Modèle Cellulaire et Etude ex. vivo

M2 MA 1

République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Université A. Mira-Bejaia

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Polycopié de cours

Destiné aux étudiants Master : Microbiologie Appliquée

Modèle Cellulaire et Etude ex.

vivo

M2 MA 2 I. Historique

En résumé, trois périodes ont marqué le développement de la culture cellulaire :

- La période des précurseurs (1885, 1900) : Cette période annonce la première méthode de culture de tissus en dehors du corps, grâce au Professeur Ross Harrison qui a pu cultiver des neuroblastes de grenouille dans un milieu de lymphe et ainsi franchit un premier pas vers la recherche actuelle sur les cellules souches et dérivées.

- La période de la culture de tissus (à partir de 1902). Cette période est dominée par Alexis Carrel qui oriente le développement de la culture de tissus suivant 3 voies principales:

L'amélioration des techniques d'obtention des tissus.

L'élaboration des règles d'asepsie.

L'étude des besoins nutritionnels.

Les premières cellules cultivées in vitro, par Harrisson et Carrel, en 1913 étaient des cellules animales normales, puis cancéreuses. Les recherches ultérieures, notamment depuis 1950, ont permis d’en isoler de nombreuses souches, dont plusieurs sont maintenues depuis des années. Ces souches ont servi à de nombreuses recherches de morphologie, de physiologie, de biochimie et de génétique cellulaire, surtout à partir du moment où il a été possible d’en obtenir des clones, dérivés d’une seule cellule. La culture cellulaire n'apparait proprement dite qu'à partir de 1952 lors de l'introduction de la trypsinisation des tissus par Moscona en 1952. Il procéda à la digestion de tissus d'œuf de poulet avec de la trypsine afin d'obtenir des cellules isolées ou des amas de cellules capables de se diviser in-vitro.

II. Différents types de culture II.1. Culture de tissus

La culture de tissus est utilisée en tant que terme générique pour inclure la culture in vitro d’organes, tissus et cellules. A l’origine, le terme n’est pas limité aux cellules animales, mais inclus la culture in vitro de cellules végétales. La culture de tissus peut être subdivisée en trios catégories majeures; culture d’organes, culture d’explants, et culture de cellules.

M2 MA 3 II.2. Culture d’organes

La culture d’organes se réfère à la culture tridimensionnelle de tissus retenant quelques ou la totalité des caractéristiques histologiques de tissus in vivo. L’organe complet ou une partie de l’organe est maintenu (e) d’une manière qui permet la différentiation et la préservation de son architecture, usuellement par culture du tissu à l’interface liquide-gaz sur une grille ou un gel.

Il ya des inconvénients pour la culture d’organes. Les organes ne peuvent pas être propagés ; donc chaque pièce de tissu ne peut être utilisée qu’une fois ; ce qui rend difficile de vérifier la reproductibilité d’une réponse. En plus, les cellules d’intérêt pourraient être en nombre faible dans une pièce de tissu donc la réponse produite serait difficile à détecter et à quantifier.

Il serait impossible de fournir la quantité adéquate d’oxygène et de nutriments tout au long du tissu du fait de l’absence d’un système vasculaire fonctionnel, donc une nécrose de certaines cellules se produit très rapidement. Ce problème pourrait être résolu d’une certaine manière en maintenant l’organe dans une culture agitée dans des flacons Roller « roller bottles » qui alternativement fournissent de l’air et des nutriments solubles.

II.3. Culture d’explants

Dans la culture d’explants, de petits fragments du tissu d’intérêt sont simplement laissés s’attacher à un substrat approprié, généralement du collagène, et sont cultivés dans un milieu riche, généralement contenant du sérum.

II.4. Culture de cellules (dissociées)

La culture de cellules se réfère aux cultures dérivées de cellules dissociées prélevées du tissu d’origine (culture cellulaire primaire). Les cellules sont dispersées (mécaniquement et/ou enzymatiquement) dans une suspension cellulaire qui pourrait être cultivée comme une monocouche sur une surface solide ou comme une suspension dans un milieu de culture.

Ces cultures ont perdu leur architecture histologique typique et souvent quelques propriétés biochimiques associées avec elles. Cependant, elles peuvent être propagées et par conséquent développées et divisées pour donner des répliquas.

M2 MA 4 Les cultures cellulaires peuvent être caractérisées et une population définie peut être conservée par congélation. L’avantage le plus évident de la culture cellulaire et de la culture de cellules dissociées en particulier, est qu’elles permettent d’avoir des cellules vivantes individuelles. Les cultures primaires sont particulièrement aptes pour étude en utilisant des techniques morphologiques et physiologiques.

III. Conditions de la culture cellulaire

Dans le but de maintenir un environnement de travail propre, les surfaces du laboratoire, les murs et le parterre devraient être lisses et faciles à nettoyer. Elles doivent aussi être résistantes à l’eau et à différents produits chimiques (tels que les acides, bases, solvants et désinfectants). Dans les zones utilisées pour le stockage du matériel et de l’azote liquide, le sol doit être résistant au craquement si de l’azote liquide est déversé. En plus, le sol et les murs devraient être continus avec une zone exposée pour permettre un nettoyage facile et réduire le potentiel de la poussière à s’accumuler. Les fenêtres devraient être scellées. Les surfaces de travail devraient être positionnées à des hauteurs de travail confortables.

III.1. Matériel nécessaire - Cellules

- Hotte à flux laminaire - Incubateur à CO2

- Des tubes et boites pour la croissance cellulaire - Filtres stérilisants (0,2 µm)

- Milieux de culture - Microscopes

- Matériel de comptage cellulaire ; hématimètre ou autre

- Autre matériel : pipet aid ou pipteur électrique, pompe d’aspiration, centrifugeuse, bain marie, congélateur et réfrigérateur, équipement de cryoconservation.

III.1.1. Le matériel biologique : Les cellules animales

Les collections américaines (ATCC : American Type Cell Collection) et européenne (ECACC : European Collection of Cell Cultures) sont les principales sources de lignées cellulaires. Elles contiennent plus de 3400 lignées cellulaires de plus de 80 espèces animales.

M2 MA 5 Ces cellules sont stables, peuvent être congelées (azote liquide) et cultivées pour un nombre bien défini de passages. Ex. 3T3, 293, CHO, COS, HeLa.

La collection Européenne de cultures de cellules (ECACC) a été fondée en 1984 comme une collection de cellules pour culture au service de la communauté scientifique et fournir un « International Depository Authority recognized patent depository for Europe ». A travers les trois derniers siècles l’ECACC s’est élargie et diversifiée pour devenir une des premières collections de cellules en culture authentifiées dans le monde. Les collections renferment actuellement plus de 40,000 lignées cellulaires représentant 45 espèces différentes, 50 types de tissus, 300 types HLA, 450 anticorps monoclonaux et au moins 800 désordres génétiques.

Le développement et le maintien d’une telle collection a inévitablement produit un niveau élevé de connaissances spécialisées et ceci combiné avec le support de l’agence de protection de la santé « Health Protection Agency », a permis à l’ECACC de se positionner comme un centre d’expertise dans tout les aspects liés à la culture cellulaire. L’ECACC a développé une panoplie de services en relation avec la culture cellulaire et a diversifié ses prestations en de nouveaux produits tels que de l’ADN génomique de qualité élevée extrait des lignées cellulaires. L’ECACC est l’une des quatre collections qui constituent les collections de culture de l’agence de protection de la santé « Health Protection Agency Culture Collections (HPA Culture Collections).

Lignées cellulaires

De nombreuses lignées cellulaires paraient identiques. Des lignées cellulaires avec des origines et des caractéristiques biologiques différentes ne peuvent pas typiquement être séparées sur la base des caractéristiques morphologiques ou culturales. Une infection ou contamination d’une lignée cellulaire par un virus ou un mycoplasme pourrait changer significativement les caractéristiques des cellules mais également une telle contamination ne serait pas apparente. Les lignées cellulaires vont également changer avec le temps de culture, et pour ajouter à tous ces dangers naturels il est facilement possible de mentionner incorrectement le nom de la lignée ou de faire une contamination croisée entre les différentes lignées cellulaires dans un grand laboratoire de culture cellulaire.

M2 MA 6 Les opportunités d’introduire involontairement des erreurs au niveau de la lignée cellulaire sont non limitées et toujours présentes. Il est de nature de la science qu’une fois introduite, une erreur va se propager, comptabiliser, consolider et se disséminer.

Types de cellules

Cellules primaires : Cultivées directement à partir de tissus ou d’organes. La plupart ont une durée de vie limitée et entre en vieillissement après un certain nombre de dédoublement. Isolées pour culture par plusieurs méthodes : Purifiées à partir de sang, libérées de tissus par utilisation d’enzymes tels que la collagenase, trypsine ou pronase.

Cultures primaires

Les cultures primaires sont obtenues directement à partir d’un tissu animal normal coupé et cultivé soit en tant qu’une culture d’explant ou après dissociation en une suspension de cellules individuelles par une digestion enzymatique. De telles cultures sont initialement hétérogènes mais par la suite deviennent dominées par les fibroblastes. La préparation de cultures primaires est intensément laborieuse et peuvent être maintenues juste in vitro pour une durée limitée. Durant leur vie relativement limitée, les cellules primaires retiennent souvent plusieurs de leurs caractéristiques de différentiation de cellules in vivo.

Note importante: les cultures primaires par définition n’ont pas été repiquées ou passées, une fois passées elles deviennent des lignées cellulaires et ne sont plus des cultures primaires. Les cellules ‘Primaires’ originaires de fournisseurs sont en fait des lignées cellulaires ayant fait l’objet de peu de passages.

Cultures continues

Les cultures continues sont formées d’un seul type cellulaire qui peut être propagé en série en culture soit pour un nombre de divisions cellulaires limité (approximativement trente) ou soit indéfiniment.

Les lignées cellulaires d’une vie finie sont souvent diploïdes et maintiennent un certain degré de différentiation.

M2 MA 7 Les lignées cellulaires continues qui peuvent être propagées indéfiniment ont généralement cette capacité du fait qu’elles ont été transformées en cellules tumorales. Les lignées cellulaires tumorales sont souvent dérivées de tumeurs cliniques vraies, mais une transformation pourrait être introduite en utilisant les oncogènes viraux ou par traitements chimiques.

Les lignées cellulaires transformées présentent l’avantage d’une disponibilité presque illimitée, mais l’inconvénient de retenir très peu des caractéristiques originales de l’in vivo.

Exemples de lignées cellulaires obtenues de tissus :

- Tissus épithéliaux : CHO (Chinese Hamster Ovary), HeLa, Hep-2, MCF-7, U373.

- Tissu conjonctif (Ex. fibroblastes): 293, 3T3, COS.

- Tissu musculaire : Cellules du muscle lisse vasculaire - Tissu nerveux : SKN

 Cellules HeLa provenant d'une tumeur utérine

 Cellules KB provenant d'un carcinome oral humain

 Cellules 3T3 provenant d'un embryon de souris.

 Cellules Véro provenant de rein de singe

 Cellules MRC-5 provenant de poumons de fœtus humain

Remarque : La plupart des lignées cellulaires sont obtenues de tumeurs cancéreuses : Ces cellules croissent attachées sur des supports et sont appelées cellules adhérentes.

Tableau II. Comparaison des lignées cellulaires et des cellules primaires

Lignées cellulaires Cellules primaires

Largement utilisées, mais les informations obtenues pourraient ne pas être fiables que celles obtenues des cellules primaires.

Médicalement et physiologiquement plus fiables

Faciles à cultiver, se cultivent indéfiniment Parfois difficiles à cultiver, durée de vie limitée en culture

Peuvent souvent être conservées pour des utilisations futures

Aucune modification Faciles à obtenir. Achetées de l’ATCC ou

obtenues d’un autre laboratoire.

Obtenues d’animaux ou de tissus Devraient être génétiquement identiques (une

attention particulière doit être apportée si elles ne sont pas obtenues de l’ATCC)

Pourraient être une population mixte

M2 MA 8 III.1.2. Hotte à flux laminaire ou poste de sécurité en microbiologie (PSM) instrument de base

Outre le matériel classique du poste de travail de microbiologie, la culture de cellules et de virus impose l'utilisation de la hotte à flux laminaire ou poste de sécurité en microbiologie (PSM), utilisable d'ailleurs aussi en bactériologie.

Le PSM est un outil indispensable au travail en culture cellulaire. C’est une enceinte qui permet de travailler stérilement SANS FLAMME. L'air y est constamment filtré par des filtres absolus HEPA (high efficiency particulate air). Le mouvement de l'air, assuré par un puissant ventilateur, permet d'établir un flux laminaire d'air stérile sur le plan de travail. La protection de l'opérateur est assurée par une vitre à l'avant de l'enceinte. On distingue des formes verticale et horizontale. Le niveau de contrôle fourni varie suivant la classe de la hotte utilisée. Un second filtre HEPA est utilisé pour filtrer l’air avant son passage à l’atmosphère (Figure 1). Un contrôle de l’environnement en utilisant des boites remplies de la gélose TSA (Tryptose Soya Agar) à l’intérieur de la hotte pour une durée minimale de 4 h est un bon indicateur de la désinfection de la hotte. Il ne devrait pas y avoir de croissance de bactéries ou de champignons à la surface de ces boites. Dans la majorité des cas, la hotte de classe 2 est adéquate pour la culture de cellules animales. Cependant, chaque étude doit être évaluée pour son risque biologique et il est possible que des facteurs additionnels, tels qu’une infection avec un virus connu ou d’une provenance incertaine pourraient nécessiter un niveau de confinement plus élevé.

III.1.3. Incubateur à CO2

Toutes les cellules animales exigent un incubateur à CO₂. Température de 28°C/ 37°C, 95% humidité et 5-10% CO2. De ce fait, la culture cellulaire requis un environnement strictement contrôlé. Des incubateurs spécialisés sont utilisés en routine pour fournir les conditions nécessaires à la croissance des cellules (tels que la température, degré d’humidité et niveaux de CO2) et ce d’une manière contrôlée et stable. Généralement, ils peuvent fonctionner à des températures de 28°C (pour les lignées de cellules d’insectes) à 37°C (pour les lignées cellulaires de mammifères) et pour obtenir le taux de CO2 requis (ex. 5-10%).

Certains incubateurs ont également la capacité de contrôler les niveaux d’O2. Les incubateurs revêtus de cuivre sont actuellement disponibles. Ils sont rapportés capables de réduire le

M2 MA 9 risque de contamination microbienne à l’intérieur de l’incubateur grâce à l’activité antimicrobienne du cuivre. L’inclusion d’un agent bactéricide dans le circuit d’eau de l’incubateur pourrait aussi réduire le risque d’une croissance bactérienne ou fongique.

Cependant, il n’ya pas de substitut au nettoyage régulier.

III.1.4. Centrifugeuses

Les centrifugeuses sont utilisées en routine dans la culture de tissus comme une étape de subculture pour la majorité des lignées cellulaires et pour la préparation de la cryoconservation. Cependant, plusieurs centrifugeuses produisent des aérosols et par conséquent il est nécessaire de minimiser ce risque. Ceci pourrait être obtenu en achetant des modèles de centrifugeuses qui ont des seaux scellés. L’idéal est que la centrifugeuse devrait avoir un couvercle transparent pour permettre d’observer le contenu sans ouvrir le couvercle.

Ceci va réduire le risque pour l’opérateur d’être exposé à un matériel dangereux dans le cas ou le godet ou le tube est cassé au cours de la centrifugation. Une précaution doit toujours être prise de ne pas trop remplir les tubes et de bien les équilibrer. Ces étapes simples pourraient réduire le risque que des aérosols soient générés. La centrifugeuse devrait être placée dans un endroit facilement accessible pour le nettoyage et la maintenance.

Les centrifugeuses devraient être vérifiées fréquemment pour tout signe de corrosion.

Une petite ‘bench-top’ centrifugeuse avec un freinage contrôlé est suffisante pour la majorité des objectifs. Une sédimentation cellulaire est satisfaisante à 80 – 150 x g. des forces gravitationnelles plus élevées pourraient causer un dommage et provoquer une agglutination du culot cellulaire.

III.1.5. Matériel spécifique

Presque chaque type d’ustensile de culture cellulaire, avec son consommable tels que les tubes et pipettes, sont commercialement disponibles sous forme de packs stériles à usage unique chez plusieurs fournisseurs incluant Sigma-Aldrich, Nunc, Greiner, Bibby Sterilin et Corning. L’usage de tels contenants en plastique « plasticware” quoi que plus couteux que la verrerie recyclable, permet un niveau plus élevé d’assurance qualité et ne nécessite pas des procédures de validation du nettoyage et de la désinfection. Les flacons de culture de tissus en

M2 MA 10 plastique sont souvent traités pour fourbir une surface hydrophile pour faciliter l’attachement des cellules dépendantes de l’adhésion.

Un matériel de culture spécifique est nécessaire pour la culture de : Cellules adhérentes : Boîtes de culture ("Falcon")

On utilise pour la culture cellulaire des boîtes en plastique à fond plat (figure ) principalement. Des microplaques à cupules (figure ) plus ou moins grandes sont aussi possibles. Ces boîtes, souvent appelées Falcon, sont munies d'un bouchon permettant l'entrée et la sortie des gaz. Elles permettent l'étalement du milieu de culture sur une grande surface sur laquelle les cellules se multiplieront sous le milieu.

- Falcons-T (T-flasks) : T-25, T-75, T-150 (le nombre indique la surface en cm²).

- Plaques de culture : 8, 16 et 96 puits.

Cellules en suspension : Flacons Spinner (Spinner flasks) Densité cellulaire : 5x 10⁴- 1x 10⁷

Fournisseurs: Corning, Nunc, BD, Wheaton.

III.1.5. Matériel de pipetage

Le pipetage doit évidemment respecter des conditions de stérilité rigoureuses. Des systèmes spécifiques facilitent le travail sous le PSM, systèmes qui peuvent être utilisés par ailleurs mais dont certains ont été développé pour ce travail.

III.1.5.1. Système de type « Pipet aid » ou pipteur électrique

Ces systèmes sont conçus pour permettre l'utilisation de pipettes classiques.

L'aspiration et l'éjection sont assurés par l'air aspiré ou soufflé dans la pipette par une pompe, la stérilité de l'air étant assuré par un filtre 0,22 µm. Il existe des systèmes sur accumulateurs beaucoup plus pratiques. Cependant, ce système pose quelques problèmes et nécessite certaines précautions d'emploi :

 Ce type de système est coûteux

 Il ne faut pas aspirer de liquide

 Il faut changer les filtres

 Il ne faut pas oublier de recharger les accumulateurs.

M2 MA 11 III.1.5. 2. Système à cônes

On peut évidement utiliser des pipettes automatiques ou micropipettes. Il faut toutefois s'assurer d'une stérilité de la pipette et utiliser des cônes stériles.

III.1.6. Matériel de comptage

Les cellules sont souvent comptées en utilisant des hémocytomètres ou hématimètres (cellules de Malassez ou de Thoma).

III.1.7. Matériel de stérilisation des réactifs

La plupart des solutions utilisées ne peuvent être stérilisées à la chaleur.

On ne peut donc qu'utiliser la filtration pour assurer la stérilité des solutions comme la trypsine, les milieux de culture, la glutamine, les antibiotiques... Plusieurs dispositifs de filtration existent (figure ).

D'autres outils comme le four Pasteur, l'autoclave, etc. sont aussi utilisés pour stériliser le matériel en culture cellulaire.

III.1.8. Matériel d’Examen microscopique

Pour réaliser l'examen des boîtes sans les ouvrir, on peut utiliser un microscope inversé.

III. 2. Les milieux de culture

Les milieux usuels sont formés de:

 base

 acides aminés essentiels et non essentiels

 vitamines et autres cofacteurs

 autres composants : bases azotées, cholestérol, ribose, désoxyribose...

À ces milieux il faut ajouter :

 des antibiotiques:

M2 MA 12 - Pénicilline G

- Streptomycine

- Amphotéricine B (antifongique)

Ils doivent être ajoutés en concentration adéquate car à trop forte dose ils sont toxiques pour les cellules.

 des facteurs de croissance cellulaires apportés par le sérum de veau fœtal (SVF=FCS= Fœtal Calf Serum) 1,5 à 10 %. Ces facteurs de croissance sont notamment l'EGF (Epidermic Growth Factor=facteur de croissance épidermique), le FGF (Fibroblastic Growth Factor=facteur de croissance fibroblastique) le PDGF (Platelet Derived Growth Factor=facteur de croissance dérivé des plaquettes), IL2 (Interleukine 2=facteur de croissance des lymphocytes T). Le sérum de veau fœtal apporte aussi : de l'insuline et de la fibrinolectine qui permet l'ancrage des cellules aux parois du flacon.

 de la glutamine car bien qu'il y en ait dans les milieux elle se désamine spontanément à 37°C. Elle est rajoutée pour en avoir 1%.

On peut citer :

- Les milieux les plus communs : Milieu D-MEM/F12

Contient du D-glucose, L-glutamine, tampon HEPES, sel d’hypoxanthine de sodium, acide linoleique, acide lipoique, dihydrochlorure de putrescine, rouge de phénol, pyruvate de sodium, thymidine, acides aminés, vitamines.

- RPMI 1640 w/Glutamine

L-glutamine, tampon HEPES, rouge de phénol.

Suppléments :

Tampon HEPES, EDTA, L-glutamine, Antibiotiques: pénicilline, gentamycine, solution Pénicilline-Streptomycine, Antifongiques : Fengizone (amphotéricine B), Sérum de veau fœtal. La plupart des milieux ont un pH de : 7,2 -7,5. La plupart des milieux ont un indicateur coloré.

La composition comporte :

68% eau, 10% sérum, 11% sels inorganiques, 2% acides aminés, 1% vitamines, 5% sucres, 3% autres.

M2 MA 13 Les milieux de culture doivent répondre aux exigences culturales des cellules animales. Ces exigences sont multiples et complexes et l'on ne doit pas oublier les exigences en gaz.

Les cellules animales ont besoin :

 d'eau

 d'ions minéraux nombreux et variés à des concentrations adéquates. L'osmolarité du milieu doit être celle du sérum physiologique (9 g de NaCl par litre).

Le pH ne doit le plus souvent guère varier autour de 7 à 7,4. Il faut donc un système tampon qui est en général le système CO2/HCO3-

ou phosphates.

 de source de carbone et d'énergie (glucose par exemple)

 de source d'azote : acides aminés obligatoirement

 de facteurs spécifiques :

 les acides aminés essentiels

 les vitamines

 des acides gras comme l'acide arachidonique

 des gaz :

 le dioxygène (O2), les cellules étant aérobies strictes

 le dioxyde de carbone (CO₂) en général, car les tissus sont en permanence dans une atmosphère contenant du dioxyde de carbone (p =5,3 kPa)

La culture nécessite bien souvent d'autres facteurs, en particulier des facteurs de croissance cellulaires hormonaux comme les interleukines. On évite la multiplication microbienne par l'ajout d'antibiotiques.

Les milieux sont formulés sur une base à laquelle sont ajoutés les autres composants.

La base peut servir de liquide de survie pour des suspensions cellulaires.

III.2.1. La base Elle contient:

 des ions minéraux pouvant servir aussi de tampon (ex : phosphates ou/et HCO3-)

M2 MA 14

 du glucose

 un indicateur de pH (en général le rouge de phénol): Il est rose au départ. Son virage au rouge (traduisant une alcalinisation) indique souvent la présence de champignons, tandis que son virage au jaune révèle plutôt des bactéries. Des exemples de bases sont donnés dans le tableau I.

Tableau III. Exemples des bases les plus classiques

Composant

HBS Hanks Buffered

Saline

EBS Earle Buffered

Saline

PBS Phosphate

Buffered Saline

PBS A GEY

NaCl 8800 6700 8000 8000 8000

KCl 400 400 200 200 370

NaH₂PO₄ 1150

NaH₂PO₄, 2 H₂O 150 150 - - 150

NaH₂PO₄, 7 H₂O - - - 2160 -

KH2PO4 200 200 30

NaHCO3 2200 2200 227

MgCl2, 6 H2O - - 100 - 210

MgSO4, 7 H2O 200 20 - - 70

CaCl2 - 20 - - -

CaCl2 2H2O 264 - 132 - 220

Glucose 1000 1000 - - 1000

Rouge de phénol 10 10 - - -

- : absence

Remarque: Actuellement on utilise de plus en plus de milieux définis (= milieux synthétiques) de composition parfaitement connue. Cela est possible en raison des connaissances plus grandes sur les besoins en facteurs de croissance des cellules.

L'obtention du sérum de veau fœtal n'est pas évidente : il faut pouvoir prélever stérilement des fœtus, donc dans un premier temps abattre les vaches gravides. Cette production est souvent liée à l'élevage extensif où l'abattage du troupeau n'est pas sélectif et inclue donc de nombreuses vaches susceptibles de porter le veau.

On imaginera assez facilement le coût du SVF (de l'ordre de 1000 euros le litre).

Il peut poser problème de transmission de prions. Il ne faut toutefois pas exagérer le risque.

M2 MA 15 III.2.2. Les facteurs de croissance

- Définition

Un facteur de croissance est une protéine qui a une taille d’environ 10 à 50 kDa. Elle agit au niveau du tissu de façon locale ou régionale. Un facteur de croissance est différent des hormones car elles sont synthétisées dans les glandes endocrines, et pour agir sur un tissu, il faut qu'elles parcourent de grandes distances. Mais il existe des hormones avec des propriétés communes à celles des facteurs de croissance, comme par exemple l'insuline. On parle d’IGF (Insulin-Like Growth Factor) qui a une séquence très proche de l'insuline (hormone). Les cytokines sont encore autre chose. Une cytokine est un peptide produit par les cellules inflammatoires du système immunitaire. Mais elles ont aussi des propriétés de facteurs de croissance. On parle de facteurs de croissance hématopoïétiques, comme les interleukines 1 et 6.

Il existe des facteurs de croissance de type positif (stimulant) et de type inhibiteur. Ils agissent en activant un récepteur de surface. Un facteur de croissance induit l'activation du récepteur, l'adhésion de substrats sur le récepteur, le relargage de ces substrats pour s'associer avec des substrats secondaires, l'activation de facteurs de transcriptions, et l'activation de la transcription dans le noyau. La propagation du signal se fait par une succession de complexes protéine-ligand.

- Classification On distingue :

Facteurs neurotropiques: ce sont des facteurs qui agissent sur les cellules du système nerveux: NGF (Nerve Growth Factor), NT3, NT4, BDNF (Brain Derived Neurotrophic Factor) et CNTF, pour ne citer que les plus spécifiques. Certains sont aussi spécifiques du type cellulaire: NGF n'agit que sur les neurones sympathiques, BDNF que sur les neurones moteurs. Il ya aussi des facteurs pléiotropes, qui peuvent agir aussi sur d'autres types de tissus: FGF qui est un régulateur assez universel. Le FGF a un rôle positionnel et organisationnel sur les neurones et les cellules gliales.

M2 MA 16 Facteurs hématopoïétiques: ils régulent l'hématopoïèse, c'est à dire la formation des cellules sanguines. Il y a trois lignées cellulaires dans ce système: granulocytaire, érythrocytaire, megacaryocytoplaquettaire. Les facteurs hématopoïétiques contrôlent aussi la myélopoïèse (formation des cellules granulocytaires pour donner les globules blancs), l'érythropoïèse (globules rouges), la plaquettogenèse et la mégacaryocytopoïèse. Le premier niveau de contrôle se situe au niveau des cellules souches hématopoïétiques. Ils permettent à ces cellules de garder leur totipotence en entretenant la multiplication continue. Cela donne des progéniteurs qui s'engagent dans les différentes voies. Par exemple le CSF (Colony Stimulating Factor) qui est présent sous deux isoformes: le G-CSF qui contrôle les granulocytes et le GM-CSF qui contrôlent les progéniteurs de types granulocytaires et macrophages. L'érythropoïétine intervient aussi, ou encore la thrombopoïétine. Les cytokines ont des actions très proches de ces facteurs hématopoïétiques. Par exemple l'interleukine 3 agit sur la mégacaryocytopoïèse et l'érythropoïèse.

Facteurs qui agissent sur les cellules épithéliales: EGF (Epidermic Growth Factor), FGF (Fibroblastic Growth Factor) et HGF (Hepatocyst Growth Factor) sont activateurs. TGF est inhibiteur et est aussi un facteur pléiotrope.

Facteurs qui agissent sur les cellules stromales, comme les vaisseaux sanguins ou fibroblastes. VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), FGF, PDGF (Platelet Derived Growth Factor)…

III.2.3. Les agents antimicrobiens pour cultures cellulaires

Parmi les lignées cellulaires cultivées, les lignées primaires demandent le plus de soin et d'attention. Les lignées primaires proviennent directement de tissus humains et animaux, et n'ont pas été modifiées génétiquement. Elles constituent des modèles très prisés pour l'expérimentation scientifique dans de nombreux domaines de la recherche fondamentale et du développement thérapeutique, car elles permettent de reproduire in-vitro des situations de l'in- vivo. Cependant, leur utilisation est limitée par leur courte durée de vie, et par le risque très important de contamination microbienne auquel elles sont exposées (en raison des contaminants présents dans l'organisme hôte ou introduits durant la dissection).

M2 MA 17 - Caractéristiques des formulations d’agents antimicrobiens à utiliser

 Protection contre tous les contaminants de la culture cellulaire

La composition antibiotique doit être spécialement conçue pour protéger les lignées cellulaires primaires contre les bactéries à Gram⁺ et à Gram^–, les mycoplasmes et les champignons.

 Combinaison antimicrobienne puissante

La préparation devrait combiner des molécules antibactériennes et antifongiques. Les éléments antibactériens éliminent les mycoplasmes et une vaste gamme de bactéries, en bloquant la synthèse d'ADN et de protéines. L'agent antifongique élimine les levures et les moisissures en perturbant la membrane cellulaire.

 Sans cytotoxicité

L’agent antimicrobien doit être non-toxique pour les cellules primaires. Il agit sur des cibles présentes uniquement chez les micro-organismes. Les cibles bactériennes sont l'ADN gyrase et les sous-unités 30S et 50S des ribosomes procaryotes. La cible fongique est l'ergostérol, une molécule seulement présente dans la membrane cellulaire des champignons (moisissures et levures).

 Prêt pour la culture cellulaire

Devrait être une solution stérile soluble dans l'eau, qui peut être ajoutée directement au milieu de culture cellulaire. Généralement fournie sous forme de tubes de 1 ml ou dans un flacon de 20 ml. Un tube de 1 ml suffit à traiter une bouteille de 500 ml de milieu de culture par exemple.

V. Méthodes d'obtention des cellules cultivées

Deux sources biologiques de cellules sont possibles :

- des cellules isolées dans les liquides biologiques comme le sang, - des cellules d'organes qu'il faudra donc séparer les unes des autres.

V.1. Cas des cellules circulantes (lymphocytes)

Les cellules circulantes doivent être séparées. Leur différence de densité permet l'utilisation d'un gradient de Ficoll avec centrifugation. L'utilisation de trieur de cellules est aussi possible.

M2 MA 18 V.2. Cas des cellules à partir de tissus ou d'organes

Un tissu est formé d'un ensemble de cellules et éventuellement d'une matrice extracellulaire. Dans les tissus de type épithélial, les cellules sont fortement liées entre-elles.

Rares sont les tissus isolés ou " purs " : ils appartiennent en général à un organe constitué d'un tissu principal et de nombreux tissus accessoires : tissus conjonctifs d'emballages, tissus des vaisseaux sanguins, neurones...).

Un organe contient donc de nombreux types de cellules. La culture sera donc réalisée à partir d'un fragment plus ou moins important d'un organe. On a deux méthodes :

V. 2. 1. Utilisation d'un fragment de tissu : Les cellules se développent à partir du fragment à la surface du support baignant dans le milieu de culture.

V. 2. 2. Fragmentation de l'organe

 Le tissu est dissocié mécaniquement et enzymatiquement : on obtient une suspension de cellules que l'on peut partiellement purifier.

 Les cellules sont mises en culture : c'est la culture primaire

 Elles sont repiquées comme en microbiologie : c'est la culture secondaire Les étapes sont résumées ci-dessous :

Culture de tissus

Dissociation enzymatique ou/et mécanique du tissu en cellules

Mise en culture des cellules

Culture primaire de cellules Repiquage

Culture secondaire de cellules Repiquage

Remarque 1.

M2 MA 19 Repiquage = passage: On réalise un repiquage d'une culture cellulaire en dissociant le tapis obtenu par action de la trypsine (ou d'autres enzymes protéolytiques) qui, en détruisant certaines protéines de liaisons, brisent les liens entre les cellules.

Remarque 2. La dissociation enzymatique peut se faire

 à 4°C : condition la plus douce, la dissociation a lieu alors lentement

 ou à 37°C : condition plus forte, il faut alors contrôler de façon très précise l'action de l'enzyme qui peut si la durée est trop longue par exemple attaquer les protéines membranaires des cellules.

V.3. Purification du type cellulaire

Dans un tissu, il existe plusieurs types de cellules. Parfois il y a intérêt à conserver les différents types de cellules qui conservent certaines interactions mais parfois il y a nécessité de séparer un type cellulaire. Cela est réalisé:

V. 3. 1. Méthode clonale (comme en microbiologie)

Les cellules sont diluées de façon à ce que chacune prolifère en formant un clone lorsqu'elles adhèrent à la surface. Il suffit alors d'isoler le clone.

V. 3. 2. Méthodes de séparation physiques

 Centrifugation différentielle en gradient de Ficoll

 Chromatographie d'affinité

 Electrophorèse sur gel d’agarose

 Cytométrie de flux

 VII. Conservation des cellules : La cryoconservation

 VII. 1. Généralités sur la cryoconservation

La conservation par le froid consiste essentiellement à provoquer un ralentissement des activités physico-chimiques des cellules proportionnel à l'abaissement de la température. Dans certaines conditions et à très basses températures, ce ralentissement

M2 MA 20 peut aboutir à l'arrêt total de toute manifestation vitale, qu'on espère bien entendu réversible lors du réchauffement de la cellule.

 Le protocole technique devra être précis et adapté à chaque type de cellule pour obtenir ce but. En effet, les différents types cellulaires nécessitent chacun des schémas de refroidissement différent: lent pour les cellules ovariennes ou surrénaliennes, très rapide pour les globules rouges. Ces caractéristiques de cryoconservation pour chaque cellule ont été déterminées empiriquement, avec principalement le but d'éviter la formation de glace intracellulaire dont l'effet serait la destruction des structures membranaires intracellulaires. Pour le réchauffement au contraire, il s'agit dans tous les cas d'aller très vite: quelques centaines de degrés par minutes (400 à 1000). Cette technique ne peut concerner que des cellules isolées ou des petites structures de faible épaisseur permettant une diffusion immédiate et homogène de la température. On utilise le diméthyl sulfoxyde (DMSO) pour les congeler. Ce produit protège les membranes lysosomiales et empêche le relargage des protéines.

 On congèle une suspension de 3 à 4 10⁶ cellules/ ml de milieu en phase exponentielle, à -40°C lentement (1 ou 4°C par min) puis dans le diazote liquide. La décongélation est rapide à 37°C suivie d'un lavage et d'un contrôle de viabilité.

 La cryoconservation consiste à conserver des tissus ou des cellules à des températures proches de celle de l'azote liquide, soit -196°C, température à laquelle on peut considérer que les processus biologiques sont suspendus.

 On sait depuis longtemps que la vitesse de refroidissement, la vitesse de réchauffement ainsi que la concentration et le type de cryoprotectant ont un rôle fondamental pour le résultat final de ce procédé, alors que la température de stockage n'a pas une importance aussi grande.

VII. 5. Cryoprotectants

Ce sont des substances utilisées pour protéger les cellules lors de la cryoconservation. Le mécanisme d'action est la stabilisation d'une part des protéines par des liaisons non-covalentes et d'autre part des structures membranaires par des interactions ioniques^. Le cryoprotectant le

M2 MA 21 plus utilisé, et donc le plus étudié est le diméthyl sulfoxyde (DMSO), dont il faut déterminer avec précision la concentration nécessaire pour obtenir l'effet protecteur sans avoir une toxicité trop importante.

VIII. Application à l’échelle industrielle

Plus fragiles que les cellules microbiennes, les cellules animales constituent de précieuses sources de protéines, telles que les anticorps monoclonaux. Leur culture en masse demande du doigté et des procédés mêlant technologies de pointe et connaissances fondamentales sur le fonctionnement cellulaire.

La culture des cellules animales fait aujourd’hui partie du panthéon des procédés modernes de biotechnologie. Elle est couramment utilisée pour la production à large échelle de virus destinés à la préparation de vaccins (contre l’hépatite B, la grippe, la rage, la poliomyélite, etc.), d’anticorps monoclonaux (utilisés en thérapeutique et pour le diagnostic), et de protéines recombinées aux propriétés thérapeutiques : activateur du plasminogène (traitement des thromboses), facteurs de coagulation VIII et IX (hémophilie), érythropoïétine (anémie), hormone de croissance humaine (nanisme), interférons (antiviraux et immunomodulateurs), interleukine 2, etc.

Mais pourquoi utiliser des cellules animales alors que l’on produit des protéines humaines recombinées, comme l’insuline, dans des bactéries ?

En fait, certaines protéines ne conservent pas toutes leurs caractéristiques quand elles sont produites dans des procaryotes ou des eucaryotes inférieurs (levures). En particulier, beaucoup de modifications nécessaires à l’activité des protéines et qui interviennent après la traduction de l’ARN messager, telles que le clivage protéolytique, la glycosylation (l’ajout de chaînes glucidiques sur les chaînes latérales des acides aminés), les modifications d’acides aminés (hydroxylation, phosphorylation) et le repliement des chaînes protéiques, ne sont pas assurées correctement par ces cellules. Or une protéine incorrectement modifiée peut être inactive ou même provoquer une réponse immune dangereuse chez les patients auxquels on l’administre.

Les cellules animales peuvent quant à elles mener à bien les modifications requises.

Elles constituent donc un système de choix pour produire des molécules thérapeutiques ou de

M2 MA 22 diagnostic. Avec le développement de la thérapie génique, la culture cellulaire a récemment vu ses perspectives élargies à la production de matériel génétique et de vecteurs capables de transporter des gènes thérapeutiques jusque dans les cellules des patients. À plus long terme, d’autres applications de la culture de cellules animales pourraient se développer pour la reconstitution de tissus endommagés ou la création d’organes bio-artificiels, ou encore pour la greffe thérapeutique de cellules.

VIII. 1. Différences entre culture de cellules animales et microbiennes

La culture de cellules animales se distingue des cultures microbiennes par différents aspects.

- D’abord, les concentrations cellulaires obtenues sont faibles : 1 million par millilitre en général, contre 10 milliards avec des bactéries. Or des concentrations élevées sont souhaitables tant pour accroître la vitesse de la production et la rentabilité des bioréacteurs que pour minimiser le volume de ces derniers.

- Ensuite, avec les cellules animales, tout est beaucoup plus lent qu’en culture microbienne: il faut 15 à 40 heures pour doubler le nombre de cellules, contre quelques dizaines de minutes, au plus 1 ou 2 heures, avec les bactéries. Une production peut donc être obtenue en quelques heures à quelques jours avec des bactéries ou des levures, alors qu’elle requiert plusieurs jours, voire quelques semaines avec des cellules animales.

- Enfin, ces dernières sont plus fragiles que les cellules microbiennes : par exemple, elles ne tolèrent bien qu’une gamme étroite de températures, entre 35 et 39°C, demandent une oxygénation constante et sont plus sensibles aux forces hydrodynamiques. Généralement, une population de cellules animales fragilisée cesse de proliférer, puis entre rapidement dans une phase de mort cellulaire. Le problème n’est alors pas seulement la perte du potentiel de biosynthèse, mais aussi la libération dans le milieu de culture de substances provenant de la lyse des cellules mortes, dont des protéases et des formes inachevées du produit souhaité. Ce matériel contaminant

M2 MA 23 affecte l’efficacité de la récupération du produit et complique ou compromet sa purification à partir du milieu de culture.

VIII. 2. Procédés industriels

Les entreprises établissent d’abord leurs lignées cellulaires et maîtrisent leurs processus de production à l’échelle du laboratoire, en boîte de Pétri ou en flacons. Vient ensuite le moment où les essais cliniques et la production commerciale nécessitent de plus grandes quantités de produit (en culture de cellules animales, on considère généralement des milligrammes ou des grammes de molécules actives). Deux voies s’offrent à ces entreprises pour accroître leurs capacités de production : Extensification et intensification.

VIII. 2. 1. Extensification

Elle consiste à augmenter le volume des récipients (scale-up), jusqu’à 1000 litres et au-delà, et à multiplier leur nombre pour accroître l’échelle de production (« extensification » du procédé).

VIII. 2. 2. Intensification

Elle consiste à accroître le nombre de cellules par unité de volume (« intensification » du procédé). L’intensification de la production nécessite l’augmentation simultanée des apports de nutriments, de l’élimination des métabolites produits et des transferts de chaleur.

La composition du milieu de culture (glucides, glutamine, acides gras, vitamines, hormones et facteurs de croissance), l’oxygénation, l’agitation et l’homogénéisation du milieu, de même que le contrôle du procédé, doivent être revus en conséquence, pour permettre à chaque cellule d’être convenablement nourrie et oxygénée, dans des conditions de pH, de température et de forces hydrodynamiques (« cisaillement ») adéquates. Augmenter la concentration cellulaire ou le volume de culture de 10 ou 100 fois implique d’en faire autant pour l’oxygénation ou l’homogénéisation du milieu. Avec un facteur 10, la technologie peut suivre, mais les problèmes deviennent réels pour un facteur 100 !

Certains types cellulaires doivent cependant adhérer à un support pour survivre et croître, par exemple, les cellules diploïdes humaines, les cellules rénales MDCK (Madin-

M2 MA 24 Darby canine kidney), des fibroblastes murins, des fibroblastes d’embryons de poulet et des lignées cellulaires utilisées pour la production de nombreux vaccins. On leur fournit la surface nécessaire sous forme de microparticules de 100 à 500 µm de diamètre, appelées microporteurs, maintenues en suspension et sur lesquelles se fixent les cellules. La présence de microporteurs rend toutefois les procédés plus complexes.

VIII. 3. Les systèmes de culture industriels

Il existe différents systèmes de culture cellulaire en suspension et plusieurs paramètres sont à prendre en considération pour mener à bien une culture :

 Le type d’agitateur importe peu à petite échelle (< 15 litres) et pour les faibles vitesses de rotation généralement utilisées. En effet, dans ces conditions, les cellules ne sont pas sensibles aux turbulences et aux effets de cisaillement.

 Le plus important, pour la survie des cellules comme pour le contrôle de la culture, est de maintenir toutes les cellules – ou les microsphères sur lesquelles elles sont fixées – en suspension, avec une bonne homogénéisation du liquide.

 Les bioréacteurs à agitation pneumatique (air-lift) sont une alternative satisfaisante aux dispositifs d’agitation mécanique pour des cultures jusqu’à 1000 litres. C’est alors l’introduction d’air comprimé qui provoque l’agitation et l’oxygénation du milieu.

 Dans tous les types de réacteurs utilisant l’injection d’air et la formation de bulles, il faut être attentif aux dommages cellulaires causés par l’« explosion » des bulles à la surface du liquide. C’est en effet à ce niveau que les stress hydrodynamiques les plus délétères sont imposés aux cellules, particulièrement dans les milieux pauvres en sérum ou sans protéines. Ils peuvent être atténués par l’emploi de surfactants tels que le Pluronic F-68 (BASF-Wyandotte).

 Éviter l’apoptose

M2 MA 25 Un inconvénient des opérations discontinues est que le milieu de culture se détériore au fur et à mesure que les cellules l’utilisent, ce qui limite tant la croissance cellulaire que la production. Certains nutriments spécifiques, particulièrement ceux qui sont indispensables au

métabolisme énergétique, tel le glucose, et à la synthèse protéique, comme les acides aminés, s’épuisent. C’est principalement le cas de la glutamine (un acide aminé intervenant à la fois comme source énergétique et dans la synthèse protéique), dont le tarissement entraîne rapidement la mort cellulaire par apoptose. À cela s’ajoutent d’autres facteurs stimulant la mort cellulaire, comme l’accumulation d’acide lactique ou d’ammoniaque. Avec l’amélioration des connaissances sur le contrôle génétique et métabolique du phénomène d’apoptose, les cellules peuvent être modifiées pour réduire son occurrence, en particulier en faisant sur-exprimer le gène bcl-2 ou le gène bcl-XL, qui codent des inhibiteurs d’apoptose.

VIII. 3. 1. Les systèmes de type batch ou discontinu

Ils constituent le mode de gestion le plus simple et le plus flexible de conduite des cultures. Après inoculation, celles-ci se poursuivent jusqu’à épuisement du milieu et récolte du produit. Elles sont réalisées dans des cytoculteurs, le plus souvent des bioréacteurs à agitation mécanique dérivés des fermenteurs microbiens. Par rapport à ces derniers, ils permettent une agitation et une aération plus lentes, suffisantes pour maintenir les cellules animales dont la concentration et les besoins restent faibles (16 à 160 ng d’oxygène par minute et par million de cellules). Avec des cytoculteurs dont la capacité dépasse 1 à 2 litres, le transfert de l’oxygène de l’air à la surface du liquide par simple diffusion devient insuffisant et un apport supplémentaire d’oxygène est nécessaire, pour répondre aux besoins des cellules. De l’air est alors introduit par la partie inférieure du cytoculteur.

VIII. 3. 2. Les systèmes de type fed-batch (discontinu alimenté)

Ils représentent une amélioration des procédés batch. Ils consistent à apporter de manière contrôlée des nutriments en cours de route, pour prévenir leur épuisement. Le volume de culture augmente donc, mais des concentrations en cellules et en produit plus importantes sont obtenues sans accroître la complexité du système. Le problème est de déterminer le taux

M2 MA 26 optimal des apports nutritifs en fonction du temps. Ce taux peut être programmé, ou mieux, mais plus délicat, résulter d’un contrôle de l’état de la culture en cours, qui repose notamment sur l’usage de biocapteurs et sur l’analyse de la composition du milieu et du gaz quittant le bioréacteur.

VIII. 3. 3. Les systèmes de vidange et remplissage (draw and fill).

Dans ce cas, une opération de type fed-batch est réalisée jusqu’à un stade où la plus grande partie de la culture est récoltée. La fraction restante sert d’inoculum pour l’opération suivante.

VIII. 3. 4. Les systèmes continus

Avec apport permanent de nutriments et retrait simultané du milieu usagé et des produits formés, le volume de culture restant constant. L’avantage est que les conditions de production ne varient pas dans le temps et sont relativement plus simples à contrôler. Vu la complexité du métabolisme des cellules animales, seules des substances dont la synthèse est stable dans le temps peuvent cependant être produites de manière contrôlée dans ces conditions.

VIII. 3. 5. Les systèmes à perfusion

La solution la plus élaborée en vue d’intensifier un procédé de culture et d’augmenter les densités cellulaires consiste à confiner physiquement les cellules dans le volume de culture et à les perfuser avec une solution nutritive.

Dans une première catégorie de systèmes à perfusion, les cellules sont maintenues dans le cytoculteur par un filtre rotatif à larges mailles qui plonge dans le milieu de culture (spin-filter) : la vitesse de rotation est adaptée pour permettre l’évacuation du milieu usagé dans un mouvement centripète, tandis que la force centrifuge prévient la perte des cellules.

À l’origine, à la fin des années soixante, ce système a été développé pour l’utilisation de microporteurs et de cellules adhérentes. Par la suite, il a été utilisé avec succès pour la culture d’hybridomes en suspension (les hybridomes, utilisés pour la production d’anticorps

M2 MA 27 monoclonaux, sont des cellules hybrides nées de la fusion d’un lymphocyte B producteur d’un anticorps spécifique et d’une cellule tumorale).

Une autre façon de séparer les cellules et le fluide nutritif consiste à utiliser des ultrasons générés dans un dispositif placé à la sortie du cytoculteur (ultrasonic filter): une onde stationnaire favorise l’agrégation des cellules en larges flocons qui retournent dans le réacteur par sédimentation. Une équipe, à Birmingham, a récemment démontré l’efficacité de ce système pour la culture d’hybridomes résistant à l’apoptose.

 Perfectionnements en cours

D’autres systèmes de perfusion utilisent des microporteurs poreux sur lesquels les cellules sont immobilisées. Par exemple, le procédé CelliGen Plus (New Brunswick Scientific Co, Inc, Edison, New Jersey, États-Unis) comprend un agitateur à haut débit qui permet de faire circuler le fluide nutritif et l’oxygène à travers un lit de supports fibreux sur lesquels les cellules sont fixées en grand nombre. D’autres systèmes utilisent des matrices de céramique, de polystyrène ou à base de biomatériaux (collagène, alginate de calcium), ou des fibres creuses.

Une configuration plus perfectionnée des systèmes à perfusion consiste à retenir non seulement les cellules, mais aussi les composants du milieu nutritif selon leur masse moléculaire, à l’aide de membranes semi-perméables. On peut ainsi retenir certaines protéines dans le milieu de culture et permettre l’évacuation des molécules indésirables, comme dans les appareils de dialyse rénale. Les systèmes les plus élaborés, par exemple le procédé Tecnomouse (d’Integra Biosciences Ltd, St Albans, Hertfordshire, Royaume-Uni), utilisé pour la production d’anticorps monoclonaux, permettent le transfert simultané de composants du milieu et d’oxygène. Un tel système peut faciliter des processus délicats, comme la culture d’hépatocytes dans les systèmes de foie bio-artificiel.

Enfin, le développement de procédés de production à l’échelle industrielle dépend d’un choix entre plusieurs options : extensification ou intensification, flexibilité ou spécialisation, simplicité ou complexité. La plupart des systèmes en place sont de type intensif, spécialisé et complexe.

M2 MA 28 X. Caractérisation des cellules en culture

X. 1. Evaluation de la mort cellulaire

X. 1. 1. Dosage de l'activité lactate déshydrogénase (LDH) - Principe

Cette technique mesure l'intégrité membranaire : les cellules dont la membrane a été rompue libèrent leur contenu cytosolique, et notamment la LDH, dans le milieu extracellulaire. La quantité de LDH relarguée dans le milieu de culture est proportionnelle à la mort cellulaire.

La mesure de l'activité LDH permet d’évaluer non seulement la mort cellulaire nécrotique (caractérisée par une rupture précoce de la membrane plasmique) mais aussi une partie de la mort cellulaire apoptotique : les cellules apoptotiques ne sont, pour la plupart, pas phagocytées (du fait de la très faible proportion de cellules phagocytaires dans ces cultures) et finissent par perdre leur intégrité membranaire au stade ultime du processus apoptotique ("nécrose secondaire").

La mesure de l'activité LDH dans le milieu de culture est effectuée par un dosage enzymatique colorimétrique à l'aide du kit LDH (Boehringer-Mannheim). Pour chaque puits ou boîte de culture, deux prélèvements de 50 µl de surnageant sont effectués. A chaque échantillon de 50 µl de surnageant (déposé dans une plaque de 96 puits de type Elisa) sont ajoutés 50 µl de réactif du kit contenant:

- du lactate (substrat de l'enzyme), - de l'iodotétrazolium (colorant), - de la diaphorase/NAD+ (catalyseur).

En présence de la LDH, le lactate est transformé en pyruvate et le NAD+

(Nicotinamide Adenine Dinucleotide+) est alors transformé en NADH. En présence de NADH, le colorant jaune (iodotétrazolium) est transformé en formazan (rouge-violet). Après 30 minutes d'incubation à température ambiante et à l'abri de la lumière, la quantification de la réaction est effectuée par la mesure de la densité optique (DO) à 492 nm sur spectrophotomètre ou lecteur de microplaques.

- Calcul du pourcentage de mort cellulaire

Cette technique permet une évaluation relative de la mort (ou de la survie) cellulaire.

Elle nécessite l'utilisation de deux contrôles :

M2 MA 29 - un contrôle "négatif" (C0) qui correspond à 0% de mort cellulaire (ou 100% de survie). Ce contrôle est obtenu avec le surnageant des cultures témoins;

- un contrôle "positif" (C100) qui correspond à 100% de mort (ou 0% de survie) cellulaire. Il est réalisé en mettant les cellules dans un milieu hypotonique.

Le pourcentage de mort cellulaire est évalué en calculant le rapport suivant:

(DOx - DOC₀) / (DOC₁₀₀ - DOC₀) avec :

- DOx = densité optique obtenue avec le surnageant des cultures traitées - DOC₀ = densité optique du contrôle "négatif" (0% de mort)

- DOC₁₀₀ = densité optique du contrôle "positif" (100% de mort)

X. 2. Evaluation de la prolifération cellulaire

Le réactif utilisé est le sel de tétrazolium MTT (bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium). L’anneau de tétrazolium qu’il contient est réduit, par la succinate déshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes actives, en formazan. Ceci forme un précipité dans la mitochondrie de couleur violette. La quantité de précipité formée est proportionnelle à la quantité de cellules vivantes (mais également à l'activité métabolique de chaque cellule). Il suffit donc après l'incubation des cellules avec du MTT pendant un certain temps à 37 °C (environ trois heures) de dissoudre les cellules, leurs mitochondries et donc les précipités de Formazan violets dans du DMSO 100 %. Un simple dosage de la densité optique à 550 nm par spectroscopie permet de connaître la quantité relative de cellules vivantes et actives métaboliquement. Il est donc nécessaire, dans le cas où le test doit être quantitatif, de réaliser pour chaque essai une courbe d’étalonnage. La lecture est réalisée à 550 nm grâce à un spectrophotomètre ou un lecteur de microplaques.

Les kits de dosage du MTT pour la viabilité cellulaire et la cytotoxicité fournissent un test pratique, sensible, quantitatif et fiable pour déterminer le nombre de cellules viables dans une culture donnée. Ce dosage colorimétrique homogène est basé sur la conversion d'un sel de tétrazolium MTT en formazan. Le MTT est un substrat jaune pâle et le formazan un colorant violet. Cette réaction de réduction cellulaire implique les cofacteurs pyridine nucléotide NADH / NADPH et est seulement catalysée par des cellules vivantes. Le produit formazan a une faible solubilité aqueuse et est présent sous forme de cristaux pourpres. La dissolution du

M2 MA 30 formazan résultant avec un tampon de solubilisation permet la quantification appropriée de la formation du produit. L'intensité de la couleur du produit, mesurée à 550 - 620 nm, est directement proportionnelle au nombre de cellules vivantes dans la culture. Ce type de test est facilement automatisable pour effectuer des dosages à grande échelle.

Exemples d’applications

Test d’adhésion des cellules probiotiques

Préparation de cellules animales en culture dans des Falcon, addition des cellules probiotiques (après leur comptage : N₀), incubation pendant 2 h, lavage des Falcon (Elimination des cellules non adhérées), détachement des cellules adhérées par trypsinisation ou action mécanique, comptage des cellules détachées (N₁).

Calcul du pourcentage d’adhésion : N1/N₀ x100 Test de cytotoxicité des cellules probiotiques

Préparation de cellules animales en culture dans des Falcon, addition des cellules probiotiques (après leur comptage : N0), incubation pendant 2 h, lavage des Falcon (Elimination des cellules non adhérées), addition du milieu de culture, incubation et détermination de l’intégrité membranaire par le test LDH ou de l’activité respiratoire (kit commercial XTT ou MTT).