UN REACTIF DE CHOIX POUR LA REVELATION DES FLAVONOÎDES:
LE MELANGE DIPHENYLBORATE D'AMINOETHANOL -PEG 400
Th. BRASSEUR et L. ANGENOT
Laboratoire de Pharmacognosie, Institut de Pharmacie
Université de Liège, 5, rue Fusch, B-4000 LIEGE - BELGIQUE
MOTS-CLES. Flavonoïdes, Diphénylborate d'aminoéthanol, Révélation. INTRODUCTION
Les chromatogrammes pulvérisés par ce réactif et exposés aux UV longs (360 nm) laissent apparaître des fluorescences dépendant de la structure des composés mis en évidence; cette observation associée à celle du compor-tement chromatographique, aide le chercheur dans l'élucidation de structure de flavonoîdes.
MATERIEL ET METHODES
Matériel: Plaques 20 x 20 cm de gel de silice 60 F 254 Merck
Plaques 20 x 20 cm de cellulose sans indicateur de fluorescence Papier Whatman 1
Réactif: Solution méthanolique à 1 % p/v de diphénylborate d'aminoéthanol (Fluka) et à 5 % de PEG 400 (UCB)
Systèmes utilisés: 1. Gel de silice 2. Gel de silice 3. Gel de silice 4. Cellulose 5. Cellulose 6. Cellulose 7. Papier Me2CO-EtMeCQ-HCOOH EtOAc-HCOOH-H 0 C6H6-EtOAc-HCOQH HOAc 60 % CHCl3-HOAc-H20 ' H20 10:7:1 Migration: 6:1:1 " 8:2:1 " 10:9:1 12 cm 12 cm 12 cm 15 cm 15 cm 12 cm 35 cm
Révélation: Après séchage rapide du chromatogramme (l'odeur d'acide formique ou acétique persiste), on pulvérise le réactif à raison de 10 ml environ pour une plaque de 20 x 20 cm. On sèche et on observe à 360 nm immé-diatement et après une demi-heure, certaines fluorescences apparaissant len-tement ou se modifiant.
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RESULTATS ET DISCUSSION
La présence de deux OH en position 5,7 n'est pas suffisante pour obtenir une fluores-cence notable; un OH en 4' (apigénine) ou 3 (galangine) fait apparaître respectivement une fluorescence vert-brun ou verte. Celle-ci n'est pas influencée par la présence d'un OH supplé-mentaire en 4' (kaempférol) ou 2' (datiscétine), La présence de deux OH en 3', 4' fait apparaître la lutéoline en jaune et la quercétine en orange. Si les deux OH du cycle B d'un flavonol sont placés en meta, la fluorescence passe au vert.
La présence de trois OH en 3', 4', 5' (myricé- FLAVONE tine) produit une fluorescence orange et une
coloration rouge en visible. L'absence de
dou-ble liaison dans le cycle C, soit diminue l'intensité de la fluorescence (naringcside, hespéridoside) soit retarde son apparition (dihydroquercétine); le glucosyl-7 ériodictyol testé récemment (génine : tetrahydroxy-5,7,3',4r flavanone) présente un comportement curieux et caractéristique:.ce n'est qu'après une demi-heure environ qu'il commence à fluoriser en rouge et à ap-paraître en mauve en lumière visible. La méthylation ou la glycosylation de l'OH en 3 des flavonols ne modifie pas la fluorescence. Par contre, la méthy-lation des OH du cycle B, supprime l'effet de ceux-ci: la tetraméthyl-5,7,3', 4' quercétine fluorise en vert comme la galangine, 1'hespéridoside comme le naringoside. D'autres types de flavonoîdes peuvent également être révélés: il en est ainsi de la maréine (chalcone) et de la maritimeine (aurone) qui fluorisent respectivement en bordeaux et rouge-orange et apparaissent en violet-mauve et rouge en lumière visible (la révélation de l1aurone en lu-mière visible semble moins sensible); ces molécules possèdent toutes deux un groupement orthodiphénolique sur le cycle B.
Le comportement ch ronatographique des génines dans les systèmes 3, 4 et 5 est lié à la fois à l'hydroxylation de la molécule et à la disposition de ces OH. En général, plus la molécule est hydroxylée et moins elle migre. Les molécules hydroxylées en 2' et 2',4' migrent davantage que celles hydroxy-lées en 4' et 3', 4'. Le système 5 a un excellent pouvoir de résolution pour les génines courantes mais n'estïïialheureusement applicable qu'aux extraits dépourvus d'hétérosides car ceux-ci migrent également. En cas de présence d'hétérosides, le système 3 est seul valable. Dans le système é, seules la morine, la datiscétine et la dihydroquercétine migrent.
Le comportement des hétérosides dans les systèmes 1 et 2 est conditionné par la nature de la génine (plus celle-ci est hydroxylée et moins l'hétéro-side migre) et par la nature des sucres et leur nombre. Plus une molécule est chargée en sucres et moins elle migre. Pour un même site de fixation des sucres, les Rf des hétérosides suivent ceux des sucres seuls chromatogra-phiées dans les. systèmes habituels: Rf rhamnose > Rf glucose > Rf galactose et Rf quercitroside > Rf isoquercitroside > Rf hypéroside. Le système 2 est le plus intéressant et ne donne pas de spots allongés.
CONCLUSION
Par les fluorescences et colorations variées qu'il donne, ce réactif est très utile au charcheur et comme il est également capable de révéler d'autres composés tels des acides phénols, des depsides etc... il constitue pour le pharmacognoste et le pharmacien d'industrie un réactif de choix pour l'iden-tification des drogues végétales et la recherche de leurs falsification • BIBLIOGRAPHIE: BRASSEUR Th. et coll. (1986) J. Chromatogr., 351,351-355.
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COMPORTEMENT DES GE:-!IME3
Génines Chrysine Apigénine Acacstine Lutéoline Galangine Kaempférol Kaempféride Oaciscétine Que rcs tine Marine Oihydroquercé tine Oiméthyi-3,7 quercétine retraméthyl-5,7,3' ,4' quercétine Fisëtine îlyricétine Que rcs taqé tine
Substitution 3 QH OH OH OH OH OH OH QH OCH.. QH OH QH OH 5 QH QH QH QH OH OH QH OH QH QH OH acH3 QH OH 6 OH Y CH OH OH OH OH OH OH QH OH QH OH OCH.J OCH, OH OH OH 2' UH OH 31 OH OH QH QH OCH OH OH OH 41 QH OCH, j QH OH OCH-. OH OH QH OH OCH3 QH OH OH 5' QH rtf x ;oo i 1QQ 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 22 2 1GQ ICQ 100 ICO 100 100 100 100 100 92 100 100 ^100 100 42 3 72 51 63 39 73 58 67 43 43 24 30 52 31 40 3H 27 4 73 56 5 94 66 1 69 38 60 36 54 74 23 56 67 63 62 36 13 13 95 32 92 47 92 83 17 37 27 90 98 23 4 2 & 0 0 0 0 0 Q 0 38 0 20 30 Q 0 Q a a 7 a Q 0 a a Q Q 10 0 a 27 a a a a a Fluorescencss observées après révélation brun vert brun vert brun jaune vert vert vert vert o rangs vert
orange apparaissant lentement orange
vert orange .
orange (rouge en visible) rouge fanes
COflPORTE-OT DES HETEROSIDES
Astraçaiine Shamnogiucasyl-3 kserapférol Néohespéridasyl-7 kaempférol Robinoside Hypéraside Isaquercitraside Quercitroside Ru tine Myricitroside Glucagyl-7 apigénine Apioside Glucosyl-7 lutéoline laoorientine Vitexine Vitexine rhamnoside Naringoside Hespéridoside Génir.es Ksemp ferai Ksempférol Kaempfërol Kaemp ferai Quercétine Quercétine Que rcé tine Quercétine Myricétine Apigénine Apigénine Lutéoline Lutéoline Apigénine Apigénine Naringétine3 Hespérëtineb Glycosylaticn Glucosyl-3 Rhamnoglucosyl-J • • Néahespéridasyl-7 lîhamnonalactosyl-J Rhgmnosyi-7 Caiactosyi-3 Glucosyl-3 Rhamnosyl-3 Rutinosyl-3 Rhamnosyl-3 Giucosyl-7 Apioglucosyl-7 Glucosyl-7 C-glucasyl-6 C-giucosyl-3 C-glucasyl-3 rhamnosyl-41 Rutinosyl-7 Rutinosyl-7 Rf x 100 1 65 35 35 16 47 56 76 23 67 66 42 55 36 69 35 41 46 2 |3U 71 45 44 20 57 61 75 35 67 65 42 60 48 64 37 46 44 1 Q Q 0 2 2 4 0 2 2 0 2 1 2 0 0 0 74 77 69 84 65 65 71 70 63 65 76 48 62 53 76 83 83 5 U 31 27 19 22 14 13 21 12 a 34 27 12 10 14 14 36 48 13 23 4 47 7 7 12 20 13 1 3 0 7 2 45 sa 35 7 17 31 a 58 12 12 19 28 18 5 a
1
10 7 50 63 58 Fluorescences observée: après révélation observées vert -. vert. . vert vif vert orange orange orange orange orange vert vert jaune orange jaune vert vert verdâtre ou brunâtre verdâtra ou brunâtrscNaringétine: trihydroxy-5,7,41 flavanone b
Hespérétine: méthyl-41 trihydroxy-5,7,31 flavanone
