Base génétique moléculaire de la féminisation induite par la bactérie endosymbiotique Wolbachia

Texte intégral

(1)THÈSE Pour l'obtention du grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ DE POITIERS UFR des sciences fondamentales et appliquées Ecologie et biologie des interactions - EBI (Poitiers) (Diplôme National - Arrêté du 7 août 2006) École doctorale : Sciences pour l'environnement - Gay Lussac (La Rochelle) Secteur de recherche : Biologie de l'environnement, des populations, écologie. Présentée par :. Myriam Badawi Base génétique moléculaire de la féminisation induite par la bactérie endosymbiotique Wolbachia Directeur(s) de Thèse : Richard Cordaux, Pierre Grève Soutenue le 03 décembre 2014 devant le jury Jury : Président. Jean-Michel Drezen. Directeur de recherche CNRS, Université de Tours. Rapporteur. Jean-Michel Drezen. Directeur de recherche CNRS, Université de Tours. Rapporteur. Jean-Christophe Simon. Directeur de recherche, INRA de Rennes. Membre. Richard Cordaux. Directeur de recherche CNRS, Université de Poitiers. Membre. Pierre Grève. Professeur des Universités, Université de Poitiers. Membre. Fabrice Vavre. Directeur de recherche CNRS, Université de Lyon 1. Pour citer cette thèse : Myriam Badawi. Base génétique moléculaire de la féminisation induite par la bactérie endosymbiotique Wolbachia [En ligne]. Thèse Biologie de l'environnement, des populations, écologie. Poitiers : Université de Poitiers, 2014. Disponible sur Internet <http://theses.univ-poitiers.fr>.

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(57) Remerciements. Cette thèse n'aurait jamais pu aboutir sans la contribution de tout un monde. Je souhaiterai donc remercier toutes les personnes qui ont contribuées de près ou de loin à ce travail. Je voudrais tout d'abord commencer par les membres du jury, qui ont bien voulu accepter d'examiner ce travail, les rapporteurs, Jean-Michel Drezen et Jean-Christophe Simon, et l'examinateur Fabrice Vavre. Je tiens à remercier également les deux membres de mon comité de thèse qui n'ont malheureusement pas pu venir à la soutenance, Abdelazziz Heddi et Philippe Glaser, pour leurs remarques et conseils judicieux en milieu de parcours. Je voudrais également remercier très chaleureusement mes deux directeurs de thèse, Richard Cordaux et Pierre Grève qui m'ont donné l'opportunité d'exercer ce travail de longue haleine qu'est la thèse. Vous m'avez beaucoup apporté sur le plan scientifique, sur la rédaction et sur la manière de présenter les choses. Vous m'avez toujours poussé vers l'avant et incité à donner le plus fort de moi-même. Même si le parcours n'a pas toujours été des plus faciles (le lot de toutes thèses), vous avez essayé de faire part de compréhension et toujours essayé de faire les choses au mieux. Je vous souhaite une bonne continuation et je sais d'avance que les résultats engendrés par cette thèse vont continuer à vous stimuler des années encore. Je voudrais également remercier l'ensemble du personnel du laboratoire, dont le directeur Didier Bouchon qui fournit un travail gigantesque absolument nécessaire à la bonne marche du laboratoire. Merci. également. aux. professionnelles de la salle d'expérimentation (le féminin l'emporte cette fois-ci ! Mais je n'oublie pas les anciens masculins partis aujourd'hui vers d'autres .

(58) horizons), pour leur bonne humeur, leur conseils avisés, les petits trucs en plus qui font que la manip fonctionne, les commandes à passer d'urgence car je ne m'étais pas rendue compte qu'on était à court de produits. Donc merci à vous, Maryline, Catherine, Carine, Alexandra et Tiffany. Je voudrais également remercier Christelle, notre expert secrétaire/comptable qui sait toujours quel numéro appeler et qui est toujours d'une efficacité redoutable. Je me suis souvent demandée si le laboratoire s'écroulerait sans toi... Je voudrais également remercier ceux que l'on appelle communément les « chefs » dans le petit groupe des doctorants, donc vous tous, chercheurs/enseignants-chercheurs avec qui j'ai pu avoir de longues discussions intéressantes, des idées génialissimes (mention à Joanne!), des créations de projet (je pense toujours aux hétéroplasmies Isabelle !), des cours préparés ensemble (mention spéciale à Roland pour tout le travail qu'il fournit dans les enseignements), la magnifique plante verte qui pousse dans notre bureau (Nicolas, j'adore ce ficus) et tous les bons conseils que j'ai pu recevoir principalement sur mes analyses (Clément, Sophie, Didier, je ne vous oublie pas). Je ne peux malheureusement pas citer tout le monde (le labo a grandit d'années en années) mais je pense que chacun s'y retrouvera dans ce que je décris. Je voudrais remercier particulièrement les amis doctorants, post-docs, ingénieurs d'étude et de recherche, avec qui j'ai passé des moments privilégiés, plein de joie et de rebondissements. Merci à Isa pour ton organisation dans l'élevage de cloportes et ton expertise en biomol. Tu es celle qui m'a appris beaucoup quand je suis arrivée en stage de M2 et je ne l'oublierai pas ! Merci également à Boubou, pour les rencontres cafés à 8h30 du matin pendant ma première année de thèse (qui ont cessé malheureusement quand l'engrenage s'est accéléré), ton expertise infaillible en bioinfo (y a-t-il des choses où tu ne trouveras pas une solution ?), ta disponibilité (il faudrait que tu mettes en place un système de tickets comme à la préfecture) et tous ces moments de rien passés dans la salle café. Merci également aux filles, avec mention spéciale à mes deux aînées d'un an (pas en âge hein !!), Lise et Jessica qui sans elles, je crois que la thèse n'aurait pas .

(59) eu la même saveur. Je sais désormais que les cloportes sont partout, et que Wolbachia rôde... J'ai particulièrement apprécié Lise, nos conversations sur la biblio des « anciens ». Au moins on est d'accord ! Je voudrais également faire une mention spéciale à Victorien, qui, même s'il ne paye pas de mine, m'a appris qu'il était possible de sourire à l'envers et à l'endroit en même temps (si si je vous assure !). Merci également à notre petite Margot, je n'ai jamais rencontré quelqu'un comme toi et tous les jours c'est presque devenu un jeu d'en apprendre plus sur ta personne ! Mais tu aurais pu naître 15 jours plus tard quand même... Merci également aux anciens (Nicolas, Sébastien, Winka, Sandrine, Frédéric, Gaël, Bianca et Marcelo) qui laissent une trace indélébile. Enfin merci aux autres qui ne sont pas du laboratoire mais dont leur contribution est sans égal. Particulièrement merci à toi Tiphaine, presque « amie de galère » vu que tu as commencé ta thèse en paléontologie en même temps que moi. Je repenserai avec nostalgie à toutes les conversations qu'on a eu, et compte bien entreprendre ensemble les projets que l'on a imaginés ! Un grand merci également à toute ma famille, qui était toujours là pour soutenir et encourager dans les moments les plus difficiles. Raphaël, j'espère que la lecture de l'introduction de cette thèse te donnera plein d'idées sur lesquelles réfléchir ! Enfin merci à toi, Gilles, pour ton amour, ta compréhension, ton soutien (surtout à la fin ! Je n'ai pas compté les lessives, courses et aspirateurs que tu as fait, car quand on aime, on ne compte pas bien entendu) et les longues conversations scientifiques qu'on a pu avoir. Je sais maintenant ce qu'est un nombre de Reynolds, un flux laminaire et les équations de Navier-Stokes. En échange, tu es capable d'expliquer ce qu'est une alpha-protéobactérie à gram négatif à n'importe qui ! Merci de m'avoir codé tant de choses qui m'ont servi directement dans la thèse (il faut toujours avoir un mécanicien des fluides dans sa poche je dis !). L'avenir s'annonce radieux et ensoleillé au Brésil. J'ai hâte de t'y rejoindre !. .

(60) Sommaire. Sommaire..................................................................................................................i Sommaire................................................................................................................iv Liste des figures......................................................................................................ix Liste des tables.......................................................................................................xii Liste des abréviations............................................................................................xiii. Introduction générale...........................................................................1 I. Wolbachia .....................................................................................................14 1. Les génomes de Wolbachia.......................................................................18 2. Les phénotypes étendus............................................................................22 2.1. Mutualisme.......................................................................................23 2.2. Parasitisme de la reproduction.........................................................25 a. La parthénogenèse thélytoque.........................................................25 b. Le male-killing................................................................................27 c. L'incompatibilité cytoplasmique......................................................27 d. La féminisation................................................................................29 3. Interactions moléculaires entre Wolbachia et ses hôtes............................31 II. Le modèle A. vulgare/Wolbachia................................................................35 1. Un modèle historique................................................................................35 2. Conflits génétiques et évolution de la détermination du sexe...................38 III. Projet de thèse...........................................................................................42. Chapitre 1 : Evolution moléculaire des facteurs responsables de la plasticité génomique chez Wolbachia................................................45. .

(61) I. Introduction..................................................................................................47 II. Publication : Signs of neutralization in a redundant gene involved in homologous recombination in Wolbachia endosymbionts...........................53 1. Abstract.....................................................................................................55 2. Introduction...............................................................................................56 3. Materials and Methods.............................................................................63 a. Identification of homologous recombination genes........................63 b. Sequence analyses of Wolbachia supergroups A and B..................64 c. Selection analyses............................................................................65 4. Results and Discussion.............................................................................68 a. Distribution of homologous recombination genes in Wolbachia strains...................................................................................................68 b. Selective pressures on homologous recombination genes...............69 c. Heterogeneity and relaxation of selection pressures........................70 5. Conclusion................................................................................................75 6. Acknowledgments.....................................................................................77 7. References.................................................................................................78 III. Discussion complémentaire......................................................................87. Chapitre 2 : Phénotype féminisant dans le contexte d'une transfection..........................................................................................91 I. Introduction..................................................................................................93 II. Publication : Persistence of the feminizing phenotype induced by the wVulC Wolbachia strain of Armadillidium vulgare after transinfection in a heterologous host ............................................................................................98 1. Abstract.....................................................................................................99 2. Introduction.............................................................................................100 3. Materials & Methods..............................................................................104 a. Transinfection of the wVulC feminizing Wolbachia strain in C. convexus.............................................................................................104 b. Developmental study and microscopy observation.......................105 .

(62) c. Statistical tests................................................................................105 4. Results.....................................................................................................107 a. Sexual differentiation of C. convexus............................................107 b. wVulC-induced feminization of C. convexus adult males.............109 c. Vertical transmission of wVulC, sex-ratio bias and intersexes in C. convexus.............................................................................................111 5. Discussion...............................................................................................115 a. Comparison of sexual differentiation timing between C. convexus and A. vulgare....................................................................................115 b. Vertical transmission of wVulC in C. convexus.............................116 c. Feminization effect of wVulC in C. convexus................................117 6. Aknowledgements...................................................................................122 7. References............................................................................................... 123 III. Discussion complémentaire....................................................................129. Chapitre 3 : Identification de gènes candidats à la féminisation 133 I. Introduction................................................................................................135 II. Matériels et Méthodes..............................................................................139 1. Séquençage de wCon..............................................................................139 a. Estimation de la densité de Wolbachia dans les différents tissus de C. convexus........................................................................................139 b. Extraction d'ADN de wCon par une méthode d'enrichissement artificielle...........................................................................................140 c. Contrôles qualités de l'ADN enrichi en wCon ..............................140 d. Pyroséquençage 454 et contrôle qualité des lectures de séquençage ........................................................................................................... 142 e. Assemblage de l'ADN mitochondrial............................................142 f. Assemblage de wCon.....................................................................143 2. Détermination des gènes candidats .......................................................144 a. Analyse in silico.............................................................................144 b. Échantillonnage de juvéniles dans le but d'analyser l'expression des gènes candidats de wVulC au cours du développement de ses hôtes 145 .

(63) c. Présence/ absence de l'expression des gènes candidats au cours du développement d'A. vulgare...............................................................145 d. Quantification de l'expression des gènes candidats au cours du développement d'A. vulgare et de C. convexus..................................146 3. Analyse des gènes candidats..................................................................148 a. Prédiction des fonctions.................................................................148 b. Comparaison de l'expression des gènes candidats chez C. convexus et A. vulgare, tests statistiques...........................................................148 c. Evolution moléculaire des gènes candidats de wVulC...................148 III. Résultats...................................................................................................152 1. Séquençage de wCon..............................................................................152 2. Détermination des gènes candidats de wVulC à la féminisation...........159 a. Détermination in silico des gènes candidats..................................159 b. Présence/ absence d'expression des gènes candidats de wVulC au cours du développement chez l'hôte A. vulgare.................................159 c. Quantification de l'expression des gènes candidats au cours du développement d'A. vulgare et de C. convexus..................................161 3. Analyse des gènes candidats..................................................................163 a. Prédiction générale des fonctions des gènes candidats..................163 b. Comparaison d'expression des gènes candidats entre A. vulgare et C. convexus........................................................................................164 c. Evolution moléculaire des gènes candidats...................................165 IV. Discussion.................................................................................................173 1. Fonction des gènes candidats.................................................................174 a. Gènes à domaines eucaryotes.........................................................174 b. Translocation dans le noyau...........................................................176 c. Régulation post-traductionnelle ou expansion et nutrition?...........178 d. Communication avec l'hôte............................................................180 e. Gènes sans fonction prédite...........................................................180 2. Les profils d'expression des gènes candidats au cours du développement de l'hôte A. vulgare et de l'hôte C. convexus...............................................181 3. Perspectives............................................................................................183. .

(64) Discussion générale et Perspectives................................................189 I. Du génome au phénotype, identification d'effecteurs potentiels de la féminisation induite par wVulC...................................................................191 1. Effet déclencheur.....................................................................................196 2. Effet mainteneur......................................................................................197 3. Aspect évolutif des déterminants du sexe d'A.vulgare............................198 II. Conclusion.................................................................................................201. Références..........................................................................................205. Annexe 1 : Publication “Signs of Neutralization in a Redundant Gene Involved in Homologous Recombination in Wolbachia” et Matériel Supplémentaire......................................................................I Annexe 2 : Matériels et Méthodes Général.....................................XI Table 1 : séquences et caractéristiques des amorces générales.....................XVII Table 2 : séquences et caractéristiques des amorces des gènes candidats.. .XVIII. Annexe 3 : Tables supplémentaires pour le Chapitre 3...........XXXI Annexe 3a : Liste des 50 gènes et de leurs orthologues utilisés pour construire l'arbre phylogénétique des souches de Wolbachia......................................XXXII Annexe 3b : Classification de 1856 gènes de de wVulC non candidats à la féminisation selon les critères utilisés pour identifier les gènes candidats à la féminisation................................................................................................XXXV Annexe 3c : Prédiction des fonctions des 29 gènes candidats à la féminisation selon la base de données.................................................................................XLI. .

(65) Liste des figures. Figure 1 : La symbiose dans la biosphère................................................................4 Figure 2 : Phylogénie de bactéries symbiotiques.....................................................8 Figure 3 : Observation de Wolbachia en microscopie électronique.......................15 Figure 4 : Phylogénie des supergroupes de Wolbachia..........................................16 Figure 5 : Les différents stades de la réduction génomique subis par les génomes d'endosymbiotes.....................................................................................................20 Figure 6 : Proportion d'éléments mobiles dans plusieurs espèces d'endosymbiotes intracellulaires........................................................................................................22 Figure 7 : Fonctionnement de la parthénogenèse thélytoque chez des individus haplo-diploïdes non infectés (a) ou infectés par Wolbachia (b).............................26 Figure 8 : Schéma du male-killing.........................................................................27 Figure 9 : Schéma du succès et de l'échec des croisements en cas d'incompatibilité cytoplasmique unidirectionnel (a) et bidirectionnel (b).........................................28 Figure 10 : Féminisation induite par Wolbachia chez des individus avec un système hétérogamétique femelle (ZZ/ZW)...........................................................29 Figure 11 : Schéma du développement morphologique des gonades d'Armadillidium vulgare.........................................................................................36 Figure 12 : Simulation d'invasion d'individus infectés par Wolbachia (courbe bleue) dans une population naïve composée de mâles ZZ et de femelles ZW (courbe noire).........................................................................................................36 Figure 13 : Scénario évolutif possible de la détermination du sexe suite à l'infection d'une population d'A. vulgare par une Wolbachia féminisante et les conflits génétiques qui en résultent........................................................................39 Figure 14 : Réarrangements génomiques calculés par Mauve v2.3.1 (Darling et al., 2010) de 9 génomes de Wolbachia appartenant aux supergroupes A à D..............48 Figure 15 : Réarrangements génomiques calculés par Mauve v2.3.1 (Darling et al., 2010) de génomes de Wolbachia appartenant aux supergroupes A (wMel, wRi et wHa) avec 111 blocs de réarrangements (a), B (wPip-Pel et wNo) avec 89 blocs de réarrangements (b), C (wOo et wDim) avec 7 blocs de réarrangements (c) et D (wBm et wLs) avec 178 blocs de réarrangements (d).............................................50 .

(66) Figure 16 : Répartition des Ka/Ks de 498 gènes du génome coeur de 8 génomes de Wolbachia complets disponibles le 07/07/14 (wMel, wRi, wHa, wPip-Pel, wNo, wCle, wOo, wBm)..................................................................................................88 Figure 17 : Schéma de la différenciation morphologique des gonades d'Armadillidium vulgare, d'après Suzuki et al. (1995)...........................................96 Figure 18 : Photos en microscopie optique des gonades d'Oniscus asellus (a-f) et de Porcellio scaber (g-i) dans les premiers stades de développement postembryonnaire........................................................................................................130 Figure 19 : Noyaux d'ovocytes après homogénéisation d'ovaires avec un dounce B .............................................................................................................................. 140 Figure 20 : Gel d'agarose à 1% où ont migré 500 ng de l'échantillon enrichi en ADN de wCon et traité à la RNase......................................................................141 Figure 21 : Schéma simplifié du graphe des contigs de de Bruijn.......................143 Figure 22 : Nombre de gènes orthologues déterminé par la technique du meilleur hit réciproque (BLASTp) entre les 4 génomes complets de Wolbachia wMel, wPip-Pel, wRi et wBm en fonction de l'identité...................................................144 Figure 23 : Ratio du nombre de copies de wsp sur le nombre de copies d'HA (a) ou de coI (b), sur les ovaires (OV), la chaîne nerveuse (CN) et l'hémolymphe (HL) .............................................................................................................................. 153 Figure 24 : Proportion du nombre de bases estimées des génomes de wCon (en rouge), de mitochondrie (en vert) et du noyau de l'hôte (en bleu) estimé en qPCR avant (a) et après (b) enrichissement et estimé par mapping des reads sur les génomes après pyroséquençage (c)......................................................................153 Figure 25 : Taille des reads issus du pyroséquençage 454 (1/4+1/8 run) de l'échantillon d'ADN enrichi en wCon...................................................................155 Figure 26 : Distribution du nombre de gènes en fonction des COG (catégories fonctionnelles des gènes de procaryotes) dans les génomes de Wolbachia..........158 Figure 27 : Filtres in sillico de détermination des gènes candidats de wVulC.....160 Figure 28 : Heatmap du ratio de l'expression de 149 gènes candidats calibrés sur le stade 2 et testés des stades 3 à 6...........................................................................162 Figure 29 : Expression des 29 gènes candidats de la féminisation induite par wVulC au cours du développement d'A. vulgare et de C. convexus.....................166 Figure 30 : Heatmap de la moyenne du ratio d'expression des gènes candidats au cours du développement chez A. vulgare (au-dessus) et chez C. convexus (endessous)................................................................................................................168 Figure 31 : Phylogénie des souches de Wolbachia construite en maximum de vraisemblance d'après une concaténation de 50 gènes en acides aminés.............171 .

(67) Figure 32 : Modes d'action possibles et localisation cellulaire des produits de 7 gènes candidats de la féminisation induite par wVulC.........................................177 Figure 33 : Hypothèses simplifiées du mode d'action de Wolbachia (Wol) en fonction de l'effet déclencheur de la féminisation (a) et mainteneur de la féminisation (b)....................................................................................................202. .

(68) Liste des tables. Table 1 : Liste des génomes de Wolbachia séquencés à ce jour.............................18 Table 2 : Gènes de ménage de Wolbachia testés en RT-qPCR afin d'établir un étalon.................................................................................................................... 149 Table 3 : Liste des souches de Wolbachia d'isopodes terrestres dont le génome a été utilisé dans l'évolution moléculaire.................................................................151 Table 4 : Caractéristiques des génomes de Wolbachia complets, de wVulC et de wCon.....................................................................................................................159 Table 5 : Nombre de gènes retrouvés dans la catégorie fonctionnelle réplication, recombinaison et réparation de l'ADN (L) en fonction de leur annotation..........159 Table 6: Patron d'absence/présence des orthologues de 29 gènes candidats à la féminisation parmi 32 génomes de Wolbachia.....................................................171 Table 7 : Synthèse de l'analyse évolutive des gènes candidats.............................174 Table 8 : Synthèse de l'analyse des 29 gènes candidats à la féminisation : fonction, évolution moléculaire et comparaison d'expression entre A. vulgare et C. convexus. ..............................................................................................................................185. .

(69) Liste des abréviations

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(100) -. )+') ! !. VIH : Vitellogenin Inhibiting Hormone. .

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(106) Le père de la mycologie Anton de Bary ne se doutait certainement pas des bouleversements qu'engendreraient la symbiose lorsqu'il introduisit ce terme dans son étude sur le développement des lichens à la fin du XIXème siècle (de Bary, 1879), à la fois sur des conceptions évolutives, écologiques, médicales ou philosophiques (Gilbert, 2014 ; Gordon, 2012 ; McFall-Ngai et al., 2013 ; Tremaroli et Bäckhed, 2012). La symbiose (sensus stricto “vivre ensemble”) fut définie par Anton de Bary comme une association d'organismes différents (de Bary, 1879). Elle implique ainsi toujours deux types de partenaires : d'une part l'hôte, le plus grand, et d'autre part le symbiote, le plus petit (Zilber-Rosenberg et Rosenberg, 2008). Grâce aux avancées technologiques de la biologie moléculaire (PCR, séquençage à haut-débit, imagerie in situ), l'étude des systèmes symbiotiques s'est vite démocratisée à l'aube du XXIème siècle, révélant un monde où chez les eucaryotes, la symbiose devient la règle et l'absence de symbiose l'exception (Gilbert, 2014 ; Moya et al., 2008). En effet, des relations symbiotiques ont été décrites dans pratiquement tous les organismes multicellulaires (cf Figure1 ; Moya et al., 2008 ; Brucker et Bordenstein, 2012). Les symbioses sont fortement représentées chez les végétaux par les mycorrhizes, rhyzobiomes et champignons endocytes (Gilbert, 2014 ; Markmann et Parniske, 2009). Quant aux animaux, ils hébergent pour la majorité d'entre eux une communauté symbiotique appelée le microbiote, dont des symbiotes essentiels pour leur survie et reproduction (notamment chez les arthropodes) (Douglas, 2014 ; Gordon, 2012 ; Kikuchi, 2009 ; McFall-Ngai et al., 2013 ; Rosenberg et al., 2007 ; Zilber-Rosenberg et Rosenberg, 2008). La symbiose a également été décrite dans des organismes unicellulaires (cf Figure 1 ; Moya et al., 2008 ; Schmitz-Esser et al., 2010 ; Wrede et al., 2012). Les relations symbiotiques sont en général modulées par des interactions multipartites entre l'hôte et les symbiotes, mais également entre les différents membres de la communauté symbiotique (Sakurai et al., 2005 ; Sicard et al., 2014). Elles ont pris telle.

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(109) . ment d'importance dans la vision de la biosphère que l'idée même de l'individu, qui représente l'unité sur laquelle agit la sélection naturelle, s'en retrouve transformée (Gilbert, 2014). Ainsi, certaines études proposent que l'individu ne serait pas un organisme monogénomique mais un organisme multi-échelle, “l'holobionte”, qui correspond à un consortium des cellules de l'hôte et de sa communauté symbiotique dans un ensemble fonctionnel intégré et complexe (Gilbert, 2014 ; McFall-Ngai et al., 2013 ; Rosenberg et al., 2007 ; Zilber-Rosenberg et Rosenberg, 2008). La sélection naturelle pourrait alors agir sur l'holobionte et non pas sur chaque partenaire séparément (Guerrero et al., 2013 ; Rosenberg et al., 2007 ; Zilber-Rosenberg et Rosenberg, 2008). Les associations entre les hôtes et les symbiotes présentent une grande diversité de formes. Ainsi, certaines associations peuvent être transitoires, et avoir. Figure 1 : La symbiose dans la biosphère, d'après Moya et al. (2008). Sont représentées ici uniquement les associations entre procaryotes et eucaryotes. Cet arbre montre ici que la symbiose a émergé plusieurs fois de manière indépendante entre les groupes eucaryotes. La taille des branches n'est pas à l'échelle. * indique que des génomes complets sont disponibles.. .

(110) peu de conséquences sur les trajectoires évolutives de l'hôte et du symbiote (Zilber-Rosenberg et Rosenberg, 2008). Cette catégorie regroupe souvent le cas des symbioses dites “facultatives” où le symbiote et/ou l'hôte peut survivre et se reproduire soit en association, soit libre (Pontes et al., 2008). C'est le cas par exemple de nombreuses symbioses chez les insectes qui ne sont pas essentielles pour la survie ou la reproduction de l'hôte, mais qui peuvent fournir un avantage indéniable à l'hôte. Par exemple, le symbiote facultatif, qualifié de secondaire, peut avoir un rôle nutritionnel (Nogge, 1981), dans la défense contre les parasitoïdes (Oliver et al., 2009) ou dans la longévité de l'hôte (Dale et Welburn, 2001). Par opposition, d'autres associations, plus durables dans le temps, peuvent engendrer de plus fortes conséquences sur les trajectoires évolutives de l'hôte et du symbiote. De telles associations peuvent conduire à une dépendance de l'un et/ou de l'autre des partenaires (Zilber-Rosenberg et Rosenberg, 2008). C'est le cas des symbioses dites “obligatoires” où le symbiote et l'hôte vivent et se répliquent exclusivement en association (Nakabachi, 2008). De nombreuses symbioses chez les insectes illustrent parfaitement ce cas, où le symbiote intracellulaire, dit symbiote primaire, a été “domestiqué” par l'hôte et est hébergé au sein des bactériocytes dans un tissu spécialisé : le bactériome (Buchner, 1965 ; Nakabachi, 2008). Ces hôtes ont un régime très spécialisé et souvent pauvre en acides aminés [aa], qui est complémenté par les nutriments fournis par leurs symbiotes (Douglas, 1998 ; Sasaki et Ishikawa, 1995). Il faut visualiser ces types d'association comme deux extrêmes reliant tout un gradient d'associations. Par exemple, l'un des deux acteurs peut être obligatoire tandis que l'autre est facultatif. Ainsi, si le symbiote est obligatoire, cela signifie qu'il vit et se réplique exclusivement en association avec l'hôte, mais la réciproque n'est pas forcément vraie. Les symbioses à Wolbachia, très répandues chez les arthropodes, en sont un parfait exemple car la bactérie ne peut pas survivre sans l'hôte alors que l'hôte le peut dans de nombreux cas (Werren et al., 2008).. .

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(113) . Indépendamment de ces notions, les associations entre l'hôte et les symbiotes peuvent également être plus ou moins étroites. Ainsi, on distingue deux grands types de symbiose : l'ectosymbiose et l'endosymbiose (Moya et al., 2008). Dans les cas d'ectosymbiose, association moins étroite, le symbiote vit à l'extérieur de l'hôte. Dans les cas d'endosymbiose, association plus intime, le symbiote vit dans les tissus de l'hôte. L'endocytobiose ou “endosymbiose intracellulaire” est un cas particulier de l'endosymbiose où le symbiote vit exclusivement à l'intérieur des cellules de l'hôte (Bordenstein et Reznikoff, 2005 ; Moran et Baumann, 2000). Cette association, la plus intime qui soit, a abouti à de grandes innovations évolutives dont la plus spectaculaire est sans nul doute la formation des organelles mitochondriaux et chloroplastiques dans les cellules eucaryotes (Keeling et Archibald, 2008 ; Sagan, 1967). Plus récemment, une étude a suggéré que des symbioses intracellulaires pourraient être à l'origine de la multicellularité (Alegado et al., 2012 ; Dayel et al., 2011). D'une manière plus globale, certaines théories suggèrent que la symbiose (sensus largo) serait effectivement l'un des mécanismes aboutissant à la multicellularité par l'interaction entre deux cellules différentes (Grosberg et Strathmann, 2007). Les relations endosymbiotiques jouent également un rôle non négligeable dans la colonisation de nouvelles niches écologiques, telle que la colonisation des cheminées hydrothermales où le symbiote permet le métabolisme du soufre (Dubilier et al., 2008 ; Petersen et al., 2011). Enfin, la symbiose pourrait être l'un des mécanismes de la spéciation (Brucker et Bordenstein, 2012 ; Sharon et al., 2010) et serait source de diversité biologique (McFall-Ngai et al., 2013). En effet, la plupart des symbioses montrent une spécificité entre l'hôte et le symbiote. L'évolution rapide des gènes de l'immunité de l'hôte en réponse au symbiote peut aboutir à des incompatibilités hybrides entre deux hôtes n'hébergeant pas le même symbiote. De plus, les effets de la symbiose peuvent amener chez l'hôte à des isolements comportementaux (comme chez les drosophiles qui ne se nourrissent pas sur le même substrat selon la composition de leur microbiote ; Koukou et al., .

(114) 2006), écologiques (comme chez le puceron Acyrthosiphon pisum qui, en association avec une gamma-protéobactérie, voit sa fitness augmenter sur le trèfle blanc ; Tsuchida et al., 2004) ou post-copulatoires (comme par exemple les symbioses à Wolbachia qui peuvent entraîner des infertilités de croisement par le biais de l'incompatibilité cytoplasmique [IC] ; Telschow et al., 2005a). Il est sans conteste que le monde vivant d'aujourd'hui est modelé par la grande richesse des interactions unissant les organismes entre eux. D'une manière générale, le symbiote retire toujours un bénéfice de sa relation avec l'hôte. Ce n'est pas toujours le cas de l'hôte. En effet, les interactions symbiotiques s'inscrivent dans un continuum allant du mutualisme (relation bénéfique pour l'hôte) au parasitisme (relation coûteuse pour l'hôte) en passant par le commensalisme (relation neutre pour l'hôte) (Bordenstein et al., 2009 ; Moya et al., 2008). Ces types d'association s'inscrivent dans un équilibre dynamique le long de ce continuum. En effet, à l'échelle phylogénétique, les transitions entre les différents modes de vie sont nombreuses (cf Figure 2 ; Toft et Anderson, 2010 ; Sachs et al., 2014). Par exemple, au niveau des endosymbiotes, des transitions entre le mode de vie parasite et mutualiste sont observés chez Wolbachia (Comandatore et al., 2013 ; Nikoh et al., 2014), Rickettsia (Perotti et al., 2006) ou encore Arsenophonus (Jousselin et al., 2013). Ainsi, les mécanismes génétiques régissant ces associations pourraient être les mêmes, qu'il s'agisse d'une relation mutualiste ou parasite (Dale et Moran, 2006 ; Ewald, 2004 ; Hentschel et al., 2000). Par exemple, une étude récente a montré que les bactériophages, qui sont des facteurs génétiques connus pour porter des facteurs de virulence associés au parasitisme, pouvaient également porter des facteurs associés au mutualisme (ici, pour la défense contre les parasitoïdes de l'hôte ; Oliver et al., 2009). Différents mécanismes évolutifs ont été imaginés afin d'expliquer comment tous ces différents types de relations ont pu être mis en place, ces mécanismes pouvant contribuer conjointement à différents degrés à l'issue évolutive d'une interaction donnée (Leimar et Hammerstein, 2010). .

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(117) . Figure 2 : Phylogénie de bactéries symbiotiques, d'après Toft and Anderson (2010). Les branches terminales dans l'arc de cercle et les noms des bactéries sont colorés en fonction de la nature de l'association symbiotique, qui ne doit pas être considérée comme l'unique type d'association possible pour la bactérie. * indique qu'il y a également des cas de mutualisme. ** indique que le nom de l'espèce est dans la catégorie Candidatus.. .

(118) Dans le cas du mutualisme, le bénéfice engendré par l'un et l'autre des partenaires surpasse le coût induit (Bronstein, 1994 ; Leigh, 2010). Sa mise en place et son maintien sont compliqués à expliquer à la lumière de la sélection naturelle (Axelrod et Hamilton, 1981 ; Bull et Rice, 1991 ; Sachs et al., 2004). En effet, chaque partenaire bénéficie davantage en exploitant ou abandonnant l'autre partenaire. Ainsi, très rapidement, les conflits d'intérêts émergeant briseraient ou préviendraient l'apparition du mutualisme (Bronstein et al., 2003 ; Ferriere et al., 2002 ; Holland et al., 2004). D'autant plus que certaines études suggèrent que le mutualisme se brise fréquemment et évolue vers du parasitisme, ou vers l'autonomie d'au moins un des deux partenaires (Sachs et Simms, 2006 ; Sachs et al., 2011). Dans ce cas, comment expliquer la mise en place et le maintien de la coopération entre l'hôte et le symbiote ? La théorie de l'holobionte est intéressante dans ce contexte car la sélection naturelle agirait sur l'ensemble hôte/symbiote et pas sur chaque partenaire séparément (Gilbert, 2014 ; Savinov, 2011). Par ailleurs, cette idée a déjà été utilisée intuitivement par le passé car la plupart des mécanismes expliquant la mise en place et le maintien du mutualisme prennent tout leur sens dans le cadre de la théorie des jeux. Cette théorie initialement énoncée par John von Neumann en 1928 explique que la stratégie optimale pour un joueur dépend des stratégies utilisées par les autres joueurs (Von Neumann et Morgenstern, 1944). De plus, au sein de la théorie des jeux, l'équilibre de Nash indique qu'une fois qu'un équilibre a été trouvé, les joueurs perdraient à en dévier (Nash, 1951). Ainsi, la théorie des jeux prédit que l'action d'un partenaire dépend et induit celle de l'autre partenaire, comme s'il s'agissait d'un ensemble. Le mutualisme pourrait par exemple être maintenu par des mécanismes dits “d'alignements des intérêts” ou de “réciprocité” (Leimar et Hammerstein, 2010). On y définit des “coopérateurs”, par opposition aux “tricheurs”. Ces mécanismes sont divisés traditionnellement en deux grandes catégories : le choix du partenaire (les tricheurs sont exclus au profit des coopérateurs ; Bull et Rice, 1991 ; Ferriere et al., 2002 ; Murray, .

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(121) . 1985 ; Noë et Hammerstein, 1994, 1995) et la fidélité du partenaire par effet retour (l'effet positif engendré par le premier partenaire sur le second partenaire lui bénéficie également, par effet retour ; Connor, 1986 ; Connor, 2007 ; Sachs et al., 2004). Un exemple connu du choix de partenaire est le système des figuiers/guêpes du figuier dans laquelle la guêpe pond ses œufs dans les ovaires de la plante en la pollinisant. Puis, les larves se développent dans les fruits et se nourrissent d'une portion des graines. La plante limite le nombre de pontes en dispo sant des ovaires hors d'atteinte de l'ovipositeur des guêpes femelles (Axelrod et Hamilton, 1981). Un exemple connu de la fidélité du partenaire par effet retour est l'association entre la seiche Euprymna scolopodes et la bactérie Vibrio fischeri. En effet, la seiche fournit des nutriments à ses symbiotes. En retour, les symbiotes, hébergés dans un organe spécifique, émettent de la lumière qui a pour conséquence de masquer la silhouette de l'hôte vu du-dessous (la silhouette se confond avec la lumière provenant de la surface ; McFall-Ngai, 1999). Il est supposé que le mutualisme se serait mis en place à partir du parasitisme ou du commensalisme (Edwards, 2009 ; Frank, 2003 ; Siepielski et Benkman, 2007), bien qu'une étude ait récemment montré que le mutualisme pouvait émerger spontanément, en concordance avec la théorie de l'holobionte dans le cadre de la théorie des jeux (Aanen et Bisseling, 2014 ; Hom et Murray, 2014). D'autres études suggèrent que le mutualisme se serait mis en place par effet tolérance, comme fréquemment rencontré dans les relations animal/parasite (Aanen et Hoekstra, 2007 ; Edwards, 2009 ; Roy et Kirchner, 2000). Ainsi, le parasite, en modulant l'environnement interne de l'hôte, est capable indirectement d'induire une modification des seuils de tolérance de l'hôte à certains paramètres, aboutissant à une réelle dépendance de l'hôte vis-à-vis du parasite. Alors que la mise en place et le maintien du mutualisme demeurent complexes à expliquer, il en est tout autrement pour le parasitisme. Dans le cas des relations parasitiques, le symbiote engendre un coût pour l'hôte, qui de son côté es.

(122) saie de s'en libérer. Les conflits d'intérêts de l'un et l'autre partenaire sont illustrés par la course aux armements (Brockhurst et Koskella, 2013 ; Ebert, 2008 ; Little et al., 2006 ; Luijckx et al., 2013). En effet, tandis que l'hôte met en place des stratégies d'évitement ou de défense immunitaire, le parasite met en place des stratégies de rencontre et de détournement des défenses immunitaires de l'hôte (Auld et al., 2012 ; Soper et al., 2014). Par exemple, la bactérie Legionella détourne la voie endosome-lysosome des amibes où elle se multiplie remodelant le phagosome en vacuole hébergeant les légionelles (Price et al., 2014). La sélection de ces stratégies peut rentrer dans un équilibre dynamique durable dans le temps (Carval et Ferriere, 2010). En effet, un symbiote peu virulent verra sa transmission décroître alors que trop virulent, une mort prématurée de l'hôte diminuera également sa transmission. Ainsi, des virulences intermédiaires peuvent être sélectionnées (May et Anderson, 1983 ; Regoes et al., 2000). En parallèle, les résistances mises en place par l'hôte ne seront sélectionnées que si le coût induit n'outrepasse pas le bénéfice qu'elles octroient. Dans une dynamique balançant entre coûts et bénéfices, des réponses modérées de l'un et de l'autre partenaire peuvent être sélectionnés, permettant la mise en place d'une relation durable (Carval et Ferriere, 2010). Van Valen propose dans son hypothèse de la Reine Rouge que l'hôte et le symbiote coévoluent continuellement pour s'adapter l'un à l'autre (Van Valen, 1973). Bien que l'idée originelle de Van Valen était d'expliquer les taux d'extinction du registre paléontologique (qui peuvent dépendre de la coévolution entre les espèces), c'est également une très belle manière d'illustrer la course aux armements dans laquelle évoluent l'hôte et le parasite et montre bien que des relations antagonistes aboutissent à une coévolution entre les partenaires. D'une manière générale, les relations à long terme conduisent irrémédiablement à une co-évolution entre les deux types de partenaires (Xu et Gordon, 2003). Ceci est illustré par la co-spéciation, la congruence des phylogénies hôtes/symbiote, l'adaptation du système immunitaire et le développement de structures spécifiques comme le bactériome ; Buchner, .

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(125) . 1965 ; Aksoy et al., 1997 ; Auld et al., 2012 ; Gilbert, 2014 ; McFall-Ngai et al., 2013 ; Munson et al., 1991). Selon la théorie de l'holobionte, la sélection naturelle n'agirait pas seulement sur l'un ou l'autre des partenaires mais sur l'ensemble hôte/partenaire, à l'interface entre les deux. L'interaction entre les deux partenaires est donc la clef de la co-évolution et de la mise en place de toutes ces catégories d'interactions, ainsi que des innovations évolutives majeures qui ont modelé l'histoire des êtres vivants. On sait aujourd'hui que les interactions entre les symbiotes bactériens et leurs hôtes eucaryotes sont complexes et nombreuses. Ainsi, on commence à connaître des mécanismes relatifs au quorum-sensing (qui représente les mécanismes régulateurs de la densité bactérienne ; González et Venturi, 2013 ; Ng et Bassler, 2009 ; Stevens et al., 2012), aux molécules de surface (McFall-Ngai et al., 2012) ou encore au système immunitaire (Anitha et al., 2012). En revanche, lorsqu'il s'agit de symbiotes intracellulaires obligatoires, peu de mécanismes moléculaires régissant l'interaction entre les différents partenaires sont connus. En effet, la plupart sont non cultivables et non transformables, rendant les études moléculaires difficiles (Wood et al., 2014). De plus, les outils permettant de les étudier plus finement n'ont été développés et popularisés que récemment (PCR, séquençage haut débit, études in situ). Par exemple, les mécanismes moléculaires régissant la symbiose de l'endosymbiote considéré comme le plus répandu sur la planète et parmi les plus étudiés, Wolbachia, sont encore aujourd'hui inconnus (Serbus et al., 2008 ; Sicard et al., 2014), et ce, en dépit de l'identification d'effecteurs potentiels (Siozios et al., 2013). A l'aube du XXIème siècle, nous n'ignorons plus cet aspect primordial de la biosphère et le nombre d'études sur les endosymbiotes est croissant. Parmi ces études, celles portant sur les symbioses à Wolbachia deviennent de plus en plus nombreuses. En effet, cette bactérie intracellulaire obligatoire infecte un large spectre d'hôtes invertébrés et est capable d'induire tous les types de symbiose, du mutualisme au parasitisme (Werren et al., 2008). En consi.

(126) dérant son impact sur les phénotypes de ces hôtes, Wolbachia représente donc un modèle idéal pour étudier les interactions unissant les endosymbiotes intracellulaires obligatoires et leurs hôtes.. .

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(129) . I.. Wolbachia Wolbachia pipientis est un endosymbiote intracellulaire obligatoire dé-. couvert par Wolbach et Hertig en 1924 dans des ovocytes du moustique Culex pipiens. C'est une Alphaprotéobactérie gram-négative membre de la famille des Rickettsiales (Hertig, 1936). Bien qu'intracellulaire, Wolbachia n'est pas spécialisée dans un type donné de cellules comme le sont certains endosymbiotes intracellulaires cantonnés dans les bactériocytes (Baumann et al., 1995), bien qu'un cas soit connu chez l'hôte Cimex lectularius (Hosokawa et al., 2010). En effet, de nombreuses études in vivo ont démontré que Wolbachia était capable, chez ses hôtes et quelque soit le phénotype induit, d'infecter différents types de tissus : les gonades, les tissus nerveux, les tissus digestifs, l'hémolymphe (Dittmer et al., 2014 ; Dobson et al., 1999 ; Taylor et al., 2005) et même les cellules du système immunitaire (Chevalier et al., 2011). Sa transmission se fait par voie ovocytaire, il est donc essentiel pour la bactérie de se situer dans les cellules germinales. Cependant, les études phylogénétiques révèlent une incongruence entre Wolbachia et ses hôtes, mettant en évidence le succès de transferts horizontaux à l'échelle évolutive (Shoemaker et al., 2002 ; Werren et al., 1995). Des études suggèrent que ces transferts horizontaux peuvent naturellement se faire par contact d'hémolymphe, par ingestion ou par les voies du parasitisme (Cordaux et al., 2001 ; Heath et al., 1999 ; Huigens et al., 2004 ; Le Clec'h et al., 2013a, 2013b ; Rigaud et Juchault, 1995). Les observations de la bactérie en microscopie électronique ont révélé que Wolbachia a perdu sa paroi mais possède une double-membrane, entourée d'au moins une troisième membrane qui probablement proviendrait d'une exten.

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(133) . en particulier d'humains, de bétail ou d'animaux de compagnie ; Ferri et al., 2011) et a également été rapportée dans deux espèces de nématodes parasites de plantes de la famille des Pratylenchididae (Haegeman et al., 2009). Chez les arthropodes, Wolbachia est présente chez les insectes (66% des espèces infectés ; Hilgenboecker et al., 2008) les crustacés (Cordaux et al., 2012) et les chélicérates (acariens, araignées et scorpions ; Baldo et al., 2007 ; Breeuwer et Jacobs, 1996 ; Cordaux et al., 2001 ; Duron et al., 2008). Chez les crustacés en particulier, Wolbachia infecte au moins 61% des espèces d'isopodes terrestres (Bouchon et al., 2008) et infecte également des amphipodes, des ostracodes, des cirripèdes et des copépodes (Baltanas et al., 2007 ; Cordaux et al., 2001, 2012 ; Wiwatanaratanabutr, 2013). Cette large gamme d'hôtes a permis une grande radiation évolutive des souches de Wolbachia. Ainsi, les phylogénies ont permis de regrouper les souches. Figure 4 : Phylogénie des supergroupes de Wolbachia, d'après Lo et al. (2007). La phylogénie est basée sur les gènes ftsZ, groEL, gltA et dnaA. 10 supergroupes sont représentés (de A à J). Le groupe G est supposé être issu d'une recombinaison entre des souches du supergroupe A et du supergroupe B. Les supergroupes K, L, M et N se brancheraient près du supergroupe B d'après le gène ARNr 16S (Augustinos et al., 2011).. .

(134) de Wolbachia en 13 supergroupes, nommés par des lettres majuscules (cf Figure 4 ; Augustinos et al., 2011). Les souches de Wolbachia les plus étudiées sont celles des supergroupes A et B (infectant des Arthropodes) et C et D (infectant des Nématodes) (Bandi et al., 1998 ; Fenn et al., 2006 ; Werren et al., 1995). Les souches de Wolbachia des supergroupes E, H, I, K, M et N infectent des arthropodes uniquement (Augustinos et al., 2011 ; Bordenstein et Rosengaus, 2005 ; Czarnetzki et Tebbe, 2004 ; Fischer et al., 2002 ; Lo et al., 2002 ; Vandekerckohve et al., 1999). Celles des supergroupes J et L infectent des nématodes parasites de plantes (Haegeman et al., 2009). Les Wolbachia du supergroupe F semblent être un cas particulier car elles peuvent infecter à la fois des nématodes et des arthropodes (Baldo et al., 2007 ; Casiraghi et al., 2005 ; Casiraghi et al., 2001 ; Keiser et al., 2008 ; Rasgon et Scott, 2004 ; Ros et al., 2009). Quant au supergroupe G, il semble qu'il résulte plutôt d'une recombinaison entre les supergroupes A et B (sur la base du gène wsp), ce qui fait qu'aujourd'hui il a été éliminé (Baldo et Werren, 2007 ; Rowley et al., 2004). La distance phylogénétique entre chaque supergroupe étant supérieure à 3% sur l'ARNr 16S (Stackebrandt et Goebel, 1994), la question de la notion d'espèce chez les Wolbachia a été soulevée, sans être élucidée (Ellegaard et al., 2013 ; Lo et al. 2007 ; Taylor et al., 2005 ; Werren et al., 2008). En effet, la grande diversité moléculaire observée dans le genre Wolbachia n'est probablement que le sommet de l'iceberg. Avec la détection de nouvelles souches de Wolbachia, l'arbre phylogénétique actuel pourrait rapidement se transformer en buisson phylogénétique, flouant la barrière entre les différents supergroupes (et donc entre les différentes espèces potentielles). L'avènement des nouvelles méthodes (séquençage à haut débit, phylogénie multi-génique) combinées à l'acquisition de nouvelles données (identification de Wolbachia dans de nouveaux hôtes, génomes), pourrait permettre à terme d'élucider cette question.. .

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(137) . 1.. Les génomes de Wolbachia Le séquençage des souches de Wolbachia, et d'une manière plus générale. des endosymbiotes, a longtemps été un challenge difficile car ces bactéries sont souvent peu nombreuses et surtout situées dans le cytoplasme des cellules de l'hôte, qui contient notamment le génome de l'hôte et des mitochondries (Ellegaard et al., 2013 ; Sun et al., 2001). Ainsi, ce n'est que depuis les récentes optimisations des procédés de purification de l'ADN bactérien (Iturbe-Ormaetxe et al., 2011), couplé à l'avènement des nouvelles technologies de séquençage, permettant de séquencer l'ADN à haut-débit, que le séquençage des génomes d'endosymbiotes s'est peu à peu popularisé. Le premier génome de Wolbachia séquencé a été celui de la souche wMel infectant l'hôte Drosophila melanogaster, en 2004 (Wu et al., 2004). Ont ensuite abouti de nombreux projets de séquençage. A ce jour, on comptabilise 28 génomes de Wolbachia séquencés, appartenant aux supergroupes . . . . ! " #$$ % &% ' ( ) * % &+ % & ) , $ !' ) - , ..

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