Thesis
Reference
Elucidating MOM1-mediated gene silencing
SMATHAJITT, Chotika
Abstract
Chez Arabidopsis, la protéine MOM1 (Morpheus' Molecule 1) est impliquée dans le silencing épigénétique des gènes. La mutante "mom1" ne présente aucun changement de méthylation de l'ADN, de modifications des histones ou de l'architecture nucléaire. Ces caractéristiques différencient nettement MOM1 des autres régulateurs épigénétiques connus. Durant ma thèse, j'ai utilisé deux approches afin d'identifier des composants additionnels participant au silencing dirigé par MOM1. La première approche m'a permis de montrer que MOM1 interagit avec la protéine AtSW13A, une sous-unité d'un complexe de remodelage de la chromatine.
La seconde approche visait à isoler des mutants modifiant l'effet de "mom1" sur le silencing d'un transgène. Plusieurs mutants ont été isolés, dont un, "moe1", a été analysé plus en détails. Le gène "NRPD1b" n'est plus exprimé dans "moe1", ouvrant la possibilité d'une relation entre le silencing dirigé par MOM1 et la méthylation de l'ADN dirigée par des ARN impliquant NRPD1b.
SMATHAJITT, Chotika. Elucidating MOM1-mediated gene silencing. Thèse de doctorat : Univ. Genève, 2007, no. Sc. 3853
URN : urn:nbn:ch:unige-24004
DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:2400
Available at:
http://archive-ouverte.unige.ch/unige:2400
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et de biologie végetale Professeur Jerzy Paszkowski
Elucidating MOM1-mediated gene silencing
THÈSE
Présentée à la Faculté des sciences de l’Université de Genève pour obtenir le grade de Docteur ès sciences, mention biologique
par
Chotika Smathajitt de
Bangkok, Thäilande
Thèse N°3853
GENÈVE
Atelier de reproduction de la Section de physique 2007
Dedicated to my grandmother, ซิวคิ้ม สมรรถจิตต
She is my inspiration…………..
Je voudrais exprimer ma sincère et profonde gratitude envers mon directeur de thèse, le Prof. Jerzy Paszkowski, pour m’avoir donné l’opportunité de travailler dans son laboratoire, pour m’avoir guidée de façon créative, apportant sans cesse des suggestions et m’encourageant tout au long de cette étude. Durant mon travail dans son laboratoire, j’ai beaucoup appris non seulement sur le travail scientifique, mais également à accepter les choses telles qu’elles sont, grâce au soutien de Jurek. Il aurait été trop difficile de surmonter tous les hauts et les bas sans ses encouragements.
Je remercie sincèrement mes rapporteurs Dr. Barbara Hohn et le Prof. Michel Goldschmidt-Clermont pour avoir accepté de participer à mon jury de thèse.
Je suis très sincèrement reconnaissante envers le Dr. Yoshiki Habu, du
« National Institute of Agrobiological Sciences », à Tsukuba au Japon, pour son travail initial et pour m’avoir guidée dans ce projet. La majeure partie de ce travail n’aurait pu être accomplie sans lui.
Tous les membres du laboratoire Paszkowski: Sally Adams, Karin Afsar, Regular Banninger, Moez Hanin, Jacek Lichota, Susanne Lienhard, Aline Probst, Ortrun Mittelsten Scheid, Hidetoshi Saze, Zerihun Tadelle, Muhammed Tariq, Roman Ulm, du FMI à Bâle, et Larissa Broger, Etienne Bucher, Marian Caikovski, Melanie Dapp, Sonia Guimil, Caroline Gutjahr, Ariane Honsberger, Hidetaka Ito, Sylvain Marcel, Frederic Masclaux, Olivier Mathieu, Marie Mirouze, Joël Nicolet, Taisuke Nishimura, Anna Noatynska, Uta Pazkowski, Maria Perez, Jon Reinders, Daniela Ricci, Ruairidh Sawers, Patrice Simon, Shin Takeda, Mireille Tittel-Elmer, Rim Toumil, Isabelle Vaillant, Susan Espejo Waelchli sont remerciés pour l’atmosphère de travail chaleureuse et motivante, et pour les nombreuses et enrichissantes discussions.
Je remercie en particulier Marie m’avoir gentiment aidé à traduire ma thèse en français. Je n’aurais pu le faire moi-même. Mes remerciements vont également à Jon pour avoir corrigé mon « Thaïlish » en « English » plus lisible. Merci beaucoup ! Je voudrais remercier tout spécialement Susanne, Joël and Larissa pour toute leur aide
questions, requêtes, perturbations et complaintes.
Mes remerciements vont à tous mes amis où qu’ils soient. Ils m’ont soutenue en partageant leur propre expérience. Je ne pourrais pas remercier suffisamment les quelques personnes que j’ai rencontrées ici; Cory Strahm, พี่แปด พี่กุง พี่เปยก, qui m’ont beaucoup aidée durant les premiers mois en Suisse, en particulier pour les moments de « fun » lors des week-ends de grande solitude ici. Je voudrais dire merci à quelqu’un que j’ai rencontré, Joan, qui m’a aidée à affronter certaines difficultés à un moment de ma vie, et envers qui je suis si reconnaissante.
Je voudrais exprimer mon amour le plus profond et mes remerciements à mes parents bien aimés, mes tantes โกวเขียว โกวนอย et tous les membres de ma famille pour leur amour infini, leur attention, compréhension et encouragement, qui ne sera jamais oublié. Ma plus profonde gratitude va à พอนภ pour son aide infinie, pour avoir allumé la torche et éclairé le chemin devant moi. Je voudrais également remercier la personne la plus merveilleuse, Dr. Kittisak Yokthongwattana pour avoir toujours été là dans les moments où j’en avais le plus besoin. Merci pour l’amour et le soutien. Il m’aurait été impossible d’affronter tout ça sans lui. Enfin, sans mes grands-parents et tout particulièrement ma grand-mère qui m’a élevée, je ne serais pas là aujourd’hui. Je voudrais la remercier pour son amour et son soutien, tout ce qui m’a fait telle que je suis maintenant. Merci pour m’avoir montré comment aimer et être aimée, merci pour son courage et sa patience. L’histoire de sa vie motive la mienne pour aller de l’avant et elle sera toujours à mes côtés.
Chotika Smathajitt, Genève, 2007
I would like to express my deepest sincere gratitude to my advisor, Prof. Jerzy Paszkowski for giving me opportunity to work in his lab, for his meaningful supervision, creative guidance, continuous suggestions, and encouragement throughout my study. During the time I worked in his lab, I have learned a lot not only how to work in sciences but also to understand how to accept things the way it is, of course, with full supports from Jurek. It would have been too difficult to go through all of my ups-and-downs without his encouragement.
I deeply thank my committees: Dr. Barbara Hohn and Prof. Michel Goldschmidt-Clermont for accepting to be on my thesis committee.
My deepest appreciation is expressed to Dr. Yoshiki Habu, National Institute of Agrobiological Sciences, Tsukuba, Japan, for his initial work and guidance on the project. Major part of this work will not be completed without him.
All members of Paszkowski lab: Sally Adams, Karin Afsar, Regular Banninger, Moez Hanin, Jacek Lichota, Susanne Lienhard, Aline Probst, Ortrun Mittelsten Scheid, Hidetoshi Saze, Zerihun Tadelle, Muhammed Tariq, Roman Ulm, FMI, Basel and Larissa Broger, Etienne Bucher, Marian Caikovski, Melanie Dapp, Sonia Guimil, Caroline Gutjahr, Ariane Honsberger, Hidetaka Ito, Sylvain Marcel, Frederic Masclaux, Olivier Mathieu, Marie Mirouze, Joel Nicolet, Taisuke Nishimura, Anna Noatynska, Uta Pazkowski, Maria Perez, Jon Reinders, Daniela Ricci, Ruairidh Sawers, Patrice Simon, Shin Takeda, Mireille Tittel-Elmer, Rim Toumil, Isabelle Vaillant, Susan Espejo Waelchli are thanked for the great and motivating atmosphere, and many helpful discussions. My special thanks go to Marie for her kindness in helping me translating my thesis into French. I could not have done it myself. My thanks go to Jon for correcting my “Thailish” into more readable English. Thanks a lot! I would like to thank especially Susanne, Joel and Larissa for giving me a lot of technical supports during my study, to our “green-thumb gardeners” Bernard Delessert, Yves Dudan for providing supports. My special thanks also go to Marian
My thanks go to all of my friends where ever they are. They are good supporters as they shared what they have been through. I could not thank enough few people to whom I have met here; Cory Strahm, พี่แปด พี่กุง พี่เปยก, who gave me a lot of help during my first few months in Switzerland especially for the “fun” time on the very lonely weekends here. I would like to say thank you for some one whom I met, Joan, who helped me get through some difficulties I faced at certain point in my life and for that I am so grateful.
I would like to express my deepest love and thanks to my beloved parents, my aunts โกวเขียว โกวนอย and all of my family members for their infinite love, attention, understanding and encouragement, which will never be forgotten. My deepest gratitude goes to พอนภ for his infinite guidance, for lighting the torch and shows me the path ahead of me. I also would like to thank the most wonderful person, Dr.
Kittisak Yokthongwattana for always be there for me the very time I needed supports.
Thank you for love and caring. It would be impossible for me to go through all these without him. Finally, without my grandparents especially my grandma who brought me up, I will never be here. I would like to thank her for all loves and supports;
everything that made me the way I am now. Thank you for showing me how to love and be loved, for her bravery and patience. The tales of her life motivates mine to move on and she will be forever with me.
ขอบพระคุณคะ
Chotika Smathajitt, Geneva, 2007
Chez Arabidopsis, la protéine MOM1 (Morpheus’ Molecule 1) est impliquée dans le silencing épigénétique des gènes. La mutant mom1 ne présente aucun changement de méthylation de l’ADN, de modifications des histones ou de l’architecture nucléaire.
Ces caractéristiques différencient nettement MOM1 des autres régulateurs épigénétiques connus. Durant ma thèse, j’ai utilisé deux approches afin d’identifier des composants additionnels participant au silencing dirigé par MOM1.
La première approche m’a permis de montrer que MOM1 interagit avec la protéine AtSWI3A, une sous-unité d’un complexe de remodelage de la chromatine. La seconde approche visait à isoler des mutants modifiant l’effet de mom1 sur le silencing d’un transgène. Plusieurs mutants ont été isolés dont un, moe1, a été analysé plus en détails. Le gène NRPD1b n’est plus exprimé dans moe1, ouvrant la possibilité d’une relation entre le silencing dirigé par MOM1 et la méthylation de l’ADN dirigée par des ARN impliquant NRPD1b.
Page ACKNOWLEDGEMENTS
CHAPTER
GENERAL SUMMARY 1
1 RESUME EN FRANÇAIS 3
2 INTRODUCTION 25
2.1 Chromatin structure 25
2.2 Epigenetic gene silencing 27
2.3 DNA methylation 31
2.4 Covalent modifications of histones 37
2.4.1 Histone methylation 37
2.4.2 Histone acetylation 39
2.5 Chromatin remodeling 41
2.6 DNA methylation independent silencing components, Morpheus’ molecule 1 (MOM1)
43
3 OBJECTIVES 47
4 MATERIALS AND METHODS 48
4.1. Materials 48
4.1.1 Plant material 48
4.1.2 Plant tissue culture media 49
4.1.3 Bacterial strains 49
4.1.4 Bacterial growth media 49
4.1.5 Yeast strains and culture 50
4.1.6 Plasmid vector 50
4.1.7 DNA fragments used as probes in gel blot analysis 51
4.1.8 Chemicals and reagents 52
4.1.9 Oligonucleotides 52
4.2 Methods 53
4.2.1 Plant growth conditions 53
4.2.2 Plant transformation 53
4.2.3 Selection of transformants 54
4.2.4 Genotyping of Arabidopsis mutants 54
4.2.5 Bacterial Plasmid DNA extraction 55
4.2.6 Generation of Competent Bacteria and bacterial transformation
55
4.2.7 Yeast plasmid DNA extraction 56
4.2.8 Preparation of yeast competent cells and transformation 56 4.2.9 Assay for β-galactosidase activity in yeast cells 56 4.2.10 Isolation of plant genomic DNA and Southern blot
analysis
57
4.2.11 Gel Electrophoresis and Southern Blot Analysis 57 4.2.12 Study of DNA methylation status by Southern blot 58
4.2.13 Total RNA isolation 58
4.2.14 RNA gel electrophoresis and Northern blot analysis 58
4.2.15 Hybridization with radioactive probe 59
4.2.15.1 Labeling of the probe 59
4.2.15.2 Hybridization procedure 59
4.2.15.2.1 Pre-hybridization step 59
4.2.15.2.2 Hybridization 59
4.2.15.2.3 Washing and autoradiography 60
4.2.15.3 De-hybridization of membrane 60
4.2.16 RT-PCR 60
4.2.17 In vitro pull-down assay 61
4.2.17.1 Construction of expression vectors 61
4.2.17.2 Production of recombinant protein 61
4.2.17.3 In vitro pull-down assay 62
4.2.18 Plasmid construction of plant transformation 62 4.2.18.1 Construction of AtSWI3A antisense and
overexpressed constructs
62
4.2.18.2 Generation of inducible RNAi constructs 62
4.2.18.2.1 pIR-cSWI3A 62
4.2.18.2.1 pIR-gSWI3A 63
4.2.18.3 Construction of the Butafenacil resistant vector 63
4.2.19 Chemical induction of AtSWI3A RNAi 64
4.2.20 GUS histochemical anslysis 64
4.2.21 Screening for mom1 modifiers 64
4.2.22 Immunostaining 65
5 SCREENING FOR MOM1-INTERACTING PROTEINS 66
5.1 Result 66
5.1.1 MOM1 interacts with AtSWI3A 66
5.1.2 MOM1 interacts directly with AtSWI3A in vitro 69 5.1.2.1 Expression of HA-MOM1 and GST-AtSWI3A 69
5.1.2. 2 In vitro pull-down assay 70
5.1.3 Identification of AtSWI3A–interacting motif in MOM1 72 5.1.4 Functional study of AtSWI3A 74
5.1.5 Phenotypes of AtSWI3A depleted plants 75 5.1.6 GUS locus remains silent in the AtSWI3A depleted
plants
76
5.1.7 AtSWI3A over-expression lines could not be obtained. 82
5.1.8 Chemically inducible down-regulation of AtSWI3A 84 5.1.9 No reactivation of GUS transgene in the transgenic
plants carrying pIR-cSWI3A
86
5.1.10 Transgenic plants carrying genomic AtSWI3A RNAi construct release silencing of silenced GUS transgene
87
5.1.11 Lack of clear down-regulation of AtSWI3A transcript was observed in the pIR-gSWI3A plants
89
5.1.12 Other silent endogenous loci were also de-repressed in pIR-gSWI3A plants
90
5.2 Discussion 92
5.2.1 MOM1 interacts with AtSWI3A, subunit of chromatin remodeling complex
92
5.2.2 AtSWI3A is a subunit of chromatin remodeling complex
93
5.2.3 Domain characteristic of AtSWI3A 96
5.2.4 Carboxy-terminal part of MOM1 is essential for the maintenance of TGS
98
5.2.5 AtSWI3A and the maintenance of TGS 98
6 SCREENING FOR mom1 MODIFIERS 103
6.1 Result 103
6.1.1 Generation of activation tagging populations in momLUC background
103
6.1.2 Generation of a new activation-tagging vector 108
6.1.3 Screening for mom1 modifiers 111
6.1.4 The candidate for mom1 enhancer1, moe1 118
6.1.5 Confirmation of the enhanced LUC transgene expression in moe1
120
6.1.6 Genetic analysis of the moe1 mutant 121 6.1.7 Genetic interaction between mom1 and moe1 124 6.1.8 Luciferase expression is stays enhanced during moe1
development
129
6.1.9 Enhanced luciferase expression in moe1 is not due to DNA hypomethylation
132
6.1.10 The mom1 enhancer does not affect global histone modifications
134
6.1.11 Luciferase expression levels of moe1 can be further increased by inhibition of DNA methylation but not histone deacetylation.
135
6.1.12 Target specific enhancement of expression in moe1 138 6.1.13 Expression levels of active transgenes are not altered
in moe1
142
6.1.14 Characterization of other mutant phenotypes 144
6.1.14.1 Germination tests 144
6.1.14.2 Responses to heavy metal stress 147
6.1.15 Expression levels of chosen epigenetic regulators are not altered in the moe1 mutant
149
6.1.16 DNA glycosylase/lyase, ROS1, is down-regulated in moe1 but not in mom1 mutant
151
6.1.17 Additional transposon-related sequences are reactivated in the moe1 mutant
155
6.1.18 NRPD1b is partially deleted in moe1 157
6.1.19 Additional mom1-modifiers 160
6.1.20 The enhanced LUC transgene expression persists in following generation of the new mom1 enhancer candidates
161
6.2 Discussion 163
6.2.1 NRPD1b and gene silencing 165
6.2.2 NRPD1b and MOM1: possible overlapping function 166 6.2.3 Another possible candidate for MOE1 gene, At2g40050 167
6.2.4 Further investigation 169
7 REFERENCE 170
APPENDIX I list of primers 193 APPENDIX II list of abbreviation 198
BIOGRAPHY 202
GENERAL SUMMARY
During my PhD, I studied molecular mechanism of epigenetic regulation in Arabidopsis associated with the unique gene silencing regulator, MOM1. The mom1 mutant impairs in the maintenance of gene silencing, however; no correlation between silencing/ transcriptional activity, DNA methylation levels, patterns of histone modifications and alterations in nuclear architecture have been observed. These features differentiate MOM1 from other epigenetic regulators. Using two complementary experimental approaches, I have identified additional components contributing to MOM1 mediated silencing.
In the first approach, I screened the Arabidopsis cDNA library for MOM1- interacting proteins by yeast two-hybrid system. AtSWI3A, a subunit of chromatin remodeling complex, was identified and the physical interaction between MOM1- AtSWI3A was further supported by in vitro pull-down assays. Since AtSWI3A loss of function caused embryonic lethality, functional analyses of the AtSWI3A were carried out by introducing an antisense (pAS-SWI3A), over-expressing (pOE-SWI3A), and RNAi (pIR-gSWI3A and pIR-cSWI3A) constructs into transgenic Arabidopsis line L5, which contains multicopies, silent GUS transgenic locus. Seedlings with partially depleted AtSWI3A transcript exhibited aberrant growth. The difference in growth between controls and the AtSWI3A-down-regulated plants was minor under short-day condition. However, the aberrant growth became very apparent when the plants were grown under long-days, indicating an important function of AtSWI3A in the environmental control of plant development. Interestingly, none of the plants transformed by the pOE-SWI3A exhibited overexpression of the AtSWI3A transcript.
This observation suggests that the level of AtSWI3A transcript might be tightly regulated and overexpression would lead to lethality. To determine the role of AtSWI3A in gene silencing, a silent GUS transgene was used as a marker for de-
repression of the gene silencing. The plants carrying a genomic AtSWI3A RNAi construct did release silencing of the silent GUS transgene, albeit in a stochastic fashion. Moreover, other endogenous silenced targets, which are reactivated by mom1 mutation, were also released in the plants carrying genomic AtSWI3A RNAi construct.
The results suggest possible cooperation of AtSWI3A and MOM1 in the maintenance of gene silencing in Arabidopsis.
In the second approach, I searched for mom1 modifiers in order to identify second site mutations able to enhance or suppress mom1. The luciferase transgene was chosen as a marker for this screen. To create the mutagenized population the silent luciferase transgene from line LUC25 was introgressed into mom1 mutant resulted in line momLUC. The silenced luciferase transgene was reactivated in this line. By evaluating luminescence signal between momLUC, LUC25 and the mutagenized population, I isolated several mom1 enhancer (moe) candidates. The first mutant moe1 was analyzed in more details. As compared to momLUC line moe1 has strongly elevated luciferase mRNA level and luciferase activity. This elevated reactivation is persisted throughout the plant development. Genetic analysis showed that moe1 is a recessive mutation and the enhanced luciferase expression in moe1 is dependent of mom1. Similar to mom1, elevated levels of luciferase expression in moe1 are not correlated with changes in DNA methylation. Expression analysis of various epigenetic regulators demonstrated lack of NRPD1b expression. Further analysis illustrated that 3’-region of NRPD1b gene is deleted in moe1.
In conclusion, the work presented here suggested that MOM1 functions in a complex which involved AtSWI3A. Both proteins operated to maintain gene silencing at the selected chromosomal targets. The interaction between AtSWI3A and MOM1 suggested connection between MOM1 and chromatin remodeling activity. In addition, the fact that mutation in NRPD1b enhanced mom1 phenotype suggested the possibility of connection between MOM1-mediated gene silencing and RNA-directed DNA methylation pathway.
CHAPTER 1 RESUME FRANÇAIS
1.1 INTRODUCTION
1.1.1. La structure de la chromatine
Chez les organismes eucaryotes, l’ADN est organisé dans le noyau en une structure compacte appelée chromatine, dont les nucléosomes sont les composants principaux. Les nucléosomes se composent d’octamères d’histones (des paires d’histones H2A, H2B, H3 et H4) autour desquels s’enroulent 147 bases d’ADN (Figure 2.1) (Chakravarthy et al., 2005 ; Luger, 2006). Des études de cytologie ont permis de différencier deux types de chromatine : l’euchromatine et l’hétérochromatine (Heitz, 1928; Grewal and Jia, 2007). L’euchromatine est définie par une structure relâchée, généralement composée de gènes activement transcrits, alors que l’hétérochromatine est une région dense et qui reste très compactée tout au long du cycle cellulaire (Heitz, 1928). Cette dernière est composée de séquences répétées telles les séquences péricentromériques, centromériques et télomériques, d’éléments transposables et de loci transcriptionellement inactifs. Outre leur structure cytologique, l’euchromatine et l’hétérochromatine diffèrent également par le type et/ou la densité de modifications biochimiques qui affectent l’ADN et les histones. La méthylation de l’ADN, les modifications post-traductionnelles des queues d’histones et le remplacement d’histone par des variants d’histone définissent des structures particulières de la chromatine (Hsieh and Fischer, 2005). La configuration de la chromatine peut en outre être affectée par des complexes de remodelage de la chromatine. Ces processus de modulation de la structure de la chromatine joue un rôle essentiel dans la régulation de l’expression des gènes transmise au cours des générations.
1.1.2. Le silencing épigénétique
Le terme épigénétique a été introduit pour la première fois par Conrad Waddington et définit alors l’interaction des gènes avec leur environnement qui transforme un phénotype en organisme vivant (Waddington, 1942). L’épigénétique aujourd’hui définit des changements héritables mais potentiellement réversibles dans l’expression des gènes qui adviennent sans changement dans la séquence d’ADN correspondante. Les régulations épigénétiques sont souvent associées à des changements de marques épigénétiques telles la méthylation de l’ADN et les modifications des histones qui, combinées avec l’action des complexes de remodelage de la chromatine, maintiennent un état transcriptionnel épigénétique (Figure 2.2) (Qiu, 2006). Plusieurs organismes tirent profit des régulations épigénétiques pour contrôler la régulation des gènes (Grewal and Jia, 2007; Yang and Kuroda, 2007; Zaratiegui et al., 2007). Par exemple le locus « mating type » (gènes HMR et HMN), l’ADN ribosomal ainsi que les répétitions télomériques et centromériques sont des cibles largement étudiées du silencing épigénétique dans la levure. Un phénomène appelé
« position effect variegation » (PEV) chez la Drosophile décrit l’altération de l’expression d’un gène lorsque celui-ci est situé près de l’hétérochromatine.
L’inactivation du chromosome X est également un exemple classique de régulation épigénétique chez les mammifères. Cette inactivation implique une compensation de dosage de l’expression des gènes liés au chromosome X afin d’égaliser la différence du nombre de chromosomes sexuels chez les mâles et les femelles (Straub and Becker, 2007).
Chez les plantes, les régulations épigénétiques comme les paramutations ont d’abord été décrites chez le maïs. Les paramutations sont des mutations alléliques dans lesquelles l’expression d’un allèle est altérée par la présence d’un autre allèle, cette expression étant héritable aux générations suivantes (Chandler, 2007). Le silencing des transgènes a tout d’abord été découvert chez le Pétunia transformé par un transgène codant la chalcone synthase (Napoli et al., 1990). L’expression de ce
gène est responsable de la couleur pourpre des pétales. Cependant après la transformation des fleurs blanches ou panachées ont été obtenues. La couleur blanche de ces fleurs est due au silencing à la fois du transgène et du gène endogène codant la chalcone synthase, ce phénomène ayant été nommé co-suppression (Napoli et al., 1990).
Le silencing épigénétique a d’abord été divisé en deux catégories : silencing transcriptionnel TGS et post-transcriptionnel PTGS, bien que la frontière entre les 2 soit aujourd’hui de moins en moins évidente (Figure 2.3) (Feschotte et al., 2002). Le TGS intervient au niveau transcriptionnel par la répression de la transcription liée à une structure répressive de la chromatine. Il est souvent associé à un fort taux de méthylation de l’ADN et des modifications particulières des histones. De plus le TGS peut être transmis au cours de la mitose et de la méiose. Les transgènes sont souvent la cible du TGS lorsque de multiples copies sont intégrées dans le génome de la plante. La méthylation de l’ADN associée au TGS peut être dirigée par des petits ARNs par un processus appelé « RNA directed DNA méthylation » (RdDM) qui sera décrit plus loin dans ce chapitre. La RdDM a été mise en évidence par exemple lorsqu’un ARN complémentaire à la région promotrice du gène cible est transcrite. En plus du silencing des transgènes, le TGS peut également être associé à des cibles endogènes tels les gènes de phosphoribosylanthranilate isomérase (PAI), enzyme impliquée dans la biosynthèse du tryptophane. Dans les plantes d’Arabidopsis de l’écotype Wassilewskija 4 gènes PAI (PAI1-4) sont présents en 3 loci distincts. Seuls PAI-1 et PAI-2 codent des protéines fonctionnelles, mais PAI-2 est silencé par méthylation de l’ADN (Bender and Fink, 1995). FWA est un autre exemple de régulation de l’expression des gènes par méthylation de l’ADN. Ce locus est fortement méthylé et transcriptionnellement inactif dans tous les tissus de la plante, et n’est réactivé que dans l’endosperme ou la méthylation est supprimée (Kinoshita et al., 2004).
Le PTGS aussi appelé ARN silencing ou ARN interférence (RNAi) est généralement lié à la dégradation d’un ARN messager cible dans le cytoplasme (Figure 2.3). Chez les plantes, le PTGS requiert la production de petits ARN interférants (small interfering RNAs ou siRNAs) qui sont produits à partir des ARN double brin (dsRNAs) grâce à l’ARN polymérase ARN-dépendante (RdRP), à des enzymes RNAIII (Dicer-like proteins, DCL) et à Argonaute (AGO) (Brodersen and Voinnet, 2006; Baulcombe, 2007). Dans ce cas, le taux de transcription du gène cible n’est pas affecté et le silencing doit être ré-initié à chaque génération.
1.1.3. La méthylation de l’ADN
La méthylation de l’ADN est, parmi les marques épigénétiques conservées au cours de l’évolution, celle qui est la mieux caractérisée (Figure 2.2) (Goll and Bestor, 2005; Qiu, 2006). On la trouve chez Neurospora crassa, chez les plantes et les mammifères, mais elle est très peu présente chez la levure et la drosophile (Selker et al., 2003; Bender, 2004; Bernstein et al., 2007). Récemment la méthylation de l’ADN a aussi été détectée chez l’abeille (Wang et al., 2006). Chez les mammifères, la méthylation de l’ADN a lieu principalement dans des contextes symétriques CpG. En revanche chez les plantes, en plus de cette méthylation CpG, on trouve une méthylation significative au niveau de sites CpNpG et CpNpN (Bender, 2004). La méthylation de l’ADN peut toucher jusqu’à 19% des cytosines chez Arabidopsis.
Cette méthylation est cependant concentrée dans des régions hétérochromatiques, bien qu’un tiers des gènes transcrits contiennent aussi de la méthylation (Zhang et al., 2006).
On distingue la méthylation de maintenance et méthylation de novo. La méthylation de maintenance se produit lors de la réplication ou de la réparation de l’ADN grâce à l’action d’enzymes telles DNMT1 chez les mammifères et MET1 chez les plantes qui utilisent comme matrice l’ADN hémi-méthylé (Finnegan et al., 1996;
Bestor, 2000). Cette information épigénétique peut donc être transmise au cours de la mitose et de la méiose. Le mutant met1 d’Arabidopsis est affecté dans la méthylation
CpG au niveau des répétitions centromériques, des répétitions d’ADNr 5S, des transposons et des loci transgéniques silencés (Vongs et al., 1993; Kankel et al., 2003;
Saze et al., 2003; Vaillant et al., 2006; Rangwala and Richards, 2007). Ces mutants présentent de nombreuses anomalies développementales : délai de floraison, mutation homéotiques dans le développement floral, problèmes de fertilité ; ce phénotype devenant de plus en plus sévère au cours des générations successives (Finnegan et al., 1996; Ronemus et al., 1996). La méthylation de novo est assurée par les enzymes de la classe DNMT3 chez les mammifères et DRM2 chez les plantes (Hsieh, 1999; Cao and Jacobsen, 2002a; Hermann et al., 2004). DNMT3 et DNMT3L chez les mammifères sont impliquées au niveau de la méthylation « imprinted » lors de l’embryogenèse (Kaneda et al., 2004). Chez les plantes DRM2 est impliqué dans la méthylation des cytosines dans tous les contextes (symétriques et asymétriques) et est l’enzyme majeure assurant la méthylation dirigée par les ARN (Cao and Jacobsen, 2002a, b; Cao et al., 2003). Les plantes contiennent également des méthyltransférases spécifiques appelées chromométhylases 3 (CMT3) (Henikoff and Comai, 1998).
L’enzyme CMT3 chez Arabidopsis est nécessaire à la méthylation CpNpG (Bartee et al., 2001; Lindroth et al., 2004). CMT3 contient un chromodomaine capable de se lier aux lysines méthylées assurant ainsi un lien entre la méthylation de l’ADN et les modifications des histones (Figure 2.4) (Lee and Workman, 2007).
La méthylation de l’ADN dirigée par les ARN (RdDM) a tout d’abord été découverte chez des plants de tabac infectés par des viroïdes. L’ADNc du viroïde était méthylé après intégration comme transgène dans le génome du tabac. La réplication du viroïde n’implique aucun intermédiaire ARN, indiquant une méthylation de novo par l’ARN du viroïde (Wassenegger et al., 1994). Par la suite la RdDM a été identifiée comme un système mis en place par les plantes pour le silencing de transposons et transgènes (Herr et al., 2005; Kanno et al., 2005b; Huettel et al., 2006). La RdDM nécessite des petits ARN interférants qui conduisent à la méthylation de l’ADN et aux modifications des histones (Huettel et al., 2007). Cette méthylation de l’ADN affecte les cytosines, quel que soit leur contexte (Pelissier et al., 1999). Les analyses
génétiques ont permis d’identifier les acteurs impliquées dans la voie RdDM chez Arabidopsis tels les ADN méthyltransférases, les enzymes de modifications des histones, les protéines impliquées dans la voie de RNAi, et les ARN polymérases IV ADN-dépendantes spécifiques de plantes (Figure 2.5). Récemment 4 gènes (NRPD1a, 1b, 2a, 2b) codant différentes sous-unités de l’ARN polymérase IV ont été identifiés (Herr et al., 2005; Kanno et al., 2005b; Pontier et al., 2005). La plus grande sous- unité, NRPD1a, a tout d’abord été identifiée en tant que mutant affecté dans le silencing des transgènes (silencing defective 4, sde4) (Dalmay et al., 2000), bien que le gène muté n’ait été identifié que plus tardivement (Herr et al., 2005). Les deux autres plus grosses sous-unités NRPD1b et 2a ont été identifiées par des cribles génétiques à la recherche de mutants affectés dans la RdDM (Kanno et al., 2005b;
Pontier et al., 2005). Deux complexes de polymérases IV fonctionnellement différents peuvent être formés : polymérase IVa (NRPD1a et 2a) et polymérase IVb (NRPD1b et 2a). La polymérase IV pourrait être impliquée dans la production de transcrits aberrants qui serviraient ensuite de matrice à une ARN polymérase ARN-dépendante RDR2 produisant ainsi des ARN double brins (dsRNAs). Ces ARN double brins sont ensuite clivés par Dicer like 3 (DCL3) en petits ARN interférants (siRNAs) de 21 à 24 nucléotides. Ces petits ARN interférants à leur tour serviraient de signal pour diriger la méthylation de l’ADN par DRM2 et les modifications des histones au niveau des loci cibles (Pontes et al., 2006; Huettel et al., 2007 ).
La méthylation de l’ADN peut être reconnue par des protéines possédant un motif spécifique de liaison aux méthyl-CpG (MBD) : MeCP2 chez les mammifères et MBD chez les plantes (Hendrich and Tweedie, 2003; Klose and Bird, 2006; Grafi et al., 2007; Zemach and Grafi, 2007). La liaison de MeCP2 ou de l’enzyme DNMT1 elle-même permet de recruter des histones déacétylases illustrant ainsi le lien entre la méthylation de l’ADN et les méthylation des histones (Bird and Wolffe, 1999; Fuks et al., 2003). Le génome d’Arabidopsis contient 13 gènes codant des protéines MBD (Grafi et al., 2007). Trois de ces protéines MBD peuvent se lier à l’ADN méthylé in vitro (Ito et al., 2003; Zemach and Grafi, 2003). De plus, comme c’est le cas pour
MeCP2, il a été montré que AtMBD6 est également associée à une activité histone déacétylase (Zemach and Grafi, 2003).
La méthylation de l’ADN peut être perdue de façon passive et/ou active. La perte passive est la conséquence d’une absence de maintien de la méthylation au cours la réplication de l’ADN tandis que la déméthylation active est liée à l’activité des ADN glycosylases spécifiques des cytosines méthylées (Chan et al., 2005). On connaît 4 glycosylases de ce type chez Arabidopsis : repressor of silencing (ROS1), demeter (DME), demeter-like 2 (DML2), et demeter-like 3 (DML3) (Choi et al., 2002). Ces glycosylases sont impliquées dans la déméthylation active par le biais de système de réparation « base excision » de l’ADN (Agius et al., 2006; Morales-Ruiz et al., 2006; Penterman et al., 2007). Dans le mutant ros1, une hyperméthylation et un silencing ont été observés au locus transgénique mais également au locus endogène (Gong et al., 2002; Zhu et al., 2007). La fonction de DME est nécessaire à la réactivation de MEDEA et FLOWERING WAGENEINGEN (FWA) (Choi et al., 2002;
Kinoshita et al., 2004). Chez Arabidopsis FWA et MEA sont silencés dans les tissus végétatifs suite à la méthylation de l’ADN. Suite à l’activité de DME, les allèles maternels de MEA et FWA sont déméthylés et ainsi exprimés dans l’endosperme (Xiao et al., 2003; Kinoshita et al., 2004).
1.1.4. Les modifications covalentes des histones
Les histones sont des protéines composées d’un domaine globulaire et de queues N-terminales qui font extrusion hors du nucléosome. Les queues N-terminales peuvent être l’objet de modifications post-traductionnelles comme la méthylation (me), l’acétylation (Ac), la phosphorylation (P), et l’ubiquitination (Ub) (Jenuwein and Allis, 2001; Shilatifard, 2006; Kouzarides, 2007). L’hypothèse d’un code d’histones propose que les différentes combinaisons de modifications des histones puissent être interprétées de façon différente par des protéines entraînant des changements dans l’expression des gènes (Figure 2.4) (Jenuwein and Allis, 2001; de la Cruz et al., 2005).
1.1.4.1. La méthylation des histones
La méthylation des histones peut avoir lieu, pour l’histone H3, au niveau des résidus lysines K4, K9, K27, K36 et K79. La lysine K20 de l’histone H4 peut également être méthylée. La méthylation peut aussi avoir lieu au niveau des résidus arginine R2, RR8, R17, R26 de l’histone H3, et R3 de l’histone H4. Ces queues d’histones peuvent être mono-, di- ou tri-méthylées, ce qui ajoute un niveau supplémentaire de complexité (Kouzarides, 2007). Dans ce manuscrit la mono-, di- ou tri-méthylation sera notée me, me2 et me3 respectivement. La méthylation des histones au niveau d’un locus est corrélée avec l’activité transcriptionnelle. Par exemple la méthylation H3K9me2 est associée à la chromatine silencée alors que la méthylation H3K4me2 est généralement liée aux loci activement transcrits de la chromatine (Jenuwein and Allis, 2001). Comme c’est le cas chez d’autres organismes l’euchromatine chez Arabidopsis est associée à un fort taux de H3K4me2 alors que l’hétérochromatine est généralement riche en H3K9me2 (Jasencakova et al., 2003).
Néanmoins, suivant les organismes, différentes méthylation des histones peuvent être associées à la structure de la chromatine. Par exemple l’hétérochromatine chez les animaux est associée à H3K27me3 alors que cette marque des histones est spécifique de l’euchromatine chez Arabidopsis (Schotta et al., 2004; Mathieu et al., 2005; Ebert et al., 2006; Fischer et al., 2006).
La méthylation des histones est assurée par les protéines contenant un domaine SET (Qian and Zhou, 2006). La première histone méthyltransférase Su(var)3-9 a été identifiée comme suppresseur du « position effect variegation » chez la drosophile (Tschiersch et al., 1994). Plus tard son activité histone méthyltransférase a été montrée in vitro (Rea et al., 2000). Les histones méthyltransférases ont également été identifiées chez Schizosaccharomyces pombe (Clr4p) (Nakayama et al., 2001), Neurospora crassa (Dim-5) (Tamaru and Selker, 2001), et chez les mammifères (SUV39H1 et SUV39H2) (O'Carroll et al., 2000; Rea et al., 2000). Chez Arabidopsis au moins 37 protéines contenant un domaine SET ont été décrites. Certaines d’entre elles ont une activité histone méthyltransférase démontrée (Baumbusch et al., 2001;
Naumann et al., 2005; Ebbs and Bender, 2006; Fischer et al., 2006). La kryptonite (KYP/SUVH4) est une histone méthyltransférase capable de mono et di-méthyler les histones H3K9 in vitro (Jackson et al., 2002; Malagnac et al., 2002; Jackson et al., 2004). Le mutant kyp a été identifié par deux criblages distincts pour des gènes nécessaires au silencing pour les loci PAI et SUPERMAN (SUP) chez Arabidopsis (Jackson et al., 2002; Malagnac et al., 2002). La méthylation H3K9me2 n’est pas simplement une marque de l’hétérochromatine mais elle permet également, chez les mammifères et la drosophile, la liaison de la protéine HP1 (Heterochromatin protein 1) (Bannister et al., 2001; Lachner et al., 2001). Cette liaison de HP1 à la chromatine recrute à son tour d’autres composants nécessaires à la formation de l’hétérochromatine. Chez les plantes cependant le rôle de l’homologue de HP1 (LHP1) dans la formation de l’hétérochromatine n’est pas clairement défini. LHP1 est localisé dans les régions euchromatiques et joue un rôle dans la répression du locus FLC impliqué dans la floraison suite à la vernalisation (Libault et al., 2005; Mylne et al., 2006; Sung et al., 2006).
La méthylation des histones a longtemps été considérée comme une modification biochimiques stable, cependant récemment la première déméthylase des histones a été identifiée chez les mammifères (Lysin specific demethylase, LSD1).
LSD1 déméthyle H3K4 et H3K9 mono- et di-méthylés (Shi et al., 2004). Plus
récemment encore plusieurs histone déméthylases ont été identifiées chez d’autres organismes, dont certaines peuvent déméthyler la tri-méthylation (Shi and Whetstine, 2007).
Le lien entre la méthylation de l’ADN et la méthylation des histones fait l’objet de nombreuses études chez Arabidopsis. La méthylation de l’ADN aux sites CpG est nécessaire pour guider la méthylation H3K9me2 puisque la mutation met1-3 résulte en une perte de méthylation H3K9me2 et une augmentation de H3K4me2 aux loci dé-silencés (Soppe et al., 2002; Tariq et al., 2003). De plus, dans le mutant met1- 3 on observe au niveau des noyaux une redistribution H3K9me2 depuis les régions hétérochromatiques (Tariq et al., 2003). La mutation kyp entraîne une diminution de la méthylation aux sites CpNpG suggérant que la méthylation H3K9me2 est nécessaire pour diriger la méthylation CpNpG (Jackson et al., 2002; Malagnac et al., 2002). Enfin, l’enzyme CMT3 peut se lier aux queues d’histones lorsque celles-ci présentent simultanément les méthylations K9 et K27, illustrant à nouveau un lien entre la méthylation de l’ADN et les méthylations des histones (Lindroth et al., 2004).
1.1.4.2. L’acétylation des histones
L’acétylation et la déacétylation des histones sont des processus dynamiques qui joueraient un rôle sur la structure de la chromatine et l’expression des gènes en modulant l’accessibilité de l’ADN des nucléosomes aux activateurs de la transcription, enzymes de modifications de la chromatine et complexes de remodelage de la chromatine. Les queues d’histones peuvent être acétylées par des histones acétyltransférases (HAT), les histones déacétylases (HDAC) ayant une activité antagoniste qui conduit généralement à la répression des gènes activés par l’acétylation des histones. Les lysines K9, K14, K18, K23, K56 des histones H3, et les lysines K5, K8 et K12 des histones H4 peuvent être les cibles d’acétylation (Kouzarides, 2007; Shahbazian and Grunstein, 2007). L’acétylation des histones est généralement associée à l’expression des gènes tandis que le silencing est associé avec la déacétylation (Jenuwein and Allis, 2001). Des études d’immunolocalisation
chez Arabidopsis ont révélé que des histones H4 acétylées étaient présentes uniquement au niveau de l’euchromatine et absentes de l’hétérochromatine (Jasencakova et al., 2003; Probst et al., 2003). Des traitements avec des inhibiteurs des HDAC comme TSA (trichostatine A) entraînent des changements majeurs dans l’expression des gènes (Chang and Pikaard, 2005).
On distingue 4 familles HAT et 3 familles HDAC. Les 4 familles HAT sont classifiées en fonction de leur domaine catalytique : GNATs, MYST, p300/CBP et co- activateurs de récepteurs nucléaires (Lee and Workman, 2007). Les 3 familles de HDAC sont les suivantes : RPD3, HDA1, Sir2 (Pandey et al., 2002). Le génome d’Arabidopsis contient 12 HAT potentielles et 18 HDAC. Malgré la possible redondance des membres de ces familles, ces protéines ont des rôles biologiques différents. AtHAC1 est impliqué dans la régulation de la floraison (Deng et al., 2007).
L’homologue de GCN5 joue un rôle dans la régulation de l’expression des gènes par la lumière (Benhamed et al., 2006). La répression de l’expression de HD1 (histone deacetylase 1) par des constructions antisens conduit à l’accumulation d’histones acétylées et l’expression de loci auparavant silencés (Tian and Chen, 2001; Tian et al., 2005). Le mutant hda6 est affecté dans le maintien du silencing des transgènes et de l’ARN ribosomique (Murfett et al., 2001; Probst et al., 2004; Earley et al., 2006). Il a été proposé que AtHDA6 puisse jouer un rôle dans la RdDM puisque le mutant est affecté dans le TGS médié par ARN et présente une diminution de la méthylation de l’ADN (Aufsatz et al., 2002).
1.1.5. Le remodelage de la chromatine
Outre les modifications de l’ADN et des histones, la structure de la chromatine peut être modulée par l’activité de complexes de remodelage de la chromatine ATP- dépendants (Narlikar et al., 2002; Smith and Peterson, 2005; Reyes, 2006; van Vugt et al., 2007). Ces complexes multi-protéiques sont conservés au cours de l’évolution de la levure jusqu’à l’homme et peuvent être classés en différentes sous-familles sur la base des motifs conservés des core ATPases à savoir : SWI2/SNF2, ISWI, Mi-2 /CHD, et INO80 (Eberharter and Becker, 2004; Smith and Peterson, 2005). Ces différentes types d’ATPases contiennent des domaines distincts impliqués dans la reconnaissance des histones (Figure 2.4). Les ATPases de type SWI2/SNF2 contiennent un bromodomaine qui reconnaît les lysines acétylées (van Vugt et al., 2007), (Winston and Allis, 1999; Zeng and Zhou, 2002; Hassan et al., 2007). Les ATPases ISWI ont des domaines SNAT et SLIDE qui interagissent potentiellement avec les queues d’histones (Dirscherl and Krebs, 2004). Les ATPases CHD possèdent des chromodomaines qui peuvent se lier aux queues d’histones méthylées tandis que le domaine DBINO présent dans les ATPases INO80 pourrait se lier à l’ADN (Bakshi et al., 2004; Flanagan et al., 2005; Marfella and Imbalzano, 2007). Le complexe SWI/SNF de remodelage de la chromatine a tout d’abord été identifié dans la levure Saccharomyces cerevisiae (Peterson and Herskowitz, 1992; Peterson et al., 1994 ). Ce complexe se compose de 8 à 15 sous-unités qui affectent la structure de la chromatine modifiant l’accessibilité des facteurs d’activation ou de répression de la transcription.
Le génome d’Arabidopsis contient 42 gènes d’ATPases de remodelage de la chromatine (www.chromdb.org). DDM1 (Decreased in DNA methylation) a été identifié dans un criblage pour des mutants affectés dans la méthylation de l’ADN (Vongs et al., 1993; Jeddeloh et al., 1998; Mittelsten Scheid et al., 1998). DDM1 est impliqué dans la maintenance du silencing TGS des transgènes, des transposons et des séquences répétées (Lippman et al., 2003). L’activité de remodelage de la chromatine de DDM1 a été montrée in vitro (Brzeski and Jerzmanowski, 2003). Dans le mutant ddm1, une réduction globale de la méthylation de l’ADN a été observée, renforçant le
lien entre méthylation de l’ADN et remodelage de la chromatine (Vongs et al., 1993).
Les orthologues de DDM1 existent chez la levure (Yfr038w), la souris (Lsh) et l’homme (HELLS) (Geiman et al., 1998; van Vugt et al., 2007). Chez les mammifères l’orthologue de DDM1 (Lsh) joue également un rôle dans la maintenance de la méthylation de l’ADN puisqu’une déméthylation globale a été observée chez des souris mutées Lsh (-/-) (Jarvis et al., 1996; Dennis et al., 2001). Comme DDM1, DRD1 est une protéine SWI/SNF également nécessaire à la méthylation non CpG de novo (Kanno et al., 2004). PICKLE (PKL/GYM) est une ATPase de type Mi-2/CHD impliquée dans la répression de la transcription des caractères embryonnaires après la germination (Ogas et al., 1999; Li et al., 2005). Une revue récente rassemble les données relatives au remodelage de la chromatine chez Arabidopsis (Jerzmanowski, 2007).
En plus des protéines SWI2/SNF2 les complexes de remodelage de la chromatine sont composés de SNF5 et SWI3 (Phelan et al., 1999). Les génomes d’Arabidopsis, du riz et du maïs ne contiennent qu’un homologue de SNF5 (www.chromdb.org). BSH (bushy) est l’homologue chez Arabidopsis et ce gène peut complémenter en partie la mutation snf5 dans la levure (Brzeski et al., 1999). Les génomes d’Arabidopsis et du maïs contiennent 4 homologues prédits de SWI3 alors que le riz en contient 6 (www.chromdb.org). Des mutations dans le gène AtSWI3 résultent en de nombreuses anormalités dévelopementales : forme des feuilles, nanisme, retard de la floraison et perte de dominance apicale suggérant un rôle fondamental de AtSWI3 dans la régulation de l’expression des gènes et dans la croissance et le développement (Zhou et al., 2003; Sarnowski et al., 2005). Les complexes de remodelage de la chromatine sont capables de reconnaître certaines modifications des histones et peuvent par conséquent, de concert avec d’autres modifications épigénétiques, moduler l’expression des gènes.
1.1.6. MOM1, un composant du silencing indépendant de la méthylation de l’ADN
Les changements de propriétés de la chromatine étant associés avec des changements de méthylation de l’ADN, des marques des histones et/ou de la structure de la chromatine, de tels changements sont généralement observés dans des mutants affectés dans les régulateurs épigénétiques. Il est intéressant de noter que des mutations dans certains composants épigénétiques comme Morpheus’ molecule 1 (MOM1), BRU1, et RPA2 n’affectent pas le niveau de méthylation de l’ADN (Amedeo et al., 2000; Guyomarc'h et al., 2004; Suzuki et al., 2004; Takeda et al., 2004; Elmayan et al., 2005). Les mutants bru1 ont un phénotype semblable au mutant fas1 et fas2 affectés dans les sous-unités de facteurs d’assemblage de la chromatine (CAF1) (Kaya et al., 2001; Takeda et al., 2004). La mutation bru1 réactive des cibles endogènes silencées et présente une hypersensibilité aux stress génotoxiques. Ces observations ont montré un lien entre le silencing épigénétique et la réparation de l’ADN (Takeda et al., 2004). RPA2 a été identifié au cours de deux criblages indépendants, le premier cherchant à identifier des gènes nécessaires au silencing, le second cherchant à identifier des suppresseurs de la mutation ros1 (Elmayan et al., 2005; Kapoor et al., 2005; Xia et al., 2006). Les mutations dans RPA2 réactivent un transgène GUS silencé et hyperméthylé sans altérer la méthylation de l’ADN à ce locus (Elmayan et al., 2005). Comme bru1, rpa2 est aussi hypersensible au stress génotoxique (Elmayan et al., 2005).
La mutation mom1 a été identifiée lors d’un criblage génétique à la recherche de nouveaux facteurs impliqués dans la maintenance du silencing d’un transgène codant l’hygromycine phosphotransférase (HPT). Le transgène HPT est hyperméthylé et silencé, cependant la mutation mom1 réactive ce transgène sans affecter son niveau de méthylation (Amedeo et al., 2000). De plus, lorsque la mutation mom1 est introduite dans des lignées portant d’autres transgènes silencés tels GUS ou la luciférase, ces transgènes sont également dé-réprimés (Amedeo et al., 2000; Tariq et
al., 2002; Banninger, 2003). Dans ce cas également la réactivation des transgènes n’est pas accompagnée de changements dans la méthylation de l’ADN.
L’architecture nucléaire n’est pas affectée dans le mutant mom1 et l’hétérochromatine reste condensée au niveau du noyau (Probst et al., 2003). Cette caractéristique diffère des résultats obtenus avec le mutant ddm1 où l’on observe une décondensation de la chromatine et, dans certains cas, une complète dispersion (Probst et al., 2003). La distribution des modifications des histones H3K9me2, H3K4me2 et H4Ac n’est pas affectée non plus dans les noyaux du mutant mom1 (Probst et al., 2003). En plus de la réactivation des transgènes, la mutation mom1 entraîne la réactivation de cibles endogènes simple copie et de séquences répétées (dont les séquences péricentromériques appelées TSI pour transcriptionnally silent information), l’ARN 5S, et un petit nombre de transposons (Steimer et al., 2000;
Habu et al., 2006; Vaillant et al., 2006). De plus, des expériences de ChIP ont montré que la méthylation H3K4, H3K9 et H3K27 n’est pas affectée à ces loci (Habu et al., 2006; Vaillant et al., 2006). Des analyses d’épistasie entre mom1 et ddm1 montrent une forte synergie sur la réactivation des cibles (Scheid et al., 2002). Ces résultats indiquent que MOM1 joue un rôle dans le silencing de façon indépendante de la méthylation de l’ADN (Scheid et al., 2002). Il faut noter que les cibles de MOM1 possèdent des caractéristiques particulières. Toutes les cibles réactivées par mom1 contiennent des marques contradictoires de la méthylation des histones : H3K9me2 (chromatine silencée) et H3K4me2 (chromatine active). Ce type de chromatine a été appelé hétérochromatine intermédiaire et a été proposé comme un pré-requis pour le silencing par MOM1 (Habu et al., 2006). Une telle chromatine présentant des marques d’histones contradictoires a été mise en évidence dans des cellules souches embryonnaires de souris et les gènes associés pourraient être dans un état silencé mais néanmoins permissif pour une activation transcriptionnelle (Azuara et al., 2006;
Kouzarides, 2007).
MOM1 code une protéine de 2001 acides aminés qui ne présente pas d’homologie globale avec les séquences disponibles dans les bases de données (Amedeo et al., 2000). Néanmoins elle contient deux régions qui présentent des similarités avec des motifs déjà décrits (Figure 2.6) (Amedeo et al., 2000). La partie N-terminale de MOM1 contient une région similaire aux ATPases SWI2/SNF2 appartenant à la superfamille 2 des hélicases (SF2) (Amedeo et al., 2000). Les hélicases SF2 contiennent des motifs conservés : I, Ia, II, III, IV, V et VI (Tuteja and Tuteja, 2004). La structure cristallographique de l’hélicase SF2 RAD54 a montré que ces motifs forment deux lobes séparés (Thoma et al., 2005). La protéine MOM1 contient uniquement le second lobe composé des motifs IV, V, et VI (Amedeo et al., 2000). Cette observation a permis d’émettre l’hypothèse selon laquelle MOM1 pourrait fonctionner sous forme hétérodimère avec un partenaire non encore identifié qui porterait la partie manquante de cette hélicase. La seconde région de MOM1 qui présente des similarités avec un motif connu est une région de 100 acides aminés près de la partie C-terminale. Cette région présente des similarités avec une tensine de poulet (Amedeo et al., 2000). Ce fragment de tensine contient des éléments répétés permettant la liaison à l’actine. L’actine et les protéines qui lui sont liées sont présentes dans le noyau et font également partie des complexes de remodelage de la chromatine (Kandasamy et al., 2004).
1.2 OBJECTIFS DE L’ETUDE
La protéine MOM1 est impliquée dans les mécanismes épigénétiques du silencing dans la plante Arabidopsis thaliana. Cependant, contrairement aux autres acteurs des régulations épigénétiques, MOM1 maintient le silencing au niveau transcriptionnel sans affecter la méthylation de l’ADN d’une part et les modifications des histones d’autre part. De ce fait, l’étude du rôle de MOM1 dans le silencing transcriptionnel présente un intérêt particulier. Dans ce contexte, l’étude des protéines agissant de concert avec MOM1 permettrait de mieux définir la voie dans laquelle MOM1 est impliquée. Ce travail est ainsi divisée en deux parties : une première partie fondée sur un crible d’interaction protéique dans la levure, et une deuxième partie fondée sur un crible génétique dans la plante.
La première partie est centrée sur l’étude des partenaires potentiels de MOM1.
Pour répondre à cette question, un crible double-hybride dans la levure a été entrepris en utilisant MOM1 comme proie. Plus précisément, deux régions ont été utilisées : l’une impliquée dans l’activité ATPase SWI2/SNF2 l’autre correspondant à la liaison à l’actine. Une banque d’expression d’Arabidopsis thaliana a été criblée, et a permis l’identification d’un partenaire potentiel. Des lignées antisens ont été obtenues pour le gène en question. Dans ces lignées, la stabilité du TGS a été étudiée.
La seconde partie consiste en une approche génétique : une mutagenèse
« activation tagging » a été réalisée afin d’identifier des modulateurs potentiels de la mutation mom1. La mutagenèse a été réalisée sur le mutant mom1 afin d’identifier des mutants gain ou perte de fonction. Les mutants isolés ont été caractérisés vis-à-vis du silencing transcriptionnel, plus particulièrement pour leur dépendance par rapport à la mutation mom1.
1.3 RESULTATS
1.3.1 Identification des partenaires de la protéine MOM1
Un crible double hybride dans la levure a été initié afin d’identifier les partenaires éventuels de MOM1 qui pourraient être impliqués dans la maintenance du TGS. Le principe de base du double hybride provient de l’étude des facteurs de transcription. De façon générale un facteur de transcription peut faciliter la transcription d’un gène donné lorsqu’il se fixe à un élément cis de ce gène. Un facteur de transcription se compose de deux éléments physiquement distincts : un élément de liaison à l’ADN (DB) et un domaine d’activation de la transcription (AD).
L’identification d’un tel facteur de transcription a permis de développer un système in vivo permettant d’étudier les interactions protéine-protéine. L’interaction entre les deux protéines est recherchée grâce à la fusion de la protéine d’intérêt appelée
« appât » au domaine de liaison à l’ADN et la fusion de protéines « proies » au domaine d’activation. Les deux protéines sont co-exprimées dans la levure. Si elles interagissent physiquement, leur interaction rassemble le domaine de liaison à l’ADN et le domaine d’activation, permettant ainsi de reconstituer l’activité du facteur de transcription et conduisant à l’activation transcriptionnelle de plusieurs gènes rapporteurs. Dans ce travail, deux régions de la protéine MOM1 ont été utilisées comme appât : un domaine semi-hélicase HHD (457-761 aa) et un domaine putatif de liaison à l’actine ABR (1766-2001 aa) (Figure 5.1). Ces deux régions sont les seuls motifs prédits dans la protéine MOM1 et ont donc été choisies comme appât pour cribler des partenaires de MOM1.
Grâce à ce crible basé sur le système double hybride, AtSWI3A une sous unité de facteur de remodelage de la chromatine a été identifié comme partenaire de MOM1. La partie C-terminale de AtSWI3A interagit avec la région ABR de MOM1 dans la souche de levure L40 utilisée pour le criblage. L’interaction spécifique entre MOM1 et AtSWI3A a ensuite été vérifiée in vitro par une expérience de « pull down
» (Figure 5.2). Dans ce système, la protéine de fusion HA-MOM1 a été exclusivement précipitée avec GST-AtSWI3A en utilisant des billes glutathion-sépharose. Des
analyses de délétions sérielles ont révélé que le site d’interaction de MOM1 avec AtSWI3A est situé dans la partie C-terminale de MOM1 (Figure 5.3).
Les mutants homozygotes AtSWI3A ne sont pas viables chez Arabidopsis (Sarnowski et al., 2005). Par conséquent des analyses fonctionnelles de AtSWI3A ont été entreprises dans des plantes transgéniques. Trois constructions ont été utilisées pour réprimer l’expression de AtSWI3A : une construction antisens (pAS-SWI3A), et deux constructions RNAi (à partir de séquence génomique : pIR-gSWI3A ; ou de l’ADNc : pIR-cSWI3A). Des plantes surexprimant AtSWI3A (pOE-SWI3A) ont également été obtenues. La lignée L5 d’Arabidopsis a été utilisée pour construire ces lignées transgéniques car elle contient plusieurs copies du transgène GUS silencé (Morel et al., 2000). Les jeunes plantes dans lesquelles AtSWI3A est réprimé ont une croissance anormale. Les plantes comportant la construction pAS-SWI3A sont plus petites que les plantes contrôle. Cette différence de croissance est faible en conditions de croissance en jours courts (Figure 5.5 (B)), mais elle est accrue lorsque les plantes sont cultivées en conditions de jours longs (Figure 5.5 (A), 6), ce qui suggère une fonction importante de AtSWI3A dans le développement de la plante. Il faut noter qu’aucune des plantes transformées par la construction pOE-SWI3A ne sur-accumule le transcrit AtSWI3A. Cette observation suggère que le niveau des transcrits AtSWI3A est strictement contrôlé. Pour observer le rôle de AtSWI3A dans le silencing, le transgène GUS silencé a été utilisé comme marqueur d’une éventuelle dé-répression du silencing. Cependant parmi les plantes dans lesquelles AtSWI3A est réprimé, aucune n’a réactivé le gène rapporteur. De façon surprenante, les plantes comportant une construction RNAi génomique de AtSWI3A (pIR-gSWI3A) ont montré une dé- répression du silencing du transgène GUS de façon stochastique (Figure 5.9). De plus, d’autres cibles qui sont réactivées par la mutation mom1 telles que TSI sont également dé-réprimées dans les plantes pIR-gSWI3A (Figure 5.10). Les résultats présentés dans ce chapitre suggèrent un rôle de AtSWI3A en interaction avec MOM1 pour la maintenance du silencing chez Arabidopsis.
En conclusion, les données présentées dans ce chapitre suggèrent que MOM1 et son partenaire AtSWI3A jouent un rôle important dans le processus de silencing transcriptionnel. Les deux protéines interagissent dans la levure et in vitro au niveau d’un motif leucine zipper chez AtSWI3A et d’un motif coiled-coil pour MOM1. La région impliquée dans l’interaction avec AtSWI3A dans la protéine MOM1 est également la région essentielle pour la maintenance du silencing. Dans le génome d’Arabidopsis, on estime à 42 le nombre de « core ATPases », 4 SWI3, et 1 SNF5.
Cependant, l’assemblage des complexes de remodelage de la chromatine est peu documenté chez les plantes. Il reste donc à déterminer quelles sont les sous-unités qui forment un complexe fonctionnel. Le travail présenté ici propose une réponse possible à cette question en suggérant que l’interaction entre MOM1 et AtSWI3A puisse constituer un de ces complexes impliqué dans la maintenance du silencing au niveau transcriptionnel.
1.3.2. Identification des mutations modifiant l’effet de la mutation mom1
L’étude des protéines agissant de concert avec MOM1 permettrait de mieux définir la voie dans laquelle MOM1 est impliquée. Le chapitre précédent décrit les techniques moléculaires et biochimiques comme le crible double-hybride et les études d’interaction in vitro employées pour identifier les partenaires de MOM1. Dans ce chapitre, nous décrivons l’approche génétique engagée pour identifier d’autres gènes impliqués avec MOM1 dans la voie de régulation du silencing. Un criblage a été effectué pour identifier des mutations modifiants l’effet de la mutation mom1. Ce criblage est fondé sur la technique de « activation tagging » (Weigel et al., 2000). Par cette technique, des mutations perte ou gain de fonction peuvent être identifiées. La perte de fonction est liée à l’insertion de l’ADN-T dans un gène ce qui abolit sa fonction, tandis que le gain de fonction est lié à l’insertion de l’ADN-T en amont d’un gène dont la transcription est alors activée par la présence des multiples copies du promoteur 35S CaMV.
La lignée momLUC issue du croisement entre la lignée LUC25 et le mutant mom1-1 a été transformée par Agrobacterium tumefaciens afin d’utiliser la technique de « activation tagging » (Figure 6.4). Le transgène LUC codant la luciférase est soumis au silencing dans la lignée L25 (Banninger, 2003), mais la mutation mom1 réactive ce transgène, fournissant ainsi un marqueur visuel facilitant le criblage. La population mutagenéisée a donc été criblée pour une expression altérée du gène codant la luciférase, par comparaison avec l’expression observée dans la lignée momLUC de départ. L’analyse des populations T1 et T2 a permis d’identifier plusieurs candidats présentant des modifications du phénotype mom1. Un de ces candidats, appelé moe1 (mom1 enhancer 1) a été étudié plus en détail, les résultats étant donnés dans le présent chapitre.
Le mutant moe1 présente une réactivation accrue du transgène LUC par rapport à la lignée momLUC dont il est issu. Ces résultats ont été obtenus par des techniques d’imagerie (bioluminescence) et de biologie moléculaire (RT-PCR). Cette dé-répression accrue a été observée à plusieurs stades de développement, de la germination jusqu’à la floraison (Figures 6.16 et 6.17). Des analyses génétiques ont permis de déterminer le caractère récessif de la mutation moe1 (Figure 6.14, Tableau 6.3) et de montrer que le phénotype associé à cette mutation est dépendant de la mutation mom1. Cette dernière caractéristique de la mutation moe1 suggère un rôle de moe1 dans les régulations épigénétiques en tant que modificateur de mom1.
Lors de l’utilisation de la technique d’activation tagging, la caractérisation du gène muté consiste généralement à déterminer le site d’insertion de l’ADN-T.
Cependant, dans le cas du mutant moe1, les analyses génétiques ont montré que la mutation ne ségrégeait pas avec l’ADN-T. De plus ce mutant étant issu d’un croisement entre plusieurs écotypes différents, la cartographie classique n’est pas envisageable à ce jour. Des stratégies alternatives ont été menées afin de caractériser le phénotype du mutant moe1.
Les résultats présentés en figures 6.18 et 6.19 montrent que la mutation moe1 active le transgène LUC sans modifier de façon détectable la méthylation de l’ADN, ni les marques des histones. Néanmoins, lorsque les plantes moe1 ont été traitées avec de l’azacytidine, une drogue qui inhibe la méthylation de l’ADN, une réactivation du transgène LUC encore accrue a pu être observée (Figure 6.20). Ces résultats suggèrent que le silencing du transgène LUC résulte de deux mécanismes : l’un étant dépendant de la méthylation de l’ADN, l’autre non. MOM1 et peut être MOE1 pourraient être impliqués dans le second mécanisme. De façon intéressante, l’expression de plusieurs gènes endogènes réactivés par la mutation mom1 n’est pas affectée par la mutation moe1 (Figure 6.21). Plusieurs transposons cependant, tels que AtGP1 et AtSN1 (Figure 6.30) présentent une réactivation accrue dans le mutant moe1.
Des analyses moléculaires ont révélé la délétion de deux gènes consécutifs dans le mutant moe1, les gènes NRPD1b et At2g40050 (Figure 6.32). NRPD1b code une sous-unité de la polymérase IV, une ADN polymérase ARN dépendante spécifique des plantes (Kanno et al., 2005b). Le gène At2g400500 code une protéine de fonction inconnue. La partie C-terminale de la protéine NRPD1b est délitée dans le mutant moe1. Cette partie contient les répétitions du « C-terminal domain » (CTD), similaires à la grande sous-unité de RNAPII (Pontier et al., 2005). Le domaine CTD est important pour plusieurs étapes de la transcription (Phatnani and Greenleaf, 2006), et sert également de site de liaison pour plusieurs facteurs nucléaires, tels AGO4 (Li et al., 2006). Cependant, aucun anticorps spécifique n’étant disponible pour NRPD1b, la présence de la protéine tronquée n’a pas pu être analysée dans le mutant moe1.
CHAPTER 2 INTRODUCTION
2.1. Chromatin structure
In eukaryotes, nuclear DNA is organized into a compact structure called chromatin. A basic building block of chromatin is nucleosome which contains a histone octamer (two copies of each histone proteins: H2A, H2B, H3 and H4) with 147 base pairs of DNA wrapped around it (Figure 2.1) (Chakravarthy et al., 2005;
Luger, 2006). Cytological studies have described two types of chromatins:
euchromatin and heterochromatin (Heitz, 1928; Grewal and Jia, 2007). Euchromatin is a loosely-packed structure that includes actively transcribed DNA whereas heterochromatin is condensed, as observed by cytological analysis, and is typically composed of transcriptionally silent repetitive DNA such as pericentric, centromeric and telomeric sequences (Heitz, 1928). In addition to the cytological and functional divergence, euchromatin and heterochromatin also differ in the type and/or density of chemical modifications that affect both DNA and histone proteins. The particular structure of chromatin seems to be determined by levels of DNA methylation, post- translational modifications of histones, and replacement of histones by histone variants (for review see (Hsieh and Fischer, 2005)). Chromatin configurations can also be changed by the function of ATP-dependent chromatin remodeling complexes.
The processes modulating chromatin structure play a key role in the heritable regulation of gene expression.
Figure 2.1. Structure of chromatin. Eukaryotic DNA is organized in a compact structure called chromatin (Chakravarthy et al., 2005).
2.2. Epigenetic gene silencing
The term “epigenetics” was first introduced by Conrad Waddington as “the interactions of genes with their environment that bring the phenotype into being”
(Waddington, 1942). Epigenetics now refers to heritable, but potentially reversible changes in gene expression that occur without a corresponding change in the primary DNA sequence. Epigenetic regulation is often associated with changes in various epigenetic marks such as DNA methylation and histone modifications, which, when combined with chromatin remodeling complexes, maintain a particular epigenetic state of transcription (Figure 2.2). Various organisms exploit epigenetic regulation to control gene expression (For review see (Grewal and Jia, 2007; Yang and Kuroda, 2007; Zaratiegui et al., 2007)). For example, the mating type loci (HML and HMR genes), rDNA, telomeric and centromeric repeats are well studied targets of epigenetic regulation in yeast. Another example is position-effect variegation (PEV) in Drosophila described as the alteration of gene expression when the gene is located near heterochromatin. X-chromosome inactivation in is another example of epigenetic regulation in mammals. The X-inactivation involves dosage compensation of X- linked genes in order to equalize the difference in gene dosage caused by the different number of sex chromosomes in males and females (For review see (Straub and Becker, 2007).
Figure 2.2. Epigenetic marks. The picture illustrated the two main epigenetic marks, DNA methylation and histone tail modifications. Figure taken from Qiu et. al., 2006 (Qiu, 2006).
