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STOP
Fabrice Dufour
To cite this version:
Fabrice Dufour. Identification des partenaires neuronaux des protéines STOP. Sciences du Vivant [q-bio]. Université Joseph Fourier (Grenoble I), 2008. Français. �tel-01507202�
Présentée par
Fabrice DUFOUR
Pour obtenir le titre de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE JOSEPH FOURIER – GRENOBLE 1
(Arrêtés ministériels du 5 juillet 1984 et du 30 mars 1992)
Discipline : Biologie cellulaire
Spécialité : Neurobiologie
Identification des partenaires neuronaux
des protéines STOP
Soutenue le 25 Novembre 2008
Devant le jury composé de :
Dr Stefan Nonchev
Président
Dr Jean-Christophe Larcher
Rapporteur
Dr Fiona Francis
Rapporteur
Dr Annie Andrieux
Directrice de thèse
Thèse réalisée au sein de l’Ecole Doctorale Chimie et Sciences du Vivant
Grenoble-Institut des Neurosciences, INSERM U836, France
Sommaire
Introduction
Chapitre 1 : Le cytosquelette neuronal ... 9
A) Les microfilaments d’actine ... 9
I. Structure de l’actine ... 9
I-1. L’actine monomérique G ... 9
I-1-1. Structure moléculaire de l’actine G ... 9
I-1-2. Modifications post-traductionnelles de l’actine G ... 10
I-1-3. Isoformes de l’actine G ... 10
I-2. L’actine filamenteuse F ... 11
II. Dynamique de l’actine... 11
II-1. Mécanisme de polymérisation ... 11
II-1-1. La polarité des microfilaments d’actine ... 12
II-1-2. Les nucléateurs d’actine ... 13
II-2. Modèle de renouvellement de l’actine à la membrane ... 18
III. Rôle des microfilaments d’actine dans les neurones ... 19
III-1. Rôle de l’actine dans la structure et la motilité des cônes de croissance axonaux ... 19
III-2. Rôle de l’actine au niveau synaptique ... 22
III-2-1. La synapse ... 22
III-2-2. Rôle de l’actine dans les mécanismes pré-synaptiques ... 23
III-2-3. Rôle de l’actine dans les mécanismes post-synaptiques ... 28
B) Les neurofilaments ... 32
I. Structure et dynamique des neurofilaments ... 32
II. Fonction des neurofilaments ... 34
C) Les microtubules ... 35
I. Structure et dynamique ... 35
I-1. La structure des microtubules ... 35
I-1-1. La tubuline ... 35
I-1-2. Les protofilaments et les microtubules ... 37
I-2. La dynamique des microtubules ... 39
I-2-1. Les processus moléculaires de la polymérisation et de la dépolymérisation ... 40
I-2-2. Les mécanismes structuraux de la polymérisation et de la dépolymérisation ... 42
I-2-3. La coiffe GTP et la stabilité des MT ... 43
I-2-4. L’action des drogues affectant la dynamique microtubulaire in vitro ... 44
I-2-5. L’action des effecteurs affectant la dynamique microtubulaire in vivo ... 45
I-3. Les modifications post-traductionnelles de la tubuline ... 45
I-3-1. L’acétylation ... 46
I-3-2. Les polymodifications : la polyglutamylation et la polyglycylation ... 46
I-3-3. La détyrosination/tyrosination ... 47
I-3-4. La phosphorylation/déphosphorylation ... 49
I-3-5. La palmitoylation ... 49
I-4. Nucléation des microtubules in vivo ... 49
II. Rôle des microtubules dans la croissance neuronale ... 51
II-1. Neuritogénèse ... 51
II-2. La formation axonale ... 51
II-3. L’élongation axonale ... 52
II-3-1. Les différentes phases de l’élongation axonale ... 52
II-3-2. La dynamique des microtubules dans le cône de croissance... 53
II-3-3. Dynamique d’interaction entre les microfilaments d’actine et les microtubules dans le cône de croissance ... 54
Chapitre 2 : Les effecteurs microtubulaires neuronaux ... 56
A) Les protéines stabilisant les microtubules ... 56
I-1. MAP1 ... 56
I-2. MAP2 ... 58
I-3. Tau... 61
II. La Doublecortine (DCX) ... 64
III. Les protéines STOP... 68
IV. Les protéines liant les bouts plus des microtubules (+TIPs) ... 68
IV-1. CLIPs ... 68
IV-1-1. CLIP-170 ... 68
IV-1-2. CLIP-115 ... 72
IV-2. CLASPs ... 72
IV-3. La famille EB1 ... 76
IV-4. APC ... 78
B) Les moteurs moléculaires ... 83
I. Les kinésines ... 83
I-1. Structure générale des kinésines ... 83
I-2. Classification des kinésines ... 84
I-3. Fonction des kinésines ... 85
I-3-1. Transport antérograde axonal rapide ... 85
I-3-2. Transport antérograde axonal lent ... 90
I-3-3. Transport mixte dendritique... 90
I-3-4. Régulation du transport intracellulaire ... 93
I-3-5. Régulation de l’élongation neuritique ... 94
II. La dynéine cytoplasmique ... 95
II-1. Structure de la dynéine cytoplasmique ... 96
II-1-1. Les chaînes lourdes de la dynéine ... 97
II-1-2. Les chaînes intermédiaires de la dynéine ... 99
II-1-3. Les chaînes intermédiaires légères de la dynéine ... 101
II-1-4. Les chaînes légères de la dynéine ... 101
II-2. Fonctions de la dynéine cytoplasmique ... 102
II-3. Régulation de la fonction de la dynéine cytoplasmique ... 103
II-3-1. Régulation de la dynéine par phosphorylation ... 103
II-3-2. Régulation de la dynéine par le complexe de la dynactine ... 103
III. La chaîne légère Tctex1 de la dynéine cytoplasmique ... 107
III-1. Structure de Tctex1 ... 108
III-2. Localisation de Tctex1 au niveau tissulaire, cellulaire et subcellulaire ... 110
III-3. Fonctions de Tctex1 ... 115
III-3-1. Rôle d’adaptateur au sein du moteur de la dynéine ... 115
III-3-2. Rôles indépendants du moteur de la dynéine ... 115
Chapitre 3 : Les protéines STOP ... 121
A) Identification ... 121
B) Les différentes isoformes des protéines STOP ... 122
I. Les isoformes neuronales N-STOP et E-STOP ... 123
I-1. Structure moléculaire des isoformes neuronales ... 123
I-2. Expression et localisation tissulaires, cellulaires et subcellulaires des isoformes neuronales ... 123
II. Les isoformes non neuronales F-STOP, A-STOP et O-STOP ... 126
II-1. Structure moléculaire des isoformes non neuronales ... 126
II-2. Expression et localisation tissulaires, cellulaires et subcellulaires des isoformes non neuronales ... 127
II-3. Fonction des isoformes non neuronales ... 128
C) Caractérisation des domaines fonctionnels des protéines STOP ... 129
I. Domaines de liaison aux microtubules ... 129
II. Domaines de liaison à la calmoduline ... 130
III. Sites de phosphorylation par la kinase CaMKII ... 131
IV. Domaine de liaison aux membranes ... 132
IV-1. Caractérisation d’une nouvelle MAP, homologue aux protéines STOP ... 132
IV-1-2. Expression et localisation tissulaires et subcellulaires de SL21 ... 133
IV-1-3. Fonction de SL21 ... 133
IV-2. Caractérisation du domaine N-terminal des protéines STOP et SL21... 133
D) Les souris déficientes en STOP ... 135
Matériels et Méthodes
Matériels ... 140
A) Souches bactériennes et milieux de culture ... 140
B) Souches de levure et milieux de culture ... 140
C) Plasmides ... 141
I. Pour les expériences de double-hybride ... 141
II. Pour les expériences de co-immunoprécipitation et de co-localisation 142 III. Pour les expériences de production de protéines recombinantes ... 143
IV. Pour les expériences de BRET ... 143
D) Anticorps... 144
I. Anticorps primaires ... 144
II. Anticorps secondaires ... 145
E) Animaux utilisés ... 145
Méthodes ... 146
A) Biologie moléculaire ... 146
I. Bactéries ... 146
I.1 Amplification de fragments d’ADN et mutagénèse dirigée par PCR ... 146
I-2. Clonage d’un fragment d’ADN dans un plasmide vecteur ... 146
I-2-1. Clonage de fragments d’ADN produits par PCR : "TOPO TA Cloning" ... 146
I-2-2. Clonage de fragments d’ADN produits par digestion enzymatique ... 146
I-3. Transformation bactérienne ... 147
I-4. Extraction d’ADN plasmidique de bactéries : mini- et maxi-préparation d’ADN ... 147
I-5. Dosage de l’ADN plasmidique ... 147
II. Levures ... 147
II-1. Principe du double-hybride ... 147
II-2. Transformation des levures ... 149
II-2-1. Par co-transformation ... 149
II-2-2. Par mating ... 149
II-3. Double sélection des clones positifs pour une interaction ... 149
II-3-1. 1er critère de sélection : pousse sur milieu sans histidine ... 149
II-3-2. 2ème critère de sélection : test de l’activité -galactosidase ... 149
B) Biochimie ... 150
I. Préparation d’extraits protéiques ... 150
I-1. Dissection des cerveaux de souris ... 150
I-2. Purification des protéines STOP à partir de cerveaux de souris ... 150
I-2-1. Purification de la fraction CE ... 150
I-2-2. Traitements de la fraction CE ... 151
I-2-3. Purification des protéine STOP par immunoaffinité ... 152
- Préparation de la colonne d’anticorps mAb 175 ... 152
- Chromatographie d’immunoaffinité ... 153
II. Détection et analyse des protéines ... 154
II-1. Détermination de la concentration protéique par la méthode de Bradford . 154 II-2. Electrophorèse des protéines en condition dénaturante (SDS-PAGE) ... 154
II-3. Détection des protéines par coloration au bleu de Coomassie ... 155
II-4. Electrotransfert des protéines sur membranes de nitrocellulose et immunodétection (Western-blot) ... 155
II-4-2. Détection immunologique des protéines transférées sur membrane de nitrocellulose ... 155
III. Test de co-sédimentation avec l’actine ... 156
IV. Production et purification de protéine fusionnée à la GST ... 156
V. Production et purification d’anticorps polyclonaux (anti-Tctex1) ... 157
V-1. Production d’anticorps polyclonaux anti-peptides ... 157
V-2. Préparation des colonnes d’affinité Sulfolink-peptides ... 157
V-2-1. Immobilisation du peptide sur colonne d’affinité ... 157
V-2-2. Purification des anticorps sur colonne d’affinité ... 158
VI. Co-immunoprécipitations à partir de lysats cellulaires transfectés .... 159
VI-1. Préparation des billes de Sépharose-Protéine A/Protéine G ... 159
VI-2. Préparation des lysats cellulaires ... 159
VI-3. Immunoprécipitation et co-immunoprécipitation des protéines surexprimées dans les lysats cellulaires... 159
VII. BRET ... 160
VIII. Peptides immobilisés sur membrane ("peptide spots")... 161
VIII-1. Principe ... 161
VIII-2. Vérification de la spécificité de reconnaissance d’un épitope par un anticorps ... 161
VIII-3. Ciblage du site d’interaction d’une protéine avec son partenaire ... 162
C) Biologie cellulaire ... 162
I. Culture cellulaire ... 162
I-1. Culture des lignées cellulaires ... 162
I-2. Culture des neurones primaires d’hippocampe de souris ... 163
I-2-1. Préparation des lamelles ... 163
I-2-2. Préparation des boîtes de culture ... 163
I-2-3. Obtention de la suspension cellulaire et mise en culture ... 163
II. Transfection transitoire des cellules de mammifère ... 164
III. Immunofluorescence indirecte ... 165
III-1.Fixations ... 165
III-2. Immunomarquage ... 165
IV. Etude du transport rétrograde... 165
Résultats
Chapitre 1 : La régulation de la protéine STOP ... 167
au niveau de la synapse ... 167
A) La protéine STOP et le réseau d’actine ... 167
B) La protéine STOP et sa localisation synaptique ... 172
Chapitre 2 : Recherche des partenaires neuronaux ... 174
de la protéine STOP ... 174
A) Les deux criblages en double-hybride... 174
B) Tests d’interaction de la protéine STOP avec les partenaires potentiels
trouvés lors des criblages ... 176
I. Par double-hybride ... 176
II. Par co-immunoprécipitation... 179
III. Par double marquage en immunofluorescence ... 180
Chapitre 3 : Etude de l’interaction de la protéine STOP avec Tctex1 183
A) Fabrication d’anticorps polyclonaux anti-Tctex1 ... 183
B) Tests de l’interaction de Tctex1 avec N-STOP par différentes techniques
biochimiques ... 187
I. Quantification de l’interaction par le transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET) ... 187
II. Ciblage du site d’interaction de N-STOP avec Tctex1 par la technique des "peptides spot" ... 190
III. Tests d’interaction de LCt muté pour le site RRRIR et/ou le module Mn3 avec Tctex1 ... 192
III-1. Par double-hybride ... 192
III-2. Par co-immunoprécipitation ... 195
C) Lien fonctionnel entre STOP et Tctex1 ... 197
I. STOP et la maturation pré-synaptique ... 197
II. STOP et le transport rétrograde neuronal ... 202
Discussion
Préambule ... 206
La régulation de la protéine STOP par phosphorylation ... 208
et son adressage à la synapse... 208
A) Modèle de régulation de la localisation synaptique des protéines STOP par
phosphorylation ... 208
B) Les protéines STOP et leur activité de stabilisation microtubulaire à la
synapse ... 209
C) Les protéines STOP et le pool vésiculaire pré-synaptique ... 210
L’identification des partenaires neuronaux ... 212
des protéines STOP ... 212
A) L’interaction de la protéine STOP avec le partenaire Arc ... 212
B) L’interaction de la protéine STOP avec le partenaire Nsg2 ... 215
C) L’interaction de la protéine STOP avec le partenaire Tctex1 ... 216
La protéine STOP et la maturation de l’élément pré-synaptique ... 219
La protéine STOP et le transport rétrograde microtubulaire ... 222
Conclusion générale ... 224
Bibliographie ... 225
µg/ml : Microgramme par millilitre µm : Micromètre
µM : Micromolaire
µm.s-1 : Micromètre par seconde
AAA+ : ATPases associated diverse cellular activities ABPs : Actin binding proteins
Actine F : Actine filamenteuse Actine G : Actine globulaire
ADF : Actin-Depolymerisation Factor ADN : Acide Désoxyribonucléotidique ADP : Adenosine diphosphate
Aip1: Actin-interacting protein 1 ALS : Sclérose Latéral Amyotrophique
AMPA : -amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid APC: Adenomatous polyposis coli
APP: Amyloid- precusor protein
APV: 2-amino-5-phosphonopentanoic acid
Arc: Immediate-early-gene product activity-regulated cystoskeleton-associated protein ARN : Acide Ribonucléotidique
ARNm : Acide Ribonucléotidique messager Arp: Actin related protein
ASEF: APC-stimulated guanine nucleotide exchange factor A-STOP: Astrocytic-STOP
ATP: Adenosine triphosphate
BDNF: Brain-derived neurotrophic factor
BRET: Bioluminescence resonance energy transfer CA1 : Région 1 de la Corne d’Ammon de l’hippocampe CaM: Calmoduline
CaMKII: Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II
CAP-Gly: Cytoskeletal associated protein glycine rich CASK: Ca2+/calmodulin-dependent serine protein kinase
Cdc42: Cell division cycle 42 proteins C-DCX: Carboxy-terminal Doublecortine Cdk5: Cyclin dependent kinase 5
CLAPs: Cytoplasmic linker proteins associated proteins CLIPs: Cytoplasmic linker proteins
Crmp-2: Collapsing response mediator protein-2 C-terminal: Carboxy-terminal
CTTs: C-terminal tails
DCLK: Doublecortin-like kinase DCX: Doublecortine
DHC: Dynein heavy chain DIC: Dynein intermediate chain
DISC-1: Disrupted-In-Schizophrenia-1 DLC: Dynein light chain
DLIC: Dynein light intermediate chain DOC : Deoxycholate
DRG: Dorsal root ganglia DYNC1:Cytoplasmic dynein 1
DYNLL1: Dynein LC8 light chain 1
DYNLRB1: Dynein roadblock light chain 1 E / Glu : Résidu glutamate
EBS : End binding proteins EGF: Epidermal Growth Factor EST: Expressed sequence tag E-STOP: Early-STOP
F-STOP: Fibroblatic-STOP G: Résidu glycine
GAP43: Growth associated protein 43 GDP: Guanosine diphosphate
GFP: Green fluorescent protein GluR2: Glutamate receptors
GMPCPP: Guanosine triphosphate non hydrolysables GRIP1: Glutamate recepteur-interacting protein1 GSK3 : Glycogen Synthase Kinase 3
GST: Glutathione S-transferase GTP: Guanosine triphosphate HDAC6: Histones déacétylases
HMWMAP2: High molcular weigh microtubule associated protein 2 JIPs: c-Jun N-terminal kinase-interacting proteins
JNK : c-Jun N-terminal kinase K : Résidu lysine
KAP3:Kinesin superfamily-associated protein
Kd: Constance de dissociation KDa: KiloDalton
KIF: Kinesin Family Member Kip2p: Kinesin-related proteins KLCs: Kinesin light chains KO : Knock-out
KR domain : Domaine riche en lysine et arginine des protéines N- et E-STOP LMWMAP2: Low molecular weigh microtubule associated protein 2
LTD: Long term depression LTP: Long term potentiation
L-type Ca2+ channel : Canal calcique sensible au voltage de type L (Long lasting)
MAP : Microtubule associated protein
MARK : Microtubule – associated protein regulating kinase MDa : MegaDalton
Mp : Mega paire de base
MTB : Microtubules-binding domain MTOCs : Microtubule-organizing centers MTs : Microtubules
N-DCX : Amino-terminal Doublecortine NF-H : chaîne lourde des neurofilaments NF-L : chaîne légère des neurofilaments NF-M : chaîne moyenne des neurofilaments NFs: neurofilaments
NGF: Nerve Growth Factor nm: nanomètre
NMDA: N-methyl-D-aspartate NR2B:
NMDA receptor 2B
NSF: soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor N-STOP: Neuronal-STOP
N-terminal: amino-terminal
N-type Ca2+ channel : Canal calcique sensible au voltage de type N (Neuronal)
O-STOP : Oligodendrocytic-STOP
P/Q-type Ca2+ channel : Canal calcique sensible au voltage de type P/Q (Purkinje)
PAK : p21-activated protein kinase PC12 : Pheochromocytoma cell PFA : Paraformaldéhyde
Pi : Phosphate inorganique
PIP3 : phosphatidyl-inositol-3, 4,5-triphosphate PKA : Cyclic-AMP-dependent protein kinase A PKC : Cyclic-AMP-dependent protein kinase C
PP2A : phosphotase 2A PRD : Prolin-rich sequence PSD : Post synaptic density
PTMs : Post-translational modification PTP : Post Tetanic Potentiation
R : résidu arginine
Rac1 : Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 RP3 :
Retinitis Pigmentosa 3 protein
SAMP : résidus sérine, alanine, méthionine et proline SCLH : subcortical laminar heterotopia
SirT2 : Histones déacétylases SL21: STOP-like protein21 SMA: Amyotrophie Spinale
SNAP: Synaptosome-associated protein SNARE : solube (NSF) attachement receptor SNC : Système Nerveux Central
Spn: spinophiline
STOPs: Stable Tubule Only Polypeptide Tctex1 : T-complex testis expressed 1 TIPs: plus-end tracking proteins
TTCP: Tubulin tyrosine carboxypeptidase TTL: Tubulin tyrosine ligase
TTLL: Tubulin-tyrosine ligase-like VGCC: Voltage-gated calcium channel WASPs: Wiscott-Aldrich-syndrome XLIS : X-linked lissencephaly Y / Tyr : résidu tyrosine YFP : yellow fliorescent protein
Chapitre 1 : Le cytosquelette neuronal
L'intégrité d'un organisme vivant nécessite l'activité coordonnée des cellules qui le composent. Cette coordination est assurée par des mécanismes de communication intercellulaire impliquant soit des cellules d'un même tissu, soit des cellules pouvant être très éloignées, appartenant à des tissus différents. La communication intercellulaire est assurée par deux grands systèmes : le système hormonal (communication humorale) et le système nerveux, qui transmet l'information au moyen de prolongements cellulaires. Les neurones, cellules spécialisées et fortement polarisées d’un point de vue morphologique, et les cellules gliales constituent les unités fonctionnelles du système nerveux. Les cellules neuronales ont un corps cellulaire d’où émergent plusieurs ramifications neuritiques qui s’arborisent plus ou moins abondamment. Ces prolongements sont de deux types : les dendrites et l'axone, qui se distinguent sur la base de critères morphologiques, métaboliques et fonctionnels. L’organisation asymétrique de ces cellules permet ainsi à chacune d’elles d’assurer une fonction globale spécifique qui est de collecter, d’analyser et de transférer les informations sous la forme d’un influx électrique. Alors que les dendrites et le corps cellulaire constituent la principale surface de réception de l’information, l’axone délivre l’information en la générant et la propageant. La différence fonctionnelle entre les dendrites et l’axone est une conséquence directe de l’hétérogénéité des éléments moléculaires et structuraux qui les constituent. Le développement et le fonctionnement des cellules neuronales sont, pour cette raison, tributaires d’éléments architecturaux internes permettant d’établir et de maintenir cette asymétrie cellulaire. L’architecture des neurones est établie, comme dans les autres cellules eucaryotes, par les éléments du cytosquelette. Ils peuvent être regroupés en trois types d’éléments fibrillaires : les microfilaments d’actine, les neurofilaments et les microtubules.
A) Les microfilaments d’actine
I. Structure de l’actine
I-1. L’actine monomérique G
I-1-1. Structure moléculaire de l’actine G
L’actine G est une protéine globulaire de 43 kDa, en forme d’haltère, composée de 375 acides aminés arrangés en deux domaines de taille presque équivalente partagés eux-mêmes en deux sous-domaines. Ces quatre domaines ménagent entre eux une crevasse centrale où se localise un adénonucléotide sous forme triphosphate (ATP pour
"Adenosine triphosphate") ou diphosphate (ADP pour "Adenosine diphosphate") dont l’affinité varie en fonction des conditions ioniques (Kabsch et al., 1990) (Figure1).
Figure 1 : Représentation de la structure tertiaire de l’actine monomérique G obtenue à partir d’une cristallographie aux rayons X.
A. Représentation schématique de la structure tertiaire de l’actine G (d’après Kabsch et al., 1990). Les hélices sont représentées sous forme de cylindres rouges et les brins sous forme de flèches grises. Le centre de la molécule correspond à la poche nucléotidique de l’actine où est insérée la molécule d’ATP et l’ion Ca2+, représentés sous forme cyclique et sous forme de point
rouge respectivement. N réprésente l’extrémité N-terminale et C l’extrémité C-terminale de la molécule.
B. Représentation atomique de la structure tridimensionnelle de l’actine G (d’après Hennessey et al., 1993). Les 4 sous-domaines structuraux sont délimités par des couleurs : le sous-domaine 1 (résidus 1-32, 70-144, 338-375) est en rouge, le sous-domaine 2 (résidus 33-69) en jaune, le sous-domaine 3 (résidus 145-180, 270-337) en bleu et le sous-domaine 4 (résidus 181-269) en vert. La molécule d’ATP est en violet.
I-1-2. Modifications post-traductionnelles de l’actine G
Deux résidus de l’actine sont modifiés de façon post-traductionnelle au niveau de l’extrémité N-terminale de l’actine G : l’acide aspartique en position 1 est acétylé au niveau du groupement NH2 et l’histidine en position 73 est méthylée (Solomon and
Rubenstein, 1985; Pollard, 1986; Hennessey et al., 1993). L’acétylation semble nécessaire à la polymérisation de l’actine (Hennessey et al., 1991). Ces modifications sont caractéristiques de l’actine et sont très conservées.
I-1-3. Isoformes de l’actine G
Les gènes d’actine ont évolué à partir d’un précurseur commun et sont hautement conservés. L’actine provient de l’expression de plusieurs gènes. Plusieurs isoformes (au moins 6) ont été identifiées chez les vertébrés supérieurs. L’isoforme est exprimée spécifiquement dans les cellules musculaires. Les deux isoformes non musculaires et sont exprimées dans tous les types cellulaire et notamment dans le cytoplasme des neurones en quantités relativement équivalentes (Rubenstein, 1990; Khaitlina, 2001). La
-actine est spécifiquement enrichie aux sites associés aux membranes, notamment à l’extrémité axonale. La quantité néo-synthétisée de -actine, relativement faible par rapport au pool d’actine totale, est régulée localement par un gradient du facteur neurotrophique BDNF (Bassell et al., 1998; Yao et al., 2006). La nature de la localisation et de la régulation de la synthèse de -actine, souligne indirectement l’importance du contrôle de la nucléation pour le guidage du cône de croissance (protubérance localisée à l’extrémité de l’axone au cours du développement du neurone). -actine est distribuée plus uniformément à travers la cellule et n’est pas synthétisée à l’extrémité axonale en réponse aux facteurs de guidage.
Le rôle biologique fondamental de l’actine semble être à la base de la conservation remarquable de la séquence primaire de cette protéine. Les actines de différentes sources cellulaires divergent par la nature de quelques acides aminés à leur extrémité amino-terminale. Ce domaine, étant impliqué dans les interactions avec les autres protéines du cytosquelette, pourrait influencer la localisation subcellulaire des différentes actines (Kabsch et al., 1990).
I-2. L’actine filamenteuse F
Dans des conditions physiologiques, les monomères d’actine globulaire (actine G) polymérisent afin de former une structure fibrillaire appelée actine filamenteuse (actine F) de plusieurs micromètres de long, de 7 à 9 nm de diamètre, et pouvant exister sous forme labile ou stable. Les microfilaments sont stabilisés par de nombreux contacts hydrophobes et de nombreuses liaisons hydrogènes qui s’établissent entre deux monomères d’actine G. Ainsi, dans un polymère d’actine, la rotation d’un monomère par rapport au précédent est proche de 180°, ce qui donne au filament l’apparence d’une double hélice.
II. Dynamique de l’actine
II-1. Mécanisme de polymérisation
La capacité de l’actine monomérique à polymériser en un filament hélicoïdal est une propriété intrinsèque et fondamentale pour son activité biologique dans toutes les cellules eucaryotes. In vitro, la polymérisation de monomères d’actine G nécessite leur association non covalente avec des adénonucléotides pour former un complexe actine-nucléotide, et est induite par un apport d’ions divalents ou monovalents (Ca2+, Mg2+, K+,
et Na+) à des concentrations cytosoliques. Elle débute par une phase d’activation (Cooper
et al., 1983). Ce phénomène produit une neutralisation et un changement dans la conformation des monomères. La phase d’activation est suivie par une phase de
nucléation, qui correspond à l’apparition en solution des premiers oligomères hélicoïdaux constituant les noyaux de polymérisation. Ces noyaux sont des trimères issus de l’assemblage de trois monomères d’actine et constituent la structure minimale à partir de laquelle un filament d’actine peut être synthétisé (Tobacman et al., 1983; Carlier et al., 1997).
II-1-1. La polarité des microfilaments d’actine
Un filament d’actine est une structure polarisée dont les deux extrémités sont distinctes d’un point de vue structural et dynamique (Kabsch et al., 1990). L’extrémité barbée ("barbed end") ou extrémité positive est caractérisée par une constante d’association supérieure à la constante de dissociation : elle favorise ainsi l’assemblage des monomères. L’extrémité pointue ("pointed end") ou extrémité négative présente au contraire une constante d’association inférieure à la constante de dissociation : elle favorise plutôt le désassemblage.
Si le filament d’actine est considéré de l’extrémité positive à l’extrémité négative, au cours de la polymérisation, il se compose de 3 types de complexes actine-nucléotide : l’actine G-ATP, actine G-ADP-Pi et actine G-ADP (Carlier, 1991a, b; Carlier et al., 1991). L’ajout d’une sous-unité actine-G est plus rapide pour les monomères liés à l’ATP que ceux liés à l’ADP (Pollard and Borisy, 2003). L’hydrolyse de l’ATP en ADP-Pi et la dissociation du phosphate inorganique s’effectuent respectivement 1 à 2 secondes et 600 secondes in vitro après l’incorporation des sous-unités. C’est un phénomène similaire à l’hydrolyse du GTP qui accompagne l’assemblage des microtubules. Cependant cette hydrolyse n’est pas nécessaire à l’ajout d’autres monomères. Basé seulement sur la cinétique de l’hydrolyse de l’ATP et du relarguage du Pi, les sous-unités ATP-actine sont concentrées et maintenues à l’extrémité barbée, alors que les sous-unités actine-ADP-Pi et actine-ADP recouvrent tout le reste du filament. Les deux extrémités du filament d’actine maintiennent différentes concentrations critiques de monomères pour l’assemblage. Quand la concentration monomérique d’actine est comprise entre les concentrations critiques des deux extrémités, l’assemblage est ainsi favorisé à l’extrémité barbue et le désassemblage à l’extrémité pointue. A taux constant, l’extrémité barbée est donc le site de l’addition des sous-unités ATP-actine alors que l’extrémité pointue est le site de la perte d’actine-ADP à la fois in vitro et dans la cellule. Le filament d’actine atteint ainsi un état d’équilibre dynamique, processus appelé effet "tapis roulant" ou "treadmilling" (Wegner, 1976) (Figure 2). Dans les cellules le renouvellement de l’actine est augmenté de plus de cent fois par des protéines liant l’actine et entraînant la coupure des filaments ou facilitant l’échange nucléotidique ADP-ATP des sous-unités monomériques.
Figure 2 : Etat d’équilibre dynamique de l’actine filamenteuse F ou effet "tapis roulant" (d’après Pak et al., 2008).
Lorsque leur concentration sous forme monomérique est élevée, les sous-unités d’actine G liées à l’ATP ("ATP-actin") s’assemblent à l’extrémité barbée ("Barbed end"), extrémité dont le taux de polymérisation est supérieur à celui de la dépolymérisation. Après son incorporation dans le filament, l’actine-ATP s’hydrolyse rapidement en actine-ADP-phosphate inorganique ("ADP-Pi-actin"). Le phosphate se dissocie lentement afin de donner de l’actine-ADP ("ADP-actin") qui finit par se dissocier à l’extrémité pointue ("Pointed end"), extrémité dont le taux de dépolymérisation est supérieur à celui de la polymérisation.
II-1-2. Les nucléateurs d’actine
Les nucléateurs d’actine permettent de stimuler de novo l’assemblage de filament d’actine. Ils facilitent la formation de noyaux de polymérisation. Quatre classes de nucléateurs sont présentes dans les neurones et ont été caractérisées in vitro : le complexe Arp2/3, les protéines formine, Spir et ADF/cofiline (Mullins et al., 1998; Blanchoin and Pollard, 2002; Andrianantoandro and Pollard, 2006). In vivo, chaque nucléateur se localise à l’extrémité membranaire par des interactions protéiques ou dépendantes des lipides. Ils sont auto-inhibés ou intrinsèquement inactifs et nécessitent des molécules de signalisation enrichies à la membrane pour être activées (Bamburg et al., 1999; Faix and Grosse, 2006; Kerkhoff, 2006; Takenawa and Suetsugu, 2007). Chaque classe nucléée les filaments d’actine à travers des mécanismes distincts, suggérant qu’ils participent à l’assemblage de différentes superstructures d’actine dans des micro-domaines distincts, notamment au sein du cône de croissance des neurones. - Le complexe Arp2/3
Le premier nucléateur d’actine découvert fut le complexe Arp2/3, un complexe macromoléculaire de sept sous-unités protéiques (Mullins et al., 1998; Robinson et al., 2001) (Figure 3). Le complexe mime la structure d’un dimère d’actine latéral et permet la formation de nouvelles branches d’actine à partir d’un filament initial. Le complexe Arp2/3 n’interagit pas directement avec les membranes. Il est concentré à l’extrémité de certains cônes de croissance grâce à son association avec un complexe de signalisation enrichi à la membrane, composé des protéines Rho GTPase Cdc42 et des protéines
Wiscott-Aldrich-syndrome (WASPs). Les protéines WASPs peuvent ainsi activer le complexe inactif Arp2/3 (Higgs and Pollard, 2000, 2001). Dans certains types neuronaux, les sous-unités du complexe Arp2/3 se localisent dans le domaine central du cône de croissance (Strasser et al., 2004) alors que dans d’autres elles sont situées aux extrémités (Goldberg et al., 2000; Mongiu et al., 2007). Dans les cônes de croissance, le rôle exact du complexe Arp2/3 reste non élucidé.
Figure 3 : Mécanisme de nucléation de filaments d’actine par le complexe Arp2/3. A. Structure du complexe Arp2/3 de bœuf, composée de sept sous-unités, et obtenue à partir d’une cristallographie aux rayons X (d’après Robinson et al., 2001).
B. Nucléation de filaments d’actine in vitro, à partir d’actine pure et de complexes Arp2/3 issus de la bactérie Acanthamoeba, par microscopie électronique (d’après Mullins et al., 1998). Les points de branchements où sont localisés les complexes Arp2/3 sont indiqués par des flèches, et forment un angle de 70° entre les filaments d’actine.
C. Branchements de filaments d’actine in vivo à l’extrémité membranaire d’un kératocyte de
Xenopus par microscopie électronique (d’après (Svitkina and Borisy, 1999). Sur l’encart agrandi,
le réseau de branchements est surligné en bleu.
D. Représentation schématique de la nucléation d’un nouveau filament d’actine sur un filament préexistant grâce au complexe multimérique Arp2/3 (d’après (Pak et al., 2008)). L’extrémité + correspond à l’extrémité barbée.
- Les formines
La formine lie deux monomères d’actine (Faix and Grosse, 2006). Contrairement au complexe Arp2/3, les formines suivent l’extrémité barbée du filament en croissance (Kovar et al., 2006). En plus de stabiliser les dimères d’actine, les formines peuvent lier les complexes actine-profiline qui accélèrent l’addition de monomères à l’extrémité barbée (Romero et al., 2004; Romero et al., 2007) (Figure 4). Les formines sont particulièrement impliquées dans l’assemblage de filaments linéaires empaquetés (en faisceaux ou en "bundle"), au niveau des filopodes des cônes de croissance.
Figure 4 : Mécanisme de nucléation de filaments d’actine par la formine et la profiline (d’après (Romero et al., 2004)).
La formine permet le recrutement successif de molécules d’actine-ATP-profiline à l’extrémité barbée en interagissant avec la profiline. L’hydrolyse rapide de l’ATP provoque le relargage de la profiline et du phosphate inorganique, et libère un des domaines de la formine pour une liaison supplémentaire avec une molécule d’actine-ATP-profiline. Ce processus permet une élongation rapide du filament d’actine. L’extrémité + correspond à l’extrémité barbée et l’extrémité – à l’extrémité pointue.
- Les Spirs
Les Spirs ont été originellement découvertes en tant que protéines codées par le gène
Spire des Drosophila melanogaster. Elles renferment dans leur région centrale quatre
motifs de liaison à l’actine G et homologues aux protéines WASPs (A, B, WH2-C et WH2-D, "WASP homology domain-2"), localisés très fréquemment dans des régulateurs de cytosquelette d’actine (Figure 5). Les motifs WH2-C et WH2-D lient chacun un monomère d’actine et la région L-3 reliant ces deux domaines favorise la formation d’un dimère d’actine par stabilisation de l’interaction des deux monomères. Les deux autres motifs WH2-A et WH2-B ajoutent successivement le 3ème et le 4ème
monomère au dimère initialement formé. A partir de quatre sous-unités monomériques, le domaine central a ainsi permis de former un tétramère longitudinal qui, combiné avec d’autres, forme un noyau octamérique (Quinlan et al., 2005; Kerkhoff, 2006). Comme le complexe Arp2/3, les protéines Spir restent associées à l’extrémité pointue des filaments et comme les formines, elles sont capables de nucléer des filaments à partir de simples monomères. Mais contrairement au complexe Arp2/3 et aux formines qui stabilisent latéralement un dimère, elles stabilisent longitudinalement un oligomère. Elles sont davantage impliquées dans le trafic vésiculaire que dans la motilité du cône de croissance.
Figure 5 : Mécanisme de nucléation de filaments d’actine par les protéines Spir (d’après Kerkhoff, 2006).
A. Représentation schématique de la protéine Spir. La protéine contient dans la région N-terminale un domaine KIND correspondant à une partie non catalytique de la famille des kinases PAK ("p21-activated protein kinase"), permettant probablement l’interaction avec des protéines de signalisation. La région C-terminale de Spir comprend un domaine FYVE en doigt de zinc permettant probablement la liaison à la membrane et une boîte Spir ("Spir-box") permettant probablement de lier des Rab GTPases. L’interaction éventuelle du domaine C-terminal des protéines Spir avec la membrane et des Rab GTPase suggère que les protéines Spir peuvent exercer une fonction dans le transport membranaire intracellulaire. La région centrale est constituée de quatre motifs de liaison à l’actine G et homologues aux protéines WASPs (WH2 pour "WASP homology domain-2"), permettant la nucléation des filaments d’actine.
B et C. Modèle de nucléation construit à partir d’expériences de mutagénèse dirigée et d’observations en microscopie électronique (Quinlan et al., 2005).
Un dimère initial d’actine est formé par la liaison de deux monomères aux motifs WH2-C et WH2-D puis stabilisé par la région de liaison L-3 au centre de la protéine Spir. Les deux monomères associés aux motifs WH2-A et WH2-B s’empilent longitudinalement sur le dimère afin de constituer un tétramère. Associé à quatre autres monomères, ce tétramère donne un noyau octamérique servant d’extrémité pointée, à partir de laquelle la polymérisation des sous-unités peut se mettre en place et le filament d’actine s’allonger.
- Les ADF/cofilines
La cofiline et l’ADF appartiennent à la même famille protéique. L’ADF ("actin-depolymerisation factor") a été isolé à partir de cerveau embryonnaire de poulet et nommé pour sa capacité à dépolymériser à faible concentration des filaments d’actine (Bamburg et al., 1980). La cofiline-1 ("co-filamentous with actine") a été isolée à partir de cerveau de porc et nommée pour sa capacité à lier et co-sédimenter avec l’actine F (Nishida et al., 1984b; Nishida et al., 1984a; Muneyuki et al., 1985). La séquence protéique de la cofiline humaine partage 70% d’homologie avec celle de l’ADF.
L’ADF/cofiline permet le renouvellement des filaments d’actine en entraînant à la fois leur assemblage et leur désassemblage et son activité duale est régulée par sa concentration locale. A faible concentration (inférieure à celle de l’actine F et à la constante d’équilibre de dissociation), la cofiline se lie aux filaments d’actine et entraîne leur fragmentation (Maciver et al., 1991; Orlova et al., 2004). Cette activité de coupure est corrélée avec l’addition de coiffes protéiques comme la gelsoline ou Aip1 qui condamnent les extrémités barbées et favorisent ainsi le désassemblage aux extrémités pointues. Elle permet la production de plus de la moitié du pool de monomères d’actine dans le cytoplasme. Les monomères d’actine désassemblés à l’extrémité pointue des filaments
grâce à l’activité de la cofiline peuvent être recyclés pour la polymérisation à l’extrémité pointue. A forte concentration, la cofiline se lie coopérativement aux filaments d’actine sans les fragmenter et favorise l’effet "tapis roulant" en accélérant le relargage du phosphate inorganique des sous-unités actine-ADP-Pi (Blanchoin and Pollard, 1999). A une concentration très élevée par rapport à celle de l’actine G et par un mécanisme non clairement identifié à ce jour, la cofiline stimule l’assemblage spontanée de monomères d’actine et l’élongation de filaments (Carlier and Pantaloni, 1997; Yeoh et al., 2002). La nucléation de filaments d’actine de novo a été mise en évidence dans des cellules en migration, en présence d’un ratio cofiline :actine très élevé (Andrianantoandro and Pollard, 2006). La cofiline exerce indirectement un rôle dans la formation de lamellipode au cours de la migration neuronale induite par un stimulus externe, comme l’exposition à un facteur de croissance, comme l’EGF ("Epidermal Growth Factor") (Kiuchi et al., 2007).
Figure 6 : Activité duale de la cofiline sur l’actine selon sa concentration locale (d’après Andrianantoandro et Pollard, 2006).
De très faibles concentrations en cofiline n’exercent aucune influence sur les filaments d’actine et leur stabilité. A faible concentration par rapport à l’actine F, la cofiline se lie aux filaments et provoque leur fragmentation. Des coiffes protéiques ("capping" proteins) lient les extrémités barbées (+) des filaments d’actine coupés et favorisent ainsi la dépolymérisation des monomères aux extrémités pointues (-). A plus forte concentration, la cofiline se lie aux filaments mais au lieu de les couper, elle accélère le relargage du phosphate inorganique des sous-unités d’actine pour lesquelles l’ATP a été hydrolysé. A très forte concentration (ratio cofiline:actine supérieur à 2:1), la cofiline lie les monomères d’actine, stimule leur nucléation et l’assemblage de filaments. - Thymosine β4 et profiline
Des mécanismes d’inhibition de l’assemblage de l’actine de novo existent. L’isoforme thymosine 4, composée quasi intégralement d’un motif WH2 de liaison à l’actine homologue aux protéines WASPs, séquestre des sous-unités monomériques actine-ATP avec une affinité 100 fois supérieure aux monomères actine-ADP. Sa haute concentration
cellulaire permet ainsi d’éviter l’assemblage spontané des monomères actine-ATP en noyau trimérique, et maintient un large pool monomérique dans le cytoplasme (Carlier et al., 1993; Carlier et al., 1996; Paunola et al., 2002). La thymosine 4 et la profiline ont une action antagoniste et entrent en compétition au niveau du pool de monomères, la profiline favorisant l’échange ADP-ATP des sous-unités et leur assemblage à l’extrémité barbée des filaments (Pantaloni and Carlier, 1993; Carlier et al., 1994).
Des mécanismes d’inhibition de l’assemblage de l’actine aux filaments préexistants utilisent des coiffes protéiques qui se lient aux extrémités barbées des microfilaments et bloquent ainsi leur croissance (Carlier and Pantaloni, 1997).
II-2. Modèle de renouvellement de l’actine à la membrane
La motilité cellulaire est entraînée par la polymérisation de monomères d’actine en filaments qui poussent l’extrémité membranaire et favorise ainsi l’extension de pseudopodes (Pollard et al., 2000, 2001; Pollard and Borisy, 2003; Carlier and Pantaloni, 2007) (Figure 7). Les sous-unités d’actine dans le filament doivent être ainsi renouvelées afin de maintenir un pool de monomères pour la polymérisation. A l’extrémité axonale, près de la membrane plasmique, la protéine profiline se lie aux monomères d’actine et sert de facteur d’échange nucléotidique en remplaçant l’ADP par l’ATP. Elle permet de maintenir un pool de sous-unités actine-ATP, dont une partie est séquestrée par la thymosine 4. Un stimulus extracellulaire, par exemple un facteur chimiotactique, en se liant à des récepteurs membranaires, va activer une cascade de signalisation intracellulaire, notamment la famille des Rho GTPases : ces GTPases se lient et activent les protéines de la famille WASP/Scar en levant leur auto-inhibition. Les protéines WASP/Scar activées s’associent à un complexe Arp2/3 et un monomère d’actine afin d’initier la croissance d’un nouveau filament d’actine sur la branche d’un filament plus ancien. La nouvelle branche se synthétise rapidement à son extrémité barbée par l’addition de complexes actine-profiline, permettant ainsi de "pousser" la membrane plasmique. L’élongation du filament dure 1 à 2 secondes jusqu’à ce qu’elle soit bloquée par l’addition d’une coiffe protéique comme la gelsoline. L’hydrolyse de l’ATP lié aux sous-unités d’actine incorporées dans le filament, puis la dissociation du phosphate accélérée par la protéine ADF/cofiline, entraînent le détachement des branches d’actine du complexe Arp2/3 et la liaison de l’ADF/cofiline aux sous-unités ADP-actine. L’ADF-cofiline fragmente les filaments ADP-actine et chaque monomère libéré peut à son tour être repris en charge par la profiline.
Il existe un mécanisme qui tamponne ce cycle d’assemblage/désassemblage. Suite à un stimulus extracellulaire, la famille des Rho GTPases active la kinase PAK ("p21-activated protein kinase") qui elle-même active la kinase LIM afin phosphoryler l’ADF/cofiline. La
phosphorylation de l’ADF/cofiline provoque son inactivation et ralentit ainsi le taux de désassemblage des filaments.
Figure 7 : Dynamique de l’actine à la membrane des cellules neuronales (d’après Pollard et al., 2001).
L’élongation de microfilaments d’actine et leur renouvellement permet de mouvoir la membrane plasmique et donc d’assurer la motilité cellulaire. La nucléation des filaments est permise par le complexe Arp2/3, activé par les protéines WASP/Scar, et leur élongation est accélérée grâce à la contribution de la profiline. La dissociation des filaments est assurée par des coiffes protéiques et l’ADF-cofiline. Le renouvellement de ces filaments est régulée par des signaux extracellulaires.
III. Rôle des microfilaments d’actine dans les neurones
Dans un neurone et plus précisément au niveau du cône de croissance lors de la pousse axonale, ou au niveau des épines dendritiques, l’actine F adopte le plus souvent des suprastructures élaborées.
III-1. Rôle de l’actine dans la structure et la motilité des cônes de croissance axonaux
Les cônes de croissance, situés à l’extrémité axonale d’un neurone en développement, peuvent être divisés en différents domaines : le domaine central C, le domaine transitoire T, et le domaine périphérique P (Figure 8). La zone périphérique est composée de filopodes, appelés également micropointes, extensions cylindriques étroites capables de s'étendre à une dizaine de microns de celle-ci, et des lamellipodes, extensions aplanies en forme de voile. Généralement les cônes de croissance contiennent des filopodes et des
lamellipodes, et les trois domaines décrits ci-dessus (P, T et C), même si la forme, la taille des domaines et le nombre de filopodes et de lamellipodes varient beaucoup d’un neurone à l’autre (Forscher and Smith, 1988; Bridgman and Dailey, 1989).
Figure 8 : Morphologie de deux cônes de croissance à l’extrémité axonale de neurones d’hippocampe en culture, obtenue par microscopie interférentielle différentielle (d’après Dent et Gertler, 2003).
Les cônes de croissance peuvent être décomposés en trois domaines distincts : le domaine central (C), le domaine transitoire (T) et le domaine périphérique (P). Ils sont constitués d’extensions filopodiales ("Filopodium") ou lamellipodiales ("Lamellipodium"). La juxtaposition de ces deux cônes de croissance indépendants montre leur variabilité de forme et de taille, malgré une même composition.
Les complexes d’actine sont responsables de la formation unique et singulière des cônes de croissance neuronaux. On y distingue différents types de réseaux :
- Les câbles d’actine (
"
actin bundles"
) sont formés par alignement parallèle de filaments d’actine linéaires. Ils composent les filopodes et peuvent d’étendre dans la région T du cône de croissance. Ce câblage augmente leur rigidité et leur longueur de persistance de plus de 600 fois in vitro (Gardel et al., 2004a; Gardel et al., 2004b; Claessens et al., 2006). La polarité des filaments dans les câbles d’actine peut être orientée dans des directions parallèles ou anti-parallèles, ce qui détermine à quelles protéines l’actine peut s’associer et comment les câbles peuvent se déformer. Pour un même nombre de filaments, la rigidité d’un câble dépend considérablement des protéines liées à celui-ci. - Les gels ou les mailles d’actine ("
actin meshwork"
ou"
actin gels"
) sont formés par lebranchement et l’enchevêtrement de filaments d’actine uniques. Cette structure en mailles occupe en grande majorité le domaine périphérique des cônes de croissance (Forscher and Smith, 1988; Bridgman and Dailey, 1989; Lewis and Bridgman, 1992). Les gels diffèrent dans la densité et la polarité nette de leurs filaments. Ces différences peuvent influer sur les propriétés mécaniques du gel, comme sa rigidité ou son élasticité. Suivant la nature et la concentration des protéines liées à l’actine, les gels d’actine peuvent prendre les propriétés d’un plastique léger ou d’un solide (Wachsstock et al., 1994; Gardel et al., 2004a; Gardel et al., 2004b). Les gels d’actine influent directement sur la motilité du cône de croissance. In vitro une seule protéine liée à l’actine, selon sa concentration ou son affinité pour celle-ci, suffit à former un gel ou un câble d’actine (Gardel et al., 2004a; Gardel et al., 2004b; Claessens et al., 2006).
- Les structures en comètes ou intrapodes se rapprochent de celles des mailles présentes dans les queues des pathogènes bactériens ou viraux, de 1 à 2 µm de large et de 5 à 10 µm de long (Rochlin et al., 1999). Les intrapodes sont des hybrides entre les réseaux câblés et maillés. Ils peuvent émaner de la région T et s'étendent dans la région P (Rochlin et al., 1999; Dent and Kalil, 2001).
- Les arcs d’actine sont des câbles transversaux de filaments d’actine qui investissent seulement le domaine transitoire des cônes de croissance et qui présentent des cinétiques différentes de celles de l'actine lamellipodiale ou filopodiale (Schaefer et al., 2002; Rodriguez et al., 2003; Gallo, 2004).
- Les points d'actine ou actine axonale ne sont pas des structures à proprement parler et sont localisés dans la région centrale des cônes, le corps axonal et la zone maillée corticale subplasmalemmale (Letourneau, 1983). Ces points d'actine sont stables.
Figure 9 : Différents réseaux d’actine présents dans les cônes de croissance neuronaux (d’après Pak et al., 2008)
Le domaine central du cône de croissance ("Central domain" représenté en bleu) n’est pas investi par des architectures d’actine. Le domaine transitoire du cône ("Transition zone" représenté en vert) contient des arcs d’actine ("Actin arcs"). Le domaine périphérique ("Peripheral domain") renferme dans sa zone lamellipodiale des gels d’actine ("Actin gels") et dans ses filopodes des câbles d’actine ("Actin bundles").
Bien que ces différents réseaux ne soient pas toujours distinguables dans tous les cônes de croissance, leur combinaison définit le domaine périphérique et transitoire des cônes et sont responsables de leur forme unique et singulière. Le domaine central ne présente pas d’architectures d’actine, il est investi par des microtubules, des organelles et des vésicules diverses.
La régulation de l’assemblage et de la dynamique des réseaux d’actine est nécessaire au changement de la vitesse du cône de croissance et de sa direction. En agissant comme une barrière à l’extension rapide de microtubules et par des cycles de polymérisation/dépolymérisation, les réseaux d’actine permettent l’avancée du cône de
croissance, son exploration de l’environnement et son guidage jusqu’à sa cible (Tanaka and Sabry, 1995; Dent and Kalil, 2001, 2003; Dent et al., 2003).
III-2. Rôle de l’actine au niveau synaptique
Au sein de la synapse, les deux capacités antagonistes de l’actine de fonctionner comme un composant structural stable ou un filament dynamique sont exploitées.
III-2-1. La synapse
La synapse excitatrice est une jonction cellulaire neuronale entre un bouton axonal (élément pré-synaptique) et une épine dendritique (élément post-synaptique) (Figure 10). La transmission synaptique au niveau des synapses chimiques regroupe l’ensemble des mécanismes allant de la libération de neurotransmetteurs en pré-synaptique à la genèse des courants électriques en post-synaptique. Le bouton axonal renferme les vésicules synaptiques chargées de neurotransmetteurs et regroupées sous forme de pools fonctionnels. Du coté post-synaptique, l’ensemble des protéines nécessaires à la transduction du signal est contenue dans un complexe biochimique hautement organisé attaché à la membrane post-synaptique. Ce complexe protéique est visible en microscopie électronique sous forme d’un épaississement d’environ 30 nm de la surface membranaire post-synaptique dans le cytoplasme. Cette matrice dense en protéines est appelée densité synaptique (PSD pour "Post synaptic density"). Cette densité post-synaptique contient les récepteurs aux neurotransmetteurs ainsi qu’un ensemble de protéines nécessaires à la transduction du signal (Kennedy, 2000). La PSD d’une épine dendritique d’un neurone de l’hippocampe (structure bilatérale et symétrique du système limbique et région "clé" de la mémorisation à long terme) contient deux types distincts de récepteurs ionotropiques au glutamate : les récepteurs AMPA (" -amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid") et NMDA ("N-methyl-D-aspartate"), activés séquentiellement. La liaison du glutamate au récepteur AMPA entraîne l’ouverture de son canal permettant ainsi l’entrée d’ions sodium et la sortie d’ions potassium et par conséquence une brève dépolarisation de la cellule. Il s’ensuit l’activation du récepteur NMDA, qui dépend à la fois de la liaison au glutamate et d’une dépolarisation post-synaptique. L’activation de ce récepteur entraîne en plus d’une entrée d’ions sodium et d’une sortie d’ions potassium, une entrée massive d’ions calcium dans la tête de l’épine dendritique.
Dans les neurones matures, l’actine est la protéine du cytosquelette la plus abondante au niveau synaptique, à la fois présente dans le compartiment pré- et post-synaptique (Hirokawa et al., 1989a; Bloom et al., 2003).
Figure 10 : Ultrastructure d’une synapse chimique excitatrice et asymétrique (d’après Sekino et al., 2007).
A. Synapse observée en microscopie électronique. Les vésicules synaptiques, renfermant les neurotransmetteurs, sont bien visibles dans l’élément pré-synaptique (flèche pleine) et la densité post-synaptique, contenant les récepteurs aux neurotransmetteurs, au niveau de la membrane de l’élément post-synaptique accolée à celle de l’élément pré-synaptique (flèche creuse).
B. Représentation schématique de la synapse marquée en microscopie électronique. L’élément post-synaptique (en bleu) est appelé épine dendritique et se compose d’une tête ("Dendritic spine head") et d’un cou ("Dentritic spine neck") émergeant du corps dendritique ("Dendritic shaft"). Le cytosquelette d’actine (en rose) n’a pas été représenté dans l’élément pré-synaptique (en jaune) pour une raison de clarté.
III-2-2. Rôle de l’actine dans les mécanismes pré-synaptiques
- L’actine et l’organisation des pools vésiculaires
Au niveau de la terminaison pré-synaptique, les vésicules sont organisées sous forme de trois pools fonctionnels distincts : le pool de relargage immédiat, le pool de recyclage et le pool de réserve (Rizzoli and Betz, 2005; Alfonso et al., 2006; Fernandez-Alfonso and Ryan, 2006). La façon dont ces pools sont ségrégés spatialement n’est pas encore élucidée.
- Le pool de relargage immédiat renferme les vésicules prêtes à être exocytées et dont une partie d’entre elles sont amarrées et amorcées au niveau de la zone active où a lieu l’exocytose vésiculaire. Il représente 1 à 2% de l’ensemble des vésicules.
- Le pool de réserve comprend des vésicules présentes au cœur du bouton synaptique. - Le pool de recyclage est constitué de vésicules qui ne sont pas nécessairement amorcées mais qui participent activement au cycle vésiculaire synaptique et peut être localisé plus près de la zone active que du pool de réserve (Schikorski and Stevens, 2001).
L’actine est présente abondamment dans les terminaisons pré-synaptiques (Drenckhahn and Kaiser, 1983; Drenckhahn et al., 1984; Landis et al., 1988). Son organisation subcellulaire est responsable de la ségrégation spatiale des pools vésiculaires et lui permet de les maintenir et de les réguler, d’un côté en servant d’échafaudage afin de restreindre la motilité vésiculaire et de l’autre formant une passerelle pour aiguiller le transfert des vésicules entre les pools (Dillon and Goda, 2005) (Figure 11).
Figure 11 : Cytosquelette d’actine au niveau de l’élément présynaptique (et post-synaptique) d’une synapse excitatrice (d’après Dillon et Goda, 2005 ; Cingolani et Goda, 2008).
A. Représentation schématique d’une synapse excitatrice.
Au niveau du bouton axonal ("Presynaptic terminal"), les filaments d’actine sont responsables de la ségrégation spatiale, de la maintenance et de la régulation de pools de vésicules synaptiques fonctionnels, parmi lesquels deux ont été représentés : le pool de réserve (RP) et le pool de relargage immédiat (RRP). Au niveau du RP localisé au centre du bouton, les vésicules sont solidement reliées entre elles par un réseau de courts filaments d’actine et de synapsine (non représentée). Ce pool de réserve peut être constitué de plusieurs sous-groupes de vésicules (astérisques, C.) Le RRP, localisé au niveau de la zone active de la synapse, renferme des vésicules prêtes à être exocytées et à relarguer les neurotransmetteurs qu’elles contiennent. Ces vésicules sont issues du RP et ont été mobilisées par des filaments d’actine.
Au niveau de l’épine dendritique ("Post synaptic terminal"), le réseau d’actine sous-membranaire relie des protéines d’échafaudage (non représentées) et permet d’organiser la densité post-synaptique (PSD pour "Post synaptic density"). Des filaments d’actine orientées longitudinalement dans la tête de l’épine permettent de réguler la diffusion et le trafic exo-endocytaire des récepteurs au glutamate (AMPA et NMDA) à la surface membranaire.
B. Localisation de l’actine au sein de la synapse excitatrice par immunomarquage aux particules d’or en microscopie électronique (d’après Bloom et al., 2003). Les flèches indiquent les particules d’or qui marquent indirectement l’actine au niveau du pool de réserve (SVC pour "synaptic vesicle cluster") et sous la PSD. M : mitochondrie ; Den : dendrite.
C. Synapse hippocampale observée en microscopie électronique, mettant en valeur les sous-groupes de vésicules du pool de réserve (astérisques), maintenus par l’actine et la synapsine (non marquées), et la PSD (encadrée et agrandie) (d’après Rostaing et al., 2006).
Un réseau maillé de vésicules, de synapsine et d’actine séquestre le pool vésiculaire de réserve au cœur du bouton synaptique (Greengard et al., 1994; Hilfiker et al., 1999b). Suite à une augmentation de l’activité électrique neuronale, la phosphorylation de la synapsine aboutit au détachement à la fois de la synapsine et des vésicules de réserve du réseau d’actine emmaillé (Chi et al., 2001, 2003). Les vésicules de réserve mobilisées sont ensuite prises en charge par d’autres filaments d’actine qui facilitent leur amarrage vers la zone active de la synapse et permettent ainsi d’augmenter le pool de relargage immédiat et donc de favoriser l’exocytose (Figure 12).
Figure 12 : Régulation du cycle vésiculaire de l’actine au niveau de l’élément pré-synaptique (d’après Dillon et Goda, 2005 ; Cingolani et Goda, 2008).
Suite à une stimulation électrique, les vésicules du pool de réserve (RP) se détachent du réseau d’actine et de la synapsine (non représentée) et sont transportées jusqu’à la zone active de la synapse (en violet) par les filaments d’actine. On parle de processus d’amarrage (a). Le moteur myosine V transporte les vésicules du RP le long des filaments d’actine et sa liaison à la syntaxine au niveau de la zone active permet ainsi d’augmenter le pool de relargage immédiat (RRP). Des filaments d’actine régulent alors l’amorçage des vésicules (b), étape préparant les vésicules pour l’exocytose en les ancrant à la membrane via le complexe SNARE ("Soluble N ethylmaleimide sensitif factor attachment Protein receptor", non représenté). Les vésicules fusionnent ensuite à la membrane plasmique de la zone active et relarguent les neurotransmetteurs, processus appelé exocytose (c). Les vésicules sont ensuite recyclées et prises en charge par la Myosine IV et les filaments d’actine (d) afin de sortir du cycle vésiculaire (e) ou d’être guidées vers le centre du bouton pour être réutilisées (f).
La fonction de l’actine dans la zone active est toutefois déterminée par le type particulier de synapse et l’état de l’activité synaptique (Dillon and Goda, 2005). Les boutons synaptiques larges ou/et qui relarguent des neurotransmetteurs à taux élevés sont dépendants de l’actine pour le recrutement des vésicules du pool de réserve au pool de relargage immédiat qui supporte l’exocytose. Les boutons de taille plus réduite ou/et qui relarguent des vésicules à un taux plus faible dépendent beaucoup moins de mécanismes actifs pour la mobilisation vésiculaire mais utilisent plutôt les filaments d’actine comme une barrière physique pour limiter la fusion vésiculaire.
Dans un tel modèle où la fonction de l’actine est duale, c’est la machinerie de signalisation intracellulaire, prédominante dans un type particulier de synapse ou enclenchée suite à une activité synaptique, qui va modifier l’activité des protéines de liaison à l’actine (ABPs pour "Actin binding proteins") et des protéines régulatrices afin de contrôler la façon dont l’actine va moduler le relargage des vésicules (Carlisle and Kennedy, 2005; Ethell and Pasquale, 2005; Sekino et al., 2007) (Figure 13).
Figure 13 : Potentialité des rôles de l’actine au sein des terminaisons synaptiques (d’après Halpain, 2003).
L’actine F (en rouge) peut agir comme une barrière ("Barrier") afin de bloquer les vésicules et d’empêcher leur diffusion passive vers la zone active, comme un enclos ("Corral") pour éviter leur éloignement de la zone active ou pour empêcher l’entrée d’autres organelles comme les mitochondries dans la zone, comme un échafaudage ("Scaffold") afin de séquestrer des molécules régulatrices (en vert) au niveau ou près du pool vésiculaire. L’actine F peut aussi servir de câble pour acheminer les vésicules près de la zone active lors de l’amorçage (non représenté). La polymérisation de l’actine peut agir comme un recycleur ("Recycler"), en facilitant le recyclage endocytaire de vésicules qui ont été exocytées par des forces de constriction ("Pinching off") ou de propulsion ("Propelling away").
- L’actine et la mobilisation des vésicules
L’altération de la motilité vésiculaire par interférence avec la dynamique de l’actine suggère un rôle de l’actine dans la restriction du pool de réserve des vésicules synaptiques. Des études portant sur les boutons de neurones d’hippocampe en culture ont montré que la motilité vésiculaire, généralement réduite, augmente sous traitement avec des agents dépolymérisant l’actine F (Shtrahman et al., 2005). L’altération de la mobilisation des vésicules par le réseau d’actine au centre de la synapse entraîne en conséquence une perturbation du relargage de neurotransmetteurs (Sakaba and Neher, 2003). En revanche, des études portant cette fois sur de petites synapses centrales de neurones d’hippocampe ont démontré l’absence de contribution de l’actine dans la mobilisation vésiculaire (Schnell and Nicoll, 2001; Sankaranarayanan et al., 2003).
Ces résultats contradictoires peuvent être expliqués par les deux fonctions opposées de l’actine au sein de la synapse, d’une part la séquestration des vésicules pour la consolidation du pool de réserve et de l’autre la mobilisation des vésicules issues de ce pool pour l’amarrage, l’amorçage et l’exocytose. Tandis que la dynamique de l’actine sert deux fonctions distinctes pouvant être régulée de manière différentielle par la machinerie endogène, on peut supposer que la perturbation pharmacologique de l’actine F peut compenser ces deux effets à la fois (Cingolani and Goda, 2008). L’importance relative de ces fonctions opposées de l’actine peut dépendre des propriétés d’un type particulier de synapse.
