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Hybridation moléculaire
1. DEFINITIONS
* Dénaturation = Fusion : Rupture des liaisons hydrogènes entre les 2 brins. Il faut donc un apport d'énergie.
Ce phénomène est visualisable grâce à l'effet hyperchrome : variation de la DO à 260 nm dûe au passage db --> sb.
•Température de fusion Tm (tf): Température à laquelle se produit le passage de l'état bicaténaire à l'état monocaténaire.
Tm est fonction de plusieurs éléments :
- composition en bases - longueur des brins - les mésappariements - milieu environnant l'ADN : . Une diminution de la force ionique diminue le Tm.
. La présence de formamide diminue le Tm.
2. La température de fusion de l ’ ADN
C’est une température, appelée également Température de demi dénaturation (Tm) qui correspond à l’ouverture ou au déroulement de 50% de la chaîne de l’ADN chauffé. C'est l'effet hyperchromique qui correspond à la rupture des liaisons hydrogènes (liaisons faibles) et la séparation des 2 chaînes entraîne une augmentation dans l'absorption d'U.V de 40% à 260 nm. La valeur de Tm des ADN est une fonction linéaire du pourcentage de (G + C) de l'ADN :
Mise en évidence du phénomène coopératif de passage de l’ADN double brin à l’ADN simple brin et mesure de la Tm.
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3. les facteurs influençant la Tm
3. 1. La composition en bases :
La complémentarité des deux brins de l’ADN est maintenue grâce à l’appariement entre G et C d’une part et A et T d’autre part. Mais le nombre de liaison hydrogène n’est pas le même pour chaque couple de base. Il est évident donc que le nombre de bases sera un facteur non négligeable dans le calcul de la Tm. De manière générale, on note que la relation entre la composition en G+C et la Tm est de nature linéaire pour des ADN de longueurs identiques ou suffisamment longs (>
100pb):
Tm = 69,3 + 0,41 (%G+C)
Mais en pratique, pour les oligonucléotides (duplexes de parfaits de 11 à 20 bases), on utilise plutôt la formule de Wallace:
Tm = 4(C+G) + 2(A+T) ; Th = Tm – 5
La formule de Wallace permet de déduire la Th des petits oligonucléotides (Ex. Les amorces).
3. 2. Les mésappariements :
De manière générale, l’abaissement de la Tm est de 1°C pour une valeur de 1% de mésappariement (mismatch).
3. 3. La nature du milieu de l’ADN :
Les sels sous forme de cations monovalents, lorsqu’ils sont ajoutés aux fortes concentrations (>1M) n’influencent pas les valeurs de TM. Par contre, aux faibles concentrations, la Tm diminue. Cette diminution est de 15°C pour une unité logarithmique de concentration ionique.
Les cations divalents ont un effet encore plus important. D’autres substances telles que le formamide peuvent abaisser la Tm lors des hybridations. Dans ce cas, la Tm est estimé selon la formule suivante (pour 100 pb) :
ΔTm = - 0,6 x (% formamide).
3. 4. La longueur des fragments des ADN :
La Tm devient plus grand si la longueur de l’ADN l’est aussi: un ADN long contient plus de liaisons à dissocier qu’un ADN plus court. La variation de température de fusion est donnée par la relation suivante :
ΔTm = - 500/nombre de pb.
3 On constate tout de même que l’effet longueur est important pour les petits fragments.
Pour les oligonucléotides avec N < 100 nucléotides on utilise la formule suivante en tenant compte de la concentration du sel, les mésappariements et la concentration de formamide:
Tm = 16.6log[Na+] + 0.41(%(C+G)) + 81.5 - (675/N) - %mismatch - 0.65% de formamide
La formule globale:
Tm = 81.5 + 16.6log [sel] + 0.41 [%(C+G)] - % mésappariement – (500/N) – 0.65%(formamide).
4. Principe de l ’ hybridation
5. Notion de Cot et Rot
Concentration de l ’ ADN et temps :
L’hybridation des séquences nucléiques est aléatoire. Cependant, si la concentration de l’ADN est grande, le nombre de copies hybridées sera grand. Il en résulte donc que la vitesse d’hybridation augmente lorsque la concentration de l’ADN augmente. Il en est de même pour le facteur temps : la probabilité d’association des brins complémentaires est importante lorsque le temps est long. L’hybridation est quantifiée en fonction de ces deux variables prises ensembles.
Dans le cas des ADN, cette variable est nommée le CoT, pour le cas des hybrides ADN/ARN, elle est dite le RoT :
Sonde
Hybridatio
n
Sonde hybridée
Cible
4 Courbe de détermination du Cot et du Rot
6. Autres facteurs influençant la Tm
6. 1. La température :
Elle favorise la rencontre des deux séquences complémentaires, donc la vitesse d’hybridation. On note que les meilleures vitesses d’association sont observées pour des températures inférieures à 25% de la Tm de la molécule considérée.
6. 2. La taille du fragment nucléique :
Dans le cas où les deux séquences complémentaires sont parfaitement identiques, la vitesse de réassociation de ces deux brins augmente proportionnellement avec la racine carrée de la longueur des fragments considérés.
6. 3. La nature des acides nucléiques :
La vitesse de réassociation dépend à la fois de la nature de l’hybride et de sa concentration. Si l’hybridation concerne un mélange ADN/ADN et si l’ADN est en excès par rapport à l’ARN, la vitesse d’hybridation ARN/ADN est 5 fois plus faible que la réassociation ADN/ADN. En revanche, si l’ARN est en large excès, la vitesse de réassociation sera identique à celle d’ADN/ADN.
5 6. 4. La force ionique :
La concentration en NaCl joue un rôle important dans les réassociations des segments complémentaires. Pour une concentration de NaCl qui avoisine 1M, la vitesse de réassociation peut être multipliée par un terme de 10.
Jusqu’aux environs de 1,2M et au-delà, la force ionique sera sans effet.
7. La température de réassociation
8. Les types d ’ hybridation
L'objectif de l'hybridation est la détection de la présence d'un acide nucléique d'une séquence donnée par l’utilisation d’un fragment d’ADN complémentaire = sonde. Cela peut avoir lieu en solution ou sur support solide (immobilisation de la cible sur une membrane [nitrocellulose, nylon], sur verre, colonies bactériennes, chromosomes, plage de lyse ...etc.).
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8. 1. Hybridation d ’ ADN sur support solide : Southern blot
La procédure de ce type d'hybridation est résumée en sept étapes 1 - Extraction de l'ADN
2 - Digestion enzymatique (par les enzymes de restriction) 3 - Electrophorèse du produit de la digestion
4 - Transfert sur membrane
5 - Hybridation avec une sonde spécifique marquée.
6 - Lavages 7 – Révélation
9. Southern Blot
Extraction d'ADN Digestion enzymatique
On peut aussi révéler la présence des séquences spécifiques dans les ARN (Northern Blot) et des protéines (Western Blot) utilisant le même principe.
- Hybridation de l'ADN sb avec une sonde spécifique marquée
- Lavage - Révélation
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10. Hybridation in situ sur chromosome
Cette technique permet de déterminer sur quel chromosome et dans quelle région se trouve le gène d'intérêt. Les chromosomes fixés sur lame sont hybridés avec une sonde marquée (H3). L’examination microscopique révèle les signaux positifs sous forme de grains noirs disposés sur le chromosome. Comme exemple d'application est la détection des gènes viraux intégrés dans les chromosomes. Examine
11. Hybridation sur colonie de bactéries, sur plage de lyse
Ce type d'hybridation permet la détection parmi un grand nombre de bactéries ou de phages recombinants (plage de lyse) celle ou celui qui contient le fragment d'ADN cible. La réalisation de cette technique passe par les étapes suivantes:
- Culture pure sur boite de Pétri (colonies ou plage de lyse) - Transfert sur membrane de nylon ou de nitrocellulose - Lyse alcaline des bactéries et dénaturation de l'ADN - Fixation par la chaleur ou les UV
- Hybridation avec une sonde marquée - Lavage
- Autoradiographie
Localisation en 2q13
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Les Sondes
1. Définition
* Sonde : Séquence nucléotidique, généralement marquée, complémentaire d'une séquence d'ADN ou d'ARN avec laquelle elle va s'hybrider.
* Sondes directes : exploration d'un gène ou d'une région génique dont on a déjà quelques informations.
* Sondes indirectes ou sondes anonymes : exploration de gènes peu ou pas connus
2. Les différents types de sondes
- sonde génomique : fragment obtenu par coupure de l’ADN génomique
- sonde ADNc : sonde ADN obtenue par transcription réverse d’un ARNm messager (= séquence codante)
- sonde oligonucléotides : ADN (ou ARN) simple brin de 18 à 50 nucléotides synthétisé chimiquement
- Les ribosondes
3. Obtention des sondes
- clonage - PCR
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AMPLIFICATION ELECTIVE IN VITRO : PCR OBJECTIF :
Amplifier la quantité d’ADN (uniquement l’ADN)OUTILS :
- 2 amorces (= oligonucléotides) - ADN pol
- Substrats : dXTP
PRINCIPE :
Grâce à un couple d’amorces strictement complémentaires des bornes de la région d’ADN à amplifier, on synthétise une grande quantité d’ADN à la suite de plusieurs cycles.
PRINCIPE
1. DENATURATION
: séparation des brins par augmentation de la température (95°C environ).2. HYBRIDATION DES AMORCES
: Avec les bornes de la région à amplifier (50°C environ).NB : la température doit être diminuée pour que l’hybridation est lieue.
3. SYNTHESE :
l’ADN pol synthétise de l’ADN. Ainsi, à la fin d’un cycle, on double la quantité initiale (70° environ).Fin du cycle
Après n cycles, on obtient 2n nouveaux exemplaires du fragment d’ADN
RESULTATS
Qu’obtient-on au bout du premier cycle?
2 copies avec les extrémités 3’ variables.
Qu’obtient-on au bout du deuxième cycle?
8 copies dont 2 avec les extrémités 3’ fixes.
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LIMITES et APPLICATIONS
LIMITE :
-Taille : on ne peut amplifier que des petits fragments (taille inférieure à 2 kb) - Connaissance d’une partie de l’ADN à amplifier (pour l’amorce)
- ADN pol thermorésistante est dépourvue de la fonction proof-reading d’où un risque d’erreur.
- Amplification parasite : mauvaise hybridation et contamination.
APPLICATIONS :
- Génération de sondes - Recherche de mutations - RT-PCR : étude des ARN - Clonage
- PCR quantitative
- PCR en temps réel : quantification précise.
4. Marquage des sondes
4. 1. Agent de marquage : - marquage radioactif
- 32P, 35S, 3H
1. nécessité de se protéger contre le rayonnement émis, maniement des sondes inconfortable 2. décroissance rapide du 32P, d'où besoin de marquer les sondes fréquemment
Avantage: grande sensibilité
- marquage froid
- direct - nucléotide modifié par un fluorophore
- indirect - nucléotide marqué par un reporter qui sera repéré par une molécule affine
4. 2. Stratégies de marquage - nick translation
- multi-amorçage au hasard - marquage des oligonucléotides
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5. Les sondes froides
Marquage direct avec un fluorophore
Le nucléotide portant le marqueur est incorporé directement.
Groupe chimique qui fluoresce quand il est exposé à une longueur d’onde donnée: Fluorescéine, Cy5, Cy3, Rhodamine, Texas red, TAMRA, TET.
Marquage indirect - digoxigénine
- marquage par la biotine-streptavidine
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6. Marquage par Nick-translation
Marquage par random priming
Endonucléase utilisée dans des conditions ménagées
La DNAse génère quelques cassures aléatoires simple brin
Au niveau des cassures la DNA polymérase I détruit l’ADN par son activité exonucléasique (5’-3’)….
… et le synthétise par son activité polymérase en Présence de nucléotides dont un est marqué
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Marquage d ’ un oligonucleotide
Différentes Applications
• Hybridation ADN/ADN ou ARN/ADN sur membrane
• Sondes oligonucléotides
• Séquençage
• Hybridation in situ
