Application de la cryoconservation des embryons à la protection des ressources génétiques chez le lapin

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Submitted on 1 Jan 1994

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Application de la cryoconservation des embryons à la

protection des ressources génétiques chez le lapin

T Joly, M Theau-Clément, F Drouet-Viard, H de Rochambeau, Jp Renard

To cite this version:

Article

_original

Application

de

la

_{cryoconservation}

des

_embryons

à

la

_protection

des

ressources

génétiques

chez le

_lapin

T Joly

M

Theau-Clément

F

Drouet-Viard

4

H de Rochambeau

3

JP

Renard

1 _{Institut national de recherche}

agronomique, unité de _biologie du développement, 78352 _{Jouy-en-Josas, Cedex;}

2

ISARA, 31, place Bellecour, 69002 _{Lyon Cedex;}

3

Institut national de recherche _agronomique, station d’amélioration génétique des animaux, Auzeville BP 27, 31326 Castanet-Tolosan Cedex;

4 _{Institut national de recherche}

agronomique, unité de pathologie du lapin,

37380 _Nouxilly, France

Résumé - L’établissement d’une _cryobanque de _gamètes et _d’embryons peut constituer

aujourd’hui

une aide précieuse _{pour garantir} le maintien de la diversité

génétique

animale

et la protection des populations menacées d’extinction. Nous avons _entrepris d’établir une telle _banque chez le lapin, espèce à la fois d’intérêt zootechnique, mais aussi modèle

pour

la recherche biomédicale. Dans un _{premier temps,} nous avons défini les conditions

techniques pour l’établissement d’une banque d’embryons à partir de la souche en cours

d’homogénéisation «hyperféconde» de _l’INRA, choisie comme référence. Nous avons

ensuite commencé à appliquer ces _techniques à la _{cryoconservation} de plusieurs types

de _{populations :} une souche à _grand effectif et de haute valeur zootechnique, la souche INRA A _1077, sélectionnée _depuis 18 _{générations} sur la taille de portée et maintenue en

population fermée; une race à effectif réduit, le «Brun Marron de Lorraine»; une _lignée

d’intérêt biomédical constituée par 3 familles sélectionnées sur la variabilité allotypique des _gènes codant pour la chaîne lourde des immunoglobulines; enfin, une _{lignée mutante,}

le lapin dit «sauteur d’Alfort». Cette recherche devrait nous _permettre de définir les choix

scientifiques et _{économiques qui présideront} à l’extension de ce travail de conservation à

d’autres _populations de lapin, notamment des _{lignées transgéniques} et des clones.

conservation _/ diversité _{génétique /} cryobanque / lapin

Summary - Cryopreservation of _{embryos applied} to the protection of genetic re-sources in the rabbit. The establishment of a _{cryobank of gametes} and embryos would

be _{useful for maintaining} animal _{genetic diversity} and _{protecting populations} threatened

species which is _of interest _from both zootechnical and biomedical _{points of} view. We _first defined the technical parameters for establishing an embryo bank _using the INRA

’hyper-fecund’ line. _Subsequently we have begun to _apply these techniques of cryopreservation to

the _{following populations :} a strain with a _{large population} size and _high zootechnical

va-lue, INRA _A-1077, selected over 18 _{generations for} litter size and maintained as a closed breeding group; a breed with reduced population size, the ’Brun-marron de Lorra,ine’; a

line of biomedical interest _{consisting of 3 families} selected _{for allotypic} variation in genes

coding for the _{immunoglobin heavy chain;} and a mutant strain _referred to as the ‘jumping

Alfort’

rabbit. This research should allow us to _define the scientific and economic choices important in the extension _of this

work

to other rabbit _{populations, particularly transgenic} lines and clones.

conservation _/ genetic diversity / cryobank / rabbit

INTRODUCTION

Chez les animaux

_domestiques,

l’utilisation intensive d’un

_petit

nombre de races se traduit par un

_{appauvrissement}

de la variabilité

_génétique

des

_populations

souvent

issues de

_longs

efforts de sélection et menace les races de

_petits

effectifs

_{(FAO, 1987).}

La définition de

_stratégies

de conservation devient un

impératif

_que la recherche ne

peut

ignorer

ne serait-ce _{que pour}

_corriger

des erreurs commises

_parfois

avec ou en son nom.

Dans le même _temps, chez les animaux dits de laboratoire

_(la

souris

_surtout),

des outils comme la

transgenèse

associée maintenant à la

_mutagenèse

insertionnelle ciblée _permettent de créer de nouvelles

_lignées

_qui

deviennent autant de modèles

irremplaçables

pour l’avancée des connaissances fondamentales et leurs

_applications

à des fins biomédicales. Associés aux

_progrès

en cours dans l’établissement des cartes

génétiques

et aux méthodes

_{d’introgression}

de

_gènes

dans une

_population,

ces outils

seront demain utilisés chez

_{plusieurs espèces domestiques.}

Dans les 2

situations,

la conservation d’une diversité

_génétique

menacée ou foisonnante

_apparaît

comme

_{indispensable}

_pour ouvrir de nouveaux

_champs

à la meilleure utilisation

_possible

de caractères

_{phénotypiques}

_qui

résultent le

_plus

souvent de

_{l’expression}

de

_{plusieurs gènes}

combinants leurs effets au sein du

_génome.

Notre travail vise à fournir chez une

_{espèce domestique}

_prise

comme

_modèle,

le

_lapin

_{( Oryctolagus cuniculus),}

une base de références concrètes _pour la mise en

place, l’organisation

et l’utilisation de méthodes de conservation ex situ destinées à

renforcer les actions

_{indispensables}

de conservation in situ

_déjà

à l’oeuvre chez cette

espèce

et dont le

_{développement}

doit être activement

_poursuivi.

Une des méthodes de choix _pour la conservation ex situ consiste à

_placer

des

_embryons

et des

_gamètes

dans l’azote

_liquide

à la

_température

de -196°C

_puisque

l’on a montré

_qu’à

cette

température

on

_pouvait

conserver des

spermatozoïdes

bovins

pendant plus

de 30 ans

et des

_embryons

de souris

_{pendant plus}

de 13 ans sans modifier leur

_aptitude

à donner des descendants normalement fertiles

_(Wood

et

_al,

_1987).

Ces durées seront

probablement

allongées

au fur et à mesure _que l’on

disposera

du recul

expérimental

suffisant. En

_effet,

à la

_{température de —196°C,}

seules des réactions

_{photophysiques}

peuvent se

_dérouler,

celles-ci

_risquant

d’induire une ionisation du milieu cellulaire

cet effet _par

_{l’exposition d’embryons}

de souris à

_{l’équivalent}

d’environ 2000 années de radiations n’ont eu aucune

_{conséquence génétique}

sur les souris issues de ces

embryons

après transplantation

dans des femelles receveuses

(Glenister

et

al,

1984),

ce

_qui

_indique

_que la durée de conservation n’a dans ces conditions aucun effet néfaste sur les cellules.

Plus d’une centaine de races et variétés de

_lapin

ont été à ce

_jour

inventoriées

par la World Rabbit Science Association pour une

population

mondiale estimée à

plus

de 700 millions d’individus

_{(Lukefahr, 1985).}

Cet inventaire encore très

_partiel

montre

_qu’on

_peut

accéder avec cette

_espèce

à des

_populations

constituées de

_façons

très différentes.

À

la diversité des situations

_génétiques

rencontrées,

le

_{lapin joint}

un autre _avantage. Chez cette

_espèce,

des méthodes de

_congélation

ont

_déjà

été définies pour 2 types

cellulaires,

les

_{spermatozoïdes}

et les

_embryons;

l’insémination artificielle avec du _sperme

_congelé

_peut être utilisée en

_pratique

_(Courot,

_1977; Theau-Clément et

Vrillon,

1989)

et les

_techniques

de

cryopréservation

d’embryons

(Whittingham

et

_Adams,

₁₉₇₆₎

sont

_compatibles

avec des taux de

_{développement}

à terme similaires à ceux obtenus en l’absence de

_congélation

_(Renard

et

_al,

_1984).

ÉTABLISSEMENT

D’UNE

_CRYOBANQUE

D’EMBRYONS :

DONNÉES

TECHNIQUES

L’utilisation des basses

_{températures}

pour la

préservation

ex situ du

_génome

des mammifères

_domestiques

a fait

_l’objet

de nombreux travaux. Les auteurs formu-lent des recommandations

_parfois

précises

(FAO, 1987)

mais

_qui

_s’appuient

sur des données

_{expérimentales partielles.}

Il est en effet

_largement

fait

_appel

à des considérations

_théoriques

ou à des situations modèles

_qui

_empruntent à

_plusieurs

espèces

à la fois les données nécessaires à l’établissement de

stratégies

de conser-vation

_(Brem

et

_al,

_1982;

Renard et

_al,

_1983;

_Smith,

_1984;

Yamada et

_Kimura,

1984).

La

_première

partie

de notre travail a donc consisté à mesurer les

paramètres

techniques

conditionnant la mise en oeuvre d’une

_{cryobanque d’embryons}

de

la-pin.

Nous avons choisi comme

_population

de référence la souche n° 1029 de l’INRA. Cette souche est utilisée pour l’étude

génétique

des _composantes

_{physiologiques}

de la taille des

_portées

_(Bolet

et

_al,

_1991).

Méthode de

_congélation

retenue

Nous avons

_pris

le

_parti

de recourir à des

_techniques

de stimulation hormonale et

d’insémination artificielle _pour

_disposer

de références sur

_l’apport

de ces méthodes à la constitution d’une

_{banque d’embryons.}

La

_technique

de

_{superovulation}

décrite par

Kennelly

et Foote

₍₁₉₆₅₎

a été modifiée de la

façon

suivante : une dose de 2 mg de

pFSH

(Stimufol,

Rhône

_Mérieux,

_France)

est administrée par voie sous-cutanée en 5

injections

à 12 h d’intervalle

_{(respectivement}

0,25; 0,25; 0,625; 0,625

et

_0,25

_{mg) ;}

8 h

_après

la dernière

_injection,

les femelles sont inséminées

_{(Theau-Clément}

et

Roustan,

1991),

avant induction de l’ovulation _par un

analogue

de GnRH

(0,2

ml de Buséréline en

intramusculaire;

Réceptal,

Distrivet,

France);

les

_embryons

sont

collectés au stade morula 65 h _post coi’turn

_{après abattage}

des femelles et

_perfusion

du tractus

_génital

à l’aide d’une solution saline

_tamponnée

_(tampon

_phosphate,

années

_(Garnier

et

_al,

₁₉₈₈₎

et

_qui

_permet de

récupérer

les

_{embryons plusieurs}

fois de suite sur une même femelle n’a _pas été _{retenue pour} ce

_premier

travail. Elle le sera ultérieurement _pour définir les conditions strictes de son

_application

dans le cas où le nombre de femelles de la

_population

à conserver est très faible.

La méthode de

_congélation

retenue

_{implique l’emploi}

d’un

_congélateur

program-mable

_{puisqu’elle}

est réalisée dans des conditions

_{d’équilibre}

de variation de la

température

(Mazur, 1990).

Le

_dispositif

_que nous utilisons est

_portable

(Cryo-cell 1200.

_IMV,

_L’Aigle

_France)

et son maniement

_simple

en fait un

_appareil

bien

adapté

pour intervenir directement dans des

élevages.

La méthode

employée

com-prend

3

_étapes.

La

_première

consiste à

_remplacer

une

_partie

de l’eau intracellulaire

par une solution de cryoprotecteur; pour

cela,

les

embryons

sont

_{plongés chaque}

fois

_pendant

5 minutes dans 3 bains successifs contenant

_{respectivement 0,5, 1,0}

et

1,5

M de

_di-méthyl

sulfoxide

_(DMSO),

avant d’être introduits dans une

_paillette

en

_plastique

du _type de celles utilisées dans l’industrie de l’insémination artificielle bovine

_(0,25

_ml;

_IMV)

mais modifiées _{pour permettre} une identification sur un

jonc

de

_plastique.

Dans un 2e _temps, les

paillettes

sont

_{équilibrées}

à -7°C

_pendant

10 minutes dans le

_{congélateur programmable prérefroidi;}

cette

_opération

_permet

de mettre le milieu environnant les cellules en surfusion et favorise

_{l’apparition}

d’un

_premier

cristal de

_glace.

La troisième

_étape

consiste alors à abaisser lentement la

_température

à une vitesse de

_0,5°C

_par minute

_jusqu’à

_-30°C,

ce

_qui

_permet une

_{déshydratation}

_progressive

mais suffisante des cellules avant leur immersion dans l’azote

_liquide

à -196°C. La

_{décongélation}

s’effectue en réchauffant le

_plus

rapidement possible

les

_paillettes

_pour éviter la recristallisation

_éruptive

de la

_glace

intracellulaire. Le

_{plus simple}

_pour cela est de les faire _passer directement de l’azote

liquide

dans un bain-marie à 20°C. Le _{cryoprotecteur} est retiré en

_plaçant

les

em-bryons

successivement

_pendant

5 minutes dans 2 bains contenant

_{1,0 puis 0’,5}

M de DMSO. La survie des

_embryons

est mesurée par le taux de

_{développement}

ob-tenu soit

_après

24 h de culture

_(taux

_d’embryons

au stade

_blastocyste

_{«épanoui»)}

soit _par transfert

_chirurgical

dans les cornes utérines ou oviductes d’une femelle

pseudogestante.

Un

premier

bilan

Soixante-quinze

femelles

_âgées

de

_4,5

mois et élevées dans les mêmes conditions d’environnement ont été utilisées comme donneuses

_(n

=

40)

_{et receveuses}

(n

=

35)

d’embryons. Après application

d’un traitement de

_{superovulation,}

nous avons

congelé

en _moyenne

_11,5

embryons

_par femelle traitée. La variabilité de

_réponse

au traitement est élevée. Plus du _quart des animaux

_(11/40,

soit

_27,5%)

ne donnent aucun

_{embryon congelable ;}

les autres fournissent en _moyenne

_15,

9 f 13

_embryons

par individu. Le bilan de la

congélation

est évalué in vivo à

_partir

du taux

de

_{développement}

à terme des

_embryons

_(après

transfert dans des receveuses

synchronisées)

ou in vitro

_après

24 h de culture

_(tableau

_I).

Près de 90% des

_{embryons congelés}

sont intacts à la

_{décongélation}

et

_plus

de

60% de ces

_embryons

cultivés in vitro ou transférés sont

_capables

de se

_développer

et donner naissance à des

_lapereaux

viables.

La distribution des donneuses en fonction du nombre de descendants obtenus est

Ces résultats montrent que sur les 19 femelles

qui

ont donné au minimum 9

_{embryons congelés}

et

_{transplantés,}

18

_(94,7%)

d’entre elles ont eu au moins 1 descendant viable et 7

_(36,8%)

_plus

de 10

_lapereaux,

soit une moyenne de

9,5

descendants _par femelle

_(180/19).

En

définitive,

ces différents éléments nous

permettent d’en déduire

_{qu’après congélation}

d’au moins 9

_{embryons, plus}

de 80%

des

_{accouplements}

_(16/19)

donnent 3 descendants viables ou

_plus

ce

_qui,

_compte

tenu d’une mortalité entre la naissance et la

_puberté

d’environ

20%,

est

_compatible

avec l’obtention d’un

couple

de

reproducteurs

adultes.

Des essais sont en cours pour confirmer ces

_premiers

résultats et définir des

pa-ramètres

_techniques

_{plus précis}

_pour l’établissement de

_{protocoles d’échantillonnage}

et de

_gestion

des

_{accouplements}

des animaux donneurs

_d’embryons

en _prenant en

compte la variabilité individuelle de

réponse

des femelles. Trois

_paramètres

tech-niques

permettront alors de déterminer le nombre

_d’embryons

qui

doivent être

congelés :

- la

probabilité

pour un

couple

donné de

reproducteurs

d’obtenir au moins

un descendant de

_chaque

sexe; ce

_{paramètre dépend}

directement de l’efficacité

technique

de la

_{cryoconservation ;}

- le nombre d’animaux

retenus pour

représenter

génétiquement

la

_population

à conserver; ce nombre

dépend

des

objectifs génétiques

visés et du coût de la

conservation ;

- le

plan

d’accouplements

nécessaires _pour

_pouvoir

réaliser un

échantillonnage

correct de la

_population.

On estime _{que pour} une

_population

d’effectif

réduit,

de

quelques

centaines d’individus

seulement,

l’échantillon doit

_représenter

au minimum 20

_{accouplements}

de _parents le moins

apparentés

possible

(Woodford, 1990).

Pour ces

populations, l’objectif

est de conserver le maximum de

produits

de différents

accouplements.

Pour les

_populations

de

_plusieurs

milliers

d’individus,

des

_techniques

d’échantillonnage

permettent

d’organiser

les

_{accouplements}

pour maintenir la

plus

CHOIX DE POPULATIONS DE

RÉFÉRENCE

Dans le cadre de l’action que nous

conduisons,

4 races

(ou souches)

font

l’objet

d’un programme de conservation. Chacune

correspond

à un _type de

population

différent. Souche à

_grand

effectif

_possédant

une haute valeur

_{zootechnique :}

la souche A 1077 de l’INRA

Cette

_population

est un bon

_exemple

des races à

_grands

effectifs

(plusieurs

milliers

d’animaux).

Les animaux sont utilisés pour leur

aptitude

à la

production

de viande

(principalement

les races néo-zélandaise et

_{californienne)}

ou de fourrure

(races

_Rex,

Angora).

Certaines souches issues de ces races font

_l’objet

de

_plans

d’amélioration

génétique

rigoureux

(Matheron

et

_Poujardieu,

_1984).

C’est le cas de la souche A 1077.

_Celle-ci,

_d’origine

néo-zélandaise

_blanche,

est sélectionnée artificiellement dans les installations de la station INRA de Toulouse

_depuis

1976 _pour améliorer la taille de la

_portée

au _{sevrage. Les animaux}

disponibles aujourd’hui

sont les descendants de 11 mâles et 53 femelles fondatrices. La souche fermée dès

_l’origine

est à sa

_{vingtième génération}

de sélection. Elle est conduite en 11 _groupes de

reproduction

formés en

_pratique

de 4 mâles

pleins

frères et de 11 femelles. La valeur des coefficients de

_{consanguinité}

est connue; à la dix-huitième

_{génération,}

elle était de

_{0,144 ± 0, 037}

chez les mâles et

0,153

f

_0,041

chez les femelles

_(Poujardieu,

communication

_{personnelle).}

La sélection se

_poursuit

selon un

_{plan d’accouplements}

précis

(Matheron

et

_Chevalet,

₁₉₇₇₎

_qui

vise à distribuer l’ensemble des

_gènes

sur l’ensemble des individus et donc à éviter _que ne se constituent des

_{pseudo-isolats}

génétiques.

L’échantillon des

_{reproducteurs}

utilisés _pour

_produire

les

_embryons

peut dans ces conditions

_correspondre

aux

_{accouplements}

tels

_qu’ils

sont

_prévus

dans la

_gestion

normale de la souche

_puisque,

_pour une

_génération

_donnée,

on

peut considérer _{que tous} les

_{reproducteurs}

_qui

donneront des futurs

_{reproducteurs}

sont des fondateurs. La conservation sous forme

_{d’embryons congelés}

vise d’abord à constituer une réserve de

_{gènes disponibles}

en cas de

_catastrophe

_(problèmes

sanitaires sur la

_population

de

base,

destruction de

_l’élevage

_par

_{incendie...).}

Mais elle constitue aussi un témoin pour estimer le

progrès génétique

réalisé sur une

période

de 5 ou 10 ans.

Race à effectif réduit : le «Brun-marron de Lorraine»

À

côté des

_«grandes

races» directement

_exploitées

_pour une

_production,

on trouve

un

_grand

nombre de races

_possédant

des

_qualités

sans valorisation

_économique

directe,

isolées _par des éleveurs

_passionnés

attachés le

_plus

souvent à des caractères de

_phanères

_(aspect

du

_pelage,

coloration

_{particulière).}

Ces

_populations

d’une centaine d’animaux sont souvent menacées d’extinction. Dans un _pays comme la

France,

il en existe actuellement encore une

_quarantaine

bien caractérisées _par référence à un

standard,

et

_qui

forment des

_populations

de

_petits

effectifs maintenus in situ chez les éleveurs

_(Rochambeau

et

_Vrillon,

_1980).

La

_plupart

d’entre elles ne

sur une

_période

consécutive de 5 ans, l’intérêt par les éleveurs collectionneurs étant

alors manifestement insuffisant.

La race _que nous avons retenue comme

_premier

modèle _pour la conservation de ce

type de

_population

est le Brun-marron de Lorraine. C’est une race

_{légère d’origine}

française,

créée au début du siècle _par C Kauffmann et obtenue _par croisement du Garenne et du Noir et Feu. Ces

_lapins

de

_petite

taille ont un

_poids

_moyen adulte de

1,5

à 2

_kg,

une conformation et une coloration de

_pelage

dérivée du

_lapin

de _garenne. L’intérêt

_principal

de cette race réside dans sa bonne

_adaptation

à des conditions

précaires d’élevage

(température, microbisme).

Mais face au _peu d’intérêt actuel des éleveurs

_français,

elle n’est

_{plus représentée}

que par à

peine

une centaine d’individus. En accord avec la Fédération

_française

de

_{cuniculture, l’objectif}

est de conserver des

_embryons

en

_complément

d’animaux vivants. L’échantillon à conserver est

constitué de 10 familles issues

_{d’élevages}

différents et _comprenant chacune un mâle

et 2 femelles. Le coefficient de

_parenté

entre individus des différentes familles est

considéré comme

_pratiquement

nul. Le schéma de circulation des mâles fondateurs utilisés pour

l’accouplement

a été décrit par Rochambeau et Chevalet

_(1989).

Les

embryons

collectés sur les femelles de deuxième

_génération

constituent donc le stock

représentant

au maximum la variabilité

_génétique

actuelle de la race Brun-marron de Lorraine.

Une

_lignée

d’intérêt

_potentiel

_pour la recherche fondamentale : les

_lapins

_porteurs

_{d’allotypes}

rares

Les

_lignées

utilisées pour la recherche fondamentale et biomédicale sont maintenues le

_plus

souvent en

_petits

effectifs de

_quelques

dizaines d’individus. C’est le cas

par

exemple

de

lignées

de

lapins histocompatibles

qui

présentent

un intérêt pour

les études

_{d’immunopathologie}

et pour l’étude

_fondamentale

du

_{complexe majeur}

d’histocompatibilité

(CMH)

dont la structure est

_{plus proche}

de celle de l’homme

que ne l’est par

exemple

celle de la souris

(Marche

et

al, 1989;

Laverrière et

al,

1989).

C’est aussi le cas _pour la

_lignée

_que nous avons

_{choisie, qui}

est constituée

par des animaux sélectionnés par le Dr A Kelus

(depuis

de nombreuses années

à l’Institut

d’immunologie

de

_Bâle)

sur la variabilité

_allotypique

des

_gènes

codant

pour la

production

des

immunoglobulines.

Les animaux de

chaque allotype

sont

très

_homogènes

entre eux

_(Mage

et

_{al, 1982;}

_Knight

et

_al,

_1985).

En

1990,

une

vingtaine

d’individus

_{représentant}

3

_{allotypes différents,}

alibas

_(souche

_Kelus),

3R4K bas et 2H4G4F ont servi de fondateurs pour 3 familles maintenues à la

station de

_{pathologie expérimentale}

de l’INRA de

_Nouzilly

_(P

_Coudert,

données non

publiées).

Le taux de

_{consanguinité}

de ces familles est maintenant élevé et la

prolificité

des femelles est

faible,

de 0 à 3

_lapereaux

_par

_{portée ;}

le coût d’entretien d’un tel _troupeau est _trop élevé pour une demande

ponctuelle. L’objectif

de notre

travail est donc de conserver ces familles

_uniquement

sous forme

_d’embryons

et de semence

_congelés.

Vingt-deux

femelles ont été

accouplées

avec 11 mâles de même

allotype

_puis

sacrifiées afin de

_congeler

leurs

_embryons.

En

_complément,

la semence de 8 mâles a été

_congelée.

Un total de 264

_embryons

et 137

_paillettes

de semence

représentant

les 3 souches de la

_lignée

est maintenant mis à l’abri. Ces souches sont ainsi

Une

_lignée

issue d’une mutation

_{monogénique :}

le

_lapin

dit «sauteur

d’Alfort»

Contrairement à la situation

_qui

_prévaut

chez la

_souris,

les

_lignées

caractérisées par

l’effet d’un seul

_gène

sont _peu nombreuses. Il _y a _peu de mutations

monogéniques

naturelles isolées

_{(Letard, 1935)}

et le nombre de

_{lignées transgéniques quoiqu’en}

augmentation rapide

est encore faible

_(Massoud

et

_al,

_1991;

_Aigner

et

_al,

_{1993) .}

Nous avons choisi comme

_exemple

une

_lignée

issue d’une mutation

_spontanée,

celle dite du

_«lapin

sauteur d’Alfort». La

_{particularité}

de cette

_population

se

manifeste par un _comportement locomoteur

_{original :}

l’animal se

_déplace

sur les membres antérieurs en soulevant son arrière train à la verticale de sa

_tête;

il fait le

_«poirier».

Ce caractère

_monogénique

récessif _apparu à la suite d’une mutation

spontanée

(Letard, 1935)

est associé chez la

_plupart

des animaux à une cataracte

(pénétrance variable).

La souche

_présente

donc un double intérêt : c’est un modèle

possible

pour la

microchirurgie

oculaire _{et pour} la

_{sémiologie neurologique.}

Actuellement,

cette

_{population comprend plusieurs}

dizaines d’individus conser-vés in situ dans 6

_{élevages agréés}

_permettant la fourniture de

_sujets

pour la recherche

_(Boucher,

_1991).

L’intérêt de la

_cryobanque

est de

_préserver

ex situ ce

_gène

original.

L’échantillon est donc constitué d’un seul

_couple

d’animaux

_homozygotes

pour ce

gène

et leurs descendants sont utilisés comme donneurs

_{d’embryons.}

Seules

quelques

dizaines

_{d’embryons congelés}

_{suffisent pour}

_sauvegarder

cette mutation. PERSPECTIVES

Le programme de

cryopréservation

est actuellement étendu à des

_lignées

transgéni-ques

(Massoud

et

_al,

₁₉₉₁₎

et à des _groupes

_particuliers

de

_{reproducteurs.}

Ces derniers sont constitués _par des clônes

_{d’embryons,}

c’est-à-dire des lots

_d’embryons

de même constitution

_génétique

obtenus _par transfert des _noyaux d’un

_embryon

donneur au stade morula

_(environ

64

_noyaux)

dans autant

_d’ovocytes

receveurs énucléés. Ces

_embryons

_peuvent

_{après transplantation}

dans une femelle _porteuse donner naissance à des

_jeunes

viables et normalement fertiles

_(Heyman

et

_al,

_1990).

Les taux de réussite sont encore faibles

_puisque

seulement 5 à 10% d’entre eux se

développent

à terme. Mais on _peut

_anticiper

une meilleure maîtrise de cette

tech-nologie sophistiquée

dans les

_prochaines

_années,

ce

_qui

justifie déjà

la mise à

l’abri,

dans une

_cryobanque,

de

_petits

lots

_{représentatifs}

de ce _type

d’ embryons.

Les

_embryons

et

_{spermatozoïdes}

d’autres races dont le choix est actuellement à l’étude devraient

_{prochainement}

être à leur tour

_pris

en _compte. Il deviendra alors

possible

d’examiner l’effet du

_génotype

des

_embryons

sur leur taux de survie

_après

décongélation.

En

_effet,

les

_embryons

de

_lapin

manifestent _apparemment, selon leur

_{origine génétique,}

des

différences

de sensibilité aux _processus de

congélation-décongélation

(Vicente

et Garcia

_Ximenez,

_1993).

Ces différences sont aussi mises en évidence chez la souris

_(Pomp

et

Eisen,

1990).

Chez cette

_espèce

toutefois,

les

taux de survie

_{après décongélation}

ne varient entre eux _que de 35% ce

_qui

amène à ne

_prendre

en _compte ces données que pour

ajuster

la taille de l’échantillon.

Les résultats

_acquis

chez le

_lapin

pourront alors être utilisés pour définir les bases

de l’économie d’un

_plan

rationnel de conservation du

_patrimoine

_génétique

d’une

populations végétales

(Joly

et

_Trommeter,

_{1991). À}

_terme, l’introduction dans la

_banque

de

_lignées

de cellules

_totipotentes

_congelées

devra être considérée. Ces cellules dites ES

_(embryonic

stem

_cells)

ou EG

_(embryonic

_germinal

_cells)

sont de

plus

en

_plus

utilisées chez la souris car elles

_présentent

l’intérêt de

_pouvoir

_participer

à la formation de la

_{lignée germinale}

au sein de chimères

d’agrégation,

et donc de voir leurs caractères transmis aux

descendants,

notamment

_après

introduction ou

remplacement

ciblé d’une

_{séquence génique}

donnée _par recombinaison

_homologue.

Les résultats chez le

_lapin

sont toutefois encore très limités

_(Moens

et

al,

1992).

L’intérêt d’une

_banque

se mesure aux

échanges qu’elle

_permet entre différents

partenaires.

Des modalités de fonctionnement

_impliquant

des relations

contrac-tuelles entre laboratoires de recherche et éleveurs et _prenant en _compte les

conséquences

des décisions concernant la brevetabilité éventuelle des

_lignées

ani-males

_(Milligan

et

_{Lesser, 1989;}

Hermitte et

_Joly,

₁₉₉₁₎

sont actuellement

expéri-mentées à l’échelon national.

_{L’élargissement}

à d’autres pays va constituer une deuxième

_étape

_qui

sera

_engagée

à travers une action concertée de la commission des Communautés

_européennes

_{soutenue par} la direction

_générale

_pour la _science, la

_recherche,

et le

_{développement}

_(DG

XII,

programme PL

920184).

Une

façon

de

montrer _que les

_responsables

des ressources

_génétiques

des _pays

_d’Europe

doivent

rapidement

et concrètement se rassembler. Mais aussi un début de

_réponse

à l’am-bitieux programme de

banques d’embryons

de souris et de

_lapin

mis actuellement en

place

aux

États-Unis

(Gershon, 1993)

_par l’Institut national de la santé

(NIH),

banques

qui pourraient

constituer un

_premier

_{pas pour} d’autres

_espèces

animales. REMERCIEMENTS

Nous tenons à remercier G Arnold et les responsables de la Fédération _française de cuni-culture pour l’intérêt qu’ils portent à cette recherche. Nous remercions aussi B _Poujardieu

pour ses conseils lors de la _préparation de ce document. Cette _recherche, initiée en _1991, a été financée par l’INRA dans le cadre de son action _Agrotech

(programme

Prodige)

et _par la Fondation pour la recherche médicale

(FRM)

qui nous _permet aujourd’hui de

poursuivre notre travail.

RÉFÉRENCES

Aigner

B,

Brem G

₍₁₉₉₃₎

_Tyrosinase

as a marker _gene and model for

_screening

transgenes in mice and rabbits.

_{Theriogenology}

_39,

177

Bolet

_G,

de Rochambeau

_H,

Coudert P

₍₁₉₉₁₎

_{Caractéristiques génétiques}

des souches de

_lapins

de l’INRA. In : lleg Journées d’études IFFA CREDO.

Marcy-l’Étoile,

France,

3-4

_octobre,

Fondation

_Mérieux,

_Lyon,

_91,

35-52 Boucher S

₍₁₉₉₁₎

Le

_lapin

sauteur d’Alfort. Rev-Avicole _3, 91-95

Brem

_G,

Graf

F,

Krausslich H

₍₁₉₈₂₎

_{Moglichkeiten}

der

_anlage

von _genreserver. Genetische

_probleme

und kostete.

_Bayer

Landr Jb

_59,

380-383

Courot M

₍₁₉₇₇₎

L’insémination artificielle chez les

_lapins.

Cuniculture

_4,

135-136 FAO

₍₁₉₈₇₎

Definitions

_pertaining

to animal

_genetic

resources. In : anim Genet resources

(Hodges

_J,

ed)

FAO Animal Production and Health _paper

_n°66,

_appendix

Garnier

_V,

Renard

_JP,

Menezo Y

₍₁₉₈₈₎

_Viability

and

_{freezing ability}

of rabbit

embryos

collected in the

vagina

after

_{prostaglandin}

treatment.

_Jpn

J

_Physiol

38,

585-589

Gershon D

₍₁₉₉₃₎

NIH to support

embryo

bank for mice and rabbits. Nature

_362,

684

Glenister

_{PH, Whittingham DG, Lyon}

MF

₍₁₉₈₄₎

Further studies on the effect of radiation

_during

the _storage of frozen 8-cell mouse

_embryos

at -196°C. J

_Reprod

Fert

_70,

229-234

Heyman Y,

Chesné

_P,

Renard JP

₍₁₉₉₀₎

_{Reprogrammation complète}

de noyaux

embryonnaires

congelés,

après

transfert nucléaire chez le

_lapin.

CR Acad Sci

_311,

Série

111,

321-326

Hermitte

_{MA, Joly}

PB

₍₁₉₉₁₎

_{Biotechnologie}

et brevets : un essai

_d’analyse

économique.

In:

_Innovation,

_{changement technique}

et

_{agroalimerctaire.}

INRA Actes Communication

_8,

67-82

Joly

PB,

Trommeter M

₍₁₉₉₁₎

World

_{regulation of genetic}

resources: is the model of common

_heritage

sustainable? In: Int

_Symp

_IFFAS,

_{Nairobi, juin}

1991

Kennelly

JJ,

Foote RH

₍₁₉₆₅₎

_{Superovulatory}

response of pre- and

post-pubertal

rabbits to

_commercialy

available

gonadotrophins.

J

_Reprod

Fert

_9,

177-188

Knight KL,

Burnett

_RC,

Nicholas

JM

₍₁₉₈₅₎

_Organization

and

_polymorphism

of rabbit

_{immunoglobulin heavy}

chain _{genes. J}

_{Immunol 134,}

1245-1250

Laverrière

_{A, Kulaga}

_H,

Kindt

_{TJ, Lequerse C,}

Marche PN

₍₁₉₈₉₎

A rabbit class II gene with _strong similarities to HLA-DRA.

_{Immunogenetics}

_30,

137-140

Letard E

₍₁₉₃₅₎

Une mutation nouvelle chez le

lapin.

Bull Acad Vét Fr

_8,

608-610 Lukefahr SD

₍₁₉₈₅₎

A note on an estimate of the World’s domestic rabbit

popula-tion. J

_Appl

Rabbit Res _8, 157

Lukefahr SD

₍₁₉₉₀₎

Conservation of

_global

rabbit

_germplasm

resources. J

_Appl

Rabbit Res _12, 283-290

Mage

RG,

Dray

S,

Gilman-Sach A et al

₍₁₉₈₂₎

Rabbit

_heavy

chair

haplotypes-allotypic

determinants

_{expressed by}

V

h

-C

h

recombinants.

_{Immunogenetics}

_15,

287-297

Maijala

K

₍₁₉₈₄₎

Conservation of animal

_genetic

resources in

_Europe.

Livest Prod Sci

_11,

3

Marche

_PN,

Rebirre

_{MC, Leguerse}

_C,

Kindt TJ

₍₁₉₈₉₎

Structure and

_expression

of rabbit MCH genes. Ann Rech Vét

20,

361-365

Massoud

_M,

Bischoff

_R,

Dalemans W et al

_!1991)

_Expression

of active recombinant human

_a

_i

_{-antitrypsine}

in

_transgenic

rabbits. J Biotech

_18,

193-204

Matheron

_G,

Chevalet B

₍₁₉₇₇₎

Conduite d’une

_population

témoin de

_{lapin :}

évolu-tion à court terme du coefficient de

_{consanguinité}

selon le schéma

_{d’accouplement.}

Ann Génét Sél Anim _9, 1-13

Matheron

_{G, Poujardieu}

B

₍₁₉₈₄₎

La

_génétique

du

_{lapin :}

le

_point,

les

_{perspectives.}

7n : Proc III World Rabbit

_Congress.

_Rome,

4-8 avril

_1984,

_WRSA,

_{1, 3-32}

Mazur P

₍₁₉₉₀₎

_{Equilibrium, quasi-equilibrium,}

and

_{nonequilibrium}

_freezing

of mammalian

_embryos.

Cell

_Biophys

_17,

53-92

Milligan

R,

Lesser W

₍₁₉₈₉₎

Animal _patents

_implication

for

_agriculture.

In : Animal

patents

(Lesser

W,

ed).

Stockton

_Press,

New-York _,100-113

Pomp

D,

Eisen EJ

₍₁₉₉₀₎

Genetic control of survival of frozen mouse

_embryos.

Biol

Reprod

42, 775-786

Renard

JP,

Rochambeau H

de,

Lauvergne

JJ

₍₁₉₈₃₎

Utilisation of _gametes and

embryos banking

for the

_preservation

and

_{study of genetic}

resources in farm animals. In : Proc World

_Conf

Anim

_Prod,

_Tokyo,

_1,

66-72

Renard

_JP,

Bui

_Xuan-Nguyen,

Garnier V

₍₁₉₈₄₎

Two _strop

_freezing

of two cell rabbit

_embryos

after

_{partial dehydration}

at room temperature. J

_Re

_P

_rod

Fert _71, 573-580

Rochambeau H

_de,

Vrillon JL

₍₁₉₈₀₎

Faut-il sauver nos races de

_lapins?

Cuniculture

7,

103-105

Rochambeau H

_de,

Chevalet C

₍₁₉₈₉₎

_{Aspects théoriques}

de la

_gestion

des res-sources

génétiques :

cas des

populations

en conservation. In : La

_gestion

des res-sources

_génétiques

des

_espèces

animales

_domestiques

_{(BRG, éd).}

Tec-Doc

_Lavoisier,

Paris,

171-180

Smith CH

₍₁₉₈₄₎

Genetic _aspects of conservation in farm

_livestock.

Livest Prod Sci

11, 37-48

Theau-Clément

_M,

Vrillon JL

₍₁₉₈₉₎

Le

_point

sur l’insémination artificielle. Cuni-culture

_16,

141-149

Theau-Clément

M,

Roustan A

₍₁₉₉₁₎

L’insémination chez la

_lapine.

_Elevage

et

Insémination

_245,

3-12

Vicente

_JS,

Garcia-Ximénez F

₍₁₉₉₃₎

Effects of strain and

_embryo

transfer model

(embryos

from one versus two donor

_{does/recipient)}

on results of

_{cryopreservation}

in rabbit.

_Reprod

Nutr Dev 33, 5-13

Wittingham

DG,

Adams CE

₍₁₉₇₆₎

Low _temperature

_preservation

of rabbit

em-bryos.

J

_Reprod

Fert

_47,

269-274

Wood

MJ ,

Whittingham

DG,

Rall WF

₍₁₉₈₇₎

The low _temperature

_preservation

of mouse _oocytes and

_embryos.

In : Mammalian

_development

a

_practical

approach

(Monk

M,

ed).

IRL

_Press,

255-280

Woodford MH

₍₁₉₉₀₎

_Cryogenic

_preservation

of wild animal

_germplasm.

In : Animal

genetic

resources : a

_global

_Program

_for

sustainable

_development

_{(Wiener, ed).}

FAO Animal Production and Health _paper,

_Rome,

vol

_80,

69-82

Yamada

_Y,

Kimura K

₍₁₉₈₄₎

Survival

_probability

in small livestock

_populations.

In : Animal

_genetic

resources conservation

_by

_management,

data banks and

_training