ETUDE DE LA FIXATION AUX PROTEINES PLASMATIQUES DU 99MTC-DTPA: PRODUIT RADIOPHARMACEUTIQUE UTILISE EN SCINTIGRAPHIE RENALE

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ANNEE : 2019 THESE N°: 26 / 17 CSVS

THÈSE DE DOCOTORAT

Formation Doctorale : Sciences du Médicament

Présentée par :

Laîla CHEMLAL

Etude de la fixation aux protéines plasmatiques du

Tc-DTPA: Produit Radiopharmaceutique utilisé en

scintigraphie rénale.

Equipe de Recherche en Analyses

Biopharmaceutiques et Toxicologiques

Soutenue publiquement, le 13 / 07 / 2019

Devant Les Membres du Jury :

Pr. Y. Cherrah Faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat Président de jury Pr. M.A. Faouzi Faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat Directeur de thèse Pr.M.Azougagh Ecole Normale Supérieure de l‘Enseignement Technique de Rabat Rapporteur Pr. A. Biyi Faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat Rapporteur Pr. Y. Khabbal Faculté de Médecine et de Pharmacie d‘Agadir Rapporteur Pr. S. Makram Faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat Examinateur Dr. B. Zoubir Centre National de l'Energie, des Sciences et des Techniques

Nucléaires de Rabat

Membre associé UNIVERSITE MOHAMMED V

FACULTE DE MEDECINE ET DE PHARMACIE- RABAT-

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RESUME

Titre : Etude de la fixation aux protéines plasmatiques du 99mTc-DTPA: Produit Radiopharmaceutique utilisé en scintigraphie rénale

Auteur : Laila CHEMLAL

Mots clés : 99mTc-DTPA, Scintigraphie rénale, Précipitation, Ultrafiltration, Dialyse à l‘équilibre, Taux de fixation protéique, Interactions Médicamenteuses, Physiopathologies.

Dans ce travail, nous avons d‘abord maitrisé les techniques de marquage radioactif et les méthodes de vérification et de contrôle de la pureté radiochimique des préparations du 99mTc-DTPA. Dans ce travail, la pureté radiochimique de toutes nos préparations était supérieure à 98%.

Deuxièmement, nous avons déterminé le pourcentage de liaison du 99mTc-DTPA dans le sérum complet (SH) et le Sérum Albumine Humaine (SAH). Nos résultats ont montré qu‘il y avait une différence très significative entre la dialyse à l'équilibre, l'ultrafiltration et la précipitation. De plus, la précipitation est une technique agressive et l‘ultrafiltration nécessite un équipement coûteux. Par contre la dialyse à l‘équilibre semble la technique la plus adaptée pour les études de fixation plasmatique in vitro et in vivo.

Troisièmement, notre objectif était d‘évaluer le déplacement compétitif de la fixation du 99m

Tc-DTPA à la (SAH) en présence de deux médicaments de structures chimiques diverses le Furosémide (FUR) et la Métformine (MET), afin de sonder le site de liaison du 99mTc-DTPA sur la (SAH) en utilisant la technique de dialyse à l‘équilibre et la modélisation moléculaire comme méthode complémentaire. Nos résultats ont démontré que les deux médicaments (FUR et MET) ont été liés à la SAH et ont déplacé la fixation du 99m Tc-DTPA, tandis que les résultats obtenus grâce à la modélisation moléculaire ont montré que le 99mTc-DTPA se fixe sur les sites I et II de la SAH.

Quatrièmement, nous avons étudié les taux de fixation plasmatique du 99mTc-DTPA chez le modèle animal, sous différentes états physio-pathologiques. Nos résultats ont démontré que chez les rats déshydratés et les rats à diurèse osmotique, les taux de fixation plasmatique du 99mTc-DTPA augmentaient par rapport au groupe témoin. Par ailleurs, les taux de fixation plasmatique du 99mTc-DTPA chez les groupes de rats ayant une acidose et une alcalose induites, diminuaient par rapport au groupe témoin.

Enfin, nous avons réalisé une étude clinique, pour la première fois, afin d‘évaluer les taux de fixation plasmatique du 99mTc-DTPA chez des sujets ayant une scintigraphie rénale (n=7).

Nos résultats ont montré qu‘effectivement l‘état physiopathologique et le profil protéique chez nos sujets clinique, affectent les taux de fixation plasmatique du 99mTc-DTPA.

En Conclusion, les études rapportés dans ce travail de thèse ont explorés les rendements de trois techniques de séparation, afin d‘évaluer les taux de fixation plasmatique du 99m

Tc-DTPA in vitro, chez l‘animal et chez des patients. Ceci mènera au but ultime qui est la meilleure prise en charge des patients chez qui une scintigraphie rénale dynamique au 99mTc-DTPA est demandée.

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ABSTRACT

Title: Study of plasma protein binding of 99mTc-DTPA: Radiopharmaceutical product used in renal

scintigraphy

Author: Laila CHEMLAL

Key words: 99mTc-DTPA, Renal scintigraphy, Precipitation, Ultrafiltration, Equilibrium dialysis, Protein binding rate, Drug interactions, Pathophysiology.

In this work, we first mastered radioactive labeling techniques and methods for verifying and controlling the radiochemical purity of 99mTc-DTPA preparations. In this work, the radiochemical purity of all our preparations was greater than 98%.

Secondly, we determined the binding percentage of 99mTc-DTPA in whole serum (SH) and human albumin serum (HSA). Our results showed that there was a very significant difference between equilibrium dialysis, ultrafiltration and precipitation. In addition, precipitation is an aggressive technique and ultrafiltration requires expensive equipment. In contrast, equilibrium dialysis appears to be the most appropriate technique for in vitro and in vivo plasma fixation studies.

Third, our goal was to evaluate the competitive shift of 99mTc-DTPA binding to (SAH) in the presence of two drugs of various chemical structures Furosemide (FUR) and Metformin (MET), to probe the site of 99mTc-DTPA binding to (SAH) using the equilibrium dialysis technique and molecular modeling as a complementary method. Our results demonstrated that both drugs (FUR and MET) were linked to HSA and displaced 99mTc-DTPA binding, while results from molecular modeling showed that 99mTc-DTPA binds to sites I and II of the SAH. Fourth, we studied plasma 99mTc-DTPA binding rates in the animal model under different physio-pathological states. Our results demonstrated that in dehydrated rats and osmotic diuresis rats, 99mTc-DTPA plasma binding levels increased relative to the control group. In addition, the plasma binding levels of 99mTc-DTPA in rat groups with induced acidosis and alkalosis decreased relative to the control group.

Finally, we performed a clinical study, for the first time, to evaluate plasma binding rates of 99mTc-DTPA in subjects with renal scintigraphy (n = 7).

Our results showed that indeed the physiopathological state and the protein profile in our clinical subjects affect the 99mTc-DTPA plasma binding rate.

In conclusion, the studies reported in this thesis explored the yields of three separation techniques, in order to evaluate the 99mTc-DTPA plasma binding rates in vitro, in animals and in patients. This will lead to the ultimate goal of the best management of patients in whom dynamic 99mTc-DTPA renal scintigraphy is required.

4

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_Tc-DTPA

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.ةيضرملا ايجولويزيفلا ،ءاودلا

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_Tc-DTPA

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98%

.

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_Tc-DTPA

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_Tc-DTPA

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ا لجأ نم ،نيمروفتيملاو ديميسوريفلا : نيتفمتخم نيتياميك نيتبيكرتب نيراقع دوجوب

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_Tc-DTPA

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_Tc-DTPA

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طبر تلادعم مييقت

_Tc-DTPA

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REMERCIEMENTS

Un travail scientifique n‘est jamais le fruit d‘une seule personne, il est l‘émanation d‘une communauté, d‘un réseau d‘enseignants et de chercheurs. C‘est le moment de remercier toutes les personnes qui ont permis que ce travail se réalise.

Je tiens tout d‘abord à remercier mon directeur de thèse Monsieur le Pr. My Abbes FAOUZI, de m‘avoir témoigné sa confiance en acceptant la direction de ce travail avec beaucoup de bienveillance.

Je remercie Monsieur le Dr. Brahim ZOUBIR de m‘avoir initié à la pratique, et à la maîtrise des techniques de manipulation des produits radiopharmaceutiques lors de mon stage de recherche au sein du Centre National de l‘Energie, des Sciences et des Techniques Nucléaires, et de m‘avoir aidé par la suite à analyser, à valoriser mes résultats de recherche et à rédiger ma thèse.

J‘adresse de chaleureux remerciements à Madame le Pr. Sanaa MAKRAM, Merci pour vos aides précieuses, vos conseils et votre amitié.

Je tiens à remercier grandement Monsieur le Pr. Yahya CHERRAH, Professeur de la Faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat, d‘avoir accepté de juger ce travail et de participer à mon jury de thèse en qualité de président.

Je remercie infiniment tous les membres du jury de m'avoir fait l'honneur d'accepter d'évaluer ce travail.

A Monsieur le Pr. Mohammed AZOUGAGH, pour avoir accepté de participer à ce jury de thèse, veuillez trouver ici l‘expression de ma sincère reconnaissance.

A Monsieur le Pr. Abdelhamid BIYI, j‘espère que vous aurez plaisir à parcourir cette thèse tout comme je suis heureuse de votre présence dans ce jury. Veuillez recevoir l‘expression de toute ma reconnaissance.

6 A Monsieur le Pr. Youssef KHEBBAL, je vous remercie pour l‘intérêt porté à mon travail en acceptant de faire partie du jury de thèse. Soyez assurée de ma profonde gratitude.

Monsieur le Pr. DOUDOUH le chef de service de médecine nucléaire à l‘Hôpital d‘Instruction Militaire Mohammed V de Rabat, Madame le Pr. AAOUAD le chef de service de médecine nucléaire au Centre Hospitalier Universitaire de Rabat. Veuillez trouver ici l‘expression de ma gratitude de m‘avoir accueilli au sein de vos services.

Mes plus vifs remerciements s‘adressent :

A tous les professeurs et le personnel du Laboratoire de Pharmacologie et Toxicologie, notamment Pr

Y. BOUSLIMAN.

Au CNESTEN, notamment la Pharmacienne responsable Dr N. BENTALEB.

Aux deux services de médecine nucléaires au sein de à l‘Hôpital d‘Instruction Militaire Mohammed V et au Centre Hospitalier Universitaire de Rabat, et la Pharmacie Centrale de l‘Hôpital d‘Instruction Militaire Mohammed V de Rabat.

À mes collègues et à tous les chercheurs dans les Laboratoires de Biotechnologie, de Chimie Thérapeutique, de Chimie Analytique de la Faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat, et du Laboratoire des Analyses Physico-chimiques de la Direction des Médicaments et de Pharmacie, qui m‘ont aidé, encouragé et soutenu et qui ont contribué à rendre l‘ambiance de travail très agréable.

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DEDICACES

Que MES PARENTS trouvent à travers cette thèse l’expression de ma profonde reconnaissance et ma gratitude éternelle pour l’amour qu’ils m’ont témoigné, le soutien indéfectible et constant et pour la confiance qu’ils m’ont accordée durant toutes ces longues années d’études. J’espère en avoir été digne, mille fois Merci.

A RAFIK et IDIR, Tout simplement Merci !

A MON MARI, Merci de m’apporter force et courage ainsi de m’avoir soutenu dans les épreuves les plus difficiles de ma vie.

A MOHAMMED, SALWA et RIM Je vous suis profondément reconnaissante pour tout ce que vous avez fait pour moi. Une chose est sure : je l’oublierais jamais.

A Toute ma FAMILLE, à Tous mes AMI(E)S et à Tous ceux qui m’ont encouragé de près ou de loin et m’ont souhaité la réussite durant la réalisation de ce travail de recherche.

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PUBLICATIONS SCIENTIFIQUES

Dans Le Cadre Du Travail De Thèse :

Cette thèse a fait l‘objet de plusieurs articles scientifiques dans des journaux internationaux, et des communications orales et affichées dans des congrès nationaux et internationaux.

Articles scientifiques

L. Chemlal, S. Makram, Br. Zoubir, Y. Cherrah, My. A. Faouzi. Étude comparative de

l‘estimation in vitro de la fixation plasmatique du 99m

Tc-DTPA utilisé en exploration rénale. Annales Pharmaceutiques Françaises 71, 418-422 (2013).

L. Chemlal, S. Makram, B. Zoubir, Y. Cherrah, MyA. Faouzi. Equilibrium Dialysis and

Ultrafiltration Compared for Determining the Protein Binding Rates of 99mTc-DTPA. American Scientific Research Journal for Engineering, Technology, and Sciences (ASRJETS) 49, No 1, 19-27 (2018).

L. Chemlal, J. Akachar, S. Makram, B. Zoubir, Y. Cherrah, R. Eljaoudi, A. Ibrahimi, MyA. Faouzi.

The displacement study of 99mTc-DTPA – Human Serum Albumin binding in presence of Furosemide

and Metformin by using equilibrium dialysis and molecular docking. IUBMB Life TBMB-18-0626-AA (2019).

Communication Orale :

L. Chemlal, S. Makram, B. Zoubir, Y. Cherrah, MyA. Faouzi. Etude de la Fixation Plasmatique

du 99mTc-DTPA : Produit Radiopharmaceutique utilisé en Scintigraphie Rénale. 4ème FORUM

AFRICAIN DE LA SANTE – UIASS, le 11 Mai 2018.

Communications Affichées :

L.Chemlal, S. Makram, B. Zoubir, Y. Cherrah, MyA. Faouzi. Détermination de la fixation des

radiopharmaceutiques sur les protéines plasmatiques in vitro : Cas de 99mTc-DTPA. 4èmes journées scientifiques du CEDOC-SVS de l‘Université Mohammed V Souissi. Le 16 Février 2013.

Chemlal Laila, Makram S, Zoubir B, Cherrah Y, Faouzi MA. Determination of

radiopharmaceutical plasmatic proteins binding: Case of 99 m Tc-DTPA. 7th International Congress of Pathophysiology, Faculty of sciences, Mohamed V University Rabat Morocco. 4-7 September 2014.

9 Dans Le Cadre De Collaborations :

Articles scientifiques

Nguema Ongone, Redouane Achour, Mostafa El Ghoul, Latyfa El Ouasif, Meryem El Jemli,

Laila Chemlal, Yahia Cherrah, Katim Alaoui, Amina Zellou..Analgesic and Antioxidant Activities of

4-Phenyl-1, 5-benzodiazepin-2-one and Its Long Carbon Chains Derivatives. Terence Journal of Chemistry (2019).

K. Sayah , L. Chemlal, I. Marmouzi, M. El Jemli, Y. Cherrah, My El Abbes Faouzi. In vivo anti-inflammatory and analgesic activities of Cistus salviifolius (L.) and Cistus monspeliensis (L.) aqueous extracts. South African Journal of Botany 113 (2017) 160–163

H Naceiri Mrabti, I Marmouzi, K Sayah, L Chemlal, Y El Ouadi, H Elmsellem, Y Cherrah, My A Faouzi. Arbutus unedo L. aqueous extract is associated with in vitro and in vivo antioxidant activity. Journal of materials and Environmental Sciences 8 (1), 217-224 (2017).

K. Karrouchi, L. Chemlal, J. Taoufik, Y. Cherrah, S. Radi, M. El Abbes Faouzi, M. Ansar. Synthesis, antioxidant and analgesic activities of Schiff bases of 4-amino-1,2,4-triazole derivatives containing a pyrazole moiety. Annales Pharmaceutiques Françaises (2016)

K.Karrouchi, L.Chemlal, L.Doudach, J.Taoufik, Y.Cherrah, S.Radi, MyA.Faouzi and M.Ansar. Synthesis, anti-inflammatory and antioxidant activities of some new pyrazole derivatives. Journal of Pharmacy Research. Volume 8, Issue 8, Pages 1171-1177, (2014).

K. Karrouchi, L. Doudach, L. Chemlal, M. Karim, J. Taoufik, Y. Cherrah, S. Radi, M E. Faouzi and M. Ansar. Synthesis and pharmacological evaluation of some new pyrazole derivatives. International Journal of Pharmacy. Volume4, Issue 2, Pages 79-87, (2014).

Communication Orale:

L. Chemlal, M. Benabbes, F. Elaboui, F. Amrati, B. Meddah. Antioxidant and Antibacterial

activities of Berberis hispanica and Erodium guttatum. Congrès Sipam6, Faculté de Sciences Semlalia, Université Cadi Ayyad Marrakech, 16-18 Mars 2017.

Communication Affichée :

Houda Attjioui. Saber Boutayeb. Laila Chemlal. Bouchra Meddah Le Comportement Alimentaire Des patients Cancéreux : Etude Prospective. XIèmes Journées Nationales d'Actualités en Oncologie .Nantes, France. 11-12-13 Octobre 2017.

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LISTE DES FIGURES

Figure 1: Genèse des médicaments radiopharmaceutiques ... - 28 -

Figure 2: Schéma de la filiation du Molybdène99 au 99Ru stable [1]. ... - 36 -

Figure 3: Schéma du Générateur du Technétium [15]. ... - 36 -

Figure 4: Cuve chromatographique et séparation des composées de l‘échantillon sur la plaque ... - 48 -

Figure 5: Radiochromatographe ... - 48 -

Figure 6: Exemple de Radio-chromatogramme ... - 48 -

Figure 7: Schéma de Préparation et injection d‘un produit radiopharmaceutique... - 55 -

Figure 8: Schéma des différentes Techniques d'imagerie urinaire en médecine nucléaire [27] ... - 55 -

Figure 9: Les voies de filtration des radiotraceurs dans diverses parties du néphron [28] ... - 56 -

Figure 10: Exemple d'un rénogramme pour un rein normal ... - 60 -

Figure 11: Structure chimique 2D de la molécule DTPA avant le marquage au 99mTc ... - 63 -

Figure 12: Structure chimique 3D de la molécule 99mTc-DTPA... - 63 -

Figure 13: Schéma de la Filtration glomérulaire du 99mTc-DTPA ... - 63 -

Figure 14: Le point d'interception sur l'axe des ordonnés (Y) est équivalent à n*Ka. Le point d'interception sur l'axe des abscisses (X) est équivalent à n. la pente est égale à1/Ka. ... - 75 -

Figure 15 : Le point d'interception sur l'axe des ordonnés (Y) est équivalent à n*Ka*P. Le point d'interception sur l'axe des abscisses (X) est équivalent à n*P.la pente est équivalente à –Ka. ... - 75 -

Figure 16: Structure 3D de l‘Albumine Humaine ... - 80 -

Figure 17: Principe de la technique d‘ultrafiltration ... - 80 -

Figure 18: Principe de la technique de dialyse à l‘équilibre ... - 80 -

Figure 19: Kit du lyophilisat d‘acide diéthylène triaminopentaacétique (ROTOP), 5mg. ... - 96 -

Figure 20: Schéma du contrôle de la qualité radiochimique du produit radiopharmaceutique par chromatographie sur couche mince. ... - 96 -

Figure 21: Schéma du contrôle de la qualité radiochimique du produit radiopharmaceutique par chromatographie sur couche mince. ... - 96 -

Figure 22: Figure 16: Sur la gauche : appareil de dialyse à l‘équilibre (DIANORM® Munich Allemagne), sur la droite deux demi-cellule ... - 102 -

Figure 23: Figure 15: Dispositif d'ultrafiltration avec membrane Ultracet YMT... - 102 -

Figure 24: Structure proposée de 99mTc-DTPA pour étude de modélisation moléculaire [121] ... - 117 -

Figure 25: Effet d‘interactions médicamenteuses sur les taux de liaison du 99m Tc-DTPA à l'albumine humaine (40g/L) ... - 117 -

Figure 26: Représentation de la structure et des modes de liaison du 99mTc-DTPA, FUR et MET à la SAH. Comparaison d‘amarrage en. ... - 118 -

11 Figure 27: Représentation de la SAH complexée avec des modes de reliure: A-FUR, B-MET, C et D 99m Tc-DTPA ... - 119 - Figure 28: Modes de liaison du 99mTc-DTPA amarré à AH en 3D. ... - 119 - Figure 29: Interactions et modes de liaison du FUR et MET à la AH ... - 120 - Figure 30: Les Types d‘interactions et modes de liaisons en 2D, pour 99m

Tc-DTPA [A], FUR [B] et MET [C] avec la AH utilisant le visualiseur Discovery Studio 4.5 ... - 121 - Figure 31: Cage métabolique pour la collecte des urines de 24h, chez le rat. ... - 131 - Figure 32: Changement du volume des urines chez les rats témoins et les rats avec des conditions physiologiques altérées. *Différence statiquement significative par rapport au groupe témoin à p <0,05 .... - 135 - Figure 33: Variation du taux de pH de l'urine chez les rats témoins et les rats avec des conditions physiologiques altérées. * Différence statiquement significative par rapport au groupe témoin à p <0,05 ... - 136 - Figure 34: Variation des niveaux de créatinine dans l'urine des rats témoins et des rats avec des conditions physiologiques altérées. * Différence statiquement significative par rapport au groupe témoin à p <0,05 ... - 137 - Figure 35: Evolution dans le temps de la liaison du Tc99mDTPA aux protéines plasmatiques chez les rats témoins et chez les rats présentant des conditions physiologiques modifiées, par usage de la méthode d‘Ultrafiltration. * Différence statiquement significative par rapport au groupe témoin à p <0,05 ... - 140 - Figure 36: Evolution dans le temps de la liaison du Tc99mDTPA aux protéines plasmatiques chez les rats témoins et chez les rats présentant des conditions physiologiques modifiées, par usage de la méthode de dialyse à l'équilibre. * Différence statiquement significative par rapport au groupe témoin à p <0,05 ... - 141 -

- 12 -

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1: Exemple de complexes de technétium utilisés en scintigraphie rénale ... - 41 -

Tableau 2: Dosimétrie des explorations diagnostiques en médecine nucléaire [49] ... - 64 -

Tableau 3: Fixation Protéique du 99mTc-MAG3 dans le sang humain après 20 minutes de l‘injection ... - 88 -

Tableau 4: Fixation Protéique du 99mTc-DTPA, étudiée par plusieurs méthodes in vitro. ... - 88 -

Tableau 5: Fixation protéique du 99mTc-DTPA sur plasma humain ... - 89 -

Tableau 6: Pourcentage de la fixation Protéique de six Kits de DTPA commercialisés dans le marché Européen - 89 - Tableau 7: Pureté Radiochimique du 99mTc-DTPA en % (RCP) ... - 97 -

Tableau 8: Taux de fixation du 99mTc-DTPA au SH et SAH, par la technique de Précipitation à 25°C ; (% ± SD) - 103 - Tableau 9: Taux de fixation du 99mTc-DTPA au SH et SAH, par la technique d‘Ultrafiltration à 25°C ; (% ± SD) ... - 104 -

Tableau 10: Taux de fixation du 99mTc-DTPA au SH et SAH, par la technique de Dialyse à l‘équilibre à 37°C ; (% ± SD) ... - 106 -

Tableau 11: Résultats du meilleur mode Amarrage de HSA avec 99mTc-DTPA, FUR et MET obtenu à partir du logiciel iGEMDOCK 2.1v. En couleur verte les liaisons hydrogène. En rouge, les meilleures valeurs de liaison d'énergie FUR sur HSA. ... - 122 -

- 13 -

LISTE DES ABBREVIATIONS

99m

Tc-DTPA Diéthylènetriaminepentaacétate De Technétium

CCM Chromatographie Sur Couche Mince

Tc Technétium

EDTA L'acide Ethylènediaminetétraacétique

eV Electron-Volt

Bq Becquerel

Ci Curie

Mo Molybdène

NaCl Chlorure De Sodium

OH L'hydroxyde

MAG 3 Mercaptoacetyltriglycine

DMSA Dimercaptosuccinic Acid

AMM Autorisation De Mise Sur Le Marché

HMDP Hydroxymethylene Diphosphonate

PRC Pureté Radiochimique

DFG Débit De Filtration Glomérulaire

SAH Sérum Albumine Humaine

UF Ultrafiltration DE Dialyse A L‘équilibre PM Poids Moléculaire SH Sérum Humain FUR Furosémide MET Metformine

- 14 -

SOMMAIRE

RESUME ... 2

TITRE : ETUDE DE LA FIXATION AUX PROTEINES PLASMATIQUES DU 99M_TC-DTPA: PRODUIT RADIOPHARMACEUTIQUE UTILISE EN SCINTIGRAPHIE RENALE ... 2

AUTEUR : LAILA CHEMLAL ... 2

DEDICACES ... 7

PUBLICATIONS SCIENTIFIQUES ... 8

LISTE DES FIGURES ... 10

LISTE DES TABLEAUX ... - 12 -

LISTE DES ABBREVIATIONS ... - 13 -

INTRODUCTION GENERALE ... - 20 -

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ... - 22 -

CHAPITRE I : RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES SUR LES PRODUITS RADIOPHARMACEUTIQUES ET LA MEDECINE NUCLEAIRE ... 24

-RAPPELS SUR LES PRODUITS RADIOPHARMACEUTIQUES ... - 24 -

I. HISTORIQUE ET ASPECT REGLEMENTAIRE [1] ... - 24 -

II. DEFINITION D’UN PRODUIT RADIOPHARMACEUTIQUE ET REGLEMENTATION ... - 25 -

III. CLASSIFICATION DES PRODUITS RADIOPHARMACEUTIQUES ... - 30 -

IV. DOMAINE D’APPLICATION DES PRODUITS RADIOPHARMACEUTIQUES ... - 31 -

1. Applications thérapeutiques ... 31

-2. Applications diagnostiques ou explorations scintigraphiques ... 31

- 15 -

1. Générateur 99Mo/99mTc ... 33

-2. Production du Molybdène99 ... 34

-a) Irradiation de 98Mo métallique ou le trioxyde de molybdène Mo203 (naturel ou enrichi en 98Mo), avec des neutrons thermiques dans un réacteur nucléaire ... 34

-b) Filiation radioactive : ... 34

-3. Séparation du 99mTc du 99Mo ... 34

-a) La colonne d’alumine ... 35

-4. Contrôle de qualité du système Générateur 99Mo/99mTc: ... 37

-VI. STRUCTURE ET PROPRIETES CHIMIQUES DU TECHNETIUM 99M_{TC ... - 39 -}

VII. KITS FROIDS (VECTEURS) ... - 40 -

VIII. PREPARATION DES PRODUITS RADIOPHARMACEUTIQUES MARQUES AU 99M_{TC - 42} - 1. Considérations générales du processus de marquage ... 42

-2. Marquage Par Le 99mTc ... 43

-3. Incubation ... 43

-4. Contrôle de qualité du Produit Radiopharmaceutique ... 44

-a) Contrôle de la pureté radiochimique par CCM ... 45

-b) Principe de la chromatographie sur couche mince ... 46

-c) Appareillage de la CCM (Figure 4, 5,6) ... 46

-RAPPELS SUR LA MEDECINE NUCLEAIRE ... - 49 -

I. HISTORIQUE DE LA MEDECINE NUCLEAIRE ... - 49 -

II. DEFINITION DE LA MEDECINE NUCLEAIRE ... - 50 -

III. APPLICATIONS DE LA MEDECINE NUCLEAIRE ... - 50 -

1. Applications thérapeutiques ... 51

-2. Applications diagnostiques ... 51

-a) Définition de la scintigraphie ... 52

-b) Principe de la scintigraphie ... 52

-IV. SCINTIGRAPHIE RENALE ... - 53 -

-- 16 --

a) 99mTc –DMSA, Traceur statique ... 58

-2. La scintigraphie rénale dynamique ... 58

-a) 99mTcMAG3 (éliminé par sécrétion tubulaire) ... 59

-b) 99mTcDTPA (éliminées par filtration glomérulaire) ... 61

-c) Calcule du débit de la filtration glomérulaire du 99mTcDTPA [49] ... 64

-V. RADIOPROTECTION ... - 68 -

CHAPITRE II : FIXATION PROTEIQUE DES MEDICAMENTS ... 70

-I. NOTION DE LA FIXATION PROTEIQUE DES MEDICAMENTS (PROTEIN BINDING) .... - 70 -

1. Introduction ... 70

-2. Protéines fixatrices ... 71

-a) Albumine (Figure 16) ... 71

-b) Acide Alpha1glycoprotéine ... 72

-c) Autres protéines ... 72

-II. PARAMETRES DE LA FIXATION PROTEIQUE DES MEDICAMENTS ... - 73 -

1. Caractérisation analytique des paramètres de fixation ProtéineMédicament ... 73

-2. Caractérisation graphique des paramètres de fixation ProtéineMédicament... 75

-a) Représentation de Scatchard [66] : ... 75

-b) Représentation de Rosenthal [67] : ... 75

-III. TECHNIQUES D’ETUDE DE LA FIXATION PROTEIQUE DES MEDICAMENTS ... - 76 -

1. La microdialyse ... 77

-2. Précipitation... 77

-3. Ultrafiltration (Figure 17) ... 78

-4. Dialyse à l’équilibre (Figure 18) ... 78

-5. Modélisation Moléculaire ... 81

-IV. MODIFICATIONS DE LA FIXATION PROTEIQUE DES MEDICAMENTS ... - 82 -

1. Les interactions médicamenteuses ... 82

-2. L’insuffisance rénale ... 83

-- 17 -- V. CONSEQUENCES DES MODIFICATIONS DE LA FIXATION PROTEIQUE DES

MEDICAMENTS ... - 84 -

1. Conséquences cliniques ... 84

-2. Conséquences pharmacocinétiques ... 84

-CHAPITRE III : FIXATION DES 99M_{TC-RADIOPHARMACEUTIQUES AUX PROTEINES} PLASMATIQUES ... 86

PROBLEMATIQUE... 91

-PARTIE EXPERIMENTALE ... - 92 -

CHAPITRE I : MARQUAGE DU KIT DTPA ET CONTROLE DE LA PURETE RADIOCHIMIQUE ... - 94 - I. INTRODUCTION ... - 94 -

II. MATERIELS ET METHODES ... - 94 -

1. Reconstitution du Kit 99mTcDTPA ... 94

-III. RESULTATS ET DISCUSSION ... - 97 -

CHAPITRE II : MISE AU POINT, VALIDATION ET COMPARAISON DE TROIS TECHNIQUES ANALYTIQUES DE SEPARATION. ESTIMATION IN VITRO DE LA FIXATION PLASMATIQUE DU 99M_{TCDTPA UTILISE EN SCINTIGRAPHIE RENALE. ... 99}

-I. INTRODUCTION ... - 99 -

II. MATERIELS ET METHODES ... - 99 -

1. La précipitation : ... 100 -2. L’ultrafiltration : ... 100 -3. Dialyse à l'équilibre : ... 100 -III. RESULTATS ... - 103 - 1. Précipitation... 103 -2. L’ultrafiltration ... 104

-- 18 --

3. Dialyse à l’équilibre ... 105

-IV. DISCUSSION ... - 106 -

V. CONCLUSION ... - 109 -

CHAPITRE III : INTERACTIONS MEDICAMENTEUSES : EFFET DU FUROSEMIDE ET DE LA METFORMINE SUR LES TAUX DE FIXATION DU 99M_{TC-DTPA, ÉTUDE IN VITRO ET} MODELISATION MOLECULAIRE ... 111

-I. INTRODUCTION ... - 111 -

II. MATERIELS ET METHODES ... - 113 -

1. Médicaments et produits chimiques ... 113

-2. Préparation des échantillons ... 113

-3. Equipement de dialyse d'équilibre ... 113

-4. Calcul des taux de liaison du 99mTcDTPA au sérum Albumine humaine (SAH) ... 114

-5. Études d'amarrage moléculaire ... 114

-III. RÉSULTATS ET DISCUSSION ... - 115 -

IV. CONCLUSION ... - 125 -

EFFET DES ALTERATIONS PHYSIOPATHOLOGIQUES SUR LES TAUX DE FIXATION PROTEIQUE DU 99M_{TC-DTPA CHEZ LE RAT.CHAPITRE IV : ETUDE IN VIVO : EFFET DES} ALTERATIONS PHYSIOPATHOLOGIQUES CHEZ LE RAT SUR LES TAUX DE FIXATION PROTEIQUE DU 99M_{TCDTPA ... 126}

-I. INTRODUCTION ... - 127 -

II. MATERIELS ET METHODES ... - 128 -

1. Induction des conditions physiologiques modifiées chez le modèle animal ... 128

-2. Préparation radiopharmaceutique ... 132

-3. Étude de liaison aux protéines (PB) ... 132

-a) Technique d'ultrafiltration (UF)... 132

-b) Technique de dialyse d'équilibre (ED) ... 133

-- 19 --

III. RESULTS ... - 134 -

1. Modification des conditions physiologiques chez le rat ... 134

-2. Mesure de la liaison de la protéine 99mTcDTPA chez le rat en utilisant les méthodes UF et ED ... 138

-IV. DISCUSSION ... - 142 -

V. CONCLUSION ... - 144 -

CHAPITRE V : ETUDE CLINIQUE : ETUDE DE LA FIXATION PROTEIQUE DU 99M_TC-DTPA CHEZ DES PATIENTS AYANT EU UN EXAMEN DE SCINTIGRAPHIE RENALE ... 146

-CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES ... - 154 -

- 20 -

INTRODUCTION GENERALE

Les médicaments radiopharmaceutiques utilisés dans les services de médecine nucléaire sont des médicaments contenant des radioéléments artificiels appelés radionucléides, employés à des fins diagnostiques ou thérapeutiques. Ils se présentent soit sous forme de spécialités pharmaceutiques contenant des radionucléides livrées prêtes à l‘emploi, soit sous forme de préparations radiopharmaceutiques reconstituées à partir de trousses, précurseurs, ou générateurs.

La qualité des examens réalisés et donc la valeur du diagnostic clinique dépendent de la qualité des préparations radiopharmaceutiques mais aussi du comportement cinétique in vivo du produit administré. En effet, pour certaines applications diagnostiques comme le cas des explorations fonctionnelles rénales, le taux de fixation du médicament radiopharmaceutique aux protéines plasmatiques est un paramètre fondamental pour la valeur du diagnostic clinique, c‘est l‘exemple du 99m

Tc-DTPA utilisé pour évaluer le taux de filtration glomérulaire et dont seule la fraction libre est filtrée par les reins. Le calcul de la clairance rénale tient compte seulement de cette fraction libre. Différents facteurs peuvent influer le taux de fixation protéique et modifier leurs caractéristiques pharmacocinétiques et par conséquent affecter la qualité des images scintigraphiques et discréditer la valeur du diagnostic clinique. Le plus souvent cette fixation est diminuée soit par diminution de la concentration des protéines vectrices, soit par inhibition par des substances endogènes ou exogènes.

Il est ainsi nécessaire, particulièrement dans le cas des traceurs rénaux, d‘évaluer les fractions libres et les fractions liées ainsi que les paramètres physiologiques pouvant agir sur le taux de fixation plasmatique et le rôle de certains facteurs exogènes (co-médication, médicaments acides, ...) sur cette fixation.

L‘objectif de notre travail est d‘étudier les paramètres modulant le taux de fixation aux protéines plasmatiques du médicament radiopharmaceutique et traceur rénal : 99mTc-DTPA, en vérifiant les critères de liaison spécifique (critère d‘affinité, de saturabilité, de réversibilité, …) et les critères de la liaison non spécifique avec la qualité radiochimique et certains facteurs physico-chimiques, exemple : mesure de coefficient de partage, la détermination de la répartition sanguine ainsi des études métaboliques in vitro (réaction de compétition, stabilité de marquage dans le sang…) et in vivo (analyses sanguines et urinaires).

- 21 - Ainsi, le présent travail sera structuré en trois parties

Une première partie analytique (Chapitres I et II) portant sur les :  Procédures de préparation du produit radiopharmaceutique.

 Et de Contrôle de la pureté radiochimique du radiopharmaceutique, par la technique de chromatographie sur couche mince CCM.

 Puis la mise au point et la comparaison des trois techniques analytiques : à savoir la technique de Précipitation, d‘Ultrafiltration, et de la Dialyse à l‘équilibre pour la détermination in vitro et in vivo des taux de fixation aux protéines plasmatiques par incubation des traceurs avec des solutions de sérum albumine humaine et avec du plasma humain.

Une deuxième parties (Chapitres III et IV) sera dédiée à la :

 Détermination des paramètres médicamenteux modulant la liaison plasmatique in vitro par incubation des traceurs avec du sérum humain ou solution de SAH en présence de certaines substances exogènes (médicaments).

 Caractérisation de la fixation plasmatique du traceur rénal in vivo chez l‘animal (rat).

Dans une troisième partie (Chapitre V), nous étudierons :

 Application des techniques analytiques validées en clinique par évaluation de la fixation chez des patients ayant reçu le 99mTc-DTPA pour la scintigraphie rénale.

 Puis l‘étude des différents facteurs physiopathologiques pouvant influencer la fixation aux protéines plasmatiques des 99mTc-DTPA en étudiant les liens avec les conditions physiologiques et les médicaments associés.

- 22 -

- 23 -

CHAPITRE I

Rappels Bibliographiques sur les Produits

Radiopharmaceutiques et la Médecine Nucléaire

- 24 -

CHAPITRE I : Rappels Bibliographiques sur les Produits

Radiopharmaceutiques et la Médecine Nucléaire

RAPPELS SUR LES PRODUITS

RADIOPHARMACEUTIQUES

I.

HISTORIQUE ET ASPECT REGLEMENTAIRE

La notion de médicament radiopharmaceutique a été associée dans un premier temps à la découverte de la radioactivité artificielle, lorsqu‘au début des années 30 du siècle dernier, des traceurs radioactifs furent utilisés pour la première fois aux états unis pour traiter certaines maladies. Quelques années plus tard, la discipline médicale qui organise l‘application des techniques nucléaires en médecine fut structurée autour d‘une nouvelle spécialité médicale appelée la médecine nucléaire.

Cette spécialité « la médecine nucléaire » consiste en l‘injection au patient d‘une substance pharmaceutique associé à un radio-isotope ou radionucléide, dite produit radiopharmaceutique, qui se dirigera vers un tissu biologique ou vers un organe qu‘il va reconnaitre sélectivement. La substance pharmaceutique auquel est greffé ce radionucléide est conçu de manière à favoriser une concentration de ce radionucléide sur le tissu ou l‘organe ciblé. La radioactivité émise par ce radionucléide sera alors mise à profit soit pour visualiser sa localisation (diagnostic), soit pour initier la détérioration des cellules environnantes (thérapies).

En France, vers les années 60, les centres de recherche du Commissariat à l‘Energie Atomique en France, commençaient à fournir des radionucléides pour des fins médicales mais sans une base réglementaire proprement dite.

La Belgique a été, en 1963, le premier pays européen à fixer des obligations pour la production, l‘importation, la détention et l‘utilisation des radio-isotopes sous forme non scellée.

Vers les années 1970, plusieurs pays européens (France, Royaume Uni, Danemark, Belgique) ont commencé à réglementer la production, la préparation et l‘usage de ces produits, et ont mis en place des procédures d‘enregistrement. A cette époque, les radiopharmaceutiques n‘étaient pas encore considérés officiellement comme des médicaments. Ce n‘est qu‘en mai 1989 que la direction du conseil de ‗Union Européenne n° 89/343 a fait entrer les radiopharmaceutiques dans le domaine du médicament en prévoyant des dispositions complémentaires pour les produits radiopharmaceutiques.

- 25 -

II.

DEFINITION D’UN PRODUIT RADIOPHARMACEUTIQUE ET

REGLEMENTATION

La définition de « médicament radiopharmaceutique » est apparue dans 1a législation française après promulgation de 1a loi du 8 décembre 1992 [1].

Du fait de leur nature radioactive, les radiopharmaceutiques sont soumis à une double réglementation : celle des médicaments (notamment des substances vénéneuses) et celle des radioéléments, avec pour conséquence un double référentiel législatif, réglementaire et normatif ainsi que des contraintes spécifiques à toutes les étapes de leur circuit.

Actuellement, Le Maroc dispose d‘une installation nucléaire (le Centre National de l‘Energie, des Sciences et des Techniques Nucléaires) dont la mission inclut la production des radiopharmaceutiques.

En Novembre 2006, le Dahir n° 1-06-151 du 30 Chaoual 1427, portant promulgation de la loi n° 17-04 portant code du médicament et de la pharmacie, a donné une définition au médicament radiopharmaceutique [2].

Article 2 : << On entend par : (…)

 Le médicament radiopharmaceutique, est tout médicament contenant un ou plusieurs isotopes radioactifs, incorporés à des fins médicales sous forme de générateur, trousse ou précurseur. On désigne sous les noms de :

 Générateur : tout système contenant un radionucléide parent déterminé, servant à la production d'un radionucléide de filiation obtenu par élution ou par toute autre méthode et utilisé dans un médicament radio pharmaceutique.

 Trousse : toute préparation qui doit être reconstituée ou combinée avec des radionucléides dans le médicament produit radiopharmaceutique final.

 Précurseur : tout autre radionucléide produit pour le marquage radioactif d'une autre substance avant administration.

Toutefois, les radiopharmaceutiques au Maroc, demeurent soumis à une double réglementation : La première, relative à l‘aspect pharmaceutique du produit telle que prévue par la loi et commune à l‘ensemble des médicaments : loi 17-04 portant code du médicament et de la pharmacie.

La seconde, relative aux aspects radioactifs et aux obligations de protection des individus contre les effets nuisibles des rayonnements ionisants : celle d‘une source radioactive liée à un régime d‘autorisation spécifique du Centre national de radioprotection CNRP : la loi n° 005-71 du 12 Octobre 1971 relative à la protection contre les rayonnements ionisants.

- 26 - Après la création de la nouvelle agence marocaine AMSSNUR chargée de la protection de l‘homme, de la société et de l‘environnement contre les risques liés aux utilisations des rayonnements ionisants. Une nouvelle loi portant création de cette agence a aussi cadré le cadre juridique de l‘utilisation des rayonnements ionisants pour des fins médicales dont les radiopharmaceutiques.

Les organismes internationaux concernés et les gouvernements de différents pays ont mis en place des règlementations spécifiques auxquelles doivent répondre tous les processus liés à : la production, la préparation, la détention, la commercialisation et l‘utilisation des médicaments radiopharmaceutiques. Ces règlements visent à protéger en permanence le manipulateur, le patient, le publique, et l‘environnement et font objet de plusieurs monographies.

Ces monographies déterminent, pour chaque produit des normes de qualité à respecter [3] et classées dans la Pharmacopée. Au Maroc, la Pharmacopée européenne en est la référence. La pharmacopée américaine a également été adoptée officiellement comme référence au Maroc tout récemment.

La Pharmacopée Européenne a aussi défini les préparations radiopharmaceutiques comme étant les uniques formulations médicamenteuses contenant des radio-isotopes qui sont utilisés en médecine à des fins diagnostics et / ou thérapeutiques [4] [5] (Figure 3). La Pharmacopée Européenne a défini aussi les exigences de la pureté et de l‘activité pour une large gamme de préparations radiopharmaceutiques à visée thérapeutique ou diagnostique. Ces préparations sont conçues pour délivrer dans l‘organisme la dose radioactive minimale utile, ce qui rend singulièrement complexe le contrôle de leur qualité et requiert des méthodologies très spécifiques (pureté radiochimique, endotoxines, teneur en radioactivité, etc.), que décrivent les monographies.

Les médicaments radiopharmaceutiques utilisés dans les services de médecine nucléaire sont donc des médicaments contenant des radioéléments artificiels (REA), appelés radionucléides (A), ces derniers peuvent être utilisés soit sous forme chimique très simple, soit liés à des vecteurs spécifiques (B) d‘un organe, d‘une fonction physiologique ou d‘une pathologie : molécules organiques, analogues de molécules biologiques, anticorps monoclonaux, particules (colloîdes, macroagrégats), cellules sanguines, etc.

L'utilisation d'un produit radiopharmaceutique est dictée par les caractéristiques des deux composants (A+B) :

- 27 - A- radionucléide: (99mTc; 51Cr; 123I …) + B- vecteur: (DTPA; EDTA; Hippurate …)

Les considérations générales lors de la conception de nouveaux produits radiopharmaceutiques sont sa disponibilité, son faible coût, la demi-vie optimale du radionucléide, la courte demi-vie efficace du radiopharmaceutique, l'émission de photons à énergie appropriée (100 à 200 keV), l'émission négligeable de particules, la capture d'électrons ou la transition isomérique, et le rapport signal / bruit [6].

Ces critères sont extrêmement stricts, et par conséquent, aucun produit radiopharmaceutique n'est idéal pour une situation donnée, celle du choix étant le meilleur de plusieurs compromis. En dehors de ces considérations générales, un aperçu du mécanisme de localisation du produit radiopharmaceutique dans différents organes fournit l'indice de la conception de l'agent destiné à un organe ou à une voie spécifique.

Les facteurs à prendre en compte avant, pendant et après la préparation du radiopharmaceutique sont la spécificité, la compatibilité, la stœchiométrie, la charge et la taille de la molécule, la solubilité, la stabilité, l'inertie cinétique in vivo et la capacité de liaison aux protéines [7] [8].

Chaque radionucléide est caractérisé par :

- Une période invariable, exprimée en unité de temps.

- La nature et l‘énergie de son ou de ses rayonnements, exprimée en électronvolts (eV), kilo-électron volts (keV) ou mégakilo-électronvolts (MeV).

Les Produits Radiopharmaceutiques se présentent soit sous forme de spécialités pharmaceutiques contenant des radionucléides, livrées prêtes à l‘emploi, soit sous forme de préparations radiopharmaceutiques réalisées à partir de trousses, précurseurs, générateurs.

Leur spécificité en tant que médicament repose sur plusieurs propriétés :

 Ils sont principalement utilisés à des fins diagnostiques mais également à des fins thérapeutiques.  Ils sont souvent administrés de façon unique et en petites doses.

 Les lots de fabrication sont de dimensions restreintes.

 La durée d‘utilisation du médicament peut être très courte (quelques minutes à quelques jours)

en raison de a période physique du radionucléide.

 Ils se présentent sous la forme de sources non scellées, destinées à être administrées par voie veineuse, orale, respiratoire … à des activités variables selon l‘utilisation ; l‘âge et le poids du patient.

- 28 - Figure 1: Genèse des médicaments radiopharmaceutiques

- 29 - La Pharmacopée a donné également les définitions suivantes :

Nucléide : espèce atomique caractérisée par le nombre de protons et de neutrons contenus dans son noyau et par l‘état énergétique de son noyau.

Isotopes d‘un élément : nucléides ayant le même numéro atomique, mais des nombres de masse différents.

Source radioactive : matériau radioactif utilisé pour sa propriété d‘émettre des rayonnements ionisants

Source non scellée : source radioactive prévue pour être utilisée de telle façon que la substance radioactive se trouve en contact immédiat avec le milieu environnant. Dans une source non scellée, la matière radioactive est directement accessible. Il est généralement admis qu‘elle peut être soumise à des manipulations physiques ou chimiques au cours desquelles elle peut être transférée d‘un récipient dans un autre. Les préparations radiopharmaceutiques entrent dans cette catégorie.

Radioactivité (ou activité) d‘une préparation : nombre de désintégrations ou transformations nucléaires se produisant par unité de temps. Les quantités de radioactivité dans le Système International sont exprimées en becquerel (Bq) correspondant à une transformation nucléaire par seconde.

- 30 -

III. CLASSIFICATION DES PRODUITS

RADIOPHARMACEUTIQUES

Plusieurs classifications des produits radiopharmaceutiques sont proposées :

 Classification selon leur forme couplé ou non à un vecteur

Bien que le radionucléide puisse être utilisé seul, le médicament radiopharmaceutique est le plus souvent composé d‘une molécule vectrice couplée à un radionucléide. Les Produits Radiopharmaceutiques sont donc classés en deux catégories, selon le couplage des Radionucléides aux molécules vectrices :

Radionucléides Non couplés à des molécules vectrices : Iode, Thallium, Pertechnétate …. Radionucléides couplés à des molécules vectrices : ces molécules peuvent être spécifiques à un

organe, à une fonction physiologique ou pathologique, telles que des molécules organiques, analogues de molécules biologiques, des ligands de récepteurs ou des anticorps.

 Classification selon les modalités de production [9] :

- Bombardement d‘une cible stable par des particules d‘énergie élevée dans des cyclotrons (à coût élevé) ou dans des réacteurs nucléaires (à coût faible et en grande quantité). - Transformation radioactive de radionucléides parent eux-mêmes dans des générateurs.  Modes de distribution [10]:

- Distribution strictement déterminée par le débit sanguin ou la perfusion.

- Distribution finale déterminée par des interactions biochimiques ou de liaison au récepteur spécifiques.

 Modes d’action [11] :

- Passive (diffusion, dilution isotopique, blocage dans les capillaires, séquestration cellulaire ou phagocytose).

- Active (voie métabolique, captation métabolique, ligand de récepteur, anticorps).

Mais la classification la plus communément adoptée est selon leur domaine d‘application, diagnostique ou thérapeutique.

- 31 -

IV. DOMAINE D’APPLICATION DES PRODUITS

RADIOPHARMACEUTIQUES

Les isotopes, qu‘ils soient naturels ou synthétiques, possèdent les même propriétés chimiques que leurs homologies non radioactifs. Ils diffèrent seulement par leur instabilité et cette dernière provoque une transformation spontanée et irréversible des noyaux des isotopes en d‘autres noyaux radioactifs ou non. Cette transformation est appelée désintégration qui se traduit par l‘émission de différents types de rayonnements.

Le Choix du radionucléide en radiopharmacie se fait d‘après son activité spécifique, sa demi-vie, sa pureté, sa radio-toxicité, et son coût …. Mais en premier lieu se fait d‘après ses caractéristiques physiques : nature du rayonnement, énergie, demi-vie, qui déterminera son champ d‘utilisation. Puisque les rayonnements excitent ou ionisent les atomes rencontrés en fonction de la qualité d‘énergie qu‘ils cèdent et que les dégâts biologiques vont de pair avec cette énergie transférée, on utilisera les radioéléments selon leurs émissions pour une application diagnostique ou thérapeutique.

1. Applications thérapeutiques

Les principales pathologies traitées sont les affections thyroïdiennes, les arthrites rhumatoïdes, les douleurs osseuses métastatiques, en utilisant des radionucléides de haute énergie (de l‘ordre de Mev), émetteurs - ou - et , avec pour but l‘irradiation spécifique de certains tissus, entrainant le blocage des processus de division cellulaire puis la mort cellulaire.

Les rayonnements  et -, cèdent leur énergie sur un parcours court de quelques µm à quelques cm dans les tissus, sont donc inutiles et même dangereux en imagerie. On parle donc de rayons très ionisants et peu pénétrants.

Ces rayonnements ne peuvent pas atteindre une caméra de détection et provoquent des dommages indésirables en diagnostic. Par ailleurs, ils sont utilisés les (-) et les (+) en thérapie ainsi qu‘en recherche

2. Applications diagnostiques ou explorations scintigraphiques

La plupart des organes peuvent faire l‘objet d‘une exploration scintigraphique (squelette, cœur, poumons, cerveau, thyroïde, reins …) ainsi que certaines pathologies (infections, tumeurs …).

Les actes diagnostiques ou les explorations scintigraphiques : utilisent des émetteurs de rayonnements  ou des émetteurs de rayonnements  et  dont l‘énergie d‘émission  est

- 32 - habituellement comprise entre 70 et 511 Kev. Leur pouvoir de pénétration élevé permet d‘explorer en profondeur l‘organisme.

Par comptage externe de la radioactivité fixée par un organe, il est possible de réaliser des images numérisées, des courbes représentant le transit du médicament radiopharmaceutique dans cet organe, permettant ainsi d‘étudier sa morphologie et surtout sa fonctionnalité.

Les Radionucléides les plus fréquemment utilisés en médecine nucléaire sont :

Le technétium99m (99mTc), facilement disponible grâce au générateur 99Mo/99mTc qui peut être administré sous forme de pertechnétate de sodium ou fixé sur différents vecteurs pour des actes diagnostiques.

Les radio-isotopes de l‘iode : l‘iode123 utilisé pour des actes diagnostiques, l‘iode131 utilisé pour des actes diagnostiques et thérapeutiques.

D‘autres radionucléides, tels que par exemple le thallium201

pour l‘étude de la perfusion myo-cardiaque, le chrome51 pour le marquage des hématies ou l‘exploration rénale, l‘indium111

pour les explorations hématologiques, le gallium67 dans la détection scintigraphique des foyers infectieux, le xénon133 et le krypton81m dans les explorations de la ventilation pulmonaire.

- 33 -

V.

PRODUITS RADIOPHARMACEUTIQUES MARQUES AU

TECHNETIUM

TC

Le Technétium est un élément artificiel obtenu par la désintégration radioactive du molybdène. L‘élément 43 du tableau périodique, nommé technétium en 1947, avait été découvert en 1937 par Carlo Perrier et Emilio Segrè en Californie en bombardant une cible de molybdène 99Mo avec un faisceau de neutrons d‘énergie de 8 MeV.

Le Technétium99m , est un radionucléide quasiment pur, émetteur de rayon γ, avec une demi-vie ~ 6h [12] (Figure 2), peu irradiant pour les patients et particulièrement adapté à une détection par les gamma-caméras (résolution optimale des images et rendement de détection acceptable).

Sa production se fait localement dans les services de médecine nucléaire à partir d'un générateur au Molybdène99. En pratique, le Tc est obtenu par décroissance du Molybdène99 fixé sur une colonne d‘alumine contenue dans une petite colonne de verre. L‘ensemble, placé dans une protection plombée, constitue le générateur 99Mo/99mTc.

1. Générateur

Mo/

Tc

Reçu dans les services de médecine nucléaire, le générateur 99Mo/99mTc comprend

schématiquement (Figure 2) un réservoir de liquide d'élution constitué par une solution stérile isotonique de chlorure de sodium, un site de prélèvement, constitué par une aiguille fixée en sortie de la colonne d'alumine.

La pénétration de l'aiguille dans le bouchon d'un flacon sous vide entraîne une aspiration du liquide d'élution à travers la colonne où il se charge en pertechnétate de sodium Na99mTcO4 car le technétium 99mTc n'a aucune affinité pour l'alumine, à la différence du molybdène pour lequel l'affinité est très forte.

Par ailleurs, le Technétium99m par filiation donne du technétium99 émetteurs bêta de très longue période. Ce dernier existe en quantité plus importante dans l'éluât lorsque la précédente élution est ancienne (plus de 48 heures). Il ne gêne pas la détection du signal à 140 keV, mais entre en compétition avec le technétium 99mTc lors du marquage [13] [14].

- 34 -

2. Production du Molybdène

a) Irradiation de 98Mo métallique ou le trioxyde de molybdène Mo203 (naturel ou enrichi en 98Mo), avec des neutrons thermiques dans un réacteur nucléaire

Des grandes quantités de cibles naturelles peuvent être irradiées pour donner un rendement élevé de 99Mo. Les rendements élevés sont également obtenus en soumettant une cible riche en 98Mo à une irradiation neutronique intense (plus de 1014 neutrons / cm2 / s).

Cependant, le prix de ce matériau cible est très élevé. Par conséquent, pour la production à grande échelle, cette méthode est rarement utilisée.

Irradiation de l‘235

U avec des neutrons thermiques et la séparation de 99Mo des produits de fission : L‘avantage de la fission de 99

Mo est son activité spécifique élevé (> 104 Ci / g Mo).

b) Filiation radioactive :

La Filiation radioactive à l‘origine du générateur 99

Mo/99mTc est comme suivant:

- Les trois premiers nucléides de filiation sont radioactifs. Seul le nucléide Ruthénium99 est stable. - Les périodes radioactives respectives de ces trois radionucléides sont très différentes.

- Le 99Tc ayant une période très longue vis-à-vis de la durée d‘un examen diagnostique peut être considérer comme stable.

- La désintégration du 99Mo donne dans 87% des cas du 99mTc, utilisable en diagnostic, et dans 13% des cas donne du 99Tc sans intérêt.

- Mais cette proportion non négligeable de 99Tc devra être prise en compte dans les calculs d‘activité spécifique.

3. Séparation du

Tc du

Mo

Il existe plusieurs méthodes pour séparer le 99mTc du 99Mo, les plus couramment utilisées sont : la chromatographie sur colonne, l‘extraction par des solvants ou la sublimation.

En Médecine nucléaire, les générateurs utilisés sont basés sur la séparation chromatographique sur colonne d‘alumine du pertechnétate de 99m

- 35 -

a) La colonne d’alumine

- Le 99Mo est lié fortement à un lit d'alumine de qualité chromatographique. - Le radionucléide 99mTc est éluée sélectivement dans la colonne d‘Al2O3. - Les deux radioéléments le 99Mo et le 99mTc sont liés sous forme d'anions. - Toutefois, le 99Mo a une forte affinité de liaison liée à la colonne d‘aluminium.

- Par contre, l‘affinité de 99mTc est faible, l‘anion pertechnétate peut être remplacé par un anion chlorure ou le nitrate en respectant l‘ordre suivant : OH

> MoO42- > Cl- > NO3- > TcO4- .

- Une solution saline stérile (sérum salé) est utilisée pour l'élution de 99mTc (anion pertechnétate99mTcO4-). L‘éluât isotonique stérile peut être utilisée directement dans certains procédés diagnostiques.

- La majorité de l‘activité du 99mTc est nécessaire au marquage et préparation des médicaments radiopharmaceutiques technétiés à partir des kits froids préformés (livrée par le fabricant).

- L'oxyde d'aluminium est prétraité par une activation à haute température (250 °C) pour que sa structure chimique résiste à l‘environnement très irradiant du 99Mo.

- Le revêtement argenté des particules d‘alumine a un effet similaire et offre une capacité plus élevé à la matrice d‘alumine pour la fixation du 99

Mo-molybdate. Le 99Mo produit par fission offre de nombreux avantages :

- Une activité spécifique élevée de 99Mo-molybdate est appliquée à la colonne, permet de confectionner de petites colonnes avec des petites quantités d‘alumine.

- Une petite colonne chromatographique permet l‘élution avec un faible volume, donc une activité spécifique (ou concentration radioactive) élevée.

- Une colonne de petit volume peut être incorporée facilement dans une protection plombée, sans augmenter le poids du générateur. Ceci est primordial pour le transport et sa manipulation (son installation au sein de la hotte plombée du laboratoire et l‘élutions quotidiennes).

- 36 - Figure 2: Schéma de la filiation du Molybdène99 au 99Ru stable [1].

- 37 -

4. Contrôle de qualité du système Générateur

o/

Tc:

La Pharmacopée Européenne contient deux monographies distinctes pour les solutions de pertechnétate de sodium [99mTC] injectables, en fonction de la source de 99Mo utilisé pour la production du générateur pertechnetatis Natrii [99mTc] fissione formati solution injectable (Monographie 124), et pertechnetatis Natrii [99mTc] fissione sous format solution injectable (Monographie 283).

Les critères de qualité suivant sont énoncés dans la pharmacopée européenne et doivent être évalués pour chaque générateur :

 Le rendement d‘élution : est le rapport de l‘activité de 99m_{Tc réellement éluée à l‘activité} de 99mTc éluable.

 La pureté radio nucléidique de l‘éluât : est le rapport de l‘activité du radionucléide considéré à l‘activité totale de la source.

 La pureté chimique de l‘éluât : est le rapport de la masse de matière présente sous la forme chimique indiquée, à la masse totale contenue dans la source, exception faites des excipients et solvants éventuels. Comme exemple d‘impureté chimique, l‘aluminium peut être recherché et quantifié dans l‘éluât du générateur du technétium. En plus de sa toxicité, l‘aluminium pourrait entrainer des altérations de la qualité des préparations.  Le pH de l‘éluât : pour chaque produit radiopharmaceutique, il existe un intervalle de pH

dans lequel la stabilité du produit est optimale. Un pH inadéquat peut entrainer des formations d‘espèces chimiques indésirables (hydroxydes insolubles …) et altérer la qualité de marquage.

 La pureté radiochimique de l‘éluât :

La pureté radiochimique de l‘éluât est définie par le rapport de l‘activité du radionucléide considérée, qui se trouve dans la source sous la forme chimique indiquée, à l‘activité totale de ce même radionucléide présent dans la source exprimé en pourcentage.

Par exemple pour l‘éluât du générateur 99Mo/99mTc, le 99mTc doit se trouver en majorité (à plus de 95 %) sous la forme chimique 99mTcO4-. Toute autre forme chimique présente du 99mTc sera considérée comme impureté radiochimique.

- 38 - Ce contrôle nécessite la connaissance des impuretés radiochimiques susceptibles d‘être présentes ou d‘apparaitre dans une préparation. Ces impuretés radiochimiques peuvent résulter de réactions de décomposition dues à l‘action du solvant, du changement de température ou du pH, de la lumière, de la présence d‘oxydants ou de réducteurs et de la radiolyse.

Ces impuretés radiochimiques, de par leur comportement biologique différent, peuvent entrainer une irradiation supplémentaire du patient et des images de mauvaise qualité gênant l‘interprétation des examens.

Les impuretés radiochimiques, souvent mal identifiées, sont difficiles à mettre en évidence. De plus, il n‘y a pas de méthode universelle de contrôle de la pureté radiochimique, Les méthodes mises en œuvre sont le plus souvent des chromatographies sur couche mince ou des chromatographies sur papier.

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VI. Structure Et Propriétés Chimiques Du Technétium

Tc

L‘élément technétium appartient au groupe VII B de classification périodique, il se situe entre le manganèse et le rhénium (qui a des propriétés similaires à celles du technétium).

Le technétium est un métal argenté-gris qui se ternit lentement en air moite. Sa configuration électronique à l‘état neutre : [Kr] 4d6 5s1, indique qu‘il peut subir plusieurs états d‘oxydations varient de (+VII) à (-I). Parmi ceux-ci :

Les plus stables sont : (+VII), (+V), (+IV), (+III), (+I) et (0). Les trois états : (+VI), (+II) et (-I) sont les plus difficiles à stabiliser.

Ils existent vingt-deux isotopes rapportés du technétium avec des masses s'étendant de 90 à 111. Tous les isotopes de technétium sont radioactifs. Un des deux éléments avec Z < 83 qui n'ont aucun isotope stable; l'autre élément est prométhium (Z = 61).

Le technétium a trois isotopes radioactifs à vie longue: 97 Tc (T1/2 = 2,6 x 106 années). 98 Tc (T1/2 = 4,2 x 106 années). 99 Tc (T1/2 = 2,1 x 105 années). 95m

Tc (T1/2 = 61 jours), "m" représente l'état métastable. 99m

Tc (T1/2 = 6,01 heures), l'isotope le plus utile du technétium, il est employé dans beaucoup de préparations radioactives médicales en raison de sa courte demi vie, de l'énergie du rayon gamma qu'il émet et de la capacité du technétium à être chimiquement lié à beaucoup de molécules biologiquement actives.

En médecine nucléaire, les radiopharmaceutiques technétiés sont des complexes métalliques contenant le Tc à basse état d‘oxydation. Le Tc peut se lier pour former des complexes avec les acides (acide de Lewis) ou/et les groupements fonctionnelles de propriétés basiques (base de Lewis).

Les ligands utilisés pour la réaction de complexation doivent avoir un groupement donneur (mono-denté) ou deux chélates ou bien plusieurs comme : amine, amide, thiol, phosphore, oxime ou isonitrile.

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VII. Kits Froids (Vecteurs)

Ils sont définis comme toutes préparations qui doivent être reconstituées ou combinées avec des radionucléides dans le médicament radiopharmaceutiques final, généralement avant son administration aux patients. Les kits sont entièrement testés pour vérifier les caractéristiques spécifiques, qui sont garantis par le fabriquant.

Ces Molécules vectrices couplées aux radionucléides sont sélectionnées en se basant sur :

Leurs propriétés biologiques qui conditionnent les propriétés pharmacocinétiques du médicament radiopharmaceutiques et sa spécificité.

Le temps durant lequel l‘activité du radiopharmaceutique décroit, in vivo, selon l‘élimination biologique.

La durée de conservation de kits est généralement supérieure à 1 an.

Il est important que le stockage des kits réponde aux conditions spécifiques (température, humidité) indiquées sur l'emballage, car le marquage radioactif dépend de l'intégrité des constituants du kit froid.

Les procédures de marquage ont été considérablement facilitées par la préparation des trousses (Kits). Les trousses stériles de marquage contenant les ingrédients chimiques sous forme lyophilisée sont disponibles et utilisées pour la préparation des radiopharmaceutiques technétiés.

La manipulation est minimale, étant donné que tous ce qui doit être fait est d‘ajouter l‘activité de 99m

Tc au Kit.

Dans certains cas, le chauffage du mélange réactionnel est effectué pour optimiser le rendement de marquage.

Les radiopharmaceutiques du 99mTc sont spécifiques d‘organes précis, ils sont disponible aux : - Cerveau (défauts de perfusion) ;

- Thyroïde (état fonctionnel) ; - Rein.