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Structure de la chromatine et les acides nucle iques (ADN, ARN)
La chromatine : I) Généralités :
- Complexe de filaments de l’ADN + histones et d’autres protéines constituant le chromosome eucaryote.
- Les histones sont associées avec l’ADN par des interactions ioniques.
- La moitié de la chromatine est formé de l’ADN et l’autre de protéines histones
II) Structure de la chromatine
Les histones ordonnent et empaquètent l’ADN en unités structurales : histones + ADN = nucléosome (forme empaqueté d’ADN)
a) Les histones :
- Petits protéines basiques, 5 classes : , , , ,
- Les 4 histones [ , , , ] constituent le nucléosome, sont monomérique (une seul sous unité) l’extrémité terminale en forme de bras, riche en acides aminés basiques
*argénine et lysine+ chargé positivement, c’est par le bras que les histones interagissent avec les charges négatives des phosphates du DNA
- La phosphorylation de l’histone est l’une des étapes chef de la mitose
- Histone est retrouvée dans les cellules jeunes (parce qu’ils ont une mitose active) b) Quelque protéines : « HMG »
- Protéines HMG = hight mobility group, ubiquitaires, retrouvés chez les eucaryotes, on a 4 types : 1, 2, 14, 17
- Chaque nucleosome possède 2 sites de fixation pour ces protéines (1,14, 2 ou 17) c) Nucléosomes : [DNA + Histones]
- Constituées d’octamère d’histones (8 histones) et 146 pair de base d’ADN.
- Chaque nucléoside contient 8 histones :
2 copies de chacun des histones , , , autour duquel le DNA s’enroule
III) Rôle de la chromatine :
Est de compacté l’ADN, ils ont un rôle dans la réplication et transcription du DNA
Les acides nucléiques : I) Définition :
On a 2 classes : ADN et ARN
1) Acide désoxyribonucléique (ADN) → Noyau 2) Acide ribonucléique (ARN) → cytoplasme
Intérêts dans la synthèse des protéines et support de la plupart des activités biologiques.
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II) Structure et caractères généraux :
A) ADN :
Polymères de désoxyribonucléique formé de 2 brins retrouvé chez : bactéries, virus, homme, animaux.
1) Structure primaire :
- Contient : Désoxyribose, acide phosphorique et 4 bases azotées :
Adénine, guanine → Base purique
Cytosine, thymine → base pyrimidique - Les 4 désoxyribonucléique sont : dAMP, dGMP, dCMP, dTMP
- Unis par des liaisons 3’→5’ phosphodiester
dAMP dGMP dTMP dCMP
Liaison 3’→5’ phosphodiesters
2) Structure secondaire :
- Chaque base d’un brin est reliée à une base complémentaire de l’autre brin par des liaisons [ponts] hydrogénés. et plus solide que
- Les chaines sont complémentaires l’une à l’autre et antiparallèles
3 | P a g e 3) Structure tertiaire :
- Les 2 chaines appariées présentent une configuration hélicoïdale consistant en l’enroulement des 2 brins antiparallèles autour d’un axe hypothétique central - Distance entre les bases = le pas de l’hélice se
fait à droite . Il y’a 10 paires de bases par tour de spire. Le diamètre de la double hélice
- Chaque brin a une extrémité phosphate et l’autre .
- Le modèle est la forme hydraté = DNA forme B
Conformation bicentenaire hélicoïdale ou DNA B
4) Autres formes de DNA : - La forme B est la plus stable.
forme A = DNA déshydraté, en double hélice, pas à droite mais l’intervalle par pair de base = et le nombre de pair de base par tour d’hélice = 11
forme Z = Adn à un pas à gauche avec 12 paires de bases avec intervalle entre base = et une disposition en Zigzag
III) Propriétés du DNA :
La présence du groupement phosphate = structure polyacide chargé négativement en solution captent : et histone
Propriétés physiques :
PH – chaleur – urée → DNA est dénaturée
Absorption : effet hyper chrome =le système est dénaturé les bases ne sont plus empilées, elle se comporte libre.
Propriétés chimiques :
a) Hydrolyse chimique :
1- Hydrolyse acide :
DNA hydrolysé à les liaisons osidiques [base purique et désoxyribose]
sont rompues = acides apurique
Les liaisons pyrimidique et désoxyribose reste intacte 2- Hydrolyse basique :
Sans action sur le DNA b) Hydrolyse enzymatique :
Les acides nucléiques sont hydrolysés par des nucléases intestinales secrété par le pancréas. Les liaisons phosphodiesters sont hydrolysé par :
Exonucléase = coupe l’extrémité de la chaine
𝑛𝑚
4 | P a g e Endonucléases = coupe les liaisons Endonucléases = coupe les liaisons 3’→5’ phosphodiesters intra chaines ?
c) Agents chimique :
Acide nitrique, agent alkylant, peroxyde hydrogène → entraine le domagement du DNA B) ARN :
Caractérisé par 4 types de base = adénine- guanine – cytosine – uracyle et une seul chine de nucléotides.
1) Structure primaire :
- Formé d’un seul brin les 4 types de ribonucléotides AMP-GMP-CMP-UMP sont uni par des liaisons sont uni par des liaisons phosphodiesters
2) Structure secondaire :
Les appariements par liaisons hydrogène entre les bases mais n’ont pas la régularité géométrique du DNA
3) Structure tertiaire :
Conformation pseudo-hélicoïdale 4) Les différentes formes du RNA :
a) RNA ribosomique :
De 2 sous unité de tailles différentes. Les ribosomes se regroupe en unité fonctionnelle = polysomes. Les 2 sous unités :
o Grande sous unité = : 34 protéines et 2 molécules de RNA : RNA et . o Petite sous unité = : 21 protéines et un seul RNA : RNA .
Chez les eucaryotes : Ribosome 70S
30S
50S
RNA 16S 21 protéines
RNA 5S RNA 23S 34 protéines b) RNA de transfert :
Lien entre acide nucléique et les protéines. Petite molécule de 70 -90 bases. Il existe un type de RNAt pour chaque acide aminé
On une conformation en trèfle avec des boucles et anti codon, l’extrémité 5’ de RNAt est phosphorylé
5 | P a g e Fixation de l’acide aminé
5’ phosphate 3’OH
Boucle
Anti codons c) RNA messager : RNAm
- La composition en bases RNAm reflète la composition en base du DNA
- Il s’associe temporairement aux ribosomes à la cour de la synthèse des protéines ? ont une demi-vie la plus courte
- RNAm s’unit aux ribosomes au niveau de la petite sous unité
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La re plication de l’ADN
I) Définition :
Duplication de l’information génétique de telle manière à ce que les cellules filles aient le même contenu informatif
II) Caractères généraux :
Réplication est semi-conservatrice :
- Au départ séparation des 2 chaines ensuite chacune sert de matrice pour la formation d’une nouvelle molécule. Chaque brin parental engendre son complémentaire par addition des désoxiribonucléosides tri phosphate
- A la fin chaque molécule d’ADN fille est composée d’une chaine d’origine et l’autre néo synthétisée
réplication orientée :
Commence par l’extrémité libre par l’amorce d’ADN Le sens 3’→5’ : Brin direct : synthèse continue
Le sens 5’→3’ : Brin retardé : synthèse discontinue en petit fragment : fragments d’OKASAKI 3’
5’ Brin direct 5’
3’
Brin retardée
Réplication est bidirectionnelle
La réplication s’effectue dans les 2 directions du chromosome et on a 2 fourchettes de réplication
III) Mécanisme de réplication : 1) Chez les procaryotes :
La synthèse de l’ADN se fait en 3 étapes : initiation, élongation et terminaison
ADN parental initial
2 ADN filles
3’
5’
7 | P a g e L’initiation :
L’origine chez E.coli appelé ORIc composé de 245pb.
Les séquences clé sont : 2 séries de courte répétions : 3 répétitions d’une séquence de 13pb
4 répétitions d’une séquence 3pb
- Le composant majeur de l’initiation : protéine : DNA A environ 20 protéines DNA A se fixe sur les 4 répétitions de 9 paires de base
- L’ADN s’enroule autour du complexe. Les 3 répétitions de 13 paires de bases. Sont dénaturé : complexe ouvert. La protéine DNA B se lie au complexe ouvert avec DNA C. le DNA B déroule de nouveau le DNA en le préparent à l’amorçage (formation d’amorce d’ARN)
Origine de réplication 3 répétitions 4répitions de 9
de 13 paires d base paires de base
dnaA + ATP
dnaB dnaC +ATP
Amorçage et réplication
20 protéines dnaA, se fixent sur les 4 répétitions de paires de bases. L’ADN est enroulé autour du complexe
Les 3 répétitions de 13 paires de bases, sont dénaturés = complexe ouvert
dnaB se lie au complexe ouvert avec dnaC
L’activité hélicase de dnaB déroule le DNA en le préarant à l’amorçage
8 | P a g e L’élongation :
Synthèse de brin direct : formation d’une amorce de RNA par la primase. La synthèse se fait par l’extrémité 3’OH libre. En utilisant le Brin matrice de Modèle :
- Le DNA polymérase III se déplace par pair de base avec la fourche
- Les hélicases séparent les 2 brins de DNA au niveau de la fourche et les topo isomérase II atténuent la tension de la double hélice
Synthèse de brin retardé :
- Sous forme de fragments : fragment d’OKAZAKI
- Chaque fragment a son amorce de RNA et allongé par DNA polymérase III
DNA Polymérase III
3’
5’ Brin direct
Hélicase Fourche de réplication
3’ Topo III Brin retardé
5’
Terminaison :
-DNA des procaryotes : DNA bicentenaire hélicoïdale circulaire et nue. Les 2 fourches se rencontrent et la topo isomérase II est importante pour la séparation finale.
2) Chez les eucaryotes
- polymérase [primase] qui augmente la phase S du cycle cellulaire - Polymérase béta séparation du dNA et fixation du brin retardé
- Le DNA est déroulé par les Hélicases, la polymérase alpha interagit avec RFA est synthétise RNA amorce ensuite la fixation de la polymérase delta au 3’OH et continue la synthèse
ADN est associé avec des histones = nucléosome 200pb donc fragments d’Okazaki tous les 100 à 200 nucléotides a l’inverse des procaryotes tous les 1000 – 2000 nucléotides
Donc le nucléosome retarde 10 fois la réplication
IV) Réparation du DNA :
A) Les différentes altérations :
- Altération spontanées : mutation – insertion et délétion - Altération de l’environnement :
o Physique : radioactivité, rayonnement
o Chimique : les ions et agitation thermique
B) Activité control-correction :
Par DNA polymérase I entour le DNA si il y’a des erreurs, elle va augmenter Le volume du DNA et bloque DNA polymérase III → activité 3’ exonucléasique.
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3’ 5’
5’ Brin direct
5’ Brin retardé
5‘ 3’ 5’ 3’ RNA Amorce (primase)
Origine de réplication
3’ 5’
5’
5’
5‘ 3’
Synthèse continue sur le brin direct Et discontinue sur le brin retardé
Ligature sur le brin retardé par des ligases
Original Néoformé Schéma générale de la réplication
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3’ 5’
ARN Polymérase
3’ 5’
RNA
Transcription
I) Généralité :
Synthèse de l’ARN à partir d’une molécule d’ADN grâce à l’ARN polymérase ADN Il existe les ARN messagers produit de transcription destinés à être traduit en protéines
Les RNA ribosomiques et RNA transfert ne sont pas destiné à traduit.
- Chez les procaryotes : un seul type de RNA polymérase
- Chez les eucaryotes : 3types de RNA polymérase spécifique chacune pour une classe de gènes :
o Gène de classe I → RNA ribosomique o Gènes de classe III → RNA de transfert o Gènes de classe II → RNA messager
II) Mécanisme de la transcription :
- La synthèse de sens 5’→3’ à partir du brin 3’→5’ d’ADN appelé brin sens = matrice - L’ARN polymérase se fixe sur une région : promoteur
A) Initiation :
1) Chez les procaryotes :
ARN polymérase se fixe au promoteur qui contient des séquences consensus séparé par une région d’ADN située à -10 et -35 en amont du site d’initiation
-35 -10
5’ 3’
3’ 5’
Promoteur
RNA polymérase Site d’initiation
L’enzyme forme un complexe fermé -35 et migre jusqu’à -10 l’ADN est déroulé pour former un complexe ouvert
5’ 3’
3’ 5’
NTP PP N
P P P N
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5’ 3’
3’ 5’
Initiation de la transcription chez les procaryotes 2) Chez les eucaryotes
Facteur se fixe dans une séquence (-25) puis le facteur se fixe, l’ARN polymérase + se fixe au complexe , les brins de DNA se séparent est forment un complexe ouvert, le facteur permet le démarrage de la transcription.
B) Elongation :
L’ARN polymérase allonge le brin par l’addition d’unités ribonucléotidiques à l’extrémité selon la réaction :
RNA RNA allongée
- Autour de la transcription l’ARN s’apparie au DNA pour former une courte longueur de double hélice hybride RNA-DNA
- Cette élongation est commune chez les eucaryotes et procaryotes.
C) Terminaison :
1) Chez les procaryotes :
- C’est une épingle à cheveux constituée de bases appariées sur le RNA nouvellement synthétisé riche en cytokines (C) et guanine (G)
- Le RNA se dissocie de RNA polymérase lorsque cette épingle à cheveux est suivie d’une succession de résidus uracile
5’ 3’
RNA messager
2) Chez les eucaryotes :
- L’ARNm synthétisé est clivé une vingtaine de base en aval d’une séquence AAU AAA Une nucléase va détacher la partie terminale du RNA et une Polymérase [A] synthétise une séquence Poly A
- Avant de sortir les RNAm vont subir au niveau du noyau des maturations afin de devenir mature pour une synthèse protéique N
20 bases
A A U A A A A A A A A A
5’ 3’
Coupure
Site de terminaison chez les eucaryotes G
C G C
G C
G P P P N
N N N
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D) Maturation du RNAm :
Chez les procaryotes : les ribosomes traduisent les RNAm alors q’uils sort en train d’être transcrit Chez les eucaryotes : la transcription et la traduction ont des endroits différents et des moments différents
- L’ARNm n’est pas sous sa forme définitive : la copie d’ADN est faite d’alternance de partie codon = EXON et de partie non codon Intron
- L’ARNm contient un chapeau *CAP+ guanosine triphosphate et une queue poly A - L’ARNm sera sectionné et les copies exon sont reliées entre elle => RNA mature
E) Maturation du RNAr :
Ils sont la copie de gènes ribosomaux grâce à la polymérase I sous forme de précurseur de 45S.
- Il existe 2 types de gènes ribosomaux :
L’un codon pour 45S et l’autre 5S qui servent modifiés pour fournir les RNAr : 28S- 18S, 5,8S provenant du 45S et le 5S
- Donc ils apparaissent sous forme de précurseur de grand taille puis subissent des clivages par des endonucléases pour aboutir a des RNAr mature
F) Maturation des RNAt :
Ils ne possèdent pas de structure de *CAP+, il a une extrémité 5’ triphosphate. La base terminale est une purine, leur promoteur est situé dans la partie codante.
Ils subissent de nombreux modifications 10% des bases tel que : Pseudo-uridine, inosine, méthyl guanosine
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Code ge ne tique
I- Définition :
Un motif de 3 bases = codon a une acide aminée Ex : AUG = méthionine, UAA, UAG, UGA = codon stop.
II- Code à 3 lettres :
- 4 bases par groupe de 3 donne = 64 combinaisons différents
- Les mots du code génétique= codon pour les acides aminés sont de triplets de nucléotides
III- Caractéristiques du code génétique :
A) Le code est universel :
Il est le même chez les eucaryotes et procaryotes B) Le code est dégénéré :
Un acide aminé est désigné par plus d’un codon.
Ex : leucine → 6codon, glycine → 4 codon.
Exception = méthionine → 1 codon *AUG+
C) Le code est non chevauchant :
- Le DNA est transcrit puis traduit [triplet par triplet
- Les codons sont lus en série depuis un point de départ jusqu’au point de terminaison sans chevauchement a quelque exception chez certain virus
Traduction la biosynthe se des acides amine s :
I- Définition :
Les acides aminés sont réunis les uns aux autres par des liaisons peptidiques d’après l’ordre porté par l’ARNm
C’est une traduction car en passe d’un langages a 4 lettres a un langage de 20 lettre [acides aminé]
Chez les procaryotes :
A lieu directement sur l’ARNm au fur et à mesure de leur synthèse Chez les eucaryotes :
Dans le cytosol
II- Les différentes étapes de la traduction : A) Initiation :
C’est la mise en place du premier acide aminé qui est N-terminal et la fixation du second. Elle se fait sur le codon d’initiation AUG porté par l’ARNm
Chez les procaryotes :
- Environ 10-2à bases de l’extrémité de l’ARNr se trouve dans le codon d’initiation *AUG+
14 | P a g e - L’ARNt initiateur incorpore la méthionine qui est transformé en N-Formyle méthionine à fin
d’empêche toute fixation de carboxyle au-dessus d’ARNt-f.m. il est placé dans le site P du ribosome.
- Le site A est vide, il recevra l’acide aminé-RNAt du codon suivant Chez les eucaryotes :
Un CBP (CAP Binding protéine) se lie au CAP du RNAm et aidé à la sélection du bon codon d’initiation qui est le premier codon AUG en aval du CAP
B) Elongation :
- Fixation des acides aminés les uns aux autres à partir de l’ADN terminal. L’attachement de l’AA-RNAt au site A dirigé par le acteur EF-TU (procaryotes) et EF-1 (eucaryote)
- Formation du lien peptidique entre F met-RNAt au site P et AA-RNAt au site A catalysé par peptidyl transférase
- La translocation du peptidyl-RNAt du site A au site P grâce au facteur EF-G (procaryotes) et le facteur EF-2 (eucaryotes)
RNAm
P A P A
AA2 AA2 AA3
AA1 AA1
Translocation
P A P A
AA3 AA3
AA2 AA2
AA1 AA1
Mécanisme de l’élongation
C) Terminaison :
- 3 Codon sont des signaux de terminaison des chaines : UAA-UAG-UGA - Il ne correspond pas D’ARNt et ne codent pas pour un acide aminée
- Les facteurs de terminaison = releasing factors = [RF] provoquent le détachement de la chaine peptidique
- Le *RF+ s’adapte au site A et empêche la mise en place d’autre RNAt
- Le [RF] modifie la spécificité de la peptidyl transférase qui accepte une molécule à la place de l’acide aminée entrainant la libération de la chaine peptidique
Formation de liaison peptidique Peptidyl transférase
Peptidyl-RNAt
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Outils de la biologie mole culaire
A) Les enzymes :
1°/ Enzymes qui coupent le DNA
Les enzymes de restriction (méthylase) les nucléases (DNAase I) (nucléase ) et exonucléase III 2°/ Les Enzymes qui ligaturent : ADN ligase, RNA ligase
3°/ Les enzymes qui déphosphorylent : phosphatase 4°/ Les enzymes qui recopient un acide nucléique DNA/DNA :
DNA polymérase I : enzyme de synthèse du DNA 5’ → 3’, 5’ →3’
Enzyme de KLENOW : comme la polymérase I mais activité à 65° « pour PCR » DNA/RNA
RNA polymérase transcription RNA/DNA
Retrotranscriptase (RT) : RNA dépendante, pas d’activité exonucléasique 3’→5’ et présente une activité RNAase. C’est un procédé de fabrication de CDNA (DNA complémentaire) à partir de RNAm
B) Les vecteurs :
Ils sont coupés par l’enzyme de restriction → TRT par des phosphatases → préparation d’un DNA à insérer → réalisation des recombinaisons grâce à la ligase → incorporation à l’hôte
Enzyme
de restriction 5’(P) 5’OH
3’OH 3’OH
Vecteur
Hôte
ADN inséré (ligase) 1) Les plasmides :
Les plasmides 1ère génération, 2ème génération (PBR 312/328) et de 3ème génération (PUC 8-19) et plasmides bleu-script
2) Les phages :
Ex : EMBL 3 et 4, phage monobrin -phage 3) Les cosmides :
Plasmides + séquence du phage permettant l’empaquetage et clonage des frayements très long 4) Les phagenides :
Phage +plasmide bleu script 5) Banque yac :
Yac : yeast articicial chromosome
C) Les sondes nucléotidiques :
Segments d’ADN ou ARNm complémentaire et antiparallèle au segment d’ADN à reconnaitre.
Obtention d’une sonde par CDNA, RNAm
Marquage d’une sonde : externe (kinase à l’extrémité 5’OH)
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Les techniques de la biologie mole culaire
1°/Séparation électrophorètique du DNA : Gel polyacrylamide (petit fragments verticales) Gel agarose (petit fragments horizontales)
2°/Purification des acide nucléiques par mélange phénol-chloroforme :
Le phénol dénature les protéines → centrifugation → surnageant acides nucléiques → phénol éliminé par chloroforme.
3°/ Séquençage de l’ADN :
Méthode Sanger, méthode Maxam et Gilbert.
4°/ Analyse du génome et ses modifications :
Méthode de southern : détection des pseudos gènes, délétions et mutations ponctuels
Autres méthodes : mise en évidence par RNAase, électrophorèse en gradient dénaturant, hybridation avec des oligosondes
5°/ analyse de l’expression du gène :
Analyse qualitative du transcrits : Norhen blot.
Analyse quantitative du RNA : Doth Blot.
