Manual de Laboratorio de la OMS para el examen
del semen humano
y de la interacción entre
el semen y el moco cervical
Manual de Laboratorio de la OMS para el examen
del semen humano
y de la interacción entre el semen y el moco cervical
Tercera edición
Publicado en inglé~ por Cambridge University Press para la ORGANIZACION MUNDIAL DE LA SALUD en 1992
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MARCELO T. DE ALVEAR 2145 - BUENOS AIRES
BOGOTÁ - CARACAS - MADRID· MÉXICO - SAO PAULO
Publicado por Cambridge University Press
para la Organización Mundial de la Salud en 1992 bajo el título WHO LABORATORY MANUAL FOR THE EXAMINATION
OF HUMAN SEMEN AND SPERM-CERVICAL MUCUS INTERACTION, 3rd ed.
© Organización Mundial de la Salud 1992
El Director General de la Organización Mundial de la Salud ha cedido los derechos de traducción para una edición en español a Editorial Médica Panamericana, que es la única responsable de la traducción.
Traducción de
EDITORIAL MÉDICA PANAMERICANA S.A.
efectuada por el
Dr. JORGE A. BLAQUIER
Director de Fertilab S.A., Biotecnología de la Reproducción
La mención de determinadas compañías o de ciertos productos manufacturados no implica que sean avalados o recomendados por la OMS en relación con otros de naturaleza similar que no se mencionan. Salvo error u omisión, los nombres de los productos registrados se mencionan con la primera inicial en mayúscula.
ISBN 950-06-1609-2 84-7903-208-1
IMPRESO EN LA ARGENTINA
Queda hecho el déposito que dispone la ley 11.723.
Todos los derechos reservados.
Este libro o cualquiera de su partes
no podrán ser reproducidos ni archivados en sistemas recuperables, ni trasmitidos en ninguna forma o por ningún medio,
ya sean mecánicos o electrónicos, fotocopiadoras, grabaciones o cualquier otro, sin el permiso previo
de Editorial Médica Panamericana S.A.
© 1994. EDITORIAL MÉDICA PANAMERICANA S.A.
Marcelo T. de Alvear 2145 - Buenos Aires, Argentina EDITORIAL MEDICA PANAMERICANA S.A.
Alberto Alcocer 24 - Madrid, España Esta edición se terminó de imprimir en el mes de junio de 1994
en los talleres de Editorial Médica Panamericana S.A.
"
Indice
Agradecimientos VIII
Abreviaturas X
1 Introducción
2 Recolección y examen del semen humano 3
2.A PROCEDIMIENTOS ESTÁNDAR 3
2.1 Recolección y envío de las muestras 3
2.2 Reglas de seguridad en el manejo de las muestras 4
2.3 Examen macroscópico inicial 4
2.3.1 Licuefacción
2.3.2 Aspecto 4 5
2.3.3 Volumen 5
2.3.4 Consistencia 2.3.5 pH 5
2.4 Investigación microscópica inicial 5 6
2.4.1 Preparación para el examen seminal de rutina 6
2.4.2 Graduación de la motilidad 6
2.4.3 Elementos celulares diferentes de los espermatozoides 7 2.4.4 AglutinaCión
2.5 Exámenes microscópicos adicionales 9 9
2.5.1 Vitalidad de los espermatozoides 9
2.5.2 Recuento de los espermatozoides 10
2.5.3 Análisis de las características m01fológicas de los espermatozoides 12 2.5.4 Metodos de tinción para los espermatozoides humanos 16 2.5.5 Prueba para la detección de anticuerpos unidos a la superficie de los
espermatozoides 17
2.B PRUEBAS OPTATIVAS 18
2.6 Cultivo del semen 19
2.7 Análisis bioquímico 19
2.7.1 Plasma seminal 19
2.8 Células germinales inmaduras 20
2.C PRUEBAS DE INVESTIGACIÓN 20
2.9 Pruebas funcionales del espermatozoide 20
2.9.1 Espermatozoides 20
2.9.2 Prueba de penetración del ovocito de hámster sin zona pellucida 20
2.9.3 Pruebas de unión a la zona pellucida humana 22
2.9.4 Determinación de la reacción acrosomal 22
2.10 Análisis seminal asistido por computadora (ASAC) 23
2.10.1 Introducción 23
2.10.2 Medidas obtenidas por ASAC 23
3 Interacción espermatozoides - moco cervical 24
3.1 Introducción 24
3.2 Recolección y conservación del moco cervical 25
3.2.1 3.2.2 3.3 3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.4 3.3.5 3.3.6 3.4 3.4.1 3.4.2 4 5 5.1 5.2 5.3
lA lB 11 III IV V VI VII VIII IX
X XI XII XIII XIV XV XVI XVII XVIII XIX XX XXI XXII XXIII XXIV XXV
Recolección
Almacenamiento y conservación Evaluación del moco cervical Volumen
Consistencia Helechos Spinnbarkeit Celularidad pH
Interacción espermatozoides - moco cervical Prueba in vivo (prueba poscoital)
Pruebas in vitro
Técnicas para la preparación de espermatozoides Control de calidad del análisis seminal
Introducción Control interno Metodología Apéndices
Valores normales de las variables del semen Nomenclatura de algunas variables del semen
Medidas de seguridad para el Laboratorio de Andrología Métodos para la detección de leucocitos
Técnicas de tinción vital para espermatozoides
Morfología diferencial del espermatozoide: preparados frescos Tinción de Giemsa para espermatozoides y otros núcleos celulares Tinción de Papanicolau modificada para espermatozoides
Tinción de Bryan-Leishman en extendidos para morfología de los espermatozoides
Tinción de Shorr en extendidos para morfología de los espermatozoides Formulario de registro para análisis de semen
Prueba de las Immunobeads
Pruebas de las antiglobulinas mixtas (MAR) Medición del cinc en plasma seminal
Determinación de ácido cítrico en plasma seminal Determinación de fosfatasa ácida en plasma seminal Determinación de fructosa en plasma seminal humano Determinación de a-glucosidasa neutral en plasma seminal
Prueba de la hinchazón de los espermatozoides en medio hipoosmótico Protocolos para la prueba de penetración del ovocito de hámster sin zona pellucida
Análisis seminal asistido por computadora (ASAC)
Instrucciones a los pacientes para preparar la prueba poscoital Interacción espermatozoide-moco cervical: la prueba del tubo capilar Procedimiento estándar para contar células y espermatozoides
en moco cervical
Técnicas para la preparación de espermatozoides
Requerimientos básicos para un laboratorio de andrología Bibliografía
25 26 27 28 28 28 28 29 29 29 29 31 34 35 35 35 35
36 37 38 40 43 44 45 46 49 51 52 54 56 57 59 60 62 64 66 67 71 75 77 79 81 83
85
Agradecimientos
El programa Especial de Investigación, Desarrollo y Capacitación de Investigación en Reproduc- ción Humana de la OMS, desea agradecer la participación activa de los siguientes autores en to- das las etapas de la recopilación y corrección de la tercera edición del Manual de Laboratorio para el examen del semen humano y de la interacción entre el semen y el moco cervical:
Dr. R. J. Aitken
MRC Reproductive Biology Unit Center for Reproductive Biology 37 Chalmers Street
Edinburgh EH3 9EW United Kingdom Dr. A. Aribarg
Department of Obstetrics and Gynaecology Chulalongkorn Hospital Medical School Rama 4 Road
Bangkok 10500 Thailand
Dr. K. Gopalkrishnan
Institute for Research in Reproduction (ICMR) Jehangir Merwanji Street
Parel
Bombay 400 012 India
Dr. D. W. Hamilton
Department of Cell Biology and Neuroanatomy 4-135 Jackson Hall
Minneapolis, Minnesota USA
Dr. D. F. Katz
Department of Obstetrics and Gynecology Division of Reproductive Biology and Medicine University of California
Davis, CA 95616 USA
Dr. D. Mortimer Sydney IVF
183 Macquarie Street Sydney, NSW 2000 Australia
Dr. E. Nieschlag
Institute for Reproductive Medicine of the University
Steinfurterstrasse 107 0-4400 Münster Germany
Dr. C. Sekadde-Kigondu
Department of Obstetrics and Gynaecology Kenyatta National Hospital
University of Nairobi P.O. Box 19676 Nairobi
Kenya Dr. C. Wang
Divisions of Endocrinology Metabolism & Reproductive Endocrinology
Cedars-Sinai Medical Center 444 South San Vicente Blvd Los Angeles, CA 90048 USA
Dr. G. M. H. Waites
Special Programme of Research, Development and Research Training in Human Reproduction World Health Organization 1211 Geneva 27
Switzerland Dr. C.H. Yeung
Institute for Reproductive Medicine of the University
Steinfurterstrasse 107 0-4400 Münster Germany
Han hecho valiosas colaboraciones en determinados aspectos del Manual, los siguientes autores:
Dr. D. M. Phillips Population Council 6th floor
Tower Building
1188 York Avenue at 64th Street New York, NY
USA
Dr. T. M. M. Farley, Dr. P. J. Rowe, and Dr. P. F. A. Van Look Special Programme of Research,
Development and Research Training in Human Reproduction World Health Organization 1211 Geneva 27
Switzerland
A23187 AID
BBT
AIHBSA
ASAC CFU CI DMSO
DTT
EDTA
GIFT hCG HIV HOPT HOS HPF
HSA
HZA
IBT
Ig IU IVF MAR
NADH PBS
PCT PMS
PNP
SCMC SMIT SPA
TBS
TCA U WBC
Abreviaturas
un ionóforo de calcio
inseminación artificial con semen de dador inseminación artificial con semen del marido temperatura corporal basal
albúmina sérica bovina (fracción V de Cohn) análisis seminal asistido por computadora unidades formadoras de colonia
índice de color dimetilsulfóxido ditiotreitol
etilendiaminatetracetato
transferencia intratubaria de gametas gonadotrofina coriónica humana virus de la inmunodeficiencia humana
prueba de penetración de ovocitos de hámster
prueba de la hinchazón de los espermatozoides en medio hipoosmótico
campo microscópico de gran aumento (400 x) albúmina sé rica humana (fracción V de Cohn) ensayo de la hemizona pellucida
prueba de las Immunobeads inmunoglobulina
unidad internacional * fertilización in vitro
reacción de las antiglobulinas mixtas
nicotinamida adenina dinucleótido (forma reducida) solución salina con buffer de fosfatos
prueba poscoital
suero de yegua preñada paranitrofenol
contacto espermatozoide-moco cervical
prueba de interacción espermatozoide-moco cervical prueba de penetración de ovocitos de hámster (sinónimo de HOPT)
solución salina con buffer Tris ácido tricloroacético
unidad (internacional)*
glóbulo blanco (leucocito)
• IU para enzimas se refiere a la conversión de 1 ¡.tmol de sustrato por minuto a 37°C
1
Introducción
En respuesta a una creciente necesidad para la estandardización de los procedi- mientos para el examen del semen humano, la Organización Mundial de la Salud publicó el Manual para el Examen del Semen Humano y la Interacción del Semen con el Moco Cervical en 1980. A esta le siguió una segunda edición en 1987. Estas publicaciones han sido utilizadas ampliamente por médicos e investigadores de to- do el mundo. De hecho, la segunda edición fué traducida a siete idiomas: árabe, chino, alemán, indonesio, italiano, español y ruso. En estos años el conocimiento en el campo de la andrología avanzó rápidamente. Este hecho, junto a la creciente demanda para estandardizar otras variables del semen, nos llevó a preparar esta ter- cera edición revisada.
Esta edición aparece en un momento pleno de nuevas expectativas. La medición objetiva de variables sigue siendo tan importante como antes para la regulación de la fertilidad, la infertilidad la investigación y su tratamiento y para los nuevos pro- cedimientos de reproducción asistida.
Sin embargo, un renovado interés en la evaluación funcional de los espermato- zoides residuales en estudios de contracepción (por ejempló, ver OMS 1990) y la creciente preocupación sobre los posibles efectos de la poluéión ambiental sobre la función reproductiva agregan un toque de urgencia a la búsqueda de nuevos y me- jores métodos para analizar el semen humano.
Por estas razones, el Programa Especial para la Investigación, Desarrollo y En- trenamiento en Reproducción Humana de la OMS convocó a un grupo de expertos (ver Agradecimientos) para revisar el Manual. La presente edición, con su títuio-ie- vemente modificado a Manual de Laboratorio de la OMS para el Examen del Se- men Humano y de la Interacción entre el Espermatozoide y el Moco Cervical, se complementa con el Manual de la OMS para la Estandardización en la Investiga- ción y Diagnóstico de la Pareja Infértil, de próxima aparición.
El capítulo 2 de este Manual, referido al examen del semen humano, ha sido di- vidido en tres grandes partes. La primera parte describe los procedimientos consi- derados esenciales para la evaluación del semen (secciones/2A: 2.1 a 2.5). La se- gunda describe los análisis opcionales (sección 2B: 2.6 a 2.8) mientras que la ter- cera se refiere a aquellas pruebas que aún requieren mayor evaluación y por lo tan- to son consideradas como herramientas de investigación (sección 2C: 2.9 a 2.10).
Algunos de los procedimientos descritos como opcionales en la edición anterior han sido reemplazados por otros. Por ejemplo, la tinción simplificada de Papanico- laou ha sido reemplazada por la tinción de Shorr. Entre los métodos bioquímicos para el análisis del semen, se eliminó la determinación de adenosinatrifosfato (ATP) y se incorporó la determinación de fosfatasa ácida y de a-glucosidasa neu- tral. Estos cambios reflejan una actualización según las prácticas de uso corriente en los laboratorios de andrología. De manera similar, el análisis seminal asistido
por computadora para medir la motilidad espermática ha sido incluido en la sec- ción 2e como ejemplo de uno de los varios nuevos métodos de investigación que se emplean en muchos laboratorios en los países desarrollados. Si bien algunos es- tudios sugieren que este método puede discriminar entre muestras de semen de di- ferente calidad, su certeza y precisión no son aún satisfactorias y no existe un pro- tocolo estándar para su utilización.
El capítulo 3, referido a la interacción espermatozoide-moco cervical, práctica- mente no ha sido modificado. Por otra parte, se agregaron dos nuevos capítulos: el capítulo 4 que trata sobre técnicas para la preparación de espermatozoides y el ca- pítulo 5 referido al control de calidad en el análisis del semen. Ambos capítulos son breves pero introducen nuevas técnicas y procedimientos de estandardización interlaboratorios que son de importancia y deben ser desarrollados.
La inclusión de dos nuevos apéndices, el Apéndice II sobre reglas de seguridad y el Apéndice XXV acerca de los requerimientos básicos del laboratorio de andro- logía, reflejan la preocupación por el manejo seguro de las muestras y la necesidad de contar con un equipamiento mínimo apropiado para este trabajo.
Finalmente, se debe enfatizar que el principal propósito de este manual es pro- mover el uso de procedimientos estándar para el análisis del semen. Esto permitirá la comparación de datos entre diferentes laboratorios y la sumatoria de resultados de diferentes fuentes para su análisis. La atención a los detalles de los procedi- mientos estándar debería mejorar su precisión y reproducibilidad. Se mantiene el principal objetivo de las ediciones anteriores: proveer un manual de laboratorio que atienda las necesidades de los médicos e investigadores de los países en desa- rrollo.
2
Recolección y examen del semen humano
El semen normal es una combinación entre los espermatozoides, suspendidos en las secreciones del testículo y epidídimo, y las secreciones de la próstata, vesículas seminales y glándulas bulbouretrales que se mezclan con aquella en el momento de la eyaculación. El producto final es un líquido viscoso denominado eyaculado. La recolección y examen del semen deben ser realizados mediante técnicas estandari- zadas si se pretende que los resultados provean información válida acerca de la fer- tilidad del individuo. Este capítulo y sus apéndices correspondientes (III-XX) des- criben los métodos utilizados con este propósito. Éstos han sido divididos en pro- cedimientos estándar, opcionales y de investigación.
2.A PROCEDIMIENTOS ESTÁNDAR 2.1 Recolección y envío de las muestras
Se entregará al paciente una hoja de instrucciones escrita con claridad sobre la manera de recoger el semen y trasladarlo.
a) Lo ideal es recoger la muestra después de 48 horas y no más de siete días de absti- nencia sexual. En el formulario que acompaña a cada análisis de semen se debe anotar el nombre del paciente, el período de abstinencia, así como la fecha y la ho- ra de la recolección (Apéndice X).
b) Para hacer la evaluación inicial se deben recoger dos muestras de semen. El tiempo transcurrido entre las recolecciones depende de las circunstancias locales, pero no debe ser menor de siete días ni mayor de tres meses. Si los resultados de estas eva- luaciones son muy distintos, se ensayarán más muestras de semen pues dentro de un mismo individuo pueden ocurrir variaciones importantes en la producción de espermatozoides (fig. 2-1).
c) Lo ideal es que la muestra se recoja en la intimidad de una dependencia próxima al laboratorio. De lo contrario, se la debe enviar al laboratorio antes de transcurrida una hora de recolección y si la motilidad de los espermatozoides es anormalmente baja (menos del 25% con progresión lineal rápida, véase Sección 2.4.2), examínese una segunda muestra lo antes posible después de la recolección. Si se van a realizar pruebas de la función de los espermatozoides, como el ensayo de penetración del ovocito de hámster, es fundamental separar a los espermatozoides del plasma semi- nal antes de la hora de la producción del eyaculado (Apéndice XIX).
d) La muestra debe obtenerse mediante masturbación y eyacularse dentro de un reci- piente de vidrio o plástico de boca ancha que esté limpio; si se usa plástico, verifí- quese la ausencia de efectos tóxicos sobre los espermatozoides. El recipiente debe estar tibio para reducir a un mínimo el riesgo de shock por frío. Si se va a hacer un análisis bacteriano, el paciente debe orinar y luego lavarse y enjuagarse las manos y el pene antes de recoger la muestra en un recipiente estéril (Sección 2.6).
Fig. 2·1. Concentracio- nes de espermatozoides en el líquido seminal de un individuo obtenidas quincenalmente durante un período de 120 sema- nas. En este período el individuo no recibió nin- guna medicación y no tu- vo episodios de enferme- dad febril. La línea entre- co¡¡tada indica 20 x 10 Iml, que se suele con- siderar el límite inferior de lo normal (véase Apéndice I.A). (Datos inéditos de C. A. Paul- sen.)
180
E
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O
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x 120
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ID 80ID ID
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OC ID
60
40 20 10 O
O 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 Meses
e) Por lo general, no se deben usar condones para recoger semen porque pueden com- prometer la viabilidad de los espermatozoides. Cuando por circunstancias especia- les no fuera posible obtener el semen mediante masturbación, existen condones de plástico específicos para este fin (Zavos, 1985).
El coitus interruptus no es aceptable para hacer la recolección del semen, porque puede perderse la primera porción del eyaculado, que suele contener la mayor con- centración de espermatozoides. Además, habrá contaminación celular y bacterioló- gica de la muestra y el pH ácido del líquido vaginal ejercerá una influencia adversa sobre la motilidad de los espermatozoides.
f) Las muestras incompletas no se deben analizar, en particular si se pierde la primera porción del eyaculado.
g) La muestra debe protegerse de las temperaturas extremas (no menos de 200C ni más de 40°C) durante el traslado al laboratorio.
h) El recipiente debe rotularse con el nombre del sujeto, la fecha y hora de la recolec- ción y la duración de la abstinencia.
2.2 Reglas de seguridad en el manejo de las muestras
El personal de laboratorio debe saber que las muestras de semen pueden conte- ner virus patógenos (por ejemplo, HIV, virus de la hepatitis y del herpes) y por consiguiente deben ser manejadas con cuidado. Las reglas de seguridad descritas en el apéndice II deben ser observadas estrictamente. La cuidadosa aplicación de buena técnica en el laboratorio es fundamental para la seguridad del operador y no puede ser reemplazada por equipos especiales (OMS, 1983).
2.3 Examen macroscópico inicial 2.3.1 Licuefacción
Una muestra de semen normal se licúa dentro de los 60 minutos de la eyacula- ción, a temperatura ambiente. En algunos casos la licuefacción no es completa a los 60 minutos y esto debe ser informado. La presencia de hilos de moco, señal de licuefacción incompleta, puede interferir con el recuento celular. El semen normal
puede contener gránulos gelatinosos que no se licúan y cuya significación no es conocida.
Ocasionalmente las muestras no se licúan y deben ser sometidas a algún trata- miento adicional (mezclado mecánico, exposición a bromelina 19lL, a plasmina 0,35-0,5 unidades caseína/mio a quimotripsina 150 USP/ml) a fin de poder conti- nuar con su análisis. El efecto de estos trátámientos sobié-la función espermática y la bioquímica del plasma seminal son aún desconocidos.
La muestra debe ser mezclada cuidadosamente en el recipiente original. Un mezclado incompleto es la principal causa de error en el recuento de espermatozoi- des. Un mezclado continuo mediante la rotación del recipiente durante el tiempo de licuefacción contribuye a disminuir este error (de Ziegler y col., 1987)
2.3.2 Aspecto
La muestra de semen debe ser examinada inmediatamente luego de su licuefac- ción o dentro de los 60 minutos de eyaculada, por simple inspección a temperatura ambiente. Una muestra normal tiene una apariencia homogenea gris-opalescente.
Puede aparecer menos opaca cuando la concentración de espermatozoides es muy baja y marrón cuando contiene glóbulos rojos.
2.3.3 Volumen
El volumen del eyaculado debe ser medido en un cilindro graduado de base có- nica o por aspiración de la muestra completa en una pipeta, utilizando un aparato de aspiración mecánica (ver apéndice XXV). Si la muestra será utilizada para un espermocultivo, un bioensayo, inseminación intrauterina o fertilización in vitro, se debe utilizar material estéril para su manejo. Las jeringas plásticas y agujas de in- yección no deben ser utilizadas para este propósito pues alteran la calidad del se- men, especialmente la motilidad.
2.3.4 Consistencia
La consistencia de la muestra licuada (a menudo denominada "viscosidad") pue- de ser estimada aspirando la muestra en una pipeta de 5 mI y permitiendo la libre caída de gotas, en las que se observa la longitud del filamento formado. En una muestra normal se observan gotas pequeñas y bien definidas mientras que en una muestra de consistencia aumentada se formará un filamento mayor de 2 cm. Como método alternativo, la consistencia se puede evaluar introduciendo una varilla de vidrio en la muestra y observando la longitud del filamento que se forma al retirar- la. Éste no debe exceder los 2 cm.
Una consistencia anormal, por ejemplo debida a un alto contenido de moco, pue- de interferir con la determinación de varias de las características del semen, como ser la motilidad y concentración, y también con las pruebas para la detección de anticuerpos unidos a la superficie de los espermatozoides.
2.3.5 pH
Se distribuye una gota de semen sobre papel de pH (rango 6,1 a 10). Al cabo de 30 segundos el color de la zona impregnada debe ser uniforme y se compara con la cartilla de calibración para determinar el pH de la muestra.
Todo tipo de papel de pH utilizado para este análisis debe ser controlado con es- tándares de pH conocido antes de ser usado.
El pH de la muestra debe ser medido dentro de los 60 minutos de la eyaculación y debe caer en el rango 7,2 a 8,0. Cuando el pH es menor de 7,0 en una muestra con azoospermia se debe sospechar disgenesia del conducto deferente, las vesícu- las seminales o el epidídimo.
2.4 Investigación microscópica inicial
Durante el examen microscópico inicial de la muestra se realiza una estimación de la concentración y motilidad de los espermatozoides, de la presencia de agluti- nación y de otras células.
Aun cuando se puede utilizar un microscopio óptico corriente para el examen de la muestra en fresco, en especial si se aleja el condensador para dispersar la luz, re- comendamos fuertemente el uso de un microscopio con óptica de contraste de fase para todo examen de muestras no teñidas, ya sea semen fresco o espermatozoides lavados.
2.4.1 Preparación para el examen seminal de rutina
Un pequeño volumen de semen (no mayor de 10 pi) se deposita en un portaob- jeto y se cubre con un cubreobjeto de 22 x 22 mm. Es importante que la cantidad de semen depositado y el tamaño del cubreobjeto utilizado sean siempre los mis- mos para que todos los exámenes se realicen en una preparación del mismo espe- sor (aproximadamente 20 ¡.Lm). Esta profundidad permite la expresión completa del movimiento rotatorio de los espermatozoides normales.
Este preparado se examina con una magnificación de 400x o 600x. El peso del cubreobjeto distribuye la muestra para una visión óptima y se debe penni- tir la estabilización de la misma durante un minuto. Dado que la motilidad y velocidad de los espermatozoides son muy dependientes de la temperatura, es- tas determinaciones deben hacerse a una temperatura tan próxima a los 37°C como sea posible, por ejemplo mediante la utilización de una platina termosta- tizada u otro elemento que cumpla esta función. El resto del examen debe ser realizado a temperatura ambiente, procurando estandardizar ésta entre los 20 y 24°C.
Cuando el número de espermatozoides varía considerablemente entre campos visuales significa que la muestra no es homogénea y que el semen debe ser mezcla- do cuidadosamente. La falta de homogeneidad en la muestra también puede ser el resultado de una licuefacción incompleta, consistencia anormal, de la aglutinación de los espermatozoides o de su agregado sobre hilachas de moco. Estas observa- ciones deben ser anotadas en el informe.
Cuando el número de espermatozoides es muy bajo, la muestra debe ser centri- fugada. Un volumen conocido de semen (el máximo que permita el eyaculado) es centrifugado a 600 g por 15 minutos y luego se retira un volumen conocido de plasma seminal. La muestra se mezcla nuevamente y luego se cuenta como se describe en la sección 2.5.2. La concentración final es corregida al volumen ini- cial. Las determinaciones de motilidad y morfología también se efectúan en la muestra concentrada.
2.4.2 Graduación de la motilidad
Varias técnicas para la determinación objetiva de la motilidad espermática se han desarrollado en años recientes. En este manual recomendamos el uso de un sis-
tema sencillo de graduación que provee una excelente determinación de la motili- dad sin requerir equipamiento complejo. Aquellos interesados en un estudio deta- llado de la motilidad encontrarán su descripción en la sección 2.10.
El campo microscópico es recorrido sistemáticamente y la motilidad de cada espermatozoide observado se clasifica en a, b, c, o d, según el siguiente esquema:
a motilidad progresiva rápida b motilidad progresiva lenta c motilidad no progresiva d inmóviles
Usualmente hace falta contar 4 a 6 campos para acumular 100 espermatozoi- des y obtener un porcentaje de cada categoría. Se repite la cuenta con otros 100 espermatozoides y se obtiene un promedio para cada categoría, que luego será informado.
Es recomendable repetir este recuento de la motilidad en una segunda gota de semen preparada de la misma manera. Los resultados de ambos recuentos, si no difieren en más del 10%, se promedian. Para verificar si se cumple este criterio, se suman los porcentajes de categorías a, b y c (motilidad total) y se establece que la suma de los valores de las dos muestras no difiera en más de l/20 entre cada recuento. En aquellas muestras en que la motilidad total sea menor al 50%, se compara el porcentaje de espermatozoides clase d entre am- bos recuentos. Cuando la diferencia en el recuento es superior al 10% se debe preparar y contar una tercera gota y estos resultados se promedian con los dos anteriores.
2.4.3 Elementos celulares diferentes de los espermatozoides
El eyaculado siempre contiene células diferentes de los espermatozoides. Encon- tramos células epiteliales del tracto uretral, células de la espermatogénesis y leuco- citos. Estas células han recibido el nombre genérico de "células redondas". Su con- centración puede ser determinada en las preparaciones frescas utilizando un hemo- citómetro.
Los leucocitos están presentes en la mayoría de los eyaculados humanos (Wolff y Anderson, 1988 a,b; Aitken y West, 1990; Barratt y col., 1990), con predominancia de los neutrófilos. La determinación precisa del número de leu- cocitos es importante porque un número excesivo (situación conocida como
"leucocitospermia) sugiere la existencia de una infección del tracto reproducti- vo que debe ser tratada. Además, la leucocitospermia puede estar asociada con otros defectos del semen como ser: reducción en el volumen del eyaculado y en la concentración y motilidad de los espermatozoides, pérdida de la funcio- nalidad espermática a causa de una agresión oxidativa (Aitken y col., 1989;
Aitken y West, 1990) y/o por la secreción de citoquinas citotóxicas (Hill y col., 1987)
Es difícil establecer una concentración límite de leucocitos, por encima de la cual la fertilidad del semen pueda estar comprometida. El impacto de estas células depende del sitio en que se incorporan al semen, su tipo celular y su estado de acti- vación. Debido a la susceptibilidad del espermatozoide humano a la agresión oxi- dativa, la presencia de neutrófilos es probablemente deleterea, en especial si la in- filtración ocurre a nivel de la rete testis o del epidídimo. En contraste, el ingreso de los leucocitos en el momento de la eyaculación, por vía prostática o de las vesícu-
Fig. 2·2. Leucocitos en el semen humano teñidos con un anticuerpo mono- clonal dirigido contra CD45, el antígeno co- mún de los leucocitos (ver apéndice HI.2).
las seminales, es considerada como menos dañina debido al potente efecto antioxi- dante del plasma seminal (Jones y col., 1979). Como regla general, un eyaculado normal debe contener menos de 5 X 106 células redondas/mi y el número de leuco- citos no debe exceder l x 106/ml.
Se han desarrollado varias técnicas para la cuantificación de leucocitos en el se- men. Por ejemplo el uso de criterios bioquímicos, como la determinación de elasta- sa usando ELISA, tienen cierto valor (Wolff y col., 1990). En el Apéndice III se describen dos técnicas histológicas para la identificación de leucocitos. Una se ba- sa en la presencia de peroxidasa intracelular y la otra en la existencia de antígenos específicos de los leucocitos. Debe notarse que la técnica de la peroxidasa da valo- res menores que aquellos obtenidos con anticuerpos monoclonales anti-leucocitos (fig. 2.2).
La relación entre el número de leucocitos en el semen y la existencia de infec- ción del tracto genital es el origen de controversias. Cuando el número de leucoci- tos excede 1 X 106/ml se deben practicar análisis mjcrobiológicos para investigar la existencia de infección de las glándulas anexas. Estos estudios deben incluir el pri- mer y segundo chorro urinario, el fluido prostático obtenido por masaje y la orina posterior al masaje (Meares y Stamey, 1972). Se debe incluir tambien el análisis bioquímico del plasma seminal, ya que la infección frecuentemente altera la fun- ción secretoria (Sección 2.7; Comhaire y col., 1980). Sin embargo, la ausencia de leucocitos en el semen no excluye la posibilidad de infección de las glándulas ac- cesorias.
Las células redondas no identificadas como leucocitos incluyen las espermáti- des, espermatocito s y espermatogonias. Debido a que sólo se incluyen los esper- matozoides (células germinales maduras, con cola) en el recuento, la concentración de las otras células germinales y los leucocitos pueden ser calculados de manera re- lativa a aquellos.
Si N es la cantidad de un tipo celular dado contado en los mismos campos que 100 espermatozoides y si S es el recuento de espermatozoides en millones por mi, se puede calcular la concentración de la célula dada en millones por mi (e) con la siguiente fórmula, puesto que la relación entre el número de células
y el número de espermatozoides se considera igual en el extendido y en el se- men:
c=
NxS 100Por ejemplo, si la cantidad de células germinales inmaduras es 10 por 100 esper- matozoides contados y si el recuento del semen es 120 x 106/ml, la concentración de células germinales inmaduras es:
10
x
120 X 106= Por mililitros = 12 millones/mi 100
2.4.4 Aglutinación
La aglutinación de los espermatozoides significa que los espermatozoides móvi- les se adhieren entre ellos cabeza con cabeza, pieza intermedia con pieza interme- dia, cola con cola o de otras maneras, como pieza intermedia con cola. A la adhe- rencia de espermatozoides inmóviles o móviles con filamentos de moco, con célu- las que no son espermatozoides o con detritos no se la considera aglutinación y no se la debe anotar como tal.
La presencia de aglutinación sugiere la existencia de una causa inmunológica de la infertilidad, pero no es evidencia suficiente para probarla. La aglutinación se de- termina en 10 campos microscópicos elegidos al azar. El número promedio de es- permatozoides aglutinados entre sí se estima con un error menor al 5%. El porcen- taje de espermatozoides aglutinados puede ser un dato de importancia. Sin embar- go, aun la presencia de unos pocos espermatozoides aglutinados debe ser informa- da. El tipo de la aglutinación: cabeza-cabeza; cola-cola o mixto también debe ser informado.
2.5 Exámenes microscópicos adicionales 2.5.1 Viabilidad de los espermatozoides
La viabilidad espermática refleja la proporción de los espermatozoides totales que estan "vivos" de acuerdo al criterio de exclusión de algún colorante vital o me- diante la expresión de su capacidad osmorreguladora cuando se los expone a con- diciones hipoosmóticas.
2.5.1.1 Tinción supravital
Si la cantidad de espermatozoides inmóviles supera el 50% se puede determinar la proporción de espermatozoides vivos con técnicas de tinción supravital. Estas técnicas se basan en el principio de que las células muertas cuyas membranas plas- máticas están dañadas, permiten la entrada del colorante. Existen dos de estos mé- todos: el uso de eosina sola en preparados frescos o una combinación de nigrosina y eosina en preparados secos. En el Apéndice IV se dan los detalles de los protoco- los para realizar estas técnicas.
Se cuentan cien espermatozoides con el microscopio óptico o de contraste de fa- se, diferenciando a los espermatozoides vivos (no coloreados) de los muertos (co- loreados). Estas técnicas de tinción supravital permiten diferenciar a los espermato- zoides inmóviles pero vivos de los que están muertos.
Estas técnicas también sirven para verificar la exactitud de la evaluación de la motilidad, porque el porcentaje de células muertas no debe ser mayor que el de es- permatozoides inmóviles. Además, la presencia de gran proporción de células vi- vas pero inmóviles puede significar que existen defectos estructurales en el flagelo.
El procedimiento para contar los espermatozoides en la cámara del hemocitóme- tro es el siguiente: el cuadrado central de la rejilla del hemocitómetro de Neubauer mejorado contiene 25 cuadrados grandes, cada uno de los cuales contiene 16 cua- drados más pequeños (fig. 2-3); para las muestras que contienen menos de 10 es- permatozoides por cuadrado se debe contar toda la rejilla, es decir, 25 cuadrados;
para las que contienen 10 a 40 espermatozoides por cuadrado pueden estudiarse 10 cuadrados, y para las que contienen más de 40 espermatozoides por cuadrado es suficiente analizar cinco cuadrados. Si un espermatozoide está en la línea que divi- de a dos cuadrados adyacentes, sólo se lo debe contar si está en el lado superior o izquierdo del cuadrado que se estudia.
2.5.1.2 Prueba de la hinchazón de los espermatozoides en medio hipoosmótico (HOS) Éste es un ensayo muy simple basado en el principio de la semipermeabilidad de la membrana plasmática intacta. El influjo de agua que se produce al exponer los espermatozoides a un medio hipoosmótico produce la "hinchazón" de las células por expansión del volumen celular (Drevius y Eriksson, 1966). Presentado como un test clínico por Jeyendran y col. (1984), el HOS no debe ser usado como un examen funcional sino como un análisis adicional de vitalidad. Es simple de reali- zar e interpretar y brinda información adicional sobre la integridad y función de la membrana de la cola del espermatozoide. La técnica para su realización se describe en el Apéndice XVIII.
2.5.2 Recuento de los espermatozoides
La concentración de espermatozoides puede determinarse con el método del he- mocitómetro. En este procedimiento se prepara una dilución 1 :20 con cada muestra homogénea mezclando bien 50 ¡.tI de semen licuado con 950 ¡.tI de diluyente. Este último consiste en 50 g de NaHC03' 10 mI de formalina al 35% (v/v) (optativa- mente se pueden incluir 5 mI de solución acuosa saturada de violeta de genciana o 0,25 g de azul trypan) yagua destilada en cantidad suficiente para obtener un volu- men final de 1.000 mI. No es necesario incluir el colorante si se hará microscopia de contraste de fase.
Si el examen preliminar del semen indica que la concentración de espermatozoi- des es demasiado grande o demasiado baja, se debe ajustar el grado de dilución de la muestra como corresponda.
Así, para las muestras que contienen menos de 20 X 106 espermatozoides/mi, se puede emplear una dilución 1: 10 mientras que para las que contienen más de 100 X
106 espermatozoides/mI corresponde una dilución 1 :50.
La muestra diluida se debe mezclar muy bien y luego se pasa una gota a un he- mocitómetro convencional y se cubre con el cubreobjeto. Déjese el hemocitómetro en reposo por uno a cinco minutos, con preferencia en una cámara húmeda para re- ducir a un mínimo el secado. En este tiempo las células sedimentan y luego se
Fig. 2-3. La grilla central de una cámara de Neubauer mejorada con- tiene 25 cuadrados en los cuales se cuentan los es- permatozoides (ver el texto y el cuadro 2-1 l.
cuentan en el microscopio óptico o de contraste de fase con una magnificación de 100 x 0400 x. Sólo se cuentan los espermatozoides (células germinales morfológi- camente maduras con colas). Los espermatozoides sin cabeza y las cabezas sin cola no se cuentan.
Las pipetas para glóbulos blancos y las micropipetas que funcionan por despla- zamiento de aire no son suficientemente precisas para hacer una dilución volumé- trica de un material tan viscoso como el semen. Se deben utilizar las micropipetas del tipo de desplazamiento positivo (ver Apéndice XXV).
Se cuentan ambas cámaras del hemocitómetro y se calcula un promedio de am- bos recuentos, siempre que la diferencia entre ellos no exceda el 10%. En el caso de que los recuentos difieran en más de un 10%, ambos se descartan y se prepara una nueva dilución.
Para determinar la concentración de espermatozoides, en millones/mI del semen original, se divide el promedio del recuento por el factor de conversión que aparece en el cuadro 2.1. Por ejemplo, si la muestra fue diluida 1 + 19 Y se contaron 162 y 170 espermatozoides en 10 cuadrados grandes de cada cámara, la concentración de espermatozoides en la muestra original es de 83 x 106/ml (166 dividido 2). Para otros hemocitómetros hay diferentes factores de corrección que dependen del volu- men de cada cuadrado en su retículo.
Un procedimiento opcional para determinar la concentración de espermatozoi- des es la utilización de cámaras especiales. Aunque el uso de la cámara de Makler (Makler, 1980) o la cámara Microcell (Ginsburg y Armant, 1990) es conveniente debido a que no requieren dilución de la muestra, no tienen la precisión de la técni- ca del hemocitómetro, en especial para muestras muy heterogéneas o con la visco- sidad aumentada. Cuando se las utiliza, se debe determinar su precisión mediante la comparación con el hemocitómetro.
Cuadro 2-1. Factores de corrección para /¡emocitometría Dilución
(semen + diluyente) 1+9
1 + 19 1 +49
De Mortimer, 1985.
NlÍmero de cuadrados grandes contados
25 JO 5
10 4 2
5 2 1
2 0,8 0,4
11
2.5.3 Análisis de las características morfológicas de los espermatozoides
Aun cuando la variabilidad de la morfología de los espermatozoides hace dificil hacer un recuento diferencial entre formas normales y anormales, las observacio- nes de espermatozoides seleccionados naturalmente en el tracto genital femenino, en especial por el moco cervical, han permitido definir el aspecto de un espermato- zoide normal.
Los espermatozoides anormales tienen, algunas veces, varios defectos simulta- neamente. Anteriormente cuando esto ocurría se anotaba sólo un defecto dando prioridad a los de cabeza, luego a los de pieza intermedia y por último a los de la cola. Sin embargo, recientemente se ha demostrado que el número promedio de de- fectos encontrados en un espermatozoide anormal, denominado índice de teratozo- ospermia, es un factor significativo de predicción de la función espermática tanto in vivo como in vitro (Jouannet y col., 1988; Mortimer y col., 1990b). Por con- siguiente la evaluación morfológica del espermatozoide debe ser multiparamétrica para cada célula, anotando cada defecto por separado.
2.5.3.1 Clasificación morfológica de los espermatozoides humanos
Los espermatozoides humanos pueden ser clasificados utilizando un microscopio convencional de campo claro para preparaciones fijadas y teñidas (ver sección 2.5.4 para técnicas de tinción) o por medio del uso de óptica de contraste de fase de buena calidad (con una magnificación de 600 x) en preparados frescos (ver Apéndice V).
Las cabezas de los espermatozoides teñidos son algo mas pequeñas que las de los espermatozoides frescos de la misma muestra, pero su forma no es diferente (Katz y col., 1986). Se debe aplicar un criterio estricto para determinar la normali- dad de la forma de un espermatozoide. Una cabeza normal debe ser ovalada con una longitud entre 4 y 5,5 /lm, tomando en cuenta el cambio de tamaño que induce la fijación y teñido, y un ancho de 2,5 a 3,5 um. El cociente largo/ancho debe ser 1,5 a 1,75. Estos valores cubren un límite de confianza de 95% para cabezas de es- permatozoides normales frescos o teñidos con ·la técnica de Papanicolaou (Katz y col., 1986). La región acrosomal debe estar bien definida y ocupar entre 40% y 70% del área total de la cabeza. El espermatozoide normal no debe tener defectos en el cuello, pieza media y cola y su gota citoplasmática no debe superar un tercio del tamaño de la cabeza normal. Estos criterios de clasificación requieren que todas aquellas formas con defectos mínimos sean consideradas anormales.
Dado que la clasificación propuesta considera las distintas regiones funcionales del espermatozoide no es necesario distinguir, en forma rutinaria, entre las diferen- tes variaciones de tamaño o forma de la cabeza ni tampoco entre los varios defec- tos de la cola. Sin embargo, cuando la mayoría de los espermatozoides presenta un defecto determinado de alguna región se debe agregar un comentario indicando el defecto prevalen te.
Se deben tomar en cuenta los siguientes categorías de defectos (ver fig. 2.4).
a) Defectos de tamaño/forma de la cabeza: puede ser grande, pequeña, acintada, piriforme, amorfa, vacuolada (> 20% del área ocupada por vacuolas no teñidas), doble y toda combinación entre éstos ..
b) Defectos del cuello y pieza media: incluye la ausencia de cola (cabezas aisla- das), cola mal insertada o doblada (la cola forma un ángulo de 90° con respecto al eje longitudinal de la cabeza), pieza media distendida, irregular o doblada, pieza media anormalmente fina (falta la batería de mitocondrias), y toda combinación entre éstos.
Fig. 2-4. Morfología de los esper- matozoides (ver 2.5.3.1 y 2.5.3.2).
Fotomicrografías de espermatozoi- des teñidos con la tinción de Papa- nicolaou (1000 x) (ver Apéndice VII).
a) Espermatozoides normales. N:
normal.
b), c), d), e), f), g), h), i) Esperma- tozoides con defectos de la cabeza, cuello, pieza media, cola y con ca- beza de alfiler. HA cabeza amorfa; HD cabeza doble; HL cabeza grande; HLA cabeza grande y amorfa; HP cabeza piriforme; HT cabeza acintada; HV cabeza va- cuolada; M defecto del cuello y la pieza media; CD gota citoplasmá- tica; N normal; PH cabeza de alfi- ler (éstos deben ser contados como espermatozoides pero anotados se- paradamente); TC cola enrollada;
TM cola múltiple. Nótese que hay células sanguíneas de la serie blanca y células germinales inma- duras en d), g), h) e i).
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c) Defectos de la cola: puede ser: corta, múltiple, en horquilla, rota (ángulo> 90 grados), de espesor irregular, arrollada, con gota citoplasmática terminal, y toda combinación entre éstos.
d) Las gotas citoplasmáticas mayores que 1/3 de la superficie de la cabeza normal.
Las gotas citoplasmáticas se encuentran, habitualmente, en el cuello y pieza interme- dia pero algunas células inmaduras pueden tenerla en algún lugar de la cola.
2.5.3.2 Recuento morfológico diferencial
Se deben contar al menos 100 espermatozoides, preferiblemente 200, con un ob- jetivo de inmersión de 100 X en campo claro y una preparación teñida.
Sólo se cuentan las células reconocibles como espermatozoides. Las células in- maduras, hasta el estadío espermátide Sdl, no se cuentan como espermatozoides.
Las cabezas aisladas se cuentan como formas anormales (ver sección 2.5.3.1, de- fectos del cuello y pieza intermedia) pero no se cuentan las colas libres. Si se nota una alta incidencia (>20% de los espermatozoides) de formas en "cabeza de alfi- ler" esto debe ser informado separadamente. Estas formas no se cuentan como de- fectos de la cabeza ya que rara vez contienen cromatina o estructuras propias de la cabeza.
Una alta incidencia de colas arrolladas puede sugerir que los espermatozoides han sido expuestos a condiciones de hipoosmolaridad, aunque este defecto también se encuentra asociado a los espermatozoides envejecidos.
2.5.3.3 Defectos especifzcos que causan esterilidad
Varios defectos que causan esterilidad han sido identificados en especies de ani- males domesticados, en las que esencialmente todos los espermatozoides tienen un defecto que altera su función. En el hombre se han descrito unos pocos casos simi- lares, de los cuales el mejor conocido es el defecto de "cabezas redondas" o globo- zoospermia.
2.5.4 Métodos de tinción para los espermatozoides humanos
La tinción puede ser hecha usando el método de Giemsa (Apéndice VI), la técni- ca de Papanicolaou modificada para espermatozoides (Apéndice VII), la tinción de Bryan-Leishman (Apéndice VIII) o la tinción de Shorr (Apéndice IX). La técnica de Giemsa es mejor para diferenciar células de la serie blanca que para los esper- matozoides. La técnica de Papanicolaou es la utilizada por la mayoría de los labo- ratorios de andrología. Permite distinguir la región acrosomal y posacrosomal de la cabeza, la pieza media y la cola y puede ser utilizada para muestras muy viscosas.
La tinción de Bryan-Leishman es adecuada para los espermatozoides y resulta par- ticularmente útil para reconocer las células germinales inmaduras y distinguirlas de las células de la serie blanca. La tinción de Shorr es muy simple de usar y es sufi- ciente para la evaluación rutinaria de la morfología espermática.
Existen preparados comerciales listos para usar y que tiñen en un solo paso. Sin embargo, algunos preparados no pueden ser guardados para su examen posterior mientras que otros no producen resultados de igual calidad a los obtenidos con las técnicas sugeridas en este manual.
La técnica tradicional de preparación de extendidos, estirando una gota de se- men sobre un portaobjeto limpio usando el borde de otro portaobjeto, es adecuada pero se debe cuidar de no producir extendidos muy gruesos. Esta técnica es buena para materiales poco viscosos, como la sangre o suspensiones de espermatozoides
lavados, pero puede fallar con una muestra viscosa. Como método alternativo se pone una gota de semen en el medio de un portaobjeto limpio y se apoya otro por- taobjeto limpio sobre el primero. La gota se extiende entre ambas superficies que luego se separan suavemente, deslizando uno sobre otro, para obtener dos extendi- dos.
El contorno de todas las partes del espermatozoide debe ser claramente visible.
Con la tinción de Papanicolaou la cabeza aparece teñida de azul claro en la región acrosomal y azul oscuro en la zona posacrosomal. La pieza media puede teñirse de rojo, pero esto es considerado anormal sólo cuando está groseramente distendida o es irregular. La cola también se teñirá de azul. Las gotas citoplasmáticas, usual- mente ubicadas detrás de la cabeza en la pieza media, se tiñen de verde (fig.2.5).
2.5.5 Prueba para la detección de anticuerpos unidos a la superficie de los espermatozoides
Fig. 2-5. Espermato- zoides normales teñi- dos con Papanicolaou.
Acrosoma, azul claro;
región posacrosomal, azul oscuro; pieza me- dia, rojo pálido; cola.
azul.
La presencia de anticuerpos espermáticos que recubren a los espermatozoides es típica de la infertilidad inmunológica (véase Jones, 1986) y se la considera especí- fica para ella. Los anticuerpos antiespermatozoides del semen pertenecen a dos cla- ses inmunológicas: IgA e IgG. Existen ciertos datos que sugieren que los anticuer- pos de IgA serían clínicamente más importantes que los de IgG (Kremer y Jager, 1980).
Los ensayos para detectar estos anticuerpos se hacen con la muestra de semen fresco, utilizando la reacción de antiglobulinas mixta (prueba MAR) o el método de la inmunobeads (para una reseña véase Bronson y col., 1984).
Los anticuerpos del tipo IgM, debido a su gran peso molecular, rara vez apare- cen en el semen.
Para que estos exámenes sean válidos se deben contar no menos de 100 esper- matozoides con motilidad progresiva. Un alto contenido de moco en la muestra in- terfiere con los análisis. Los resultados obtenidos con la prueba MAR y con la prueba de Immunobeads no siempre son coincidentes (Scarselli y col.,1987;
Hellstrom y col., 1989). La prueba de Immunobeads correlaciona bien con las
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pruebas de inmovilización y aglutinación de espermatozoides que se realizan con suero. Cuando estos análisis dan un resultado positivo se deben hacer pruebas adi- cionales (prueba de contacto semen-moco cervical, prueba del tubo capilar, titula- ción del anticuerpos anti-espermatozoide en suero) para confirmar y dar peso al diagnóstico (ver Capítulo 3).
2.5.5.1 Prueba de 1mmunobeads
Los anticuerpos que están en la superficie del espermatozoide se pueden detectar con la prueba de la immunobeads (Apéndice XI). Las immunobeads son unas esfe- ras de poliacrilamida que tienen antiinmunoglobulinas humanas, obtenidas en co- nejo, unidas mediante enlaces covalentes. Con esta prueba se puede explorar al mismo tiempo tanto la presencia de anticuerpos IgG como IgA e IgM.
Para esta prueba los espermatozoides son liberados del líquido seminal mediante centrifugación reiterada y re suspensión en solución tamponada. La suspensión de espermatozoides se mezcla con una suspensión de immunobeads. La reacción se examina con un aumento 400 x con el microscopio de contraste de fase. Mientras los espermatozoides nadan en la suspensión, los espermatozoides móviles que tie- nen anticuerpos en su superficie se adhieren a las immunobeads. La proporción de espermatozoides con anticuerpos superficiales y la clase (IgG, IgA o IgM) de estos anticuerpos se pueden determinar empleando juegos distintos de immunobeads (Apéndice XI).
Otro tipo de Immunobead, diseñado para marcar linfocitos B, puede ser utiliza- do para determinar en un solo paso la presencia de anticuerpos de isotipo IgG, IgA e IgM en la superficie de los espermatozoides (Pattinson y Mortimer, 1987).
La prueba es considerada positiva cuando> 20% de los espermatozoides móvi- les tienen immunobeads adheridas. Debe notarse que la penetración en el moco cervical y la fertilización in vivo suelen no estar afectadas significativamente hasta que la proporción de espermatozoides con anticuerpos adheridos supera el 50%
(Ayvaliotis y col., 1985; Clarke y col., 1985). Sobre esta base, la prueba tiene sig- nificación clínica sólo cuando el 50% o más del los espermatozoides tiene partícu- las pegadas. Mas aun, la unión de immunobeads a la punta de la cola del esperma- tozoide no se asocia con disminución de la fertilidad y está presente en el semen de algunos hombres fértiles.
2.5.5.2 Prueba MAR
La prueba MAR para IgG (Apéndice XII) se hace mezclando semen fresco, no tratado, con partículas de látex o con eritrocitos de carnero revestidos de IgG humana. A esta mezcla se le agrega antisuero anti-IgG humana. La formación de aglutinados mixtos entre las partículas y los espermatozoides móviles de- muestra la presencia de anticuerpos de IgG en los espermatozoides. El diagnós- tico de infertilidad inmunológica es probable cuando el 50% o más de los esper- matozoides móviles tienen partículas adheridas. Se sospecha infertilidad inmu- nológica cuando del 10 al 50% de los espermatozoides móviles tienen partículas adheridas.
2.B PRUEBAS OPTATIVAS
Las pruebas descritas en esta parte del manual son especializadas y su relevancia aún debe ser establecida. Por esta razones no se las recomienda para el examen ru- tinario del semen.
2.6 Cultivo del semen
Las muestras de semen que se han de cultivar deben recogerse con precauciones específicas para que no se contaminen. Antes de obtener la muestra el paciente de- be orinar e inmediatamente debe lavarse las manos y el pene con jabón. Luego en- juaga el jabón y se seca con toalla limpia. Los recipientes para el semen deben ser estériles. Para realizar un examen completo la muestra debe enviarse a un laborato- rio de microbiología.
El cultivo del plasma seminal puede contribuir a establecer el diagnóstico de in- fección de las glándulas accesorias masculinas, en particular la próstata (Mobley, 1975).
El cultivo de las bacterias aeróbicas puede hacerse en semen puro o diluido en un portaobjeto recubierto con medio o en agar-sangre. Si la concentración de bac- terias excede 1.000 unidades formadoras de colonias/mI, el tipo de las colonias de- be ser examinado. Si las colonias tienen aspecto uniforme se debe identificar el germen y realizar un antibiograma, recurriendo a un laboratorio especializado en microbiología. Cuando las colonias tienen distintos aspectos se sospecha una con- taminación y se debe solicitar una nueva muestra al paciente dándole cuidadosas instrucciones para evitar la contaminación.
Cuando la concentración de bacterias es inferior a 1.000 unidades formadoras de colonias/mI, el cultivo es considerado negativo para bacterias aeróbicas. Las infec- ciones genitales habitualmente requieren de la colaboración de un laboratorio espe- cializado en microbiología (Brunner y col., 1983; Krieger, 1984; Weidner y col., 1985).
2.7 Análisis bioquímico 2.7.1 Plasma seminal
Existen varios marcadores bioquímicos de la función de las glándulas accesorias, como ácido cítrico, cinc, y-glutamil transpeptidasa y fosfatasa ácida para la próstata;
fructosa y prostaglandinas para las vesículas seminales y L-carnitina libre, gliceril- fosforilcolina, y a-glucosidasa para el epidídimo. Una función secretoria disminuida se manifiesta como una baja emisión total de los marcadores específicos, los cuales, por lo tanto, pueden usarse para estimar la función de las glándulas secretorias acce- sorias. En ocasiones una infección puede causar una disminución considerable de la función secretoria, pero a pesar de esto la cantidad total del marcador o los marca- dores presentes todavía puede estar dentro del amplio rango de normalidad. La in- fección también puede producir un daño irreversible del epitelio secretorio, de mo- do que incluso después del tratamiento, la capacidad secretoria aún será baja.
2.7.1.1 Capacidad secretoria de la próstata
El contenido de cinc y de ácido cítrico del semen refleja bien la secreción de la próstata. Existe una buena concordancia entre el cinc, el ácido cítrico y las fosfatasas ácidas. Los ensayos para estos marcadores se describen en los Apéndices XIII a XV.
2.7.1.2 Capacidad secretoria de las vesículas seminales
La concentración de fructosa en el semen refleja la función secretoria de las ve- sículas seminales y el método para su determinación se describe en el Apéndice XVI. En los casos de azoospermia por ausencia congénita de los conductos defe-
rentes, un nivel bajo de fructosa puede mostrar también la disgenesia de las vesícu- las seminales. La determinación de fructosa tambien puede ser de utilidad en los raros casos de obstrucción del conducto eyaculador. El semen de estos pacientes, al igual que el de pacientes con disgenesia de los conductos deferentes y vesÍCulas se- minales, se caracteriza por su pequeño volumen, pH bajo y por la falta de coagula- ción y del olor característico.
2.7.1.3 Capacidad secretoria del epidídimo
Hasta épocas recientes el principal marcador clínico de la secreción epididimaria era la L-carnitina. Recientemente se ha comenzado a trabajar con la a-glucosidasa.
Existen dos isoenzimas en el plasma seminal: la forma predominante es neutra y se origina en el epidídimo mientras que la forma menor, ácida, proviene de la próstata.
La a-glucosidasa neutral es más específica del epidídimo y parece tener mayor sen- sibilidad que la L-carnitina y la glicerilfosforilcolina como marcador. Su determina- ción es más util para el diagnóstico de obstrucción distal de la vía eyaculadora, es- pecialmente cuando se la utiliza juntamente con determinaciones hormonales y con otros parámetros testiculares. Mas aun, la determinación de a-glucosidasa es más simple, barata y rápida que la de los otros marcadores (Apéndice XVII).
2.8 Células germinales inmaduras
Los distintos tipos de células germinales inmaduras que aparecen en el semen (lámina 2-6) suelen indicar trastornos de la espermatogénesis y su identificación puede facilitarse empleando la tinción de Bryan-Leishman (Apéndice VIII). Las células germinales del semen se pueden usar para estudiar cromosomas meióticos y pueden proveer material para establecer el diagnóstico de trastornos cromosómi- cos (Egozcue y col., 1983).
2.
e
PRUEBAS DE INVESTIGACION 2.9 Pruebas funcionales del espermatozoide 2.9.1 EspermatozoidesEl constante avance en el conocimiento de los mecanismos responsables de los defectos en la funcionalidad espermática hace prever que los complejos bioensayos utilizados en la actualidad pronto serán reemplazados por simples análisis bioquí- micos. Por ejemplo, ya existe evidencia de que el daño por peroxidación, debido a la excesiva producción de radicales oxidantes, por ejemplo el peróxido de hidróge- no, puede ser causa de una funcionalidad espermatica defectuosa (Aitken y Clark- son, 1987; Aitken y col., 1989, 1991; Alvarez y col., 1987; Jones y col., 1979).
Los espermatozoides defectuosos también se caracterizan por contener activida- des anormalmente altas de algunas enzimas, como ser la creatina fosfoquinasa (Huszar y col., 1988, 1990). La producción excesiva de especies de oxígeno reacti- vo y la presencia de altos niveles de creatina fosfoquinasa pueden ser la expresión de un defecto único en el espermatozoide que también se acompaña por anormali- dades en la pieza media (Rao y col., 1989).
2.9.2 Prueba de penetración del ovocito de hámster sin zona pellucida
En una consulta de la OMS (1986) para examinar la utilidad de esta prueba se llegó a la conclusión de que, cuando está bien controlada y se la asocia con otras
