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Influence de l’inhibition des signaux de survie et
radiosensibilisation des cancers pulmonaires
Yohann Loriot
To cite this version:
UNIVERSITÉ PARIS-SUD
ÉCOLE DOCTORALE 418 :DE CANCÉROLOGIE
Laboratoire : INSERM 10-30, Gustave Roussy, Cancer Campus, Grand Paris
THÈSE DE DOCTORAT
SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTÉ
par
Yohann LORIOT
INFLUENCE de l’INHIBITION
des SIGNAUX de SURVIE & RADIOSENSIBILISATION
DES CANCERS PULMONAIRES
Date de soutenance : 02/12/2014
Composition du jury :
Directeur de thèse : Eric DEUTSCH PU-PH (Gustave Roussy, Cancer Campus)
SOMMAIRE
RESUME ... 5
INTRODUCTION ...
8
Le cancer du poumon ... 9
Cancer à petites cellules du poumon ... 10
Cancer non à petites cellules ... 20
Mécanismes de mort cellulaire induits par l’irradiation ... 25
Stratégies théoriques de radiosensibilisation ... 39
Rationnel pour l’utilisation de thérapies ciblées en association avec la radiothérapie ... 48
OBJECTIFS ... 52
RESULTATS DISCUSSION ... 60
1ère partie : modulation de l’apoptose ... 61
Article 1 ... 63
Article 2 ... 76
Discussion – conclusion 1ère partie ... 110
2nde partie : modulation des voies de signalisation cellulaire .... 115
Article 3 ... 117
Article4 ... 127
Discussion – conclusion 2nde partie ... 145
CONCLUSION GENERALE – PERSPECTIVE ... 149
REFERENCES ... 155
REMERCIEMENTS
Mes premiers remerciements sont adressés à Monsieur le Professeur Eric Deutsch, qui m’a accueilli au sein de l’unité INSERM 1030 depuis mon master 2 et qui m’a ensuite proposé de poursuivre avec ce sujet de thèse. Son dynamisme et sa curiosité m’ont toujours portés. Je garde également en mémoire nos discussions exaltées. Soyez assuré de mon amitié sincère.
J’exprime également aussi ma reconnaissance et mon amitié à Monsieur le Professeur
Jean-Charles Soria, de l’unité INSERM U981 et du département de médecine, pour
m'avoir guidé si efficacement depuis mon internat.
Je remercie également Monsieur le Professeur Jean Bourhis, directeur de l’unité INSERM 1030 qui m’a accueilli au sein de son laboratoire.
Mes remerciements vont au Pr hennequin et au Pr Culine pour avoir accepté d’être rapporteurs de cette thèse, et le Pr Wislez pour avoir accepté d’être Présidente de mon Jury.
Je tiens à remercier profondément Delphine sans qui rien n’aurait été possible et qui a toujours su être patiente même dans les moments particulièrement difficiles. J’exprime également ma gratitude à l’ensemble de l’unité INSERM 1030, Céline, Marie-Catherine,
Nicolas, Frédéric, Nathalie, Laurence, Saad ainsi qu’à Andréa, Charles et Pierre.
Sans oublier Olivia, Virginie et Françoise.
Aux soutiens quotidiens du côté hospitaler, Laurence, Christophe, Benjamin, j’adresse mes remerciements les plus chaleureux.
Je remercie tendrement Carole et Camille pour leur patience et à l’ensemble des membres de ma famille pour leurs soutiens indéfectibles.
Enfin, à Jude Stefan, l’anti-pédagogue, pour tout ce qu’il m’a apporté.
RESUME
Les thérapies ciblées sont des agents dont le but est d’inhiber une voie oncogénique spécifiquement activée dans une tumeur. Ces thérapies peuvent donc cibler l’angiogenèse tumorale, les voies de signalisation cellulaire, la prolifération infinie, l’anti-apoptose ou le pouvoir métastatique. Outre leur effet en monothérapie, leur intérêt repose également sur leur combinaison avec les traitements standards, chimiothérapie, radiothérapie ou même chirurgie. Dans ce contexte, l’association des thérapies ciblées et de la radiothérapie paraît séduisante. En effet, les mécanismes qui sous-tendent la sensibilité ou la résistance à une irradiation sont maintenant mieux connus et permettent d’envisager des manipulations thérapeutiques afin d’améliorer encore les résultats d’une radiothérapie ou d’une radiochimiothérapie. L’objectif de cette thèse était d’exploiter les données d’histologie moléculaires des carcinomes pulmonaires pour évaluer de nouvelles approches de radiosensibilisation basée sur l’inhibition de signaux de survie en ciblant les protéines Bcl-2 et Bcl-XL et la voie IGF-1 dans les carcinomes à petites cellules (CPC) et en ciblant la voie EGFR dans les carcinomes non à petites cellules du poumon (CPNPC). L’un des objectifs était également d’intégrer une méthodologie de combinaison plus précise compte-tenu des discordances très fréquemment observées entre les effets pré-cliniques d’une association et les résultats des études cliniques de la même combinaison.
Dans une première partie, nous avons cherché à inhiber les mécanismes antitapoptotiques mis en jeu dans les CPC au moyen de deux nouvelles classes de thérapies ciblées : un oligonucléotide antisens ciblant l’ARNm du gène BCL2 (oblimersen) et un « BH3 mimetic » inhibiteur des protéines Bcl-2/Bcl-XL (S44563). Si
l’oblimersen a montré les limites pharmacologiques actuelles des oligonucléotides antisens, nous avons démontré dans ces deux études l’intérêt du ciblage de « l’anti-apoptose » pour radiosensibliser les lignées de CPC. En utilisant le S44563, un « BH3 mimetic » qui induit une apoptose via la voie mitochondriale (activation de Bax, dépolarisation du potentiel transmembranaire mitochondrial, libération du cytochrome c, activation de la caspase 9) dans les lignées qui surexpriment les cibles à savoir Bcl-2 et Bcl-XL,, nous avons montré que l’inhibition de Bcl-2 et Bcl-XL permettait d’induire
une radiosensibilisation in vitro et in vivo par induction de l’apoptose. Le mécanisme d’interaction reposait probablement par une induction de l’expression des protéines anti-apoptotiques, en particulier Bcl- XL à la suite d’une irradiation via l’activation de la
voie NF-κB. L’irradiation induit l’activation de la voie NF-κB conduisant à l’expression des protéines anti-apoptotiques, en particulier Bcl-XL rendant ainsi les cellules
tumorales plus sensibles à l’action de l’inhibiteur spécifique. Ceci est confirmé par les études de séquence montrant que l’administration pendant et après l’administration de la radiothérapie est plus efficace réalisant ainsi une chimiosensibilisation (sensibilisation au S44563) sous l’effet d’une irradiation rendant les cellules tumorales plus dépendantes (concept d’addiction oncogénique contextuelle) aux mécanismes de résistance à l’apoptose
Dans une seconde partie, nous avons également montré que l’inhibition d’une voie de signalisation cellulaire (la voie IGF-1) permettait également d’obtenir une radiosensibilisation tumorale validant ainsi l’intérêt de ces combinaisons. En particulier, l’anticorps monoclonal ciblant IGF-1R, le R1507 augmente l’efficacité du cisplatine et au final améliore l’efficacité de la radio-chimiothérapie dans plusieurs lignées de CPC via la diminution de l’expression de IGF-1R avec pour conséquence une diminution de l’activation de ses effecteurs, en particulier AKT, indiquant que le R1507 augmente la radiosensibilité en supprimant l’activation de IGF-1R secondaire à l’irradiation. Cependant, nous avons montré par différentes approches d’étude du transcriptome que les cellules tumorales traitées par le R1507 pendant 4 semaines s’adaptaient en ré-exprimant IGF-1R, en activant p-IRS1 et en activant différentes voies oncogéniques telles que l’angiogenèse ou d’autres voies de signalisation cellulaires (STAT, AKT). Ces résultats suggèrent donc les limites d’un schéma adapté chez l’homme lors d’une radio-chimiothérapie concomitante et plaident pour une association précoce à d’autres thérapies ciblées.
INTRODUCTION
Le cancer du poumon
Plusieurs types de cancer du poumon
Le cancer du poumon représente la première cause de mortalité dans les pays industrialisés, le tabac étant fortement impliqué dans le développement de ce cancer
(Hill, 2008). Il représente la première cause de décès par cancer chez l’homme et la
seconde chez la femme. Les carcinomes du poumon sont classés en deux grandes catégories clinico-histologiques : les carcinomes non à petites cellules du poumon (CBNPC) et les carcinomes à petites cellules (CPC) du poumon. Au sein des CBNPC, on distingue également les adénocarcinomes, les plus fréquents et de développement périphérique, les carcinomes épidermoïdes, de développement plus central et proximal et les carcinomes à grandes cellules. Cette classification repose uniquement sur des critères anatomopathologiques morphologiques. Or, le développement des techniques de biologie moléculaire permettent de distinguer entre ces formes histologiques des anomalies moléculaires expliquant leur évolution clinique différente. Au sein même des adénocarcinomes, on identifie ainsi des adénocarcinomes avec mutation du gène EGFR (10-20%), plus fréquents chez les femmes jeunes et non fumeuses, les adénocarcinomes avec translocation EML4-ALK (3%), plus fréquents chez les hommes non fumeurs, les adénocarcinomes avec mutation de KRAS (20%) ou BRAF (3%) (Kan, 2010). D’autres mutations de HER2, PI3K ou MAPK1 ont également été mises en évidence dans le CBNPC. Ces élements montrent donc l’existence de nombreuses voies oncogenèniques potentielles dans le cancer du poumon.
Le cancer à petites cellules du poumon
Généralités cliniques
1. Epidémiologie
Les CPC représentent 15 à 20% de l’ensemble des cancers du poumon et ils se caractérisent par une évolution différente des CNPC du poumon (Govidan, 2006). En effet, ces tumeurs évoluent rapidement, métastasent tôt dans l’évolution naturelle et se montrent très chimio et radiosensibles initialement. Cependant, la grande majorité des patients rechute en quelques semaines et les taux de survie à 5 ans des patients avec un cancer localisé et métastatique restent très sombres : 20% et < 5%, respectivement
(Govidan, 2006).
2. Traitement du CPC du poumon localisé
La prise en charge des CPC du poumon localisés associe une radiothérapie et une chimiothérapie. Le schéma d’administration de la chimiothérapie peut être concomitant ou séquentiel. Les médicaments utilisés font appel essentiellement au cisplatine et à l’étoposide (Sorensen, 2008).
La radiothérapie médiastinale augmente la probabilité de contrôle local ainsi que la survie globale des patients atteints de CPC du poumon localisé. Le taux de contrôle local varie de 40% à 55% selon les séries (Skarlos, 2001). Une méta-analyse de 13 essais randomisés sur données individuelles issues de 2140 patients a conclu à une augmentation de la survie à 3 ans de 8,9% à 14,3% avec l’utilisation d’une radiothérapie thoracique (Mauguen, 2012).
Le moment de l’administration de la radiothérapie a été étudié dans de nombreux essais cliniques. En général, un intervalle de 30 jours ou de 9 semaines après l’initiation de la chimiothérapie a été pris comme intervalle définissant une radiothérapie précoce d’une radiothérapie tardive. Une large méta-analyse a démontré l’intérêt d’une administration précoce d’une radiothérapie (Pijls-Johannesma, 2007)
La dose optimale n’est pas encore établie. Plusieurs études rétrospectives ont suggéré que des doses croissantes améliorent la probabilité de contrôle local. Les essais cliniques actuels évaluent donc des doses de 60-70 Grays (Gy) administrées en
6 à 7 semaines au-delà des 50 Gy habituellement délivrées en pratique quotidienne
(Sorensen, 2008).
Le fractionnement est sujet à débat. Les études actuelles ne permettent pas de déterminer si un fractionnement bi-quotidien est supérieur à un fractionnement quotidien avec des doses biologiques équivalentes (Mauguen, 2012). Les études de phase 3 en cours évaluent un fractionnement de 45 Gy en deux fractions quotidiennes sur 3 semaines à un fractionnement quotidien de 66 Gy en 33 fractions sur 6,6 semaines.
La chirurgie n’est pas un traitement standard du CPC du poumon localisé mais dans certains cas, une tumeur très localisée (T1-2, N0) pourrait faire l’objet d’une résection chirurgicale suivie de chimiothérapie adjuvante et d’une irradiation cérébrale prophylactique (Sorensen, 2010). Aucun essai randomisé n’a évalué cette stratégie.
En cas de réponse à l’issue de la radio-chimiothérapie, les patients doivent être traités par une irradiation cérébrale prophylactique. Une méta-analyse basée sur les données individuelles de 987 patients essentiellement en situation localisée et en réponse complète a montré l’intérêt d’une irradiation prophylactique cérébrale avec une survie à 3 ans passant de 15,3% à 20,7% (Auperin, 1999). La réduction du risque de métastases cérébrales était de 54%. La radiothérapie thoracique joue donc un rôle pivot pour les stades localisés, ce qui justifie donc les approches thérapeutiques cherchant à augmenter la réponse à la radiothérapie.
3. Traitement du CPC du poumon métastatique
La prise en charge des CPC du poumon métastatique fait appel à une chimiothérapie, qui n’a pas évolué depuis 20 ans, reposant sur une association d’un sel de platine et de l’étoposide. Le pronostic reste donc très sombre avec une médiane de survie de 10 mois et un taux de survie à 2 ans de 10% (Sorensen, 2010). Le traitement standard repose sur l’association cisplatine et étoposide mais la substitution du cisplatine par le carboplatine est une option acceptable dans une perspective de non curabilité. La substitution de l’étoposide par des inhibiteurs de la topo-isomérases 1 (irinotécan et topotécan) a été testée au cours d’essais randomisés avec des résultats contradictoires (Schmittel, 2007 ; Hanna, 2006)
La durée optimale de la chimiothérapie a également été étudiée au cours d’essais cliniques évaluant l’intérêt d’une chimiothérapie de maintenance au-delà des six cycles
d’induction. Aucune des études de maintenance n’a montré une augmentation de la survie globale avec une telle stratégie. La durée recommandée est donc de 4 à 6 cycles de chimiothérapie aussi bien dans les formes métastatiques que dans les formes localisées (Sorensen, 2010)
En cas de progression après une chimiothérapie de première ligne par cisplatine et étoposide, une chimiothérapie de seconde ligne peut être proposée. Seuls les patients en bon état général avec un intervalle entre la fin de la chimiothérapie et la progression suffisamment long (classiquement > 3 mois) peuvent faire l’objet d’une chimiothérapie de seconde ligne. Aucun traitement standard n’est recommandé dans cette situation : une des options consiste en l’administration d’une chimiothérapie par topotecan (un inhibiteur de la topo-isomérase 1) ou la reprise d’une chimiothérapie à base de sels de platine si l’intervalle de progression est long (> 6 mois).
Le carcinome à petites cellules manque donc d’options thérapeutiques au stade métastatique. Actuellement, aucune thérapie ciblée en particulier n’est validée pour le traitement du CPC contrairement au CPNPC.
4. Le CPC du poumon : des besoins en termes d’innovation
Ces données épidémiologiques et de survie montrent donc la nécessité d’optimiser les traitements chez les patients atteints de cancer à petites cellules du poumon aussi bien dans les formes localisées traitées par l’association radio-chimiothérapie (afin d’augmenter le taux de réponse) que les formes métastatiques traitées par une chimiothérapie à base de sels de platine.
Les différentes voies d’innovation explorent donc des innovations dans le domaine de la stratégie médicale (irradiation cérébrale prophylactique, augmentation des doses de radiothérapie) et dans le domaine de la biologie du CPC du poumon nécessitant d’intégrer l’histologie moléculaire de ces tumeurs.
Généralités sur la biologie du cancer à petites cellules du poumon
Caractéristiques histologiquesLes CPC du poumon appartiennent au groupe des tumeurs neuroendocrines malignes. Macroscopiquement, elles sont le plus souvent d’aspect blanchâtre, de consistance molle et friable. Elles se présentent au microscope conventionnel comme des proliférations comportant de larges plages de nécrose, et dont les cellules s’agencent
en massifs, travées et plages diffuses (Figure 1). Les cellules tumorales sont de petite taille avec un cytoplasme peu abondant et des limites cytoplasmiques le plus souvent difficilement identifiables. Les noyaux peuvent être ronds ou ovoïdes, la chromatine est fine et granulaire. L’index mitotique est le plus souvent élevé. Les critères OMS 2004 pour établir le diagnostic d’un CPC sont avant tout morphologiques (Travis, 2004) :
tumeurs faites de cellules de petite taille au cytoplasme peu abondant noyaux anguleux à chromatine finement dispersée, poivre et sel nucléole absent ou fin et basophile
activité mitotique élevée à 11 mitoses par 2 mm² avec une moyenne de 80 mitoses par 2 mm²
On observe de vastes territoires de nécrose et de nombreux noyaux pycnotiques. Les marqueurs immunohistochimiques ne sont pas forcément positifs. Les plus utilisés sont la chromogranine A, la synaptophysine et le CD56. Le thyroid transcription factor 1 (TTF1) marque quasiment tous les CPC (Kaufman, 2000). Il faut cependant noter que la positivité des marqueurs neuroendocrines est également retrouvée dans les tumeurs carcinoïdes et dans 20 à 30 % des cancers pulmonaires non à petites cellules.
Figure 1. Cancer du poumon à petites cellules. Les cellules tumorales sont de petite taille, ont un
cytoplasme peu abondant et un noyau arrondi ou ovoïde. Elles s’agencent içi en plages diffuses. Coloration à l’hématéine-éosine-safran, grossissement×400.
Données récentes issues des technologies d’analyse du génome à haut-débit
L’émergence de nouvelles techniques de biologie moléculaire à haut débit permettant d’analyser l’exome, le transcriptome voire le génome complet de tumeurs a permis de mieux comprendre la biologie de nombreux cancers dont les CPC du poumon. Récemment, une étude a étudié l’exome de 29 cancers du poumon à petites cellules, le transcriptome pour 15 d’entre elles et le génome complet pour 2 d’entre elles (Peifer, 2012). L’analyse intégrée de l’ensemble des données montre que le taux de mutations est élevé dans le cancer à petites du poumon (7 mutations/mégabase). Les anomalies les plus fréquentes sont essentiellement les mutations de P53 et de RB. De nouvelles mutations de gènes codant des protéines implqiuées dans la régulation épigénétique ont été identifiées tels que les gènes CREBBP, EP300 et MLL. D’autres anomalies moléculaires telles que les mutations de PTEN, SLIT2, EPHA7 ou encore des amplifications de FGFR1 et de MYC ont été observées (Peifer, 2012). Dans une autre étude adapotant la même stratégie de séquencage, des mutations affectant des gènes codant des kinases (PI3KCA, CDKN2A), des protéines du cycle cellulaire (RB et P53), d’autres mutations concernant des gènes codant des protéines impliquées dans la régulation épigénétique ont été également observés (MLL2, EP300, DMBX1). Les voies cellulaires les plus affectées par des anomalies moléculaires étaient essentiellement la voie PI3K, la voie NOTCH/Hedgehog, la voie de la réparation de l’ADN et la voie SOX (Rudin et al, 2012)
1. Altérations de l’apoptose observées dans le CPC
L’une des anomalies les plus fréquemment constatées dans les CPC du poumon consiste en une amplification et une surexpression des oncogènes de la famille MYC,
C-MYC, N-MYC et L-MYC survenant dans 15 à 30 % (Wistuba, 2001). Ces facteurs de
transcription contrôlent des gènes impliqués dans le cycle cellulaire mais aussi dans l’apoptose. Des études récentes d’hybridation génomique comparative sur puces ont montré une amplification fréquente d’oncogènes antiapoptotique impliquant TNFRSF4 (1p36), DAD1 (14q11), BCL2L1 (20q11) et BCL2L2 (14q11) et des délétions de gènes pro-apoptotique tels que MAPK10 (4q21) et TNFRSF6 (10q23) suggérant un rôle de l’altération de la balance apoptotique dans la pathogénie du CPC du poumon.
2. Modifications de la voie intrinsèque observées dans le CPC
Les protéines anti-apoptotiques
La surexpression de la protéine BCL2 est un évènement fréquent dans les CPC du poumon (jusqu’à 90 % des CPC) (Takayama, 1996 ; Lee, 2008). La surexpression de BCL2 est impliquée dans l’oncogenèse, la progression tumorale et à la résistance des CPC aux traitements antitumoraux (cisplatine, doxorubicine, étoposide et radiations ionisantes) (Sartorius, 2002). L’inhibition de l’ARNm de BCL2 par des oligonucléotides antisens ou des ARN interférents réduit la viabilité des cellules de CPC et permet de restaurer l’effet antitumoral de la chimiothérapie (Zangmeister,
1998). L’effet pro-apoptotique de ces molécules antisens est dépendant du taux
d’expression de la cible : plus l’expression de Bcl-2 est élevée, plus l’effet antitumoral est important. Les autres protéines anti-apoptotiques telles que Bcl-XL et Mcl-1 jouent
également un rôle essentiel dans la résistance de l’apoptose (Lin, 2007). Les protéines de stress
Les inhibiteurs de HSP90 montrent un effet antiprolifératif sélectif envers les cellules tumorales probablement parce que ces dernières ont une dépendance plus marquée à la fois aux protéines HSP90 souvent surexprimées dans les cellules tumorales et aussi à leurs protéines clientes oncogéniques. Les inhibiteurs d’HSP90 induisent l’expression d’HSP70, une autre protéine chaperonne qui possède des propriétés anti-apoptotiques à plusieurs niveaux cellulaires (inhibition de la translocation de BAX, inhibition de l’apoptosome, inhibition du clivage des protéines nucléaires par la caspase-3) (Figure 2). L’inhibition de HSP70 par des oligonucléotides antisens conduit à l’apoptose des cellules tumorales (Guo, 2005). Une étude récente a mis en exergue le rôle crucial d’HSP90 dans le maintien de l’anti-apoptose dans les CPC du poumon (Rodina, 2007). La protéine HSP90 régule négativement l’apoptosome. Lors de l’inhibition d’HSP90, la protéine APAF1 est libérée par sa protéine chaperonne mais non dégradée, ce qui lui permet d’activer la caspase 9. Ce complexe est lui-même activé par le relargage du cytochrome c favorisé par la dégradation de la protéine AKT, protéine cliente d’HSP 90. L’utilisation in vitro d’inhibiteurs d’HSP90 a permis d’obtenir un taux élevé d’apoptose dans des lignées cellulaires de CPC.
Figure 2. La protéine de stress HSP70 possède de nombreuses propriétés anti-apoptotiques à plusieurs
niveaux cellulaires (inhibition de la translocation de BAX, inhibition de l’apoptosome, inhibition du clivage des protéines nucléaires par la caspase-3). La protéine HSP90 régule négativement l’apoptosome. Lors de l’inhibition d’HSP90, la protéine APAF1 est relarguée par sa protéine chaperonne mais non dégradée, ce qui lui permet d’activer la caspase 9
La voie PI3K/mTOR
L’activation de la voie PI3K/AKT/mTOR est un événement fréquent dans les CPC du poumon. L’une des premières observations faisant mention du rôle de cette voie dans la carcinogenèse a été décrite dans les CPC du poumon (Moore, 1998) (Figure 3). La détection immunohistochimique d’AKT phosphorylée est retrouvée dans 70 % des CPC (Blackhall, 2003). L’activation de la voie PI3K-AKT est secondaire à des mutations des gènes codant les différentes kinases de cette voie (mutation activatrice de PI3K ou mutation de PTEN , kinase régulant négativement l’activation de PI3K dans 15 % des CPC (Yokomizo, 1998). Elle peut être également secondaire à l’activation des récepteurs membranaires tels que le récepteur d’insulin growth-factor (IGF). L’activation de cette voie induit une prolifération cellulaire et rend les cellules tumorales résistantes à l’apoptose leur permettant de former des métastases
(Razini, 2000).
Les CPC du poumon sont également capables de former une matrice extracellulaire environnante capable de bloquer l’apoptose via l’activation de l’intégrine β1
(Sethi, 1999). Un blocage de PI3K par un inhibiteur spécifique permet de restaurer
l’apoptose et de contourner cette chimiorésistance lorsque des cellules de CPC du
poumon sont cultivées sur un support à base de laminine reproduisant artificiellement une matrice extracellulaire (Tsurutani, 2005). De plus, des cellules de CPC du poumon adhérentes in vitro activent la voie PI3K/AKT et montrent une chimio- et une radio-résistance via l’inhibition de l’apoptose(Kraus, 2002).
La présence de boucles autocrines impliquant des facteurs de croissance tels que la voie de l’IGF est une autre anomalie fréquemment retrouvée dans le CPC du poumon. Le récepteur membranaire (IGFR) peut se lier à deux ligands, 1 et l’IGF-2. L’IGF-1 et son récepteur sont surexprimés dans les lignées de CPC du poumon suggérant un rôle autocrine d’IGF-1 dans la progression de ces tumeurs(Quinn, 1996).
Une fois la liaison des ligands avec leur récepteur effectuée, cette voie contribue au maintien du phénotype malin via le déclenchement de la voie anti-apoptotique PI3K/AKT/mTOR. L’inhibition in vitro du récepteur d’IGF1 par des inhibiteurs de tyrosine kinase ou un anticorps monoclonal bloque l’activation de la voie PI3K/AKT/mTOR contribuant in fine à l’apoptose des cellules tumorales (Krystal, 2005). De plus, cette inhibition d’IGFR-1 semble restaurer également l’apoptose induite par les agents cytotoxiques conventionnels (Warshamana, 2005). Un autre facteur de croissance, le fibroblast growth-factor (FGF), est également impliqué dans l’activation de cette voie anti-apoptotique. Ce facteur de croissance peut se lier à quatre isoformes du récepteur au FGF (FGFR1–4). Une fois phosphorylé, celui-ci déclenche l’activation de la voie RAS/RAF et la voie PI3K/AKT. Le taux circulant de FGF-2 au moment du diagnostic est élevé chez les patients atteints de CPC du poumon et constitue un facteur de mauvais pronostic (Ruotsalainen, 2002) FGF-2 est également un facteur de prolifération pour les cellules de CPC et contribue à leur résistance à l’apoptose induite par l’étoposide par l’intermédiaire de l’expression de BCL-XL et des protéines IAP (Pardo, 2003). De plus, un traitement par FGF-2 induit
la formation d’un complexe protéique formé de S6K2/B-RAF/PKCe conduisant à la chimiorésistance via l’expression de BCLXL et les protéines IAP (Takahashi, 1989) Ces résultats sont cohérents avec l’expression fréquente de S6K2 dans les tumeurs du poumon à petites cellules (Pardo, 2006).
Figure 3. La voie phosphatidyl-inositol 3 kinase (PI3K) est activée par de nombreux récepteurs
membranaires. La phosphorylation de PI3K permet d’activer en cascade la protéine AKT puis mTOR. Celle-ci exerce de multiples fonctions cellulaires anti-apoptotiques telles que l’inhibition des protéines BH3 effectrices (BAX) ou médiatrices (BAD) ou encore de la protéine P53.
La protéine P53
Le gène P53 est le gène le plus fréquemment muté dans les cancers humains et la protéine p53 est inactivée dans près de 90 % des cancers du poumon à petites cellules en raison de mutations non sens, localisées le plus souvent dans le domaine de liaison à l’ADN. Lorsque le gène P53 sauvage est ré-exprimé dans les cellules tumorales, celles-ci subissent de nouveau une apoptose (Takahshi, 1992). En amont de p53, la protéine P14ARF résulte de la transcription du gène P16INK4a à partir d’un
promoteur alternatif. Cette protéine augmente l’activité de p53 en se bloquant MDM2, régulateur négatif de p53. Les études immunohistochimiques ont montré une perte d’expression de P14ARF dans deux tiers des CPC du poumon (Gazzeri, 1998).
Modifications sur la voie extrinsèque
Si le rôle de la voie intrinsèque dans la résistance à l’apoptose des cellules CPC du poumon est bien établi, plusieurs études suggèrent également l’implication de la voie
extrinsèque. Une étude a comparé l’expression immunohistochimique de FAS et de FAS ligand dans une série de CPC du poumon, de CPNC du poumon et du tissu pulmonaire normal (Viard-Leveugle, 2003) Les résultats montrent que l’expression de FAS est extrêmement réduite à la surface de cellules tumorales quelle que soit l’histologie. En revanche, les CPC du poumon présentent plus souvent une augmentation de l’expression de FAS ligand en réponse à la sous-expression de leur récepteur membranaire : ce phénomène pourrait conduire à la lyse de lymphocytes T cytotoxiques qui expriment très fréquemment FAS. Cette diminution d’expression de FAS est liée à une réduction de la transcription du gène FAS et paraît associée à la résistance à l’apoptose induite par FAS. L’inhibition de FAS ligand ou la réexpression de FAS dans les cellules de CPC du poumon pourraient être une voie thérapeutique intéressante dans ce contexte.
Plusieurs études ont montré l’existence de mutations non sens du gène codant TRAIL-1 dans le CPC du poumon (Fisher, 2001). En outre, l’absence d’expression des caspases 8 et 10 impliquées dans la voie extrinsèque est fréquente dans les CPC du poumon. Or, l’efficacité de la voie extrinsèque est dépendante de l’expression de la caspase 8. En effet, une étude récente a montré qu’en l’absence de caspase 8, TRAIL induisait une prolifération des lignées de CPC de façon inattendue, suite à sa liaison avec TRAIL-récepteur 2. La restauration de l’expression de la caspase 8 induite par l’interféron gamma permet de retrouver une sensibilité à l’apoptose (Belyanskaya,
2008). Les mécanismes responsables de l’extinction de TRAIL-R1 et des caspases 8 et
10 consistent en une méthylation des promoteurs des gènes correspondants. Un traitement in vitro par un agent déméthylant tel que la 5’-aza-2-deoxycytidine permet de nouveau la transcription de ces gènes et la restauration d’une sensibilité à FAS ligand ou à TRAIL (Hopkins, 2003). L’expression de N-MYC est fréquente dans les CPC et le plus souvent associée à l’absence d’expression plus fréquente de la caspase 8 et à la surexpression de C-FLIP, un inhibiteur de la caspase 8.
Ces données sur la biologie du CPC montrent donc que :
Les altérations de l’apoptose dans la progression tumorale des CPC sont fréquentes.
Les cellules du CPC ont la propriété de mourir par apoptose (spontanément ou après chimiothérapie).
Les mécanismes régulant l’apoptose ainsi que les signaux de survie tels que la voie PI3K/AKt paraissent donc importantes dans l’oncogenèse du CPC.
Il semble donc essentiel d’évaluer une stratégie modulant les mécanismes antiapoptotiques tels qu’un inhibiteur des protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et Bcl-XL
ou les signaux de survie tels qu’un inhibiteur de IGF-1R en particulier avec la radiothérapie dans une perspective d’amélioration de la survie de ces patients d’autant plus qu’il n’existe pas de données dans cette indication.
Le cancer du poumon non à petites cellules
1. Epidémiologie
Le cancer du poumon non à petites cellules représente 80 à 85% de l’ensemble des cancers pulmonaires. Le tabac constitue le premier facteur étiologique du CBNPC chez 90% des hommes et chez 80% chez les femmes. La majorité des CBNPC sont diagnostiqués à un stade avancé non opérable (D’Addario, 2010). L’incidence européenne est variable et est d’environ 22-60 cas pour 100 000 hommes et 5-30 cas pour 100 000 femmes. L’incidence du CBNPC diminue chez l’homme mais a tendance à diminuer chez la femme. La survie globale reste très faible en Europe (<15%). Les formes histologiques du CBNPC sont classées en adénocarcinome, carcinome épidermoïde et carcinome à grande cellule. L’incidence des adénocarcinomes augmente tandis que celle des carcinomes épidermoïdes diminue (D’Addario, 2010) 2. Traitement standard du CBNPC localement avancé
Les CBNPC localement avancés sont les formes localisées au thorax, ne relevant pas d’une indiction chirurgicale (stade IIIB voire stade IIIA avec N2 macroscopique). Dans cette situation, le risque de récidive locale est élevé (80%) de même que le risque de développement de métastase (60%).
Le traitement standard du CBNPC localement avancé et non opérable reposait sur la radiothérapie seule jusque les années 1990. En effet, suite aux résultats de l’étude du Cancer and Leukemia Group B (CALGB), l’association d’une chimiothérapie d’induction suivie d’une radiothérapie conventionnelle est devenue le traitement de
référence en montrant un gain de survie passant de 9.6 mois avec la radiothérapie seule à 13,7 mois pour l’association avec un taux de réponse local initial de 40-50%
(Dillman, 1996). Plusieurs schémas d’association ont été évalués, en particulier
un schéma concomitant dans le quel la chimiothérapie est administrée pendant la durée de l’irradiation. Plusieurs études de phase III ont également montré un avantage en survie de ce schéma, la médiane de survie passant de 13 mois à 17 mois
(Curran, 2011). Le traitement de référence des CBNPC est donc actuellement
l’association d’une chimiothérapie à base de cisplatine à une irradiation selon un schéma concomitant. Cependant, le contrôle local et donc la survie de ces patients restent limités (15% de contrôle local à 1 an) (Mauguen, 2013). Ainsi, l’amélioration du contrôle local reste un objectif essentiel de la prise en charge des CBNPC localement avancés.
Plusieurs axes de recherche sont ainsi développés en ce sens. Au-delà des recherches en termes d’imagerie fonctionnelle (utilisation du TEP-scan) et de la radiophysique (utilisation de la protonthérapie, utilisation du « Gating » pour adapter les champs d’irradiation avec les mouvements thoraciques), l’une des voies les plus intéressantes repose sur l’amélioration des connaissances de la biologie du CBNPC afin de développer des thérapies ciblées à combiner avec l’irradiation.
3. Traitement des formes métastatiques
Une chimiothérapie à base de sels de platine prolonge la survie, améliore la qualité de vie et le contrôle des symptômes en première ligne de traitement chez les patients en bon état général. La combinaison fait appel à un doublet comprenant un sel de platine (cisplatine ou carboplatine) associé à un agent de troisième génération tel que le pemetrexed (pour les formes non épidermoïdes exclusivement), la gemcitabine ou des taxanes (D’addario, 2010).
Le pemetrexed est préféré à la gemcitabine pour les formes non épidermoïdes sur les bases d’une analyse en sous-groupe d’une étude de phase 3 (Scagliotti, 2008).
En cas de contre-indication aux sels de platine, une combinaison d’agents de troisième génération peut être réalisée même si le taux de réponse semble plus faible. Les patients en bon état général et avec une forme non épidermoïde peuvent être traités par une triple combinaison avec le bevacizumab, un agent anti-angiogénique et
une chimiothérapie conventionnelle par carboplatine-taxol ou cisplatine-gemcitabine
(D’addario, 2010).
En cas de mutation somatique du gène EGFR portant sur l’exon 19 et/ou l’exon 21, les patients peuvent être traités par un inhibiteur oral de tyrosine kinase (erlotinib ou gefitinib).
Pour les patients traités par une chimiothérapie conventionnelle, le nombre de cycle est débattu : il doit être de quatre minimum mais ne devrait pas dépasser six cycles. Le rôle d’un traitement de maintenance peut être discuté.
En seconde ligne ou troisième ligne, seuls les patients en bon état général peuvent recevoir un traitement médical par docetaxel, pemetrexed ou erlotinib.
1. Biologie du CBNPC
Plusieurs voies de signalisation cellulaires sont altérées dans le CBNPC. De nombreuses études ont mis en évidence des mutations du gène KRAS (dans environ 25% des patients) (Spheferd, 2013) et du gène EGFR (Janne, 2005). D’autre part, la voie PI3K, AKT est également activée dans 20% des cas via l’activation du récepteur EGFR ou via la présence de mutations activatrices de PI3K (Kan, 2010). La présence de gène de fusion impliquant EML4 (echonoderm microotubule-associated protein-like 4) et ALK (anaplastic lymphoma kinase) a également été mise en évidence chez environ 2% des patients (Soda, 2007). Ces différentes anomalies moléculaires font l’objet de ciblage par des inhibiteurs de tyrosine kinase telles que l’erlotinib ou le gefitinib en cas de mutations activatrices d’EGFR ou du crizotinib en cas de translocation EML4-ALK (Shaw, 2013). D’autres mutations impliquées dans la progression tumorale sont actuellement étudiées dans le CBNPC telles que les mutations BRAF, PI3KCA, AKT1 et MET (Kan, 2010). Comme dans le cas du CPC, l’activation de la voie IGF1 semble également jouer un rôle dans la progression tumorale du CBNPC (Dziadziuszko, 2010). Différentes stratégies exploitant l’amélioration des connaissances de la biologie du CBNC sont donc développées afin de restaurer ou d’améliorer la radiosensibilité des CBNPC.
L’angiogenèse joue également un rôle important dans le cancer du poumon non à petites cellules. Celle-ci passe par l’expression de la voie du VEGF (vascular endothelial growth factor) et du PDGF (platelet-derived growth factor). L’expression du VEGF est retrouvée dans 70 % des tumeurs bronchiques non à petites cellules (Ohta, 1996).
Des taux élevés de VEGF intratumoraux ou circulants ont été associés à un mauvais pronostic chez les patients atteints de cancer bronchique non à petites cellules
(Yuan, 2001). Une densité élevée de microvaisseaux est également un facteur de
mauvais pronostic et prédictif de survenue de métastases (O’byrne , 2000). Le VEGF joue un rôle dans la croissance tumorale en stimulant l’angiogenèse et favorise également la diffusion pleurale des cellules tumorales dans des tumeurs bronchiques. L’inhibition du VEGF ou de son récepteur entraîne une diminution de la vascularisation et de la croissance tumorale de xénogreffes de tumeurs bronchiques humaines
(Abdollahi, 2003). D’autres facteurs anti-angiogéniques jouent un rôle dans
l’angiogenèse des tumeurs bronchiques. Une expression forte du basic fibroblast growth factor constitue un facteur indépendant de mauvais pronostic, de même que l’expression intratumorale de l’hypoxia-inducible factor 2-α (O’Byrne, 2000).
Données récentes issues des technologies d’analyse du génome à haut-débit
Récemment, les données issues des études sur le profil mutationnel, transcriptomique et protéomique et de nouveaux modèles murins de cancer du poumon ont permis d’identifier de nouvelles potentielles anomalies moléculaires dans le cancer du poumon non à petites cellules (Liu, 2012 ; Seo, 2012 ; Imielinski, 2012).
Les principales anomalies récemment mises en évidence sont les suivantes :
les gènes de fusion ALK et ROS : la protéine ALK est un récepteur tyrosine kinase normallement non exprimé dans les cellules épithéliales pulmonaires. Des fusions du gène ALK avec plusieurs autres partenaires géniques tels que EML4 résultant d’inversion sur le bras court du chromosome 2 ont été identifiées en 2007 dans le cancer du poumon non à petites cellules conduisant à une activation constitutive de cette kinase (Soda, 2007). Cette translocation est retrouvée dans 3 à 7% des cancers du poumon essentiellement chez les patients jeunes, non fumeurs et est générallement observée dans dans des tumeurs avec la forme sauvage du gène
EGFR et KRAS. Cette translocation peut faire l’objet d’un ciblage pharmacologique
spécifique avec un inhibiteur orale (le crizotinib) conduisant à des taux de réponse supérieurs à 50%. Le crizotinib est actuellement indiqué chez les patients pré-traités avec remaniement du gène ALK. D’autres translocations impliquant ROS ou RET ont également été mises en évidence (Kohno, 2012 ; Takeuchi, 2012)
les nouvelles mutations : Plusieurs nouvelles mutations ont été mises en évidence dans le cancer du poumon à petites cellules partageant des caractéristiques communes : elles sont en général mutuellement exclusives et présentes chez un faible pourcentage de patients. Parmi ces mutations, on retrouve des mutations de HER2 (ERBB-2), retrouvée chez 2% des cancers du poumon non à pteites cellules (Oxnard, 2013). La protéine HER2 appartient à la famille HER des récepteurs tyrosine kinase. Ces mutations impliquent essentiellement des insertions au niveau de l’exon 20 et sont retrouvées chez des femmes jeunes, non fumeuses et atteintes d’adénocarcinomes. Ces mutations conduisent à une activation constitutive du récepteur. Des mutations de PI3K (Phosphatidylinositol-3-kinases) impliquant la partie catalytique (p110α) (exon 9) ont été identifiées dans environ 2% des cancers du poumon non à petites cellules. Elles sont moins fréquentes dans les adnocarcinomes. De même, des mutations du gène AKT1 codant la protéine kinase B ont retrouvées dans 1% des cancers du poumon et les mutations de BRAF chez 1 à 3% des cancers du poumon essentiellement dans des adénocarcinomes. Ces mutations de BRAF sont différentes de celles retrouvées dans le mélanome (résidu Val600) car elles affectent le plus souvent les résidus 600Glu et leu596Val.
Les amplifications récemment mises en évidence affectent essentiellement le gène
MET codant le récepteur à l’hépatocyt growth factor (HGF) (Engelman, 2008).
Cette amplification a été retrouvée dans le cas de résistance acquise aux inhibiteurs d’EGFR (20% des résistances secondaires)
Mécanismes de mort cellulaire induits par
l’irradiation
Mort cellulaire induite par l’irradiation
L’apoptose est le mode de mort principal en réponse à une irradiation chez les cellules naturellement sujettes à l’apoptose telles que les cellules hématopoïetiques et les cellules tumorales qui en dérivent (Jonathan, 1999). Ces cellules sont en général programmées pour mourrir par apoptose, de survenue et d’exécution rapide. Au contraire, la mort par apoptose joue un rôle mineur pour les cellules issues de tumeurs solides (Harms, 1996). En effet, chez ces dernières, on constate fréquemment une perte du potentiel apoptotique par différents mécanismes tels que une mutation du gène P53 (Hollstein, 1997) Et même en l’absence de mutation P53, d’autres altérations des mécanismes de l’apoptose empêchent son déroulement normal telles que l’hyperexpression de protéines anti-apoptotiques (Bcl-2, survivine) ou encore l’inactivation de gènes pro-apoptotiques tels que BAX, BAK ou APAF1 (Igney, 2002). En présence d’altération de l’apoptose, d’autres morts cellulaires peuvent survenir suite à une irradiation telles que la sénescence (Jones, 2005) ou la catastrophe mitotique (Ianzini, 1998). Cette dernière reste le mode de mort prépondérant à la suite d’une irradiation en particulier dans les tumeurs solides.
1. La mort par apoptose.
L’apoptose est un processus cellulaire normal d’autodestruction d’une cellule en réponse à un signal interne. Les cellules tumorales peuvent mourir par apoptose selon deux voies moléculaires distinctes : la voie intrinsèque et la voie extrinsèque (Figure 4).
Figure 4. Les deux voies d’activation de l’apoptose, la voie mitochondriale ou intrinsèque et la voie des récepteurs de mort ou voie extrinsèque. Il existe classiquement deux voies
d’activation de l’apoptose : l’une dit intrinsèque fait intervenir la mitochondrie (voie mitochondriale). Des protéines pro-apoptotiques telles que les protéines BAX/BAK viennent se loger à la surface membranaire de la mitochondrie induisant ainsi sa perméabilisation. De nombreuses molécules solubles sont libérées dans le cytoplasme telles que le cytochrome c qui active la caspase 9 qui elle-même active les caspases 3 et 7. Des protéines anti-apoptotiques comme Bcl-2, Bcl-xl et Mcl-1 peuvent inhiber l’action pro-apoptotique de BAX et BAK à la surface membranaire de la mitochondrie. Plusieurs autres molécules mitochondriales, principalement Smac/DIABLO (second mitochondria-derived activator of
caspases /direct IAP-binding protein with low pI ) passent dans le cytosol pour neutraliser l’effet inhibiteur
des IAP sur l’activité des caspases 3, 7 et 9, ce qui favorise leur activation par le cytochrome c. Parallèlement, on décrit la voie extrinsèque qui implique des récepteurs de la membrane plasmique appartenant à la super-famille des tumor necrosis factor receptor (TNFR). Ces molécules [TNF-R1 (p55/CD120a), Fas (APO1/CD95), p75NGF, les deux récepteurs de TRAIL, DR4 (TRAIL-R1/APO-2) et DR5 (TRAILR2/ KILLER/TRICK2), DR3 et DR6] possèdent, dans leur portion intracytoplasmique C-terminale, le domaine de mort, qui forme six hélices alpha. Ce domaine de mort permet le recrutement de protéines cytosoliques présentant un domaine homologue telles que la protéine Fas associated death
domain (FADD) qui recrute la procaspase 8. Ainsi se forme le death inducing signaling complex (DISC) au
sein duquel le rapprochement des molécules de procaspase 8 conduit à leur activation.
1.1. La voie intrinsèque (ou voie mitochondriale)
La voie intrinsèque est activée par différents stimuli cellulaires ou extracellulaires tels que l’exposition à des rayons ionisants, à des agents de chimiothérapie, à des lésions de l’ADN ou à l’hypoxie cellulaire. Ces signaux de stress cellulaire sont reconnus par la protéine p53 qui va activer la voie intrinsèque. L’élément déclencheur repose sur la perméabilisation de la membrane externe de la mitochondrie impliquant la famille des protéines Bcl-2 (Danial, 2004). Les 18 protéines qui constituent cette famille ont en commun au moins l’un des quatre domaines moléculaires appelé domaine d’homologie Bcl-2 (Cory, 2002). Ces protéines jouent un rôle essentiel dans la régulation de la perméabilité de la membrane externe de la mitochondrie et sont donc, soit pro-apoptotiques (Bax, Bak), soit anti-pro-apoptotiques (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1)
(Kroemer, 2007). D’autres protéines telles que Bim, Bid ou Bad activent la cascade en
recrutant les protéines effectrices (Bax et Bak) (Cory, 2002). La perméabilisation de la membrane externe de la mitochondrie conduit au relargage de nombreuses molécules mitochondriales dans le cytosol, en particulier le cytochrome c qui se lie à la protéine APAF-1 et à la caspase 9 pour former une plate-forme moléculaire appelé apoptosome (Garido, 2006). Celui-ci active à son tour les caspases effectrices, la caspase 3 et la caspase 7, pour induire la mort de la cellule (Kroemer, 2007). D’autres molécules mitochondriales relarguées jouent un rôle anti-apoptotique telles que les protéines inhibitrices de l’apoptose (IAP) dont le rôle est d’inhiber les caspases. Les IAP sont elles-mêmes régulées négativement par d’autres molécules telles que
second mitochondria-derived activator of caspase (SMAC), direct inhibitor of apoptosis-binding protein with low pI (DIABLO) et OMI (Veraghen, 2002). Enfin, une apoptose
indépendante des caspases est possible via la molécule AIF (ou apoptosis inducing
factor). Après un stimulus apoptotique, AIF subit une translocation vers le noyau où
elle induit deux signes spécifiques de la mort caspase-indépendante : la condensation partielle de la chromatine et la fragmentation de l’ADN (Susin, 1999).
Les éléments de la voie intrinsèque peuvent être modulés par d’autres voies cellulaires telles que la voie PI3K-AKT-mTOR. La protéine mTOR (ou mammalian target of
rapamycine) est une sérine/thréonine kinase intracellulaire de 289 kDa dont le gène est
localisé en 1p36.2 (Yang ,2013). L’activation de cette protéine kinase est contrôlée par la voie PI3K/AKT située en aval de récepteurs membranaires à activité tyrosine kinase
(Yang, 2013). La protéine mTOR module la traduction de nombreux ARNm en agissant
sur la phosphorylation de protéines régulatrices telles que 4EBP1, P70S6K et eEF2
(Yang, 2013). Elle participe ainsi à la régulation de nombreux processus cellulaires dont
l’apoptose (interaction avec les protéines BAD, BAX et P53) (Conn, 2011).
1.2. La voie extrinsèque
La voie extrinsèque est la voie privilégiée du système immunitaire pour détruire les cellules non viables. Cette voie est activée par des ligands extracellulaires tels que le TNFalpha (tumor necrosis factor), FAS ligand ou TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) (Wang, 2003). Ces molécules se lient à des récepteurs de mort (DR pour
Death Receptor situés sur la membrane plasmique (Trauth, 1989 ; Cotter, 2009).
Plusieurs récepteurs de ce type ont été identifiés tels que CD95/FAS/Apo1, les récepteurs 1 et 2 du TNF (TNFR1 et TNFR2) et les récepteurs de mort 3 à 6 (DR 3–6) (Itoth, 1991). Une fois activés par leur ligand respectif, ces récepteurs déclenchent une réponse intracellulaire via la formation d’un complexe moléculaire appelé DISC (death-inducing signaling complex) (Scott, 2009). Celui-ci va lui-même activer les caspases 8 et 10 puis les caspases effectrices 3 et 7 induisant ainsi la mort cellulaire
(Scott, 2009).
1.3. Les protéines de stress
Les protéines de stress (Heat Shock Proteins [HSP]) sont des protéines structuralement très conservées, dont la majorité se comporte comme des chaperons pour d’autres protéines cellulaires. Leurs fonctions cellulaires consistent à réguler la stabilité, l’activation, la localisation et la dégradation de nombreuses protéines clientes telles que les récepteurs hormonaux, les facteurs de transcription et les kinases (Shimamura, 2008). La famille HSP comporte des protéines anti-apoptotiques et des protéines
pro-apoptotiques. C’est le niveau d’expression de ces protéines qui détermine en partie le devenir de la cellule en réponse à un stimulus apoptotique, essentiellement par le contrôle de l’activation des caspases. La protéine mitochondriale HSP60 et son co-chaperon HSP10 accélèrent l’activation de la procaspase 3 par le cytochrome c en présence d’ATP (Ghosh, 2010). Au contraire, les protéines HSP27, HSP70 et HSP90 ont l’effet inverse. HSP27 interagit avec le cytochrome c lorsqu’il passe de la mitochondrie dans le cytosol (Paul, 2002), HSP70 et HSP90 interagissent avec
Apaf1 dans le cytoplasme et préviennent ainsi la formation de l’apoptosome (Pandey,
2000). HSP70 interagit aussi avec AIF, bloquant une apoptose indépendante des
caspases Ravagnan, 2001).
1.4. Implication de la protéine P53 dans l’apoptose
Le gène suppresseur de tumeur P53 localisé sur le locus 17p12.1 code pour une protéine qui agit comme un facteur de transcription (De Leleo, 1979). La protéine p53 contrôle plusieurs voies cellulaires dont le cycle cellulaire et l’apoptose
(Menendez, 2009). La protéine p53 peut être activée selon deux voies : la première
déclenchée par des signaux mitotiques et l’autre déclenchée par une lésion de l’ADN. La protéine p53 activée contrôle l’expression de nombreux gènes d’aval impliqués dans l’apoptose dont APAF1, BAX, BID, PUMA, NOXA et FAS (Riley, 2008). Réciproquement, elle inhibe l’expression de gènes anti-apoptotiques tels que BCL2 et AKT.
Le rôle de la protéine p53 est essentiel dans le déclenchement de l’apoptose. En effet, les thymocytes avec la forme sauvage de P53 sont très radiosensibles alors que les thymocytes avec mutation de P53 sont radiorésistants (Lowe, 1994). L’apoptose radio-induite dépendant de p53 survient dans les heures qui suivent l’irradiation pendant l’interphase et ne nécessite donc pas une division cellulaire (évènement pré-mitotique). Les tissus radiosensibles ont de haut niveau d’expression de la protéine p53 sauvage et/ou des taux de l’ARNm élevés. La suppression de p53 dans ces tissus les rend radiorésistants par perte de leur pouvoir apoptotique.
1.5. Implication de l’apoptose au cours d’une irradiation
La protéine p53 est un facteur de transcription qui contrôle des gènes cibles impliqués dans la régulation du cycle cellulaire, la réparation de l’ADN, l’apoptose et la sénescence (Efeyan, 2007) A la suite d’une irradiation, l’activation de p53 conduit à la survie de la cellule via un arrêt de la croissance de la cellule et une réparation de l’ADN (Helton, 2007). Cependant, la protéine p53 peut également déclencher la mort de la cellule par apoptose ou sénescence en fonction de l’étendue des dommages cellulaires en particulier de l’ADN et des capacités de réparation de la cellule
(Helton, 2007). La réponse à l’irradiation fait intervenir outre p53, de nombreux
cofacteurs régulant de nombreux gènes cibles influençant la réponse cellulaire à
l’irradiation, en particulier la protéine ATM (Ataxia telangiectasia Mutated) (Komatsu,
1990). Celle-ci est une sérine/thréonine protéine kinase dont l’activité est augmentée
après irradiation et cassures double-brin de l’ADN. L’activation d’ATM induit la phosphorylation de nombreux substrats dont la protéine p53. ATM régule ainsi en partie l’apoptose radio-induite via la protéine p53 (Bakkenist, 2003). En effet, des cellules avec une voie p53 non fonctionnelle peuvent continuer à progresser dans le cycle cellulaire (en raison des contrôles des checkpoints non fonctionnels) favorisant ainsi l’aneuploïdie et la progression tumorale (Storchova, 2004). L’instabilité génomique qui en résulte peut déclencher elle-même l’apoptose bien que celle-ci ne soit pas indispensable à la mort cellulaire radio-induite (Zhang, 2007).
Au niveau moléculaire, l’apoptose fait intervenir les caspases dont la forme inactive sous forme de zymogène est clivée en forme active à la suite d’un stimulus apoptotique
(Riedl, 2007). Une irradiation peut induire l’apoptose via les deux voies d’activation
cellulaire : la voie intrinsèque et la voie extrinsèque (Shinomiya, 2001). A la suite d’une irradiation, p53 active la transcription de gènes pro-apoptotiques de la famille Bcl-2
(Erlarcher, 2005). Plusieurs études ont montré l’induction et le rôle des protéines
Puma, Noxa et Bim dans l’aptoptose induite par l’irradiation dans les cellules hématologiques, les thymocytes ou les fibroblastes (Michalak 2008, Jeffers 2003).
La voie extrinsèque est également impliquée dans l’apoptose radio-induite. Elle est activée à la suite d’activation de récepteurs membranaires (FAS, le récepteur à TRAIL et le récepteur au TNF) par des ligands. L’expression de ces récepteurs de la famille du récepteur au TNF est augmentée à la suite d’une irradiation et active les caspases par des mécanismes liés à la mitochondrie ou totalement indépendant de la mitochondrie
(Kobayashi 1998, Wu 1997). L’activation des récepteurs par leur ligands conduit à
la formation d’un complexe multiprotéiques (DISC) activant alors les caspases 8 et 10 puis les caspases 3, 6 et 7 (Taylor, 2007). En cas d’activation insuffisante des caspases 8 et 10, une boucle d’amplification peut être déclenchée permettant aux caspases 8 et 10 de cliver Bid lui permettant de déclencher le relargage du cytochrome c et donc de déclencher l’activation de la caspase 9 et 3 (Luo, 1998).
2. La mort par catastrophe mitotique
La catastrophe mitotique correspond à une entrée prématurée ou inadaptée de la cellule en mitose et peut être la conséquence d’un agent induisant des dommages de l’ADN tels que l’irradiation (Vitale, 2011). Au niveau cellulaire, la catastrophe mitotique apparait pendant la mitose ou comme conséquence d’une mitose anormale
(Galuzzi, 2012). Deux mécanismes moléculaires sont impliqués dans la genèse de
la catastrophe mitotique. Dans un premier modèle, la catastrophe mitotique est la conséquence d’un dommage de l’ADN et d’une défaillance des points de contrôle (checkpoints) du cycle cellulaire, le plus souvent en raison d’une mutation de P53. La cellule entre alors de façon prématurée en mitose en raison d’un contrôle du checkpoint G2/M non fonctionnel (Ianzini, 2006). Le second modèle stipule que la catastrophe mitotique est la conséquence d’une hyperamplification des centrosomes
(Dodson, 2007). Lors d’une mitose normale, les centrosomes constituent les centres
organisateurs des microtubules et forment les fuseaux mitotiques bipolaires
(Wang, 2009). Les centrosomes sont donc essentiels pour une ségrégation normale
des chromosomes. Une hyperamplification des centrosomes conduit alors à la formation des fuseaux mitotiques multipolaires responsables de micronoyaux et de cellules géantes binuclées. L’hyperamplification des centrosomes survient en réponse à des lésions de l’ADN mal réparées. Le complexe CDK2-cycline A/E est essentiel dans l’initiation de l’amplification des centrosomes, celle-ci étant régulée par p53
(Hanashiro, 2008). L’activation de p53 induit une hyperactivation transcriptionnelle de
p21 qui inhibe l’activité de CDK2 bloquant ainsi la duplication des centrosomes. L’induction de l’arrêt du cycle en G2/M en est la conséquence de mécanismes dépendants de p53 et indépendants de P53 (dépendant de Chk1) (Fukasawa, 2008). En présence d’une mutation de P53, Chk1 bloque l’entrée de la cellule en mitose permettant à la cellule d’acquérir la potentiel de dupliquer les centrosomes. De plus, en l’absence de p53, l’augmentation de l’activation de p21 est insuffisante pour bloquer l’activation du complexe CDK2-cycline A/E. C’est pourquoi une hyperamplification des centrosomes est fréquemment observée dans les cellules avec une protéine p53 déficiente, évènement clé de la catastrophe mitotique. Durant la catastrophe mitotique, les cellules subissent un arrêt transitoire en G2 mais entrent en mitose
prématurément. Le checkpoint mitotique est alors activé et la progression dans le cycle est bloquée (Jallepelli, 2001).
La catastrophe mitotique est le type de mort cellulaire le plus fréquemment rencontré dans les tumeurs solides en réponse à une irradiation (Jonathan, 1999). Elle survient typiquement plusieurs jours après l’initiation du traitement par radiothérapie contrairement à l’apoptose. Une irradiation conduit fréquemment à un arrêt en mitose. Durant cet arrêt, les mécanismes apoptotiques peuvent être activés en particulier pendant la métaphase secondairement à l’activation de la caspase 2
(Castedo, 2006). Si elle ne meurt pas pendant la métaphase, les cellules irradiées
quittent l’arrêt du cycle mais ne réalisent pas une cytokinèse normale. Elles vont de nouveau entrer dans une phase G1 devenant ainsi tétraploïdes (Eriksonn, 2007) Ces cellules survivent quelques jours mais finissent par mourir par nécrose, apoptose ou sénescence.
3. La mort par sénescence
La sénescence correspond à un arrêt permanent du cycle cellulaire. Elle est observée
in vitro et in vivo dans des tumeurs traitées par des agents induisant des lésions de
l’ADN (Chang1999 ; Mirzayans, 2005). La sénescence survient dans les cellules normales lors du raccourcissement des télomères, les cellules présentant alors le phénotype observé en cas de sénescence réplicative, c’est-à-dire une augmentation de la taille cellulaire, et aplatissement de la cellule (Deng, 2008). Un marqueur moléculaire peut être utilisé pour rechercher le phénomène de sénescence : le marquage de la ß-galactosidase des compartiments lysosomaux (Deng, 2008).
En cas de lésions de l’ADN, en particulier lors d’une irradiation, il se produit un arrêt du cycle cellulaire afin de permettre la réparation des lésions. Si celle-ci ne peut pas s’effectuer, la cellule meurt par apoptose (mécanismes dépendant de p53) ou meurt par catastrophe mitotique (mécanismes indépendant de p53) ou active un signal de dommage de l’ADN persistant et chronique conduisant à la sénescence (Rodier, 2009). L’activation de la sénescence dans ce cas permet de prévenir la transmission de dommages de l’ADN aux cellules filles lors de la mitose. Les cellules sénescentes subissent une répression des gènes impliqués dans la prolifération cellulaire et
l’induction d’inhibiteurs de la croissance cellulaire. La sénescence réplicative dépend essentiellement de deux voies moléculaires contrôlées par p16/pRb et p53/p21
(Galuzzi, 2007). Dans le cas particulier de la sénescence induite par une irradiation,
les mécanismes moléculaires sont activés par p53 et p21 (Lehmann, 2007). En cas d’altération de la voie induite par p53, la sénescence peut être inhibée avec une diminution de l’efficacité de l’irradiation. Ceci a bien été démontré sur des cellules du cancer de la prostate. Par ailleurs, les cellules sénescentes restent métaboliquement actives même si elles ne se divisent plus et peuvent alors sécréter des cytokines inflammatoires induisant une angiogenèse, l’invasion tumorale et une réponse inflammatoire (Rodier, 2009). Au contraire, cette réponse inflammatoire peut activer une réponse immune contre les cellules tumorales favorisant leur élimination de façon retardée (Xue, 2007). Le lien entre sénescence et microenvironnement est donc actuellement contradictoire et est encore extrêmement débattu.
4. La mort par autophagie
L’autophagie est un processus cellulaire de dégradation métabolique au cours duquel des protéines cellulaires et des organites intracellulaires sont absorbés par des autophagosomes, digérés par les lysosomes puis recyclés pour maintenir le méabolisme cellulaire (Hait, 2006). L’initiation de l’autophagie est contrôlée par un complexe de protéines kinases appelées ULK, associant la protéine ULK1 elle-même et les protéines atg13 et atg17 (Jung, 2009). Ce complexe est lui-même régulé par la protéine mTOR1 dont l’inhibition de l’activité kinase conduit à la formation des autophagosomes
(Mizushima, 2010). La formation des autophagosomes implique d’autres protéines telles
que les protéines Vps34 (vacuolar sorting protein 34) formant un complexe avec la protiéne Beclin-1 (Furuya, 2005). Ce complexe recrute ensuite d’autres protéines atg conduisant à la conversion de la protéine LC3-I (cytosolic-associated protein light chain) en LC3-II indispensable pour l’excécution finale de l’autophagie (Satoo, 2009). L’autophagie est régulée par plusieurs cellulaires dont la voie PI3K-AKT-mTOR. L’inhibition de mTOR active directement l’autophagie (Pattingre, 2008). La protéine p53 joue également un rôle dans la régulation de l’autophagie en fonction de sa localisation cellulaire. La protéine p53 nucléaire joue le rôle de facteurs de transcription de gènes activant l’autophagie (Maiuri, 2009) tandis que la protéine p53 cytoplasmique inhibe au contraire l’autophagie par un mécanisme inconnu actuellement (Tadesmir, 2008).
Le rôle de l’autophagie dans les mécanismes de cancérogenèse est actuellement très débattu. D’une part, l’autophagie semble agir comme un mécanisme suppresseur de tumeur en éliminant les protéines anormales (Mathew, 2009 ; Liang, 1999) mais d’autre part, elle semble également pouvoir favoriser l’oncogenèse en tant que mécanisme de survie de cellules tumorales (Huo, 2013). Il existe par ailleurs une interaction entre apoptose et autophagie. Lorsque l’autophagie est inhibée, l’apoptose peut être déclenchée dans des cellules tumorales avec une machinerie apoptotique fonctionnelle
(Maiuri, 2010). A l’inverse, l’autophagie peut constituer un mode de mort cellulaire
alternatif dans les cellules résistantes à l’apoptose (Maiuri, 2010). Les liens et interactions entre ces deux voies de mort cellulaire s’expliquent par le fait qu’elles partagent de nombreux effecteurs et inducteurs. En effet, la protéine Beclin-1 possède un domaine BH3 identique à celui des protéines Bcl-2 et Bcl-XL (Aita, 1999 ;
Liang 1999). L’inhibition de l’interaction entre Beclin-1 et Bcl-2 et Bcl-Xl permet ainsi
de déclencher l’autophagie (Pattingre, 2005). Le rôle de l’autophagie dans la réponse aux traitements antitumoraux est également contreversé. En particulier, l’implication de l’autophagie dans la radiorésistance est débattue. Si de nombreuses études mettent en évidence une corrélation entre l’induction de l’autophagie et radiorésistance in vitro dans des modèles de cancer du sein (Chaachouay H, 2011), d’autres retrouvent au contraire une association d’une radiosensibilité et l’induction de l’autophagie en particulier lors de l’utilisation d’inhibiteur de mTOR lors d’une irradiation (Kim, 2009) ou d’inhibiteur de DNA-PK (Daido, 2005).
5. La mort immunogène
Plusieurs arguments suggèrent que l’irradiation puisse également induire une mort cellulaire d’origine immunologique médiée en partie par les lymphocytes T cytotoxiques (LTC). En effet, une irradiation augmente l’expression des molécules de classe I du complexe majeur d’hisocompatibilité (CMH1) les rendant plus vulnérables aux LTC (Reits, 2006). Une irradiation induit également l’expression des récepteurs de mort à la surface des cellules tumorales (Fas/CD95 et TNF-related apoptosis-inducing ligand [TRAIL] recepteurs) permettant leur lyse par les cellules immunitaires exprimant Fas et TRAIL (Chakraborty, 2003). Par ailleurs, une irradiation conduit également à
la translocation précoce (avant même la phase d’apoptose) de la protéine chaperonne
calréticuline de la lumière du réticulum endoplasmique vers la membrane plasmique facilitant ainsi la phagocytose des cellules tumorales par les cellules dendritiques. La suppression par approche génétique du gène de la calréticuline abolie cette mort cellulaire immunogénique (Obeid, 2007, Apetoh 2007)
6. Réparation des lésions induites par l’irradiation
Quel que soit le type de mort induit par l’irradiation, l’événèment moléculaire intial et causal consiste en un dommage de l’ADN. Les lésions de l’ADN provoquées par une irradiation incluent les lésions monobasiques, les cassures simple-brin de l’ADN et les cassures double-brin, ces dernières étant considérées comme les plus efficaces pour entrainer la mort de la cellule. Différents mécanismes de réparation de ces lésions sont activés en fonction de la nature de la lésion. L’inefficacité de ces mécanismes de réparation conduit en général à la mort cellulaire (Jeggo, 2009). En revanche, la tolérance des lésions secondaires à une irradiation peut mener à une instabilité génomique faisant le lit des mécanismes d’oncogenèse et donc de tumeurs radio-induites.
Il existe plusieurs types de lésions de l’ADN (Hoeijmaker, 2009 ; Friedber, 2003) :
Les lésions endogènes
Site abasique : cette lésion résulte de la rupture de la liaison entre la base et le désoxyribose.
Mésappariement (mismatch) des bases: cette lésion est la conséquence d’erreurs de l’ADN polymérase non corrigées.
Méthylations de bases. Bases oxydées.
Les lésions exogènes
dimères de pyrimidines ou de purines par liaison covalente entre deux bases adjacentes et provoquées en particulier par les radiations ultraviolettes.
adduits d’hydrocarbures polycycliques. cassures simple-brin de l’ADN.
