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Un moteur rotatif biomoléculaire
L’étude des moteurs moléculaires biologiques est un domaine en pleine expansion. C’est là en effet que s’effectue la jonction entre le monde microscopique des réac- tions chimiques ou biochimiques, et le monde macroscopique des mouve- ments mécaniques. Très souvent, par exemple au niveau des muscles, des réactions d’association/dissociation sont converties en mouvement de glissement entre fibres. Ceci conduit à des moteurs que l’on peut qualifier de « linéaires », où un équipage mobile se déplace dans une direction déterminée. Les mouvements de rota- tion sont en revanche rares (dans l’état actuel de nos connaissances), et les moteurs correspondants nette- ment plus complexes. L’analogie avec les moteurs macroscopiques de la vie quotidienne pose de plus d’intéres- sants problèmes fondamentaux.
Récemment, l’élucidation de la struc- ture et du fonctionnement de l’ATP- synthase a conduit à la mise en évi- dence d’un véritable mouvement rotatif interne à l’échelle de la pro- téine. Plus extraordinaire, il est main- tenant possible, par une combinaison de biotechnologies et de nano tech- nologies, de démonter une partie de ce moteur moléculaire pour l’associer à des composants mécaniques artifi- ciels. L’équipe de Carlo Montema- gno, à Cornell University (États- Unis), a ainsi réalisé un moteur fondé sur une seule molécule d’ATP-ase, dont le mouvement peut être observé directement au microscope [1-3]. Il s’agit sans aucun doute du prélude à l’apparition d’une nouvelle gamme d’objets moléculaires hybrides aux possibilités insoupçonnées.
La structure et le fonctionnement de l’ATP-synthase/ATP-ase
Rappelons que l’ATP-synthase cata- lyse la formation d’ATP (adénosine triphosphate) à partir d’ADP (adéno- sine diphosphate) et de phosphate, selon une réaction endoénergétique.
La molécule obtenue sert ainsi de monnaie d’échange dans nombre de processus biologiques consomma- teurs d’énergie. La synthèse de l’ATP requiert un apport d’énergie qui est assuré par l’utilisation d’un gradient de concentration de protons au tra- vers d’une membrane. La structure de l’ATP-synthase, résolue en 1994, montre ainsi deux unités, une partie F0, que l’on peut qualifier de « tur- bine à protons », et une partie F1, qui synthétise l’ATP [4]. Le transfert d’énergie de F0vers F1 est assuré de manière mécanique par un axe rota- tif assurant le couplage entre la réac- tion qui produit de l’énergie et celle qui en consomme. Ce mécanisme extraordinaire, sans précédent dans la nature, était supputé depuis les années 1980 par P.D. Boyer [5], et a été définitivement établi par la réso- lution de la structure cristallogra- phique 15 ans plus tard. Notons que, dans les organismes vivants, ce méca- nisme n’est pas destiné à obtenir un mouvement de rotation macrosco- pique*, mais ce dernier objectif peut être atteint par des modifications artificielles de l’ATP-synthase.
Le schéma général de la protéine est donné figure 1. On y trouve un rotor tournant à l’intérieur d’un stator, ces deux composants s’étendant sur deux sous-unités notées F0 et F1. Au niveau de la partie trans-membra- naire F0, les protons pénètrent du côté des fortes concentrations pour être libérés du côté des plus faibles, et ce mouvement est transformé en rotation du rotor, dans un sens déter- miné par suite de l’asymétrie du dis- positif [7, 8]. L’axe γ, ainsi mû par l’écoulement des protons, tourne à l’intérieur de l’assemblage formé par les trois sous-unités αβ qui consti- tuent la partie F1. C’est à ce niveau que s’effectue la synthèse de l’ATP.
Ce sont les unités β qui fixent les réactifs (ADP et phosphate), assurent la réaction grâce à l’apport d’énergie par la rotation forcée de l’axe γ, et permettent enfin la libération de l’ATP. Ces opérations sont activées tour à tour par la rotation de l’axe γ.
De manière remarquable, l’ATP-syn- thase peut fonctionner à l’envers, c’est à dire en hydrolysant l’ATP pour pomper des protons contre leur gradient de concentration. Dans ces conditions, l’axe γ est au contraire mû par la partie F1, et un montage judicieux doit permettre de récupé- rer le travail correspondant, une fois supprimée la partie F0. Lorsque le site F1fonctionne en moteur, chaque sous-unité effectue les tâches précé- dentes mais dans l’ordre inverse, et bien entendu toujours selon une chronologie bien précise : fixation de l’ATP sur le site actif, réaction libérant l’énergie et conduisant à l’ADP et le phosphate encore liés au site actif, libération de l’ADP et du phosphate.
MINI-SYNTHÈSE
médecine/sciences 2001 ; 17 : 927-31
L’ATP synthase est une extraordinaire machine moléculaire dans laquelle se produit un mouvement de rotation. Or, il est maintenant possible de modifier cette protéine par des méthodes de mutagenèse dirigée pour créer une interface avec des éléments artificiels. Une expérience réalisée à l’Université Cornell décrit ainsi la
fabrication d’un moteur biomoléculaire qui consomme de l’ATP pour mettre en rotation un microbarreau métallique. Il s’agit là du prélude à l’apparition d’une gamme d’objets hybrides, biologiques et mécaniques, aux possibilités fascinantes et insoupçonnées.
* L’autre moteur rotatif naturel connu, beaucoup plus gros, est celui qui actionne les flagelles de cer- taines bactéries [6]. Curieusement, le flagelle est constitué de filaments tournant sur eux-mêmes dans le même sens, ce qui implique nécessairement des frottements dans leurs zones de contact.
Ainsi le fonctionnement des trois sous-unités est soigneusement syn- chronisé [9-10], à l’instar de ce qui se passe dans un moteur d’automobile dans lequel les cycles des différents cylindres sont décalés**. A l’intérieur du site F1, l’axe γest terminé par une sorte de doigt recourbé sur lequel chaque unité β vient tour à tour pousser pour faire tourner l’axe de 120° (figure 2). Dernier raffinement nécessaire, tout comme dans un moteur d’automobile à allumage commandé, la « mise à feu » séquen- tielle des unités β est assurée par un dispositif de synchronisation. Il s’agit
d’un ensemble de deux interrup- teurs, l’un contrôlant la fixation d’ATP, l’autre la libération de phos- phate. Ces switchs sont activés au moment nécessaire du cycle de rota- tion par un dispositif analogue à un arbre à cames [9, 10].
Construction d’un moteur rotatif biomoléculaire
Le but est de rendre le mouvement de rotation utilisable macroscopique- ment. Ceci a nécessité la conjonction de plusieurs techniques de pointe relevant des biotechnologies et des nanotechnologies, afin d’isoler la partie active de la protéine et de lui fixer des éléments fabriqués [1, 2].
Dans un premier temps, les auteurs ont isolé les différentes sous-unités de la partie F1 de la protéine qu’ils ont modifiée par mutagénèse diri-
gée, afin d’introduire un résidu cys- téine à l’extrémité de l’axe γ(là où se trouve normalement le rotor de la partie F0 dans la protéine naturelle, cf. figure 1), et d’attacher des brins à base d’histidine aux sous-unités β (figure 3). Après purification, le résidu cystéine a été couplé de manière covalente à de la biotine, en vue de l’assemblage ultérieur fondé sur l’affinité biotine/streptavidine.
De son côté, le support solide a été préparé par des techniques de nano- lithographie, mettant en jeu la litho- graphie par faisceaux d’électrons, l’attaque sélective des zones irra- diées, puis un dépôt de métal, ici le nickel. Ceci a permis d’obtenir, sur une surface de silice, des « poteaux » de 50 à 120 nm de diamètre et 200 nm de hauteur, dont la partie supérieure est constituée de nickel.
Cette disposition permet d’éloigner le moteur moléculaire de la surface et d’éviter ainsi le frottement des par- ties mobiles sur cette surface. Enfin des « microbarreaux » ont été prépa- rés, également par des techniques de nanolithographie. Il s’agit de bar- reaux de nickel de 150 nm de dia- mètre et 750 à 1 400 nm de long, recouverts d’un peptide biotinylé.
L’assemblage final est fondé sur les interactions spécifiques entre d’une part les fragments histidine et le nic- kel bien décapé, et d’autre part la biotine et la streptavidine. Ainsi le traitement des supports par une solu- tion d’ATP-ase modifiée conduit à la fixation sélective de celle-ci à l’extré- mité des poteaux au bout d’environ 30 min. Après lavage, les supports sont traités par de la steptavidine, puis par les barreaux biotinylés, ce qui achève la construction (figure 4).
Observation de la rotation et performances mécaniques L’observation de la rotation des bar- reaux se fait par microscopie optique. A cause des aléas de la fixa- tion, qui peut se produire à diffé- rents niveaux du barreau de nickel, seul un petit nombre de systèmes (environ 1 %) se met en rotation en présence d’ATP. Pour ceux-là, on observe une rotation continue dans le sens attendu d’après la structure de la protéine, c’est-à-dire inverse des 928
** Le moteur le plus proche au point de vue archi- tecture serait un moteur à trois cylindres en étoile avec vilebrequin central. Il existe au moins deux réa- lisations de ce type : le moteur à explosions Walter 1925, et un moteur expérimental à cycle Stirling (Quiet Revolution Motor).
δ
α β α
b b
β β
γ ε
α
a c
12
ATP
ADP + pi
4H+
4H+
F1
F0
Figure 1. Structure générale de l’ATP synthase montrant les parties trans- membranaire F0et soluble F1. Les parties en rotation, γ, εet c12, sont repré- sentées en rouge. Au niveau de F0, la rotation est entretenue par la translo- cation des protons qui se fixent de façon transitoire sur les groupements carboxylate d’un rotor, l’oligomère c12. La rotation est unidirectionnelle par suite de l’asymétrie de son environnement [7]. Le mouvement est transmis à l’arbre rotatif γqui constitue le rotor pour la partie F1. Au niveau de F1, la rotation active tour à tour les sous-unités β qui réalisent la synthèse endo- énergétique d’ATP.
aiguilles d’une montre [3]. Cette rotation, à raison de quelques tours par seconde, est stoppée par addition d’azoture de sodium (NaN3), un inhibiteur de l’ATP-ase, et cesse lorsque la concentration en ATP devient trop faible. Il ne fait donc aucun doute que la rotation est liée à
l’utilisation de l’ATP comme carbu- rant.
Notons qu’en 1997, dans une expé- rience similaire, Noji et al., avaient déjà équipé l’axe γ d’un filament d’actine porteur d’une sonde fluores- cente, et observé la rotation par microscopie à épifluorescence [11].
Toutefois dans l’expérience de Mon- temagno et al., les caractéristiques géométriques du système sont mieux définies. D’une part, certains élé- ments comme le barreau sont rigides, d’autre part, le moteur est éloigné de la surface, ce qui évite le frottement du barreau. La connais- sance des dimensions du système et l’observation précise du mouvement permettent alors d’établir un bilan énergétique, à partir d’équations de mécanique classique.
Ainsi en utilisant la longueur des bar- reaux, leur vitesse de rotation, leur espacement par rapport à la surface, et la viscosité du milieu, le couple de frei- nage est évalué à environ 20 pN.nm pour des barreaux de 750 nm (tour- nant en moyenne à 8 tours/s) et envi- ron 19 pN.nm pour des barreaux de 1 400 nm (tournant en moyenne à 1,1 tour/s). L’énergie mise en jeu sur un tour, obtenue en multipliant par 2 π, est donc sensiblement constante, de l’ordre de 120 pN.nm, ce qui cor- respond à 17 kcal une fois rapporté à l’unité usuelle, c’est-à-dire la mole.
Sachant que l’hydrolyse de trois molé- cules d’ATP libère dans les conditions de l’expérience 3 × 7,3 soit 21,9 kcal/mole, le rendement de conversion de l’énergie chimique en énergie mécanique ressort à environ 80 % [1]. Ce rendement correspond à une énergie dissipée immédiatement dans les frottements. On ignore pour l’instant quel serait le rendement de production d’une énergie mécanique utilisable de manière pratique. A noter enfin que ces estimations montrent un couple moteur pratiquement indépen- dant de la vitesse de rotation.
Perspectives
Il existe actuellement un grand inté- rêt pour les nanotechnologies, c’est- à-dire l’ensemble des techniques visant à explorer le monde à l’échelle du nanomètre, mais aussi à intervenir à cette échelle [12]. La miniaturisa- tion des mouvements mécaniques participe de cette quête. Ainsi les progrès de la microfabrication élec- tronique permettent d’usiner à la surface d’une plaquette de silicium des petits rotors et des engrenages d’une dizaine de µm, commandés électriquement [13]. Plus bas en
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γ
β1
β3
β2 Axe de rotation
β3
β2 γ Axe de rotation
β1 γ
Figure 2. Principe de fonctionnement du moteur F1, montrant l’axe γ, tourné successivement par les unités β. (Noter que, dans cette figure, comme dans les suivantes, l’unité F1a été représentée retournée par rapport à la figure 1.) Dans chaque unité β, l’hydrolyse de l’ATP entraîne un mouvement de flexion de la partie supérieure qui appuie sur la terminaison recourbée de l’axe γ. Ceci fait tourner l’axe γd’ un tiers de tour, et le met dans la position d’être poussé par l’unité suivante, β2, laquelle poussera à son tour vers β3. Comme dans un moteur d’automobile, il y a une synchronisation précise des opéra- tions des trois actionneurs.
α β α
β
β b
α γ
Histidines de fixation
Cys
Figure 3. Schéma des zones de modification génétique de la partie F1. Les sous-unités β ont été équipées de « pattes » de fixation à base d’histidine (histidine tags), qui présentent une forte affinité pour les surfaces de nickel bien décapées. L’extrémité de l’axe γ(là où se trouve le rotor c12dans la pro- téine naturelle) a été équipée d’un groupement cystéine.
taille, se trouvent les moteurs rotatifs des flagelles, dont le diamètre est de l’ordre de 20 nm [6]. Le moteur à ATP est la plus petite machine fonc- tionnelle produisant un mouvement de rotation, puisque son diamètre avoisine 8 nm. Enfin, à l’échelle des petites molécules, on trouve des rotors moléculaires de 1,5 nm de dia- mètre, dont le mouvement sous l’effet de l’agitation thermique a été observé par microscopie à effet tun- nel, mais dont on ne sait pas encore contrôler le sens de rotation [14].
Le moteur à ATP fascine les scienti- fiques, car il illustre le mariage pos- sible entre les techniques adaptées à l’étude de la matière vivante et celles adaptées à la matière inerte. Par ailleurs son alimentation est très simple puisqu’elle est assurée par la seule présence en solution d’une molécule riche en énergie, ce qui lui confère une certaine autonomie de
fonctionnement dans des disposi- tions géométriques variées. Bien sûr se pose le problème de la dénatura- tion de l’ATP-ase, mais celui-ci n’est pas critique à l’échelle de quelques heures. Une fois passé l’émerveille- ment devant cette réalisation, que pourrait-on faire avec un tel moteur ? Une première classe d’applications serait d’utiliser ces moteurs rotatifs pour produire des flux de liquides, c’est-à-dire agir comme des pompes, afin de trier et séparer de grosses molécules. Les moteurs seraient fixés à demeure sur des structures artifi- cielles usinées de manière à définir des conduits, portes, récipients, etc.
Une deuxième catégorie serait d’assurer la propulsion d’un mobile autonome, une sorte de mini sous- marin. Il suffirait pour celà de tailler des hélices avec un « pas » (dans l’expérience de Montemagno et al., les barreaux sont l’équivalent
d’hélices en drapeau). Notons que les moteurs rotatifs assurent déjà la propulsion de certaines bactéries par mise en rotation de leurs flagelles [6]. Cependant, les moteurs rotatifs des flagelles et les bactéries sont de gros objets par rapport à ceux que l’on pourrait ainsi concevoir à partir du moteur à ATP. Or il existe une demande et des projets, parfois très futuristes, pour réaliser de tels mobiles qui serviraient de vecteurs pouvant se déplacer dans des cellules pour y effectuer diverses tâches, détecter des substances, délivrer des médicaments, etc. [15]. La validité à cette échelle des équations de méca- nique et de microfluidique permet d’aborder des problèmes comme celui du couple de renversement, cet effet bien connu des pilotes d’avion, qui fait que leur aéronef tend à tour- ner dans un sens opposé à l’hélice (un effet également observé sur les bactéries à flagelle rotatif). Comme à l’échelle macroscopique, on peut envisager de le compenser par un dessin asymétrique du mobile. Une autre solution, inspirée de l’aéronau- tique, consisterait à utiliser deux hélices, l’une à l’avant l’autre à l’arrière, donc contrarotatives dans un repère absolu.
L’association entre les techniques de nanomécanique (les objets « durs », de forme bien définie) et de biotech- nologie (les objets « mous », aux formes fluctuantes, susceptibles d’être produits en très grand nombre) n’a pas fini de nous éton- ner. D’une manière générale, c’est tout un domaine foisonnant de réali- sations, dont certaines seront jugées folles, qui vient de s’ouvrir.
RÉFÉRENCES
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2. Montemagno C, Bachand G. Construc- ting nanomechanical devices powered by biomolecular motors. Nanotechnology 1999 ; 10 : 225-31.
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Protéine modifiée
Support Ni SiO2
Streptavidine puis barreaux biotinylés
α
β β
γ ATP
ADP
Figure 4. Principe de construction du moteur biomoléculaire équipé d’un
« microbarreau ». Les étapes de construction des « poteaux » de silice recou- verts de nickel ne sont pas représentées, mais font appel à des techniques classiques de l’industrie électronique. La protéine modifiée se fixe grâce à l’interaction spécifique histidine/nickel. Puis, sur l’axe γterminé par une cys- téine, on fixe successivement la streptavidine et enfin le barreau biotinylé. À noter que le diamètre du poteau résulte d’un compromis : trop petit, le ren- dement de fixation est trop faible ; trop grand, il y a fixation de plusieurs moteurs. Le schéma n’est pas à l’échelle : dans la réalité, le diamètre du poteau est à peu près 10 fois celui de la protéine.
RÉFÉRENCES
3. Voir aussi l’animation sur le site http://falcon.aben.cornell.edu/News2.htm 4. Abrahams JP, Leslie AGW, Lutter R, Wal- ker JE. Structure at 2.8 Å resolution of F1- ATPase from bovine heart mitochondria.
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5. Gresser MJ, Myers JA, Boyer PD. Catalytic site cooperativity of beef-heart mitochon- drial-F1 adenosine-triphosphatase. Correla- tions of initial velocity, bound intermediate and oxygen-exchange measurements with an alternating 3-site model. J Biol Chem 1982 ; 257 : 2030-8.
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8. Boyer PD. What makes ATP synthase spin ? Nature 1999 ; 402 : 247-9.
9. Wang H, Oster G. Energy transduction in the F1motor of ATP synthase. Nature 1998 ; 396 : 279-82.
10. Voir aussi l’animation du modèle molé- culaire de ce moteur sur le site http://www.cnr.berkeley.edu/~hong wang/Project/ATP_synthase/
11. Noji H, Yasuda R, Yoshida M, Kinosita K.
Direct observation of the rotation of F1- ATPase. Nature 1997 ; 386 : 299-302.
12. Observatoire Français des Techniques Avancées. Rapport Arago 26, Nanocomposants et Nanomachines. Paris : Tec et Doc, Lavoi- sier, 2001.
13. Howe RT, Muller RS, Gabriel KJ, Trim- mer WSN. Silicon micromechanics. Sensors and actuators on a chip. IEEE Spectrum 1990 ; 27 : 29.
14. Gimzewski JK, Joachim C, Schlittler RR, Langlais V, Tang H, Johannsen I. Rotation of a single molecule within a supramolecu- lar bearing. Science 1998 ; 281 : 531-3.
15. Freitas RA. Exploratory design in medi- cal nanotechnology. A mechanical artificial
red cell. Artificial Cells, Blood Substitutes and Immob Biotech 1998 ; 26 : 411-30. Voir aussi de nombreuses références sur le site http://www.foresight.org/Nanomedicine.
931 Jean-Pierre Launay
Christian Joachim
Équipe « Électronique Moléculaire », CEMES/Cnrs, UPR 8011, 29, rue Jeanne-Marvig, 31055 Toulouse Cedex 4, France.
TIRÉS À PART
J.P. Launay.
■■■ BRÈVES ■■■
■■■ Syndécan : un protéoglycane qui trahit son camp. Les protéogly- canes (PG), composés d’une partie protéique et de chaînes de glycosa- minoglycanes sulfatés, dont l’hépa- rane sulfate (HS), sont peu média- tiques. Et pourtant, leurs fonctions dans l’organisme sont aussi mul- tiples qu’essentielles. M. Bernfield, qui a identifié il y a plus de 20 ans le syndécan-1, un PGHS très abondant à la surface des cellules épithéliales [1], nous démontre aujourd’hui son implication dans la dissémina- tion de la bactérie à Gram négatif Pseudomonas aeruginosa [2]. Les sou- ris dépourvues de syndécan (synd
–/–), apparemment normales, ne développent aucune infection après instillation nasale de Pseudomonas, alors qu’elles sont aussi sensibles que les souris sauvages lorsque la bactérie est inoculée par voie intra- péritonéale. Or, le syndécan-1 n’est pas le site d’attachement de la bac- térie sur les cellules épithéliales. En revanche, on sait que, en cas
d’agression, les cellules relarguent le domaine extracellulaire du PGHS, qui devient détectable dans les sécrétions trachéales ou les exsu- dats de blessures cutanées chez l’homme. De fait, l’administration aux souris synd –/–, avec la bactérie, du PGHS soluble ou de l’héparine, restaure la susceptibilité à l’infec- tion. C’est la partie HS qui est active, et elle augmente même la virulence de l’infection chez les sou- ris normales. Aussi rusé que ses compères pour tromper l’hôte, c’est Pseudomonas lui-même, par le biais d’un de ses facteurs de virulence, LasA l, qui stimule le clivage de ce même syndécan-1 à la surface des cellules infectées, que ce soit in vitro ou in vivo. Il est probable que Sta- phylococcus aureus utilise la même ruse. Par quel mécanisme le syndé- can-1 soluble augmente-t-il la viru- lence de Pseudomonas ? il ne s’agit probablement pas d’un effet direct sur la bactérie, mais plutôt de la neutralisation, par le PG, de molé-
cules importantes dans la défense antimicrobienne pulmonaire, comme les peptides cationiques antimicrobiens de la famille des cathélicidines, ou les surfactants de la famille des « collectines ». Un article d’un autre groupe corrobore ces données en montrant le lien entre l’α-défensine et une forme soluble de dermatan sulfate, un autre GAG [3]. Quelle parade trou- ver ? Inhiber le clivage de PGHS par des inhibiteurs de métalloprotéi- nases peut être risqué compte tenu des fonctions tissulaires très variées de ces enzymes ; contrer l’héparan sulfate par le sulfate de protamine, un antidote connu de héparine, ou le dissoudre par l’héparitinase ?
[1. Bernfield M, et al. Ann Rev Bio- chem 1999 ; 68 : 729-77.]
[2. Park PW, et al. Nature 2001 ; 411 : 98-102.]
[3. Schmidtchen A, et al. Mol Micro- biol 2001 ; 39 : 708-13.]
