© Marc-Olivier Turmel, 2018
Impact des agents réactivateurs de la latence sur la
physiologie des macrophages et leur susceptibilité à
l'infection par le VIH-1
Mémoire
Marc-Olivier Turmel
Maîtrise en microbiologie-immunologie - avec mémoire
Maître ès sciences (M. Sc.)
Impact des agents réactivateurs de la latence sur la
physiologie des macrophages et sur leur
susceptibilité à l’infection par le VIH-1
Mémoire
Marc-Olivier Turmel
Sous la direction de :
iii
Résumé
L’établissement de latence dans les lymphocytes T CD4+ mémoire est une des barrières majeures à l’éradication du VIH-1. Ces cellules infectées, mais qui sont peu ou pas transcriptionnellement actives sont immunisées aux trithérapies combinées qui ciblent les étapes de réplication virale. Les thérapies actuelles ne permettent cependant pas l’élimination des cellules déjà infectées. La stratégie « Shock and Kill », qui repose sur l’utilisation d’agents favorisant la réactivation virale dans les cellules infectées de façon latente, est prometteuse et pourrait, théoriquement, permettre l’élimination du VIH-1. Cependant, les agents actuellement étudiés sont non-discriminant envers les différentes populations cellulaires, infectées ou non. De plus, l’étude de l’impact de ces agents sur les macrophages, une population cellulaire clé dans l’établissement de l’infection et dans la progression de la maladie, semble avoir été négligée au détriment d’études spécifiquement axées sur les lymphocytes T CD4+. Nos résultats ont montré que le traitement des macrophages primaires humains avec les agents réactivateurs de la latence (LRA), particulièrement la bryostatin-1, un activateur de la voie PKC, est associé avec des augmentations importantes dans l’expression et la sécrétion de médiateurs pro-inflammatoires tels le CCL2/MCP-1, le CCL5/RANTES, l’IL-8/CXCL8 et le TNF. Ces modulations ne sont pas observées chez les lymphocytes T CD4+. De plus, la susceptibilité des macrophages à l’infection par le VIH-1 est diminuée suivant le traitement avec les agents réactivateurs. Finalement, le traitement des macrophages infectés à l’aide de la bryostatin-1 est associé à une diminution importante de la production ou du relargage de particules virales. Ces résultats montrent que l’effet des LRA sur les différentes populations cellulaires est très variable et qu’une meilleure connaissance des effets de ceux-ci est nécessaire.
iv
Abstract
Latency establishment in memory CD4+ T-lymphocytes is a major obstacle to HIV-1 eradication. Those infected, but poorly transcriptionally, cells are immune to combinatory antiretroviral therapy which target HIV-1 replication steps. Those therapie, therefore, don’t allow infected cells elimination. The Shock and Kill strategy, which relies on the use of agents that promote viral reactivation in latently infected cells is promising and could, theoretically, allow the elimination of HIV-1. However, the agents currently studied are non-discriminating towards the different cell populations, infected or not. In addition, the study of the impact of those agents on macrophages, which is a key cell population in the establishment of infection and progression of the disease, seems to have been neglected at the expense of studies specifically focused on CD4+ T lymphocytes. Our results have shown that the treatment of human primary macrophages with latency reactivating agents (LRAs), particularly the PKC activator bryostatin-1, is associated with a significant increase in the expression and secretion of pro-inflammatory mediators such as CCL2/MCP-1, CCL5/RANTES, IL-8/CXCL8 and TNF. These modulations are not observed in CD4+ T cells. In addition, the susceptibility of macrophages to HIV-1 infection is decreased following treatment with LRAs. Finally, the treatment of infected macrophages with bryostatin-1 is associated with a significant decrease in the production of viral particles. Those results show that the effect of LRAs on the different cell populations is very variable and that a better comprehension of the effects of these is necessary.
v
Table des matières
Contenu
Résumé ... iii
Abstract ... iv
Table des matières... v
Liste des tableaux ... ix
Liste des figures ... x
Liste des abréviations ... xii
Remerciements ... xvi
Chapitre 1. Introduction ... 1
1.1. Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) ... 1
1.1.1 Historique de l’épidémie ... 1
1.1.2 Classification, génome et structure ... 4
1.1.3 Cycle de réplication ... 5 1.1.3.1 Évènements précoces ... 5 1.1.3.2 Évènements de biosynthèse ... 7 1.1.3.3 Évènements tardifs ... 9 1.1.4. Immunopathogenèse du VIH-1 ... 10 1.1.4.1. Transmission du virus ... 10 1.1.4.2. Phases de l’infection ... 11 1.1.4.3. Réservoirs viraux ... 12 1.2. Les macrophages ... 13
1.2.1. Les macrophages tissulaires ... 14
1.2.2. Monocytes ... 15
1.2.3. Les macrophages dérivés de monocytes ... 16
1.2.4. La polarisation des macrophages ... 16
1.3. Persistance du VIH ... 18
1.3.1. Latence dans les cellules immunitaires ... 18
1.3.1.1. Établissement de la latence dans les lymphocytes T CD4+ ... 18
1.3.1.2. Établissement de la latence dans les macrophages ... 19
1.4. Stratégie « Shock and Kill » ... 19
1.5. Agents réactivateurs de la latence ... 20
vi
1.5.1.1. PKC et VIH-1 ... 21
1.5.1.2. Prostratin ... 22
1.5.1.3. Bryostatin-1... 22
1.5.2 Inhibiteur des histones déacétylases ... 23
1.5.2.1. HDAC ... 23
1.5.2.2. SAHA ... 25
1.5.2.3. Panobinostat ... 26
1.5.2.4. Romidepsin ... 27
1.5.3. Inhibiteur des bromodomaines ... 27
1.5.3.1 Bromodomaine ... 27
1.5.3.2 JQ1 ... 28
Chapitre 2: Hypothèse et objectifs de recherche ... 29
Chapitre 3: Matériels et méthodes ... 30
3.1. Production de particules virales ... 30
3.3.1. Modèle viral ... 30
3.1.2. Culture et transfection du clone moléculaire dans la lignée cellulaire HEK293T ... 31
3.1.3. Récolte et conservation de la production virale ... 32
3.2. Caractérisation de la production virale par ELISA p24 ... 33
3.3. Détermination de la TCID50 à l’aide des cellules TZM-bl ... 34
3.4. Stimulation des macrophages à l’aide des agents réactivateurs de la latence ... 35
3.4.1 Isolation et différenciation des monocytes ... 35
3.4.2. Agents réactivateurs de la latence ... 37
3.4.3. Infection des MDM avec le clone NL4.3-Bal-IRES-HSA ... 38
3.4.4. Préparation des échantillons et analyse par cytométrie en flux ... 39
3.5. Récolte des lysats cellulaires en vue de l'analyse de l'expression génique ... 40
3.5.1. Lyse des cellules ... 40
3.5.2. Isolation et purification de l'ARN ... 41
3.5.3. Rétrotranscription de l'ARN isolé en ADNc ... 41
3.5.4. PCR quantitative en temps réel ... 42
3.6. ELISA... 43
3.7. Lignée cellulaire Hek blue TNF ... 44
3.8. Analyses statistiques ... 45
vii
4.1. Les agents réactivateurs de la latence n’ont pas d’effet sur la viabilité des
macrophages ... 46
4.2. Effet de la concentration des agents sur l’expression et la sécrétion de chimiokines ... 47
4.2.1. Le traitement avec le JQ1 est associé à une diminution de l’expression/sécrétion de CCL2/MCP-1 alors que le traitement avec la bryostatin-1 est associé à une augmentation ... 48
4.2.2. Le traitement avec la bryostatin-1 et la romidepsin est associé à une augmentation de l’expression et de la sécrétion du CCL5/RANTES ... 51
4.2.3. Les traitements des MDM avec la bryostatin-1 et la romidepsin sont associés à des augmentations importantes de l’expression et de la sécrétion de l’IL-8/CXCL8 53 4.3 Effet de la concentration des agents sur l’expression et la sécrétion de cytokines . 57 4.3.1. Le traitement avec les LRA est associé à une augmentation de l’expression du TNF ... 57
4.4. Impact des LRA sur la viabilité de macrophages lors d’une infection subséquente ... 60
4.5. Impact du traitement des MDM avec les différents LRA sur leur susceptibilité à l'infection par le VIH-1 ... 61
4.5.1. Le traitement des macrophages avec les LRA est associé à une diminution significative de leur susceptibilité à l’infection par le VIH-1 ... 61
4.5. Impact de la stimulation des MDM avec les LRA à la suite de l’établissement de l’infection. ... 63
4.5.1. Le traitement des MDM infectés avec les LRA n’induit pas de changement dans la viabilité cellulaire ... 64
4.5.2. Le traitement des MDM infectés avec les LRA n’induit pas de changement dans le nombre de macrophages productivement infectés ... 64
4.5.3. Le traitement des macrophages infectés avec la bryostatin-1 est associé à une forte diminution de la production virale ... 65
Chapitre 5: Discussion ... 68
5.1. Identification de l’impact des LRA sur les propriétés physiologiques des macrophages. ... 68
5.1.1. Impact des agents réactivateurs de la latence sur la viabilité des macrophages ... 68
5.1.2. Impact des agents réactivateurs de la latence sur le profil d’expression/sécrétion de médiateurs pro-inflammatoire ... 70
5.1.2.1. CCL2/MCP-1 ... 70
5.1.1.2 CCL5/RANTES ... 72
5.1.1.3. IL-8/CXCL8 ... 73
viii
5.2. Impact des LRA sur la susceptibilité des MDM à l’infection par le VIH-1 ... 77
5.4. Effet des LRA sur les macrophages infectés ... 80
Chapitre 6: Conclusion et perspectives ... 84
ix
Liste des tableaux
Tableau 1: Informations sur les LRA utilisés. ... 38 Tableau 2: Résumé des valeurs d’expression/sécrétion pour le CCL2/MCP-1 suivant le traitement avec les LRA... 49 Tableau 3: Résumé des valeurs de sécrétion pour le CCL2/MCP-1 suivant le traitement avec les LRA et les combinaisons. ... 51 Tableau 4: Résumé des valeurs d’expression/sécrétion pour le CCL5/RANTES suivant le traitement avec les LRA... 52 Tableau 5: Résumé des valeurs d’expression/sécrétion pour l’IL-8/CXCL8 suivant le traitement avec les LRA... 54 Tableau 6: Résumé des valeurs de sécrétion pour l’IL-8/CXCL8 suivant le traitement avec les LRA et les combinaisons. ... 56 Tableau 7: Résumé des valeurs d’expression/sécrétion pour le TNF suivant le traitement avec les LRA. ... 58 ... 58 Tableau 8: Résumé des valeurs de sécrétion pour le TNF suivant le traitement avec les LRA et leurs combinaisons. ... 59
x
Liste des figures
Figure 1: Distribution mondiale des personnes vivantes avec le VIH-1. ... 2
Figure 2: Représentation génomique du VIH-1 et le rôle des protéines virales. ... 4
Figure 3: Représentation schématique d’une particule virale avec la localisation des protéines virales. ... 5
Figure 4: Interaction du récepteur CD4 avec la glycoprotéine gp120 au niveau de la région V3. ... 6
Figure 5: Représentation de la région 3’ LTR du VIH-1 et des principaux sites de liaison aux facteurs de transcription. ... 8
Figure 6: Assemblage du complexe pré-initiation et transcription médiée par Tat et NF-κB. ... 9
Figure 7: Chronologie de l’infection par le VIH-1 divisée en fonction des 7 phases de Fiebig. ... 12
Figure 8: Provenance des cellules immunitaires aux différents stades de développement. ... 14
Figure 9: Représentation du spectre de différenciation des macrophages en fonction des signaux retrouvés dans l’environnement. ... 17
Figure 10: Mécanisme d’action des HDAC et des HAT. ... 24
Figure 11: Vecteur NL4.3-IRES-HSA contenant le gène rapporteur HSA. ... 30
Figure 12: Séparation des différentes phases du sang sur gradient de densité. ... 36
Figure 13: Effet de certains agents réactivateurs de la latence sur la viabilité des MDM 46 Figure 14: Expression et sécrétion de la chimiokine CCL2/MCP-1 à la suite du traitement des MDM avec différents agents réactivateurs de la latence. ... 48
Figure 15: Sécrétion de la chimiokine CCL2/MCP-1 par les MDM à la suite de leur traitement avec les agents réactivateurs de la latence seuls ou en combinaison. ... 50
Figure 16: Expression et sécrétion de la chimiokine CCL5/RANTES à la suite du traitement des MDM avec différents agents réactivateurs de la latence ... 52
Figure 17: Expression et sécrétion de la chimiokine IL-8/CXCL8 à la suite du traitement des MDM avec différents agents réactivateurs de la latence. ... 53
Figure 18: Sécrétion de la chimiokine IL-8/CXCL8 par les MDM à la suite de leur traitement avec les agents réactivateurs de la latence seuls ou en combinaison. ... 55
Figure 19: Expression et sécrétion du TNF à la suite du traitement des MDM avec différents agents réactivateurs de la latence ... 57
Figure 20: Les traitements avec les combinaisons de LRA sont associés à des augmentations, possiblement synergiques, de la sécrétion du TNF. ... 58
Figure 21: Effet de certains agents réactivateurs de la latence sur la viabilité des MDM lorsque ces derniers sont stimulés et infectés. ... 60
Figure 22: Le traitement des MDM avec les LRA est associé à une diminution importante du nombre de cellules productivement infectées ... 62
Figure 23: Effet du traitement des MDM avec les LRA sur la production de la protéine rapportrice HSA. ... 63
Figure 24: Effet de certains agents réactivateurs de la latence sur la viabilité des MDM lorsque ces derniers sont infectés puis stimulé. ... 64
Figure 25: Effet du traitement avec les LRA à la suite d’une infection de 11 jours sur le nombre de MDM infectés. ... 65
xi
Figure 26: Effets du traitement avec les LRA sur l’intensité moyenne de fluorescence des MDM productivement infectés. ... 66 Figure 27: Le traitement avec la bryostatin-1 et ses combinaisons est associé à une diminution significative de la quantité de p24 dans le surnageant. ... 67
xii
Liste des abréviations
ADN : Acide désoxyribonucléique ARN(m) : Acide ribonucléique (messager) ART : De l’anglais Antiretroviral Therapy
BET : De l’anglais Bromodomain and Extra-Terminal motif BMDM : De l’anglais Bone marrow-derived macrophage BRD : De l’anglais Bromodomain-containing protein BSA : De l’anglais Bovine Serum Albumine
CA : Capside
CD : Cluster de différenciation
Cdk9 : De l’anglais Cyclin-dependent kinase 9 CTCL : De l’anglais Cutaneous T-Cell lymphoma CTD : De l’anglais C-Terminal Domain
DEPC : Diethylpyrocarbonate
DMEM : De l’anglais Dulbecco modified eagle medium dNTP : Désoxyribonucléotide
DSFI : De l’anglais DRB-sensitivity inducing factor eGFP : De l’anglais Enhanced green fluorescent protein ELISA : De l’anglais enzyme-linked immunosorbent assay Env : Enveloppe
ESCRT : De l’anglais Endosomal sorting complex recquired for transport FBS : De l’anglais Fetal Bovine Serum
Gag : De l’anglais Group-specific antigen
HAART : De l’anglais highly active antiretroviral therapy HBSS : De l’anglais Hank’s Balanced Salt Solution HDAC : Histone déacétylase
xiii HSA : De l’anglais Heat stable antigen
HTLV : De l’anglais Human T-lymphotropic virus IFN : Interféron
iHDAC : Inhibiteur des histones déacétylase IB : De l’anglais Inhibitor of κB
IL : Interleukine IN : Intégrase
ITS : Infection transmise sexuellement JNK : De l’anglais c-Jun N-terminal kinases kDa: Kilodalton
LAV : De l’anglais Lymphadenopathy Associated Virus LDH : Lactate déhydrogénase
LEDGF : De l’anglais Lens epithelium-derived growth factor LPS : Lipopolysaccharide
LRA : De l’anglais Latency-reversing agent LTR : De l’anglais Long terminal repeat MA : Matrice
MAPK : De l’anglais Mitogen activated protein kinase M-CSF: De l’anglais Macrophage colony-stimulating factor MDB : De l’anglais Membrane desalting buffer
MDM : Macrophage dérivé de monocyte
M-MLV : De l’anglais Moloney Murine Leukemia Virus MOI : De l’anglais multiplicity of infection
NAD: De l’anglais nicotinamide adenine dinucleotide NC : Nucléocapside
Nef : De l’anglais Negative factor
xiv
NFAT : De l’anglais Nuclear factor of activated T-cells
NF-κB : De l’anglais nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells NGS : De l’anglais Normal Goat Serum
NLS : De l’anglais Nuclear localization sequence NSCLC : De l’anglais Non-Small Cell Lung Cancer NT : Non traité
NTD : De l’anglais N-Terminal Domain
N-TEF : De l’anglais negative transcription elongation factors OMS : Organisation mondiale de la santé
O/N : De l’anglais overnight p24 : Protéine de capside virale
PBL : De l’anglais peripheral blood lymphocyte
PBMC : De l’anglais Peripheral blood mononuclear cells PIC : De l’anglais Pre-integration complex
PID : De l’anglais P-TEFb-interacting domain Pol : Polymérase
PPP: De l’anglais Promoter-proximal pausing PR : Protéase
PTCL : De l’anglais Peripheral T-Cell Lymphoma
P-TEFb : De l’anglais positive transcription elongation factor
RANTES: De l’anglais regulated on activation, normal T cell expressed and secreted
Rev: De l’anglais Regulator of viral gene expression RPMI: De l’anglais Roswell Park Memorial Institute medium
qRT-PCR : De l’anglais Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction ROI : De l’anglais Reactive oxygen intermediates
RNI : De l’anglais Reactive nitrogen intermediates RTC : De l’anglais Reverse transcription complex
xv RT : Transcriptase inverse
SAHA : Suberoylanilide Hydroxamic Acid SEC : De l’anglais Super elongation complex SIDA : Syndrome d’immunodéficience acquise ssDNA: De l’anglais Single strand DNA
Tat : De l’anglais Transactivator of transcription TAR : De l’anglais transactivation response element TCID50 : De l’anglais Tissue culture infectious dose 50 TCR: De l’anglais T-cell receptor
TFIID: De l’anglais Transcription factor II D TNF : De l’anglais Tumor necrosis factor TSS : De l’anglais Transcription start site Vif : De l’anglais Viral infectivity factor Vpu : De l’anglais Viral protein U Vpr : De l’anglais Viral protein R
xvi
Remerciements
J’aimerais tout d’abord remercier le Dr Michel J. Tremblay d’avoir accepté de superviser mes études de maîtrise. Travailler au sein de votre équipe au cours des deux dernières années a été un privilège. Vous m’avez non seulement permis de progresser sur le plan professionnel, mais également sur le plan personnel. Votre passion et votre persévérance ont été pour moi une source de motivation.
J’aimerais également remercier mon chef de projet le Dr Michel Ouellet qui m’a énormément aidé au cours de mon projet et qui, malgré le fait que j’étais toujours à la dernière minute (encore désolé), n’a jamais ménagé les efforts et les conseils. Tes interventions et tes commentaires m’ont permis de devenir une meilleure personne. Un remerciement particulier à l’ensemble des membres de l’équipe MJT qui n’a jamais manqué une occasion pour me rappeler mes moments de confusion et m’a permis de garder les pieds sur terre avec les nombreux « De toute façon, ça ne marchera pas ». Les discussions du midi qui se terminaient incessamment de manière surprenante. Les partys de Noël et les épluchettes de blé d’Inde, bien que le blé d’Inde n’était pas assez présent. J’espère avoir la chance un jour de travailler à nouveau avec une équipe aussi dynamique. J’aimerais également remercier mes amis et ma famille, particulièrement mes parents, Lise et Daniel qui ont toujours cru en moi et supporté dans mes choix. Sans vous, je n’aurais jamais réussi à me rendre où je suis aujourd’hui et je vous en serai pour toujours reconnaissant.
Finalement, j’aimerais remercier mon comité d’évaluation, ainsi que les différentes organisations subventionnaires, dont la fondation du CHU de Québec.
1
Chapitre 1. Introduction
1.1. Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) 1.1.1 Historique de l’épidémie
C'est en 1981 que les premiers cas, de ce qu'on appellera plus tard le SIDA (Syndrome d'immunodéficience acquise), ont été observés. Au début des années 1980, plusieurs cas de pneumonie causés par Pneumocystis carinii, un pathogène opportuniste, ont été rapportés chez des patients homosexuels de la région de Los Angeles. L’infection s’accompagnait également de symptômes pouvant être associés à une forme d’immunosuppression [1-3]. Au même moment, on rapportait des cas de cancers agressifs et inhabituels (Sarcome de Kaposi) dans les régions de New York et de la Californie [4]. La transmission, initialement associée aux rapports homosexuels [5], fut également observée chez des gens souffrant d'hémophilie A [6], des membres de la population haïtienne [7], ainsi que chez des femmes hétérosexuelles [8]. C'est en 1983 que l’équipe du Dr Luc Montagnier de l’institut Pasteur en France isola un nouveau genre de rétrovirus génétiquement différents des types HTLV (Human T-lymphotropic virus) –I et II, précédemment soupçonnés d’être à l’origine de l’épidémie d’immunosuppression observée [9]. Ce virus, qui a été nommé LAV (lymphadenopathy-associated virus), fut proposé comme étant l'agent infectieux responsable du développement du SIDA [10]. Cependant, en 1984, le Dr Robert Gallo du National Cancer Institute découvrit le sous-groupe HTLV-III qu'il associa à l'épidémie d'immunodéficience [11]. Il a été finalement déterminé, dans la controverse, que le virus LAV et HTLV-III n’était qu’une seule et même souche et qu'une contamination de culture en était possiblement la cause. La découverte fut finalement créditée au groupe français. Le LAV/HTLV-III prendra finalement le nom VIH -1 (Virus de l’immunodéficience humaine) en 1986 par l’Organisation mondiale de la santé (OMS) [12]. C'est également en 1986 que le plus ancien cas d'infection par le VIH-1 aurait été déterminé à partir d'échantillons sériques humains d'origine africaine prélevés en 1959. Parmi les 752 échantillons analysés, 21 se sont initialement révélés positifs. Cependant, à la suite de tous les tests de confirmations, un seul échantillon s'est finalement avéré positif pour un virus similaire au HTLV-III/LAV. L’identité exacte de cette personne ne semble cependant pas être connue [13]. Selon les dernières statistiques de l’organisme
2
ONUSIDA, plus de 35 millions de personnes seraient décédées des causes du SIDA depuis le début de l'épidémie et près de 37 millions de personnes vivent avec le VIH (Figure 1) (Statistique juin 2016) [14].
Figure 1: Distribution mondiale des personnes vivantes avec le VIH-1.
Statistique de 2016, image tirée de UNAIDS.org
Au cours de la période de 2010 à 2016, l’incidence de la maladie a diminué de 47 % chez les enfants et 11 % chez les adultes [14]. De plus, le nombre de personnes ayant accès aux traitements antirétroviraux a augmenté de 36 % [14]. Ce nombre reste cependant insuffisant dans l'espoir de contrôler la maladie. Il est également d'importance de noter que l'accessibilité des traitements antirétroviraux, particulièrement dans les pays en développement, est très loin d'être optimale et que les coûts élevés de ces traitements en sont probablement, du moins en partie, responsables.
Le VIH est majoritairement divisé en deux espèces : le VIH-1 et le VIH-2. Alors que le VIH-1 est la forme prédominante et celle responsable de l'épidémie actuellement observée dans le monde, le VIH-2 est moins infectieux, progresse moins rapidement et est essentiellement retrouvé en Afrique de l'Ouest. Le VIH-1 est lui-même divisé en 4 groupes identifiés M, N, O et P. Chacun de ces groupes serait le résultat d'un évènement de
3
transmission inter-espèce différent. Le groupe M, qui fut le premier identifié, est responsable de près de 95 % des infections qui sont retrouvés dans le monde, alors que le groupe O est responsable de moins de 1 % [15]. Les groupes N et P sont encore moins prévalents avec respectivement au moins 14 cas et 2 cas répertoriés [16]. Il est estimé que la transmission des grands singes à l'homme s’est réalisée entre 1915 et 1941 pour ce qui est des groupes M, N et O [17, 18]. Le groupe M se divise en 9 sous-groupes identifiés (A-D, F-H, J et K) et plus de près de 90 formes recombinantes circulantes (CRF) [19, 20]. Bien que la majorité des infections soit associée au sous-groupe C (50 %), la majorité des recherches est réalisée sur le sous-groupe B (12 %), qui est prédominant dans les pays industrialisés [21].
En 2018, il est toujours impossible de guérir de l’infection par le VIH-1. Malgré le développement de plusieurs classes d’antirétroviraux, l’élimination du virus de l’organisme n’est pas possible. En effet, même sous trithérapie combinée, la demi-vie des cellules infectées de façon latente est estimée à 44 mois. Une période de 73 années serait donc nécessaire, dans les meilleures conditions, afin d'éliminer complètement le virus de l'organisme [22]. Les traitements antirétroviraux actuels ciblent plusieurs étapes du cycle de réplication virale, mais ils n’ont pas d’effet sur les cellules déjà infectées. Le traitement du VIH-1 requiert donc la prise d’une médication à vie. Sous traitement, la charge virale des personnes infectées est, dans la plupart des cas, diminuée à un niveau indétectable (<40-50 copies/ml). La transmission du VIH-1 d’une personne sous médication (charge virale indétectable) à une personne séronégative n’a pas encore été répertoriée. Cependant, les effets secondaires des médicaments, leurs coûts et la stigmatisation sociale associée au VIH-1 sont souvent la source d’une mauvaise observance des traitements. À la suite de leurs arrêts, on observe un rebondissement rapide de la charge virale dans les semaines suivantes [23].
4
1.1.2 Classification, génome et structure
Le VIH-1 est un rétrovirus de la famille des retroviridae et du genre lentivirus. Son génome est composé de deux copies identiques d’ARN de polarité positive de 9200 nucléotides. Le virion a une forme sphérique et une taille habituellement comprise entre 80 et 120 nm. Le VIH-1 est un virus enveloppé, enveloppe qu’il acquiert à partir de la cellule hôte lors de son bourgeonnement. Le génome du VIH-1 contient 9 gènes et code pour 15 protéines, ce qui en fait un rétrovirus complexe (Figure 2) [24]. En plus des gènes gag, pol et env qui sont présents chez tous les rétrovirus, le génome contient également 6 gènes régulateurs (tat et rev) et accessoires (nef, vif, vpr et vpu). Finalement, on retrouve deux séquences LTR (Long terminal repeat) non traduites impliquées dans la régulation de la transcription, dans l’encapsidation du matériel génétique, ainsi que dans l’intégration.
Figure 2: Représentation génomique du VIH-1 et le rôle des protéines virales.
Figure adaptée de Warner C. Greene [25]
Les gènes gag, pol et env codent pour des polyprotéines qui seront clivées en protéines matures. Tout d’abord, la polyprotéine Gag est clivée par une protéase virale lors de la maturation afin de former la protéine de matrice (MA; p17), de capside (CA; p24), de nucléocapside (NC; p7) et la protéine p6. La polyprotéine Pol est quant à elle clivée afin de former la protéase (PR), la transcriptase inverse (RT) et l’intégrase (IN). Finalement, la
5
polyprotéine Env (gp160) est clivée par une protéase cellulaire afin de former la gp120 (SU) et la gp41 (TM) (Figure 3). Les gènes tat et rev codent quant à eux pour des protéines régulatrices de mêmes noms. Ces dernières sont impliquées dans la régulation de la réplication virale. Finalement, les protéines Nef, Vif, Vpr et Vpu, codées respectivement par les gènes nef, vif, vpr et vpu sont des protéines accessoires qui ont pour rôle de favoriser la persistance virale, la réplication, faciliter l’infection, la transmission du virus ainsi que contrôler les facteurs de restriction cellulaire [26].
Figure 3: Représentation schématique d’une particule virale avec la localisation des protéines virales.
Figure adaptée du NIH (NIAID), How HIV causes AIDS, factsheets, 2014
1.1.3 Cycle de réplication 1.1.3.1 Évènements précoces
L'infection par le VIH-1 débute par l'interaction d'un trimère de la glycoprotéine de surface gp120 avec un récepteur CD4 membranaire [27, 28]. Le CD4 est une molécule de 55 kDa de la superfamille des immunoglobulines qui est normalement impliqué dans la reconnaissance du CMH de classe II d'une cellule présentatrice d'antigène, en assistant le
6
TCR. Elle est composée de 4 domaines extracellulaires (D1-D4), d’une courte région transmembranaire et d’un domaine cytoplasmique [29, 30]. Elle est présente notamment à la surface des lymphocytes T auxiliaires, des monocytes/macrophages et des cellules dendritiques. La liaison de la molécule CD4 est réalisée au niveau de son domaine D1 par la gp120 [31]. Cette dernière est composée de 5 régions variables (V1-V5) et de 5 régions constantes (C1-C5). La liaison de la gp120 s’effectue au niveau de la région V3 (Figure 4), qui a également un rôle important dans la détermination du tropisme du virus [32]. Ces molécules sont également associées, de façon non covalente, à un trimère de la glycoprotéine transmembranaire gp41 [33]. La gp120 et la gp41 sont des produits résultants du clivage protéolytique du précurseur gp160 produit lors de la transcription du gène env et sa traduction au niveau du réticulum endoplasmique. Ces deux glycoprotéines sont d’abord assemblées en hétérodimère avant d’être incorporées sous forme de trimère dans la membrane lors du bourgeonnement de la particule virale. Suite à cette première liaison, un premier changement de conformation est induit permettant la liaison du co-récepteur CCR5 ou CXCR4 [34-36]. Selon la nature du co-récepteur utilisé par le virus, on parlera respectivement de virus de tropisme R5 ou X4. À la suite de cette interaction, un second changement de conformation se produit permettant alors l’exposition et l’interaction du peptide de fusion gp41 avec la membrane cellulaire [37]. Il en résultera la fusion entre la particule virale et la membrane cellulaire ce qui permet l’entrée de la capside virale à l’intérieur du cytoplasme [38, 39]. Chez les macrophages, la cinétique d'infection est légèrement différente puisque le VIH-1 entrerait d'abord dans la cellule par endocytose médié par récepteurs avant de fusionner avec la membrane endosomale et libérer sa capside dans le cytoplasme cellulaire [40].
Figure 4: Interaction du récepteur CD4 avec la glycoprotéine gp120 au niveau de la région V3.
7
1.1.3.2 Évènements de biosynthèse
Suivant l’adhésion et la fusion de la particule virale avec la membrane cellulaire ou endosomale, il y a libération de la capside virale à l’intérieur du cytoplasme. La capside est une structure conique fermée composée d’environ 1500 monomères de la protéine de capside (CA). Elle contient les différentes enzymes de réplication virale, l’ARN viral et les protéines de nucléocapside. La séquence d’évènements exacte suivant l’entrée de la capside dans le cytoplasme, la transcription inverse et l’import nucléaire n’est pas encore bien définie. Cependant, différents modèles ont été proposés afin d’expliquer l’étape de la décapsidation [42, 43]. Il semblerait cependant que cette étape soit déclenchée à la suite du transfert du premier brin « First strand transfert » lors de la transcription inverse et que l’élongation du brin d’ADNc- ou l’initiation de la synthèse du brin d’ADNc+ soit responsable de changement au niveau de la rigidité de la capside entrainant l’ouverture de celle-ci [44, 45]. Cette décapsidation partielle de la capside, dans les heures qui suivent son entrée, impliquerait également la présence de la cyclophilin A [46] en interaction avec le domaine CA de la protéine Gag [43, 47]. La cyclophilin A aurait un rôle, entre autres, dans la régulation du processus de décapsidation, dans la migration et l’entrée du complexe de pré-intégration à travers la membrane nucléaire. Elle serait aussi impliquée dans la protection et l’activation de l’immunité innée par la cellule infectée [43]. Il y aurait également phosphorylation des protéines de matrice par une MAPK (Mitogen activated protein kinase) [48]. La décapsidation permet alors la libération du complexe de transcription inverse (RTC). Ce complexe est composé des deux copies du génome d’ARN viral, de l’ARNtLys3, de la RT, IN, MA, NC, Vpr ainsi que de plusieurs protéines de l’hôte
[25]. Suivant la fin de la transcription inverse, le RTC devient le complexe de pré-intégration (PIC). Ce dernier est composé de l’ADNdb viral, de l’intégrase, de protéines de matrice, de Vpr, de la RT et de la protéine HMGI(Y) (High-mobility group DNA-binding protein) [25, 49, 50]. Le PIC serait par la suite dirigé vers le noyau grâce à des signaux de localisation nucléaire (NLS) présents dans MA, IN et Vpr, ainsi que par ancrage au microfilament d'actine. Le PIC est ensuite transporté à l’intérieur du noyau au travers des pores nucléaires [51]. La protéine nucléaire LEDGF/p75 serait impliquée dans cette étape en agissant comme facteur d’ancrage à la chromatine ou comme récepteur du complexe de pré-intégration. Cette protéine permettrait l’attachement de l’intégrase à la
8
chromatine, ce qui favoriserait sa protection contre la dégradation en plus d’influencer le patron d’intégration viral [52]. Afin de s’intégrer correctement à l’intérieur du matériel génétique, l’intégrase clive les deux acides nucléiques aux extrémités 3’ du double brin d’ADN. Il y a par la suite clivage décalé de l’ADN cellulaire afin de permettre la liaison des extrémités 3’ virales aux extrémités 5’ cellulaires. L’ADN cellulaire simple brin est alors synthétisé en double brin ce qui explique la duplication de la cible autour de l’ADN proviral.
Figure 5: Représentation de la région 3’ LTR du VIH-1 et des principaux sites de liaison aux facteurs de transcription.
Tiré de Churchill, M.J. et coll. [53]
Il semblerait que le site d’intégration du virus à l’intérieur du génome cellulaire ne soit pas totalement aléatoire. En effet, l’intégration se produirait préférentiellement à l’intérieur de régions bien précises caractérisées par un état de transcription active [54, 55]. La région promotrice de la transcription se situe dans la région 3’ LTR (Figure 5). Dans cette région, on retrouve 3 sites de liaison du facteur de transcription Sp1 en tandem, un élément TATA et une séquence d’initiation, tous participant à la liaison du facteur d’initiation TFIID [56]. Ils participent également au positionnement de l’ARN polymérase II au niveau du site d’initiation et à la formation du complexe pré-initiation (Figure 6) [25]. À cette étape, la transcription des gènes viraux n’est pas très efficace, notamment à cause de la présence de facteur de transcription négatif (N-TEF) comme le DSFI (DRB-sensitivity inducing factor) et les NELF (negative-elongation factor). Suivant la liaison du facteur de transcription NF-κB et NFAT (Nuclear factor of activated T-cells), qui sont respectivement associés à une augmentation de l’initiation et de l’élongation des transcrits viraux, et à la formation d’un
9
complexe de transcription pleinement actif, il y a production de courts transcrits de 2 kb qui codent pour les protéines virales Tat, Rev et Nef. Une fois traduites, ces protéines retournent dans le compartiment nucléaire. Lorsque la protéine virale Tat se trouve en nombre suffisant, elle s’associe avec la sous-unité régulatrice du facteur de transcription P-TEFb (cycline T1), qui permet alors l’interaction de Tat avec la région TAR (transactivation response element) située en aval de la région promotrice. Le recrutement de ce complexe au niveau de la région LTR est également impliqué dans la phosphorylation du domaine C-terminal de l’ARN pol II, ainsi que des facteurs des N-TEF par la sous-unité catalytique cdk9 (Cyclin-dependent kinase 9). Ces étapes sont associées à une élongation productive permettant la production des transcrits viraux de 4 kb (Vif, Vpr, Vpu et Env) et de 9 kb (Gag, Gag-Pol et ARN génomique) [25, 56].
Figure 6: Assemblage du complexe pré-initiation et transcription médiée par Tat et NF-κB.
Tiré de Kam. J et coll. [56]
1.1.3.3 Évènements tardifs
La dernière étape du cycle de réplication du VIH-1 est l’assemblage et le relargage de nouvelles particules virales. Suivant l’export des ARNm codant pour Rev par la machinerie d’export normale de la cellule et l’import nucléaire subséquent de cette protéine grâce à un signal d’import, les ARNm partiellement épissés de 4 kb et 9 kb pourront être exportés dans le cytoplasme grâce à l’interaction de la protéine Rev avec la région RRE (Rev
response element). Cette région, présente dans tous les ARNm viraux incomplètement
épissés, est située dans la région de l’enveloppe. Ces éléments vont permettre la formation du précurseur Gag (PrGag), une polyprotéine de 55 kDa. Ce précurseur est composé de la protéine de matrice (MA) à l’extrémité N-terminale (NTD), de la protéine de capside (CA),
10
de la protéine de nucléocapside (NC) et de la protéine p6 à l’extrémité C-terminale (CTD) [57]. Le PrGag est par la suite transporté jusqu’à la membrane où la région N-terminale va se lier à la membrane plasmique typiquement dans des régions de microdomaines enrichies en cholestérol (Rafts) [58]. La présence d’un acide myristique, apporté par une modification co-traductionnelle à la glycine en N-terminale, est très importante pour la liaison du PrGag à la membrane de la cellule [58-61]. Les particules virales contiennent entre 1500 et 5000 copies de la protéine Gag et 10 à 20 fois moins de Gag-Pol [62-66]. Deux brins d’ARN viraux seront alors recrutés au niveau du site d’assemblage. Ces brins vont pouvoir s’associer avec le domaine NC de la polyprotéine Gag. L’ARNm codant pour le précurseur d’enveloppe est ensuite pris en charge au niveau du réticulum endoplasmique, ce qui va permettre la synthèse de la polyprotéine gp160. C’est au niveau de l’appareil de Golgi que la gp160 sera clivée en gp120 et gp41 avant d’être assemblée sous la forme de trimère et transportée jusqu’au site d’assemblage. Le relâchement de la particule virale fait finalement intervenir la machinerie cellulaire ESCRT (Endosomal sorting complexe
recquired for transport) [67]. La maturation du virion est accomplie par le clivage des
polyprotéines Gag et Pol par la protéase virale. Cette étape permet la formation des formes finales des protéines de CA, MA, NC ainsi que des enzymes IN, PR et RT étape essentielle à l’infectivité.
1.1.4. Immunopathogenèse du VIH-1 1.1.4.1. Transmission du virus
Chez les personnes infectées par le VIH-1, le virus se retrouve dans tous les liquides biologiques [68]. Cependant, c’est dans le sang, le sperme, le liquide pré-séminal, les sécrétions vaginales et le lait maternel que le virus a été démontré en concentration suffisante pour permettre sa transmission [69]. Le VIH-1 n’a pas la capacité d’infecter ni d’outrepasser les cellules épithéliales saines. Il doit donc se produire un bris physique dans cette barrière ou un contact direct du virus avec des muqueuses afin que l’infection puisse se produire. La concentration en virus dans le sang a été montrée jusqu’à 30 fois plus élevée que dans le sperme [70]. Cela implique que les risques de transmission sont beaucoup plus élevés lors de l’exposition à des produits sanguins. Il y a 3 modes de transmission
11
principaux du VIH-1 : 1) les relations sexuelles non protégées entre une personne séropositive et une personne saine; 2) par voie sanguine, notamment dans les cas de partage de seringues contaminées par des utilisateurs de drogue intraveineuse ou lors de transfusion de produits sanguins contaminés et; 3) par transmission verticale d'une mère séropositive à son enfant lors de la grossesse, de l’accouchement ou de l’allaitement. Bien que la voie de transmission sanguine soit la plus efficace, la transmission lors de rapports sexuels est la cause la plus fréquente. Le risque de séroconversion associé à la transfusion de produits sanguins contaminés est d’environ 90 % [71] alors que les risques associés à une piqûre accidentelle [72] ou lors d’injection avec une seringue contaminée [73] sont respectivement de 0,4 % et entre 0,63 et 2,4 %. Les risques de transmission suivant des rapports sexuels à risques se situent entre 0,04 % et 1,4 % en fonction de la voie d’entrée (vaginal ou anal) ainsi que du rôle du partenaire (réceptif ou insertif) [74]. Cependant, la présence d'autres ITS (Infection transmise sexuellement), de lésions au niveau des organes sexuels et la charge virale de la personne infectée sont autant des facteurs de risques pouvant augmenter les risques de transmission [75]. Finalement, les risques de transmission verticale de la mère à l’enfant lors de la grossesse, de l’accouchement ou de l’allaitement peuvent atteindre jusqu’à 45 %. Cependant, l’administration d’un traitement antirétroviral permet de réduire cette incidence à moins de 2 % [76].
1.1.4.2. Phases de l’infection
La chronologie de l'infection, allant de la première exposition jusqu’à l'établissement de l'infection tardive, est divisée en 7 phases (Figure 7). La première phase (Phase éclipse), qui correspond au moment compris entre l'infection de la première cellule et la détection du virus dans le sang, est estimée entre 7 et 21 jours [77]. Lors de cette phase, aucun signe clinique n'est observé. Les 6 phases suivantes sont appelées phase de Fiebig I-VI et elles sont caractérisées par l'apparition dans le plasma d'ARN viral (Fiebig I), de la protéine de capside virale p24 (Fiebig II), des premiers anticorps spécifiques au VIH-1 détectable par ELISA (Fiebig III) et par immunobuvardage de type Western (Fiebig IV). Lors de la phase V, un patron de bande spécifique est observé sans évidence de la présence de la polyprotéine p31. Lors de la phase VI, le patron de bande laisse voir la présence de cette
12
polyprotéine. La durée de chacune de ces phases est variable, mais elle se situe généralement entre 5 et 10 jours pour la phase I, 4 à 8 jours pour la phase II, 2 à 5 jours pour la phase III, 4 à 8 jours pour la phase IV et 40 à 122 jours pour la phase V.
Figure 7: Chronologie de l’infection par le VIH-1 divisée en fonction des 7 phases de Fiebig.
Tiré de Shaw GM et coll. [77]
1.1.4.3. Réservoirs viraux
De manière générale, les réservoirs viraux peuvent être décrits comme des types cellulaires susceptibles à l’infection par le VIH-1 ou des régions anatomiques hébergeant une réplication et une accumulation virale persistante, et ce, malgré la prise d’un traitement antirétroviral [78, 79]. Ces réservoirs sont retrouvés dans plusieurs tissus et certains sont localisés dans des régions anatomiques inaccessibles ou peu perméables aux traitements antirétroviraux, appelées sanctuaires viraux. Dans les réservoirs viraux, la transcription des différentes protéines virales peut être complètement silencieuse; on parlera alors d’infection latente ou présente de façon cryptique (chronique, mais de faible niveau). Les réservoirs les plus étudiés et les mieux décrits sont les lymphocytes T CD4+ mémoire. Cependant, il a été suggéré que plusieurs autres types cellulaires pourraient également servir de réservoirs [80]. Les macrophages sont considérés comme des réservoirs viraux potentiels en raison de leur susceptibilité à l’infection par le VIH-1, de leur ubiquité dans
13
tous les tissus et de leur capacité à se débarrasser de certaines drogues antirétrovirales. De manière inhérente, ces cellules sont plus résistantes que les lymphocytes T aux effets cytopathiques du virus. De plus, le VIH-1 est en mesure d’interférer avec les mécanismes responsables de l’apoptose chez les macrophages [81], favorisant ainsi l’hébergement du virus sur une plus longue période de temps. D’autres types cellulaires, comme les cellules dendritiques, sont capables de fixer le virus et le transporter au niveau des organes lymphoïdes [82], favorisant ainsi le contact entre le virus et les lymphocytes T auxiliaires.
1.2. Les macrophages
Les macrophages constituent un sous-groupe de cellules immunitaire associé à l'immunité innée, mais ils sont également importants dans l'établissement de l'immunité adaptative. Ce sont des cellules mononucléées qui possèdent une activité phagocytaire. Ils ont notamment pour rôle de nettoyer l'organisme des débris cellulaires, mais sont également impliqués dans l'établissement et la résolution de réponses inflammatoires [83] en participant au recrutement de cellules immunitaires, et ce, dans un contexte de protection contre les menaces exogènes. Ils sont également très importants dans le maintien de l'homéostasie tissulaire. En effet, plusieurs pathologies telles l’athérosclérose, l’Alzheimer, l’arthrite, le diabète et certains cancers ont été associés à un dysfonctionnement des macrophages [84-87].
Les macrophages proviennent de différentes sources au cours du développement et sont essentiellement divisés en deux grandes familles. Les macrophages sans précurseurs monocytiques sont généralement associés à l'établissement des macrophages tissulaires. Dans les premiers jours/semaines de l'embryogenèse, ces macrophages proviennent soit du sac vitellin ou du foie fœtal et sont établis au niveau des tissus avant la naissance [88]. Dans certains modèles murins, ces macrophages ont montré une capacité d'auto-renouvellement, assurant leur persistance au niveau des tissus. Chez les humains, cette capacité n'est pas très bien décrite. Il est plutôt pensé que la persistance des macrophages tissulaires est assurée par des macrophages ayant transité par une phase monocytique (MDM : macrophage dérivé de monocyte). Ce second type de macrophage, qui dérive des
14
monocytes, provient de la moelle osseuse après la naissance. Ces macrophages sont généralement associés à la réponse inflammatoire.
1.2.1. Les macrophages tissulaires
On distingue 3 origines distinctes des macrophages. La première est le sac vitellin qui est une structure formée des cellules de l’endoderme présente sur la face ventrale de l’embryon. Cette structure disparait après 5 à 8 semaines de développement. Ces macrophages, qui ne passent pas par le stade de monocyte, sont impliqués dans l’établissement des populations de macrophages tissulaires au niveau du cerveau (microglie), de la peau (cellules de Langerhans), du foie (cellule de Kupffer) et à un faible niveau, de l’intestin. Par la suite, la production des cellules immunitaires est assurée par le foie fœtal. Les macrophages produits à cette étape, également sans précurseurs monocytiques, participent à l’établissement des cellules résidentes dans le foie et à un plus fort niveau, dans l’intestin. Dans les dernières semaines précédant la naissance, la production des cellules immunitaires est transférée au niveau de la moelle osseuse.
Figure 8: Provenance des cellules immunitaires aux différents stades de développement.
15
Les cellules seront alors produites sous la forme de monocytes et suivant les signaux inflammatoires résultant de l’infection d’un tissu par exemple, migreront dans les tissus et se différencieront en macrophages afin d'exercer leurs fonctions (Figure 8).
1.2.2. Monocytes
Les monocytes sont des cellules de la branche innée du système immunitaire, ces dernières dérivent de précurseurs de la moelle osseuse. Dans une situation d’inflammation, des gradients de chimiokines comme CCL2/MCP-1 (monocyte chimoattractant protein-1) vont favoriser la migration des monocytes de la circulation sanguine vers les tissus inflammés. En fonction de la composition du microenvironnement tissulaire, les monocytes vont se différentier en macrophages afin de promouvoir soit une réaction pro-inflammatoire ou une réaction anti-inflammatoire, dans le but de favoriser la réparation des tissus. Les monocytes humains sont divisés en 3 populations caractérisées par leur expression du CD14 et du CD16 (FcγRIII) [89]. Les monocytes qui expriment le CD14, mais pas le CD16 (CD14++CD16-) sont dits des monocytes classiques. Ils sont retrouvés en plus grande quantité dans la circulation sanguine et ont pour fonction principale la phagocytose. Les monocytes exprimant peu le CD14, mais exprimant fortement le CD16 (CD14+CD16++) sont dits non classiques. Ces derniers possèdent des propriétés inflammatoires et de présentation d’antigènes. Finalement, le troisième type présente un phénotype intermédiaire. Il possède de hauts niveaux de CD14 et de faibles niveaux de CD16 (CD14++CD16+). Ce dernier possède à la fois des propriétés phagocytaires et inflammatoires. Il serait notamment impliqué dans la réponse inflammatoire en suivant les mêmes signaux que les monocytes classiques [90]. En plus de présenter des fonctions distinctes, ces populations de monocytes ne possèderaient pas toutes la même susceptibilité à l’infection par le VIH-1. Alors que les monocytes classiques sont relativement résistants à l’infection, les monocytes intermédiaires et non classiques y sont plus sensibles [91, 92]. De plus, lors de la progression de la maladie, il y a une augmentation des populations intermédiaires et non classiques. Ce débalancement des populations au détriment des monocytes classiques participerait au maintien de l’environnement inflammatoire observé chez les patients infectés, malgré la prise de traitements [92].
16
1.2.3. Les macrophages dérivés de monocytes
Les macrophages dérivés de monocytes (MDM) résultent de la différentiation des monocytes en macrophages suivant leur migration dans les tissus inflammés. Migrant en suivant des signaux chimiotactiques tels le CCL2/MCP-1 ou le CCL7/MCP-3 les monocytes vont rapidement se différencier en macrophages suivant l’activation des TLR, la reconnaissance de médiateur inflammatoire, de facteurs solubles (M-CSF) ou en fonction des conditions dans leurs environnements [90]. La différenciation est également dépendante de l’activation de l’autophagie [93].
1.2.4. La polarisation des macrophages
La polarisation des macrophages est un processus continu qui reflète la grande plasticité de ce type cellulaire. En fonction des signaux présents dans l’environnement immédiat des macrophages, ceux-ci acquièrent des caractéristiques différentes afin de répondre de manière optimale. Classiquement, on divise la polarisation des macrophages selon le type M1 ou M2, ce dernier pouvant également être divisé en au moins 3 types (M2a, b, c) se présentant sous la forme d’un spectre (Figure 9). Cependant, des analyses transcriptomiques ont identifié jusqu’à 10 groupes majeurs [94]. Les macrophages de type M1 ou classiques sont des macrophages présentant des propriétés pro-inflammatoires. Leur polarisation est d’ailleurs favorisée par la présence d’interféron-γ (IFN-γ), de LPS et de TNF. Ces macrophages sont caractérisés par l’expression de récepteur d’opsonisation comme le récepteur FcγRIII (CD16), la sécrétion de ROI/RNI et de hauts niveaux de cytokines pro-inflammatoires comme l’IL-12, IL-23 et IL-6. Les macrophages de type M2 ou alternatifs sont plutôt de type anti-inflammatoire. Parmi ceux-ci, les macrophages M2a sont induits par l’IL-4 et l’IL-13. Ils sont associés à une faible production de cytokines inflammatoires, ainsi qu’à l’établissement d’une réponse Th2, notamment par la sécrétion des chimiokines CCL17, 18, 22 et 24. Les macrophages M2c sont induits par l’IL-10 et le TGF-β. De plus, ils sécrètent du CCL18 et du CCL16. Ces chimiokines sont respectivement responsables du recrutement des lymphocytes T naïfs et des éosinophiles. Tout comme les macrophages M2a, les M2c sont généralement associés à des fonctions
17
d’immunorégulation. Les macrophages M2b sont différents dans le sens où ils conservent une production soutenue de cytokines pro-inflammatoires, tout en exprimant de hauts niveaux d’IL-10. Ils sont pour leur part associés à une suppression de la réponse immunitaire et au réarrangement tissulaire. Malgré ses classifications qui semblent rigides, il faut garder à l’esprit que la polarisation des macrophages représente un spectre et que les macrophages présentent une très grande plasticité face aux différents signaux qu’ils rencontrent. Les bases de ce spectre pourraient être divisées entre la défense de l’hôte, la régénération des tissus et la régulation immunitaire. C’est à ce niveau que se trouvent les classifications M1/M2. Cependant, par analogie au spectre des couleurs, la présence de signaux mixtes sera associée à des changements, par exemple, dans l’expression de récepteurs, dans les fonctions effectrices et dans la production de cytokines et de chimiokines [95].
Figure 9: Représentation du spectre de différenciation des macrophages en fonction des signaux retrouvés dans l’environnement.
18
1.3. Persistance du VIH
1.3.1. Latence dans les cellules immunitaires
1.3.1.1. Établissement de la latence dans les lymphocytes T CD4+
Les lymphocytes T CD4+ sont les cibles principales du VIH-1. Suivant leur infection et en fonction de l'état d'activation de la cellule, le matériel viral connaitra différentes fins. Dans le cas des lymphocytes T CD4+ quiescents, l'environnement cellulaire n’est pas favorable aux différentes étapes du cycle de réplication du virus. En effet, au repos, les lymphocytes T CD4+ possèdent de faibles niveaux de dNTP, un profil métabolique faible ne permettant pas la réalisation d'une RT efficace et au transport du complexe pré-intégration dans le noyau [97, 98]. De plus, à l'état quiescent, on retrouve des facteurs de restriction comme APOBEC3G et de faibles niveaux d’expression de facteurs cellulaires clés comme NF-κB, NFAT, AP1 et Sp1 [99]. Dans la majorité des cas, particulièrement chez les personnes qui ne suivent pas de traitements antirétroviraux, le matériel génétique viral se retrouve dans ces cellules sous la forme d'ADN double brin linéaire non intégré [97]. Ce type de latence est cependant peu susceptible d'être responsable de l'établissement de la latence à long terme puisque l'ADN non intégré est rapidement dégradé à l'intérieur des lymphocytes T CD4+, bien qu'elle puisse rester stable pendant près d'un 1 mois dans les cellules actives qui ne se divisent pas comme les macrophages [100-102]. Ces cellules constituent néanmoins un réservoir inductible puisque l'activation de ces cellules peut mener à l'achèvement du cycle de réplication viral [103]. On parlera ici de latence pré-intégration. L'infection des lymphocytes T CD4+ activés conduit généralement à la production et au relargage de nouvelles particules virales. Cependant, étant donné la nature même du système immunitaire, ces lymphocytes ont une durée de vie limitée, de l'ordre de quelques jours, avant d'être éliminés par le système immunitaire de l'hôte suivant les effets cytopathiques directs ou indirects du virus [104]. Il arrive cependant, dans de très rares cas, que l'infection se produise lors de la transition du lymphocyte d'une phase effectrice à un état mémoire [99, 105]. Lors de cette transition, le niveau d'activation de la cellule serait favorable aux étapes de réplication pré-intégration, mais non permissif à l'expression des gènes viraux [106]. Cet état de latence post-intégration est caractérisé par la présence au sein du génome cellulaire d'un provirus compétent à la réplication, mais d'une absence ou
19
un faible niveau de transcription des gènes viraux et de réplication virale. En conséquence, ces cellules ne sont pas susceptibles à la trithérapie combinée puisque cette dernière cible les étapes de réplication virale. La latence dans les lymphocytes T CD4+ est responsable, du moins en partie, de la persistance virale et du rebond de la virémie qui sont observés suivant l'arrêt des traitements antirétroviraux [107, 108].
1.3.1.2. Établissement de la latence dans les macrophages
Bien qu'il soit aujourd'hui démontré et bien accepté que les cellules myéloïdes comme les macrophages et les cellules dendritiques soient susceptibles à l'infection et à la production de particules virales infectieuses [109], peu d'informations sont actuellement disponibles sur l'établissement de latence dans ces types cellulaires. Certaines études semblent toutefois indiquer que les macrophages pourraient être infectés de façon latente et donc agir à titre de réservoirs [110, 111]. Dans une étude de 2017, réalisé par Honeycutt J.B. et coll. [112], un rebond de la virémie a été observé chez 33 % des souris MoM (Myeloid-only mice), 7 semaines suivant l’arrêt des traitements antirétroviraux. Ces souris humanisées ont la caractéristique de ne pas pouvoir soutenir le développement de cellules T humaines. Cela signifie que les macrophages pourraient être des réservoirs in vivo. Les macrophages possèdent plusieurs caractéristiques importantes qui feraient d'eux des réservoirs importants, notamment une résistance aux effets cytopathiques du virus, une longue demi-vie, une présence dans tous les tissus du corps et leur capacité à exporter les drogues antirétrovirales à l’extérieur de la cellule.
1.4. Stratégie « Shock and Kill »
L'élimination complète du VIH-1 chez les personnes infectées est à ce jour toujours impossible. Les principales barrières à cette éradication sont, dans un premier temps, l'établissement de réservoirs viraux. Ces réservoirs sont majoritairement composés de lymphocytes T CD4+ mémoires, infectés de façon latente et potentiellement d’autres types cellulaires comme les macrophages [22, 80, 111, 113]. De plus, la persistance virale au niveau de sanctuaires viraux [114], qui sont des régions anatomiques où les différentes
20
drogues antirétrovirales ne se retrouvent pas en quantité suffisante afin d’exercer leur effet optimal. Au cours des dernières années, différentes stratégies ont été élaborées afin de répondre à la problématique de la persistance virale observée dans différentes populations cellulaires, particulièrement les lymphocytes T CD4+ mémoires. Puisque les agents antirétroviraux ciblent les étapes du cycle de réplication virale et que lors d’une infection latente, il y a absence ou une très faible réplication virale, les traitements actuels et le système immunitaire de l'hôte ne sont pas en mesure d’assurer l’élimination de ces cellules [115, 116]. De plus, en ciblant les étapes de réplication, ces agents n’ont pas d’effets sur les cellules déjà infectées, mais préviennent plutôt les nouvelles infections. La stratégie « Shock and Kill » [117], proposée à la fin des années 1990, repose sur l’utilisation de petites molécules actives censées favoriser la réactivation virale dans les cellules infectées de façon latente en ciblant différents mécanismes de régulation cellulaire impliqués dans le maintien de la latence. Cette réactivation, accompagnée d’une augmentation de l’expression des gènes viraux, permettrait au système immunitaire de reconnaitre et d’éliminer ces cellules. En combinaison avec des traitements antirétroviraux modernes, cette stratégie pourrait permettre l’élimination des cellules infectées de façon latente, étape cruciale pour l’élimination complète du VIH-1 [117, 118].
1.5. Agents réactivateurs de la latence
Les agents réactivateurs de la latence sont des molécules qui possèdent des activités dirigées contre les mécanismes cellulaires impliqués dans le maintien de la latence [100]. Parmi ces mécanismes, on retrouve la condensation de la chromatine au niveau de la région promotrice du virus, la disponibilité des facteurs de transcription nécessaires à l’initiation et à l’élongation des transcrits viraux, ainsi que la disponibilité de facteurs comme P-TEFb (positive transcription elongation factor b), impliqué dans la transactivation par la protéine virale tat. La majorité de ces agents ont initialement été étudiés dans le cadre du cancer [119-121] ou de maladies neurodégénératives comme l’Alzheimer [122]. Certaines de ces molécules ont fait, ou font actuellement, l’objet d’études cliniques de phase I/II. Cependant, aucun des agents actuellement étudiés n’a démontré d’effet pour réduire la taille des réservoirs viraux in vivo [123]. L’utilisation de combinaison de drogues semble
21
cependant prometteuse [124]. Une des caractéristiques importantes de ces agents est leur capacité à induire la production virale dans les cellules infectées de façon latente sans conduire à une activation générale des lymphocytes T CD4+. L’activation générale des lymphocytes T CD4+, dans un contexte de réactivation de la latence, a été associée à une importante déplétion des lymphocytes T, une forte augmentation du relargage de médiateurs pro-inflammatoires et des effets toxiques importants [125].
1.5.1 Activateur de la voie PKC
Les protéines kinases C (PKC) font partie d’une famille d'enzymes qui exercent leur activité par la phosphorylation de groupements hydroxyle des résidus sérines et thréonines de différentes protéines [126]. Chez l’humain, on retrouve 12 isoformes qui sont divisées en 3 classes. Tout d’abord, les « Conventional PKC » (cPKC), qui comprennent les isoformes α, βI, βII et γ, nécessitent les cofacteurs Ca2+ et DAG (Diacylglycerol) pour leur
activation. Les « Novel PKCs » (nPKCs), qui comprennent les isoformes δ, ε, ε’, θ, η et µ, ne nécessite que le DAG, alors que l’activation des « atypical PKCs » (aPKC) ζ et λ/ι, sont indépendantes de ces 2 cofacteurs [127, 128]. Ces enzymes sont impliquées dans de nombreuses fonctions, dont l’apoptose [129], la prolifération [128] et la différenciation de cellules effectrices. Cette famille d’enzymes a fait l'objet d'études intensives, particulièrement dans le cadre du cancer où une expression anormale de PKC a été associée au développement de cancer dans de nombreux tissus et organes [128].
1.5.1.1. PKC et VIH-1
Dans le contexte du VIH-1, l’activation de la voie PKC par des antagonistes spécifiques conduit à la phosphorylation de la protéine inhibitrice IκBα, puis sa dégradation par le protéasome [130]. La dégradation de IκBα libère NF-κB, un facteur de transcription clé dans l’établissement de la réponse inflammatoire. Suite à son activation, ce facteur migre au niveau du noyau où il peut interagir avec les sites de liaisons spécifiques à NF-κB présents au niveau de la région LTR virale en 5’. La liaison de ce facteur dans la région promotrice du VIH-1 est associée à une augmentation du niveau de transcription virale.
22
Cependant, bien que l’utilisation de ces agents ait été associée à une activation de la transcription dans différents modèles cellulaires [131-133], aucune donnée concernant la diminution des réservoirs viraux n'a été rapportée in vivo [134, 135].
1.5.1.2. Prostratin
La prostratin (13-O-acetyl-12-deoxyphorbol) est un activateur de la voie PKC de la famille des « esters de phorbol ». Elle a été isolée pour la première fois en 1976 à partir d’une plante de la famille des Thymelaeaceae [136]. La structure de cette molécule permet de mimer l’action du DAG, cofacteur très important dans l’activation de la voie PKC [137]. Contrairement à plusieurs membres de la famille des activateurs de la voie PKC, la prostratin n’a pas d’effet carcinogène. Dans le contexte du VIH-1, la prostratin a été montrée comme inhibiteur de l’infection, particulièrement en régulant à la baisse l’expression des récepteurs du VIH-1 par activation de la voie PKC. La prostratin favorisait également la réactivation virale en induisant les facteurs de transcriptions NF-κB et Sp1 [138].
1.5.1.3. Bryostatin-1
Parmi les différents agonistes de la voie PKC, la bryostatin-1, une lactone macrocyclique initialement isolée de l’invertébré marin Bugula neritina [139], a fait l’objet de plusieurs études [139]. Au départ étudié dans le domaine de l’oncologie, cette molécule a été étudiée dans près de 40 études cliniques de phase 1 et 2 dirigées contre plus de 20 types de cancer. Malheureusement, aucune de ces études ne s’est révélée fructueuse. Des études pour le traitement de différentes maladies du système nerveux central [140], dont l’Alzheimer, ont également été réalisées. Finalement, la bryostatin-1 a été étudiée dans le contexte de la réactivation de la latence du VIH-1 [134]. L’étude de phase 1 (NCT 02269605), terminée en 2015, a permis de démontrer la sécurité d’une administration de bryostatin-1 allant jusqu’à 20 µg/m2. Malheureusement, à cette concentration, aucun effet sur l’activation de
la voie PKC, ni sur la réactivation du VIH-1 n’a été observé. Dans la branche 20 µg/m2, la concentration plasmique était inférieure à 50 pg/ml. La bryostatin-1 a cependant démontré
23
des effets néfastes in vitro sur l'intégrité de la barrière hématoencéphalique (BBB : Blood brain barrier). Elle favoriserait l'adhésion et la transmigration de nombreux types cellulaire au niveau du système nerveux central [141]. Cette augmentation du trafic cellulaire au niveau de la barrière hématoencéphalique pourrait favoriser l’établissement de l’infection au niveau du complexe cérébral. De plus, l’augmentation de la perméabilité de la BBB pourrait être associée avec une augmentation de l’inflammation locale et ainsi favoriser le développement ou l’accélération de maladies neurodégénératives [141].
Plusieurs études réalisées sur des lignées modèles de la latence montrent que la bryostatin-1 et plusieurs autres analogues conduisent à une augmentation de la transcription des gènes viraux [142, 143] en plus de diminuer l’expression du CD4 à la surface des cellules [142, 144]. Cependant, aucune évidence concernant la diminution des réservoirs viraux in vivo n’a été observée [145].
1.5.2 Inhibiteur des histones déacétylases
Les inhibiteurs des HDAC (histone déacétylase) (iHDAC) sont des molécules qui exercent leur activité en inhibant les HDAC (section 1.5.2.1). Ils sont divisés en 4 catégories majeures. Tout d’abord, les acides aliphatiques à courte chaine, comme l’acide valproïque, les acides hydroxamiques comme le SAHA et le panobinostat, les benzamides et les tétrapeptides cycliques et depsipeptides comme la romidepsin [146].
1.5.2.1. HDAC
La transcription génique est un processus hautement régulé qui repose en grande partie sur l'architecture chromosomique de la cellule dans le temps, ainsi que sur la disponibilité des facteurs et des cofacteurs nécessaires à la transcription. L'architecture chromosomique locale est déterminée par l'état de compaction du matériel génétique. Cette dernière est régulée par la présence de modifications post-traductionnelles au niveau des histones, qui sont des protéines nucléaires associées à la compaction du matériel génétique. Ces modifications peuvent se présenter sous la forme de phosphorylation, d'ubiquitination, de
