dans l’inoculum infec- tieux. Grâce au caractère inductible de l’ex- pression de la PrPc, le rôle de la PrP dans ces phénomènes peut être précisé. La PrP anor- male de l’inoculum est internalisée par les cellules avec une efficacité qui ne semble pas dépendre de la présence de la PrP à la surfa- ce des cellules Rov. En outre, la PrPsc inter- nalisée alors que les cellules n’exprimaient pas la PrP normale n’est plus capable d’initier l’infection de ces cellules si l’expression de la PrP est restaurée. Ces résultats prometteurs suggèrent que la conversion de la PrP en PrPsc a lieu dans des sites subcellulaires pré- cis, soit à la membrane plasmique soit dans un compartiment favorable à la conversion dont l’accès serait contrôlé par l’expression de la PrP. L’identification et la caractérisation de ces sites sont actuellement en cours d’in- vestigation.

5 / Glycotranscriptome,

approches transcriptomique et protéomique pour l’étude comparée des états sains et infectés

La PrP cellulaire, qui joue un rôle détermi- nant dans le déclenchement et la transmis- sion des EST, est une protéine glycosylée. La glycosylation de cette GPI-protéine joue un rôle important dans la biosynthèse et le trafic de la PrP (Harris et al 1999), mais aussi, semble-t-il, dans la capacité de cette protéine à être convertie en PrP anormale (Priola et Lawson 2001, Winklhofer et al 2003). Le pro- jet développé par F. Guillerme (UMR 1061,

Limoges) exploite la compétence de cette équipe dans l’étude du transcriptome des gènes codant pour des enzymes impliquées dans la glycosylation, tout particulièrement chez les ruminants. L'enjeu est d'établir si les infections à prions ont des répercussions sur le transcriptome des gènes impliquées dans la glycosylation, en d'autres termes si l'infection modifie l'activation ou l'inactivation de cer- tains de ces gènes. Pour cela, deux modèles seront analysés. Il s’agit d’une part, de cer- veaux ou de rates provenant de souris trans- géniques pour la PrP ovine et infectées par une souche de Tremblante et d’autre part des lignées GT1 et MovS, infectées par une souche de prion murine et ovine, respective- ment. L’analyse des transcriptomes sur les

« glycopuces ADN » disponibles a permis d’identifier des gènes dont l’expression est dérégulée après infection : 8 dans la rate et/ou le cerveau et 12 gènes dans les cellules GT1, impliqués dans la synthèse des glycosamino- glycanes.

Le projet initié par J.F. Chich (VIM, Jouy-en- Josas) vise à combiner les approches trans- criptomique et le protéomique sur un même modèle, les cellules GT1 infectées ou non par une souche murine de prions. L’analyse trans- criptomique repose sur la Representational Difference Analysis, l’approche protéomique incluant l’electrophorèse bidimensionnelle suivie par spectrométrie de masse. A mi- temps du projet, 52 et 36 séquences d’ADN sont sur- ou sous-exprimées, respectivement, dans les cellules GT1 infectées. Dix-sept pro- téines sont différentiellement représentées dans les cellules infectées ou saines. Les études sont actuellement étendues au systè- me MovS afin d‘examiner si les mêmes trans- crits ou protéines sont différentiellement exprimés dans ces cellules suite à l’infection.

6 / Identification de

composés à propriétés anti-prions

La méconnaissance des mécanismes qui sous-tendent les EST et les incertitudes sur la nature précise des prions sont des obstacles réels au développement d’approches théra- peutiques raisonnées. De fait, l’identification des premières molécules présentant une cer- taine activité anti-prions provient d’essais réalisés sur des rongeurs de laboratoire. Il n’est pas envisageable, pour d’évidentes rai- sons de logistique et de coût, d’identifier des molécules actives par criblage à grande échel- le sur des modèles animaux. L’utilisation de modèles cellulaires répliquant des souches de prions de laboratoire est une alternative inté- ressante qui a permis récemment l’identifica- tion de quelques molécules (certaines polyamines branchées, des tétrapyrroles cycliques…) présentant une activité anti- prions chez la souris (Dormont 2003).

Malheureusement, l’absence de modèles

expérimentaux pertinents ne facilite pas

l’évaluation de l’efficacité de ces molécules

sur les EST touchant d’autres espèces que les

rongeurs. Des modèles cellulaires (cellules

Rov ou Mov) répliquant des souches de ter-

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INRA Productions Animales, Décembre 2004

rain pourraient donc se révéler plus perti- nents pour identifier des molécules actives dans les EST naturelles.

Le travail réalisé par V. Béringue (VIM, Jouy- en-Josas) en étroite collaboration avec le laboratoire de S. Hawke et J. Collinge à Londres (Imperial College, School of Medecine) est une illustration des potentiali- tés du système Rov dans ce domaine. Un panel d’anticorps à tout d’abord été obtenu à partir des conformations alpha ou bêta de la PrP recombinante humaine. Les anticorps produits contre la forme alpha reconnaissent uniquement la PrP cellulaire alors que les anti- corps produits contre la forme bêta recon- naissent aussi la PrP anormale. Un test de criblage sur des cellules Rov chroniquement infectées a été mis au point pour identifier des anticorps monoclonaux anti-PrP inhibant la multiplication des prions en culture. Les résul- tats obtenus montrent que les anticorps anti- forme bêta de la PrP inhibent plus efficacement l’accumulation de la PrPsc dans les cellules traitées (Beringue et al 2004). Ces résultats indiquent que le ciblage additionnel de la PrPsc par des anticorps peut se révéler avantageux dans la perspective d’une approche thérapeutique des maladies à prions.

Enfin, une collaboration a été initiée avec M.

Blondel (UMR 7127, Roscoff) dont l’enjeu consiste à valider, sur cellules de mammifères, certaines molécules présentant des activités anti-prions chez la levure. Cette équipe a en effet mis au point un test de criblage permet- tant d’identifier des composés inhibant le développement des prions PSI+ et URE3 chez la levure (Bach et al 2003). Un premier essai utilisant des cultures Rov et MovS infectées indique que certaines des molécules identi- fiées chez la levure sont actives également sur des souches de prions de mammifère. Le déve- loppement de cette collaboration pourrait déboucher sur l’identification de nouveaux composés pharmacologiques présentant des activités anti-prions in vivo.

7 / Polymorphisme naturel de la PrPc ovine et résistance à la tremblante : étude des mécanismes

L’influence du polymorphisme de la PrP sur la sensibilité ou la résistance individuelle aux EST est un phénomène décrit dans plusieurs espèces et particulièrement bien documenté dans le cas de l’espèce ovine (Hunter 1997).

Chez le mouton, certains allèles (dits de

« sensibilité ») prédisposent les animaux à contracter la maladie. A l’inverse, d’autres (dits de « résistance ») semblent protéger les moutons. Un programme de sélection géné- tique réduisant la présence de l’allèle de sen- sibilité VRQ et augmentant celle de l’allèle de résistance ARR a été initié pour réduire à terme la prévalence de la maladie dans le cheptel français. Son efficacité, déjà avérée, ne doit cependant pas faire oublier notre méconnaissance des mécanismes par les-

quels l’allèle ARR est associé à la résistance aux EST. Peut-on craindre une multiplication asymptomatique de l’agent infectieux chez les animaux résistants (porteurs sains) ? L’adaptation de certaines souches au génoty- pe ARR peut-elle être considérée comme un scénario possible ? Autant de questions cru- ciales sur lesquelles il est, en raison de notre méconnaissance des mécanismes en jeu, extrêmement difficile de se prononcer. Les résultats très récents obtenus au Neuropathogenesis Unit à Edinburgh (trans- mission, par voie intracérébrale, de l'ESB à des moutons homozygotes pour l’allèle ARR) illustrent clairement que la résistance confé- rée par cet allèle peut ne pas être absolue (Houston et al 2003), et qu’une meilleure compréhension des mécanismes impliqués est souhaitable pour que la stratégie préventi- ve mise en œuvre ait des effets durables.

Le projet développé par E. Sabuncu (VIM, Jouy-en-Josas) vise à caractériser les méca- nismes par lesquels un allèle de résistance peut influer aussi drastiquement sur la sensi- bilité à ces maladies. Il privilégie une approche reposant sur l’utilisation du modèle cellulaire Rov permissif aux prions ovins, pouvant exprimer différents allèles de la PrP.

Des clones de cellules Rov exprimant diffé- rents allèles de sensibilité ou de résistance à la Tremblante du mouton ont été générés et testés quant à leur aptitude à permettre la réplication de prions ovins. Les résultats indi- quent que la réplication de prions de mouton dépend étroitement de la nature de l’allèle exprimé par les cellules (Sabuncu et al 2003).

Ce travail suggère que la résistance à l’infec- tion observée chez l’individu, résultat d’un long et complexe cheminement au sein de l’organisme, aboutissant à la neuroinvasion, peut être reproduite à l’échelon cellulaire. Il s’agit des premiers résultats expérimentaux établissant que l’absence de pathologie pour- rait résulter d’un défaut de multiplication de l’agent infectieux. L’étude fine du trafic de ces deux variants de la PrP dans les cellules Rov et l’analyse de leurs propriétés biochimiques ont par la suite donné lieu à des observations intéressantes. La répartition intracellulaire ainsi que les propriétés physico-chimiques de ces deux allèles de sensibilité et de résistance sont très différentes. Ce modèle expérimen- tal, le premier à établir un lien causal entre polymorphisme et efficacité de la réplication, pourrait donc ouvrir des pistes intéressantes sur les mécanismes mis en jeu.

D’autres modèles cellulaires sont en cours

de développement. Des cultures primaires de

cellules neuronales précurseurs (technique

des neurosphères) à partir d’embryon de

moutons de génotype sensible et résistant

peuvent être obtenues (A. Duittoz, UMR 6073,

Nouzilly). Des neurones corticaux ou des

neurones cérébelleux isolés à partir de souris

transgéniques exprimant un allèle de sensibi-

lité ou de résistance (J.L. Vilotte, Génétique

Biochimique et Cytogénétique, Jouy-en-

Josas) peuvent d’autre part être maintenus en

cultures primaires. La pertinence des méca-

nismes identifiés dans les cellules Rov pour-

rait à terme être évaluée en utilisant ces

modèles alternatifs.

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Conclusion

Au terme d’un effort substantiel de recherche, plusieurs types de cultures cellu- laires permettant une multiplication efficace de prions ovins ont été obtenus. La complé-

mentarité de ces modèles permet d’aborder l’étude de différents aspects de la pathogenè- se des EST, comme par exemple les méca- nismes de la pathogénie, ceux de la résistance à la tremblante ou encore l’identification de composés à propriétés anti-prions.

Références

Abstract

Archer F., Bachelin C., Andreoletti O., Besnard N., Perrot G., Langevin C., Le Dur A., Vilette D., Baron-Van Evercooren A., Vilotte J.L., Laude H., 2004. Cultured per- ipheral neuroglial cells are highly permissive to sheep prion infection. Journal of Virology, 78, 482-490.

Bach S., Talarek N., Andrieu T., Vierfond J.M., Mettey Y., Galons H., Dormont D., Meijer L., Cullin C., Blondel M., 2003. Isolation of drugs active against mammalian prions using a yeast-based screening assay. Nature Biotechnology, 21, 1075-1081.

Beringue V., Vilette D., Mallinson G., Archer F., Kaisar M., Tayebi M., Jackson G.S., Clarke A.R., Laude H., Collinge J., Hawke S., 2004. PrPsc binding antibodies are potent inhibi- tors of prion replication in cell lines. Journal of Biological Chemistry, 279, 39671-39676.

Caughey B., Raymond G.J., Ernst D., Race R.E., 1991. N- terminal truncation of the scrapie-associated form of PrP by lysosomal protease(s): implications regarding the site of conversion of PrP to the protease-resistant state. Journal of Virology, 65, 6597-6603.

Cronier S., Laude H., Peyrin J.M., 2004. Prions can infect primary cultured neurons and astrocytes and promote neu- ronal cell death. Proceedings of National Academy of Science of the USA, 101, 12271-12276.

Dormont D., 2003. Approaches to prophylaxies and the- rapy. British Medical Bulletin, 66, 281-292.

Forloni G., Angeretti N., Chiesa R., Monzani E., Salmona M., Bugiani O., Tagliavini F., 1993. Neurotoxicity of a prion protein fragment. Nature, 362, 543-546.

Harris D.A., 1999. Cellular biology of prion diseases.

Clinical Microbiology Reviews, 12, 429-444.

Hetz C., Russelakis-Carneiro M., Maundrell K., Castilla J., Soto C., 2003. Caspase-12 and endoplasmic reticulum stress mediate neurotoxique of pathological prion protein.

EMBO Journal, 22, 5435-5445.

Hunter N., 1997. PrP genetics in sheep and the applica- tions for scrapie and BSE. Trends in Microbiology, 8, 331- 334.

Houston F., Goldmann W., Chong A., Jeffrey M., Gonzalez L., Foster J., Parnham D., Hunter N., 2003. Prion diseases: BSE in sheep bred for resistance to infection.

Nature, 423, 498.

Kimberlin R.H., Walker C.A., 1988. Pathogenesis of expe- rimental scrapie. Ciba Found Symposium, 135, 37-62.

Priola S.A., Lawson V.A., 2001. Glycosylation influences cross-species formation of protease-resistant prion protein.

EMBO Journal, 20, 6692-6699.

Paquet S., Sabuncu E., Delaunay J.L., Laude H., Vilette D., 2004. Prion infection of epithelial Rov cells is a polari- zed event. Journal of Virology, 78, 7148-7152.

Race R., 1991. The scrapie agent in vitro. Current Topics in Microbiology and Immunology, 172, 181-193.

Schatzl H.M., Laszlo L., Holtzman D.M., Tatzelt J., DeArmond S.J., Weiner R.I., Mobley W.C., Prusiner S.B., 1997. A hypothalamic neuronal cell line persistently infec- ted with scrapie prions exhibits apoptosis. Journal of Virology, 71, 8821-8831.

Sabuncu E., Petit S., Le Dur A., Lai T.L., Vilotte J.L., Laude H., Vilette D., 2003. PrP polymorphisms tightly control sheep prion replication in cultured cells. Journal of Virology, 77, 2696-2700.

Vilette D., Andreoletti O., Archer F. , Madelaine M.F., Vilotte J.L., Lehmann S., Laude H., 2001. Ex vivo propaga- tion of infectious sheep scrapie agent in heterologous epi- thelial cells expressing ovine prion protein. Proceedings of National Academy of Science of the USA, 98, 4055-4059.

Vilette D., Madelaine M.F., Laude H., 2000. Establishment of astrocyte cell lines from sheep genetically susceptible to scrapie. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal, 36, 45-49.

Weissmann C., Enari M., Klöhn P.C., Rossi D., Flechsig E., 2002. Transmission of prions. Proceedings of National Academy of Science of the USA, 99, 16378-16383.

Winklhofer K.F., Heller U., Reintjes A., Tatzelt J., 2003.

Inhibition of Complex Glycosylation Increases the Formation of PrPsc. Traffic, 4, 313-322.

Cell culture models of transmissible spon- giform encephalopathies

Although numerous attempts have been made during the last 30 years to generate cellular models of prion infection, very few cell models were available until recently. A few cell lines allowed the multiplication of a very small number of experimental prion strains. A project was initiated to compensate for the lack of a cellular system permissive to the multiplication of natu- ral strains of prions. Four models have been generated.