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Submitted on 6 Jun 2020
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Détection moléculaire et caractérisation de virus respiratoires du canard par une approche de séquençage
à haut débit
Etienne Liais, Guillaume Croville, Jérôme Mariette, Christophe Klopp, Cécile Donnadieu, Jérôme Lluch, Fabien Lagoutte, Mariette Ducatez, Christelle
Camus-Bouclainville, Jean-Luc Guérin
To cite this version:
Etienne Liais, Guillaume Croville, Jérôme Mariette, Christophe Klopp, Cécile Donnadieu, et al.. Dé- tection moléculaire et caractérisation de virus respiratoires du canard par une approche de séquençage à haut débit. Journée SEVAB, Nov 2012, Toulouse, France. �hal-01191337�
Détection moléculaire et caractérisation de virus respiratoires du canard par une approche de séquençage à haut débit
Etienne liais1,2, Guillaume Croville1,2 , Jérôme Mariette3, Christophe Klopp3, Cécile Donnadieu4, Jérôme Lluch4, Fabien Lagoutte1, Mariette Ducatez1,2 Christelle Camus-Bouclainville1,2 et Jean-Luc Guérin1,2.
1 Université de Toulouse, INP, ENVT, 31076 Toulouse, FRANCE et 2 INRA, UMR 1225, 31076 Toulouse, FRANCE 3 Plateforme bioinformatique Toulouse Midi-Pyrénées, UBIA, INRA, Castanet Tolosan, France
4 Plateforme génomique de Toulouse (PlaGe - GeT), INRA, Castanet Tolosan, France
Résultats Démarche
Conclusion
Ultracentrifugation
Traitement Nucléase
RNA/DNA extraction et (RT-)PCR aléatoire
Séquençage
Bioinformatique écouvillonnage
Sélection d’échantillons et écouvillonnage des animaux présentant un signe clinique : chute de ponte et/ou signe respiratoire.
11 pools de 10 écouvillons sont réalisés.
Concentration des particules virales par une étape d’ultracentrifugation.
Elimination des particules non encapsidées.
RT et PCR sont réalisées avec des amorces aléatoires possédant un tag par pool d’échantillons, permettant un multiplexage.
Optimisation des amplicons autour de 300 paires de base, qui est la taille maximum gérée par le séquenceur.
Le séquenceur MiSeq fait appel à la technologie Illumina. En janvier 2012, il pouvait générer plus de 7 millions de séquence de 150 nucléotides. Pour cette analyse, environ 3 millions de séquences ont été générées, soit entre 200 et 300 000 séquences de 150 nt par pool d’échantillons.
L’analyse des résultats a été réalisée en étroite collaboration avec la plateforme bioinformatique de Toulouse et le serveur METAVIR
2, en utilisant l’algorithme GAAS
3avec une E-value de 10-3 à 10-5.
Classification des séquences
82%
12%
6%
Bactéries Archaea Virus
Grâce à cette nouvelle approche technique, nous avons pu identifier un grand nombre de séquences d’agents infectieux potentiellement associés à un syndrome respiratoire. La caractérisation génétique de ces virus et leur association à des syndromes respiratoires sont en cours d’étude.
Bibliographie
[1] J. G. Victoria and al., ‘Metagenomic Analyses of Viruses in Stool Samples from Children with Acute Flaccid Paralysis’, Journal of Virology, 83 (2009), 4642–4651 <doi:10.1128/JVI.02301-08>.
[2] S. Roux and al., ‘Metavir: a Web Server Dedicated to Virome Analysis’, Bioinformatics, 27 (2011), 3074–3075 <doi:10.1093/bioinformatics/btr519>.
[3] Florent E. Angly and al., ‘The GAAS Metagenomic Tool and Its Estimations of Viral and Microbial Average Genome Size in Four Major Biomes’, PLoS Computational Biology, ed. by Gary D. Stormo, 5 (2009), e1000593 <doi:10.1371/journal.pcbi.1000593>.
[4] A A Owoade and al., “Avian Metapneumovirus Subtype A in China and Subtypes A and B in Nigeria,” Avian Diseases 52, no. 3 (September 2008): 502–
506.
[5] S Kumar and al., ‘MEGA2: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Software’, Bioinformatics (Oxford, England), 17 (2001), 1244–1245.
Séquences reconnues
94% 6%
matched unmatched
Représentation des familles bactériennes
Répartition moyenne des séquences ayant été générées sur 11 échantillons (mélanges d’écouvillons) :
- % des séquences ayant « blasté » sur des séquences connues.
- Les séquences classées comme « unmatched » sont vraisemblablement des séquences de l’hôte.
Représentation des familles virales
La classification des séquences parmi les super familles (Archaea / Bactéries / Virus) a été réalisée par bioinformatique, en utilisant l’algorithme GAAS avec une E-value de 10-3.
Un grand nombre de familles bactériennes et virales a été détecté dans un même échantillon. Parmi les bactéries, une majorité d’entérobactéries est retrouvée. Au sein des virus, on détecte une proportion significative de séquences d’herpesvirus, qui sont en réalité des séquences cellulaires homologues de télomérases.
C-AY590688 aMPV Colorado C-AY590692 aMPV-Mn-1a C-AY590691 aMPV Colorado C-AY198393 aMPV Minnesota 2A
C-AJ457967 aMPV/turkey/Colorado C-AY579780 aMPV from USA
C-AY590693 aMPV Mn-2a C-EF199772 aMPV strain PL-2
C-FJ977568 aMPV/MN/turkey/2a/97 C-EF199771 aMPV strain PL-1
C-AY198394 aMPV Minnesota-7
aMPV/France/muscovy duck/3-E-cons/2011 aMPV/France/Pekin duck/1-I-cons/2011
C-GU126687 aMPV/USA/15a
C-AJ811991 aMPV/muscovy duck/France/99178 C-AJ811993 aMPV/white Pekin duck/France/00094 C-AJ811992 aMPV/muscovy duck/France/99350
76 100 97
83 100
98
87
84 80
98
0.02
A
B D C
Introduction & Objectifs
L’équipe de virologie de l’UMR IHAP étudie la capacité des virus influenza aviaires à s’adapter à leur différents hôtes, notamment à l’occasion du passage du réservoir canard aux autres espèces cibles.
Les autres agents infectieux susceptibles de co-infecter le canard et d’interférer avec sa réponse à l’infection sont très mal connus. Afin d’identifier et caractériser sans a priori ces agents infectieux, des écouvillons trachéaux prélevés sur des canards reproducteurs présentant des signes respiratoires et/ou des chutes de ponte ont été soumis à un séquençage à très haut débit.
Un objectif méthodologique de cette étude était de valider un protocole générique de détection de virus (et de bactéries) dans des échantillons respiratoires cliniques, allant de la préparation des échantillons à l’analyse bioinformatique.
Des séquences se regroupant avec les métapneumovirus sont également retrouvées. Une analyse plus approfondie a montré qu’elles sont affiliées au sous-groupe métapneumovirus aviaire C. De façon intéressante, ces séquences de métapneumovirus aviaires sont plus proches des isolats américains que de ceux précédemment identifiés en France.
Figure 3 C: Arbre Phylogénique des Métapneumovirus réalisé à l’aide du logiciel MEGA5 5.
Figure 2 A: Krona représentant la répartition des séquences bactériennes d’un seul pool.
Figure 2 B: Krona représentant la répartition des séquences virales d’un seul pool.
Figure 3 A: Krona représentant la répartition des séquences virales classées comme virus ARN simple brin d’un pool.
Figure 3 B: Arbre phylogénique des sous groupes des métapneumovirus4.
