UNIVERSITE DE SHERBROOKE
PHARMACOLOGIE ET PHYSIOPATHOLOGIE DE L'ENDOTHELINE-1 (1-31) ET DU RECEPTEUR ETB
DANS LE SYSTEME CARDIOVASCULAIRE
par
JEAN-CLAUDE HONORE Departement de pharmacologie
These presentee a la Faculte de M^decine et des Sciences de la Sante" en vue de l'obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)
1*1
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UNIVERSITE DE SHERBROOKE
PHARMACOLOGIE ET PHYSIOPATHOLOGIE DE L'ENDOTHELINE-1 (1-31) ET DU RECEPTEUR ETB DANS LE SYSTEME CARDIOVASCULAIRE
par
JEAN-CLAUDE HONORE Departement de pharmacologic
These presentee a la Faculty de Medecine et des Sciences de la Sante en vue de l'obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)
RESUME
Plusieurs Evidences experimentales suggerent que le systeme endotheiine (ET) constitue une cible fbirapeutique de choix dans diverses pathologies cardiovasculaires. Cependant, si les fonctions du recepteur ETA semblent bien decrites et bien definies, celles impliquant le recepteur ETB en physiologie et
en pathologie demeurent moins caracterisees.
L'ET-1 (1-31) est une nouvelle isoforme de l'ET-1 qui, selon certaines donnees in vitro, possede une activity intrinseque et agit comme un agoniste s&ectif du recepteur ETA. Intrigues par cette perspective,
nous avons realise la caracterisation pharmacologique in vivo et in vitro de l'ET-1 (1-31) en utilisant le cobaye, un modele animal dans lequel les composantes ETA et ETB dependantes sont bien etablies. Nous
avons montre que les effets constricteurs vasculaires et bronchiques de l'ET-1 (1-31) sont respectivement sensibles aux actions du CGS 35066 et du thiorphan, deux inhibiteurs de 1'enzyme de conversion de l'endotheiine et de l'endopeptidase neutre 24.11 (NEP 24.11), respectivement. De plus, nous avons constate" que la relSche d'&cosanoi'des induite par l'ET-1 (1-31) dans le poumon perfuse" est abolie par le BQ-788, mais pas par le BQ-123, deux antagonistes respectivement des r^cepteurs ETB et ETA. Forts de
ces evidences, nous avons ensuite montre chez le lapin que le BQ-788 augmente la rdponse pressive de l'ET-1 (1-31) de facon similaire a celle observ6e avec la bigET-1, sugg6rant ainsi que l'ET-1 (1-31) requiert une conversion pour etre actif. Nous avons finalement demontre que l'ET-1 (1-31) est effectivement converti in vivo et g&iere le peptide biologiquement actif ET-1, majoritairement via Taction de la NEP 24.11.
Par ailleurs, dans le, contexte de la dysfonction endothelial, ou Ton observe une reduction de la synthese ou de la biodisponibilite du monoxyde d'azote, nous avons recherche" si le recepteur ETB present
a la surface des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) pouvait jouer un r61e, direct ou indirect, dans la reduction des effets vasoconstricteurs de l'ET-1 endogene. Chez le hamster sain, nous avons tout d'abord montre" que le recepteur ETB present a la surface des CMLV est fortement implique dans la
clairance plasmatique de l'ET-1 endogene. Une alteration chronique de ce processus avec un antagoniste non-peptidique des r^cepteurs ETB induit en effet une augmentation des taux d'ET-1 circulants associee au
d£veloppement d'un etat hypertensif chez l'animal anestbisie ou eveilie. Nous avons ensuite rente d'evaluer une approche therapeutique priviiegiant la strategie d'un antagonisme epargnant le recepteur ETB en utilisant les hamsters cardiomyopathiques Bio 14.6 et en les traitant durant 9 semaines avec des
antagonistes non-peptidiques des recepteurs ETA et ETB, seuls ou combines. Par diverses approches
experimentales, nous avons montre" qu'un blocage seiectif ETB ou non-s&ectif des recepteurs ETA/ETB est
a eviter, notamment pour limiter les effets vasoconstricteurs peripheriques de l'ET-1 endogene.
L'ensemble de nos resultats suggere done que le recepteur ETB endothelial, via la reliche de
monoxyde d'azote, joue un role primordial dans la regulation des effets presseurs non seulement de l'ET-1, mais aussi de ses precurseurs : bigET-1 et ET-1 (1-31). De plus, nous suggerons que le recepteur ETB,
present a la surface des CMLV, est tres important pour que s'effectue efficacement la clairance plasmatique de l'ET-1 en situation physiologique et pathologique. Nos travaux justifient par consequent une approche therapeutique qui priviiegierait l'utilisation d'antagonistes epargnant le recepteur ETB pour
lutter contre des pathologies cardiovasculaires impliquant une augmentation de la production d'ET-1, m§me en situation de dysfonction endotheiiale.
Science sans conscience n'est que mines et larmes. Alpha Blondy (adapte de Rabelais)
Y'a des cigales dans la fourmiliere, Et c'est pour 5a que j 'espere...
La Rue K6tanou
To'u fenua ti'ai mai ia'tu (My island home is awaiting for me) Bobby Holcomb & Angelo Neuffer
TABLE DES MATIERES
INTRODUCTION 1
l.METABOLISMEDE L'ET-1 5
1.1 Premieres etapes de maturation 7
1.2 Enzymes de conversion de l'endotheline 9
1.3 Endopeptidaseneutre24.11 13
1.4 M&alloprot£ases de la matrice 14
1.5 Agents pharmacologiques contrdlant le metabolisme de l'ET-1 15 2. ET-1 (1-31) : UN NOUVEAU PROTAGONISTE DU SYSTEME
ENDOTHELINE 19
2.1 Origine de l'ET-1 (1-31) 19
2.2 Actions biologiques de l'ET-1 (1-31) 22
2.3 ET-1 (1-31): un agoniste intrinseque ? 24
3. LES RECEPTEURS ETA ET ETB DE L'ET-1 26
3.1 Propri&ds biochimiques 28
3.2 Propri&£s pharmacologiques 34
4. MODULATION DU TONUS VASCULAIRE PAR L'ET-1 40
4.1 Contribution contractile des r£cepteurs ETA et ETB 40 4.2 Importance de la clairance de l'ET-1 plasmatique 41 4.3 Importance des autacoi'des libels par le r6cepteur ETB endothelial 44 5. IMPLICATIONS DE L'ET-1 DANS LES PHYSIOPATHOLOGIES
PULMONAIRES, RENALES ET CARDIAQUES 46
5.2.ET-1 et reins 50
5.3.ET-1 etcceur 53
6. OBJECTIFS DU TRAVAIL DE THESE 56
RESULTATS 60
MANUSCRIT N°l : Reponses vasopressives et broncho-pulmonaires induites
parl'ET-1 (l-31)chezlecobaye 61
MANUSCRIT N°2 : L'endotheline-1 (1-31) est un intermediate dans la
production de l'endothdline-l apres radminitration de big endotheline-1 in vivo 99 MANUSCRIT N°3 : L'antagonisme concomitant des r^cepteurs ETB de
l'endotheline presents sur les cellules endotheliales et musculaires lisses
vasculaires induit une hypertension chez le hamster 128
MANUSCRIT N°4 : Un blocage non-selectif des nScepteurs ETA/ETB augmente lapression sanguine syst&nique des hamsters cardiomyopathiques BIO 14.6 162
DISCUSSION 197
1. BIOSYNTHESE DE L'ET-1 ET CONTRIBUTION DE L'ET-1 (1-31) 200 2. ROLE DU RECEPTEUR ETB DANS LA MODULATION DES
EFFETS VASCULAIRES ET BRONCHO-PULMONAIRES DE L'ET-1
ETDE L'ET-1 (1-31) 206
3. UN ROLE PHYSIOPATHOLOGIQUE POUR L'ET-1 (1-31) ? 215
4. RECEPTEUR ETB ET INSUFFISANCE CARDIAQUE 220
CONCLUSION ET PERSPECTIVES 229
REMERCIEMENTS 236
iii
LISTE DES PUBLICATIONS
Pour cette these:
1 HONORE, J.-C, PLANTE, M., BKAILY, G., RAE, G.A. et
D'ORLEANS-JUSTE, P. (2002). Pressor and pulmonary responses to ET-1 (1-31) in guinea-pigs. Br J Pharmacol. 136: 819-828.
2 FECTEAU, M.-H., HONORE, J.-C, PLANTE, M., LABONTE, J., RAE, G.A. et
D'ORLEANS-JUSTE, P. (2005). Endothelin-1 (1-31) is an intermediate in the production of endothelin-1 after big endothelin-1 administration in vivo. Hypertension. 46: 87-92.
3 HONORE, J.-C, FECTEAU, M.-H., BROCHU, I., LABONTE, J., BKAILY, G. et
D'ORLEANS-JUSTE, P. (2005). Concomitant antagonism of endothelial and vascular smooth muscle cell-ETB receptors for endothelin induces hypertension in the hamster. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 289: H1258-H1264.
4 HONORE, J.-C, CARRIER, E., FECTEAU, M.-H., TIRAPELLI, C.R., BKAILY,
G. et D'ORLEANS-JUSTE, P. Non-selective ETA/ETB receptor blockade increases systemic blood pressure of Bio 14.6 cardiomyopathic hamsters, (manuscrit en preparation).
Autres publications au cows des etudes doctorales :
1 TIRAPELLI. C.R., FECTEAU, M.-H., HONORE, J.-C, LEGROS, E., GOBEIL, F. et D'ORLEANS-JUSTE, P. (2006). Enzymatic pathways involved in the generation of endothelin-l(l-31) from exogenous big endothelin-1 in the rabbit aorta. Br J Pharmacol. 148: 527-535.
2 HONORE, J.-C, FECTEAU, M.-H., WESSALE, J.L. et D'ORLEANS-JUSTE, P. (2004). Effects of selective and non-selective endothelin receptor blockade on ET-1-induced pressor response in the hamster. J Cardiovasc Pharmacol. 44: S68-S71.
3 D'ORLEANS-JUSTE, P., PLANTE, M, HONORE, J.-C, CARRIER, E. et LABONTE, J. (2003). Synthesis and degradation of endothelin-1. Can J Physiol Pharmacol. 81:503-510.
4 D'ORLEANS-JUSTE, P., HONORE, J.-C, CARRIER, E. et LABONTE J. (2003). Cardiovascular diseases: new insights from knockout mice. Curr Opin Pharmacol. 3: 181-185.
5 HONORE, J.-C, PROTEAU, C. et D'ORLEANS-JUSTE, P. (2002). Endothelin B receptors located on the endothelium provide cardiovascular protection in the hamster. Clin Sci (Lond). 103: 280S-283S.
V
6 PLANTE, M, HONORE, J.-C, NEUGEBAUER, W. et D'ORLEANS-JUSTE, P. (2002). Endothelin-1 (1-31) induces a thiorphan-sensitive release of eicosanoids via ET(B) receptors in the guinea pig perfused lung. Clin Sci (Lond). 103: 128S-131S.
7 D'ORLEANS-JUSTE, P., LABONTE, J., BKAILY, G., CHOUFANI, S., PLANTE, M. et HONORE, J.-C. (2002). Function of the endothelin(B) receptor in cardiovascular physiology and pathophysiology. Pharmacol Ther. 95: 221-238.
8 LABONTE, J., BROCHU, I., HONORE, J.-C. et D'ORLEANS-JUSTE, P. (2001). Role of ETB and B2 receptors in the ex vivo platelet inhibitory properties of endothelin and bradykinin in the mouse. Br J Pharmacol. 132: 934-40.
Publications a la maitrise :
1 HONORE, J.-C, ROBERT, B., VACHER-LAVENU, M.-C, CHAPRON, C, BREUILLER-FOUCHE, M. et FERRE, F. (2000). Expression of endothelin receptors in human myometrium during pregnancy and in uterine leiomyomas. J Cardiovasc Pharmacol. 36: S386-389.
2 BREUILLER-FOUCHE, M., HONORE, J.-C, ROBERT, B., FOURNIER, T., VACHER-LAVENU, M.-C, CHAPRON, C, DUBUISSON, J.-B. et FERRE, F. (1999). [Endothelin receptors in benign human tumours of uterine muscle]. Bull Cancer. 86: 773-778.
3 BENASSAYAG, C, LEROY, M.-J., RIGOURD, V., ROBERT, B., HONORE, J.-C, MIGNOT, T.-M., VACHER-LAVENU, M.-J.-C, CHAPRON, C et FERRE, F. (1999). Estrogen receptors (ERalpha/ERbeta) in normal and pathological growth of the human myometrium: pregnancy and leiomyoma. Am J Physiol Endocrinol Metab. 276: Ell 12-E1118.
4 HONORE, J.-C. (1998). Expression des endothelines et de leurs r^cepteurs dans le myometre humain. Metnoire de maitrise (Diplome d'Etudes approffondies "Endocrinologie et interactions cellulaires") Faculte de medecine Parissud -University de Paris XL
LISTE DES FIGURES
vn
Figure 1: Representation schematique des voies de biosynthese et
de degradation de l'ET-1 6
Figure 2 : Representation schematique de 1'enzyme de conversion de
l'endotheiine-1 (ECE-1) 10
Figure 3 : Structures chimiques d'inhibiteurs selectifs ou non seiectifs de
l'ECEetderendopeptidaseneutre24.11 17
Figure 4 : Representation schematique de la biosynthese de l'ET-1 (1-31) a
partir de la bigET-1 humaine 20
Figure 5 : Representation schematique du recepteur ETB humain 27 Figure 6 : Representation schematique des voies de signalisation activees
par les recepteurs ETA et/ou ETB de l'ET-1 29
Figure 7 : Representation schematique des voies d'activation induites par l'ET-1 et conduisant a la contraction ou a la relaxation
des cellules musculaires lisses vasculaires 30
Figure 8 : Representation schematique du devenir des recepteurs ETA et
ETB apres leur internalisation 33
Figure 9 : Representation schematique de la conversion de la bigET-1
humaine en ET-1 etenET-1 (1-31) 205
Figure 10 : Representation schematique des principaux resultats obtenus
Figure 11 : Representation schematique des principales implications
d^coulant des r^sultats obtenus au cours de ces travaux de these,
ix LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1: Liste non exhaustive des inhibiteurs selectifs et non-selectifs de l'endopeptidase neutre 24.11 (NEP) et de l'enzyme de
conversion de l'endotheline-1 (ECE) 16
Tableau 2 : Agonistes selectifs du r^cepteur ETB ...37
Tableau 3 : Liste non exhaustive des antagonistes selectifs et non-selectifs
des r£cepteurs ETA et ETB utilises en recherche fondamentale 38
Tableau 4 : Liste non exhaustive d'antagonistes selectifs et non-selectifs
LISTE DES ABREVIATIONS ET SYMBOLES ACE Angll ANP AUC b.i.d. bigET-1 BPA BW C412 CHF CMH COX CTL CVP DAG DBP DMSO E651 EARTH ECE ECELI EIA ENABLE eNOS ET GAPDH GRK-2 H591 HL HR ICC IP3 IR
Enzyme de conversion de l'angiotensine Angiotensine II
Facteur natriuretique de l'oreillette Area under the curve
Twice a day big endothelin-1
Blood Pressure Analyzer Body weight
Cysteine412
Congestive heart failure Cardiomyopathic hamsters Cyclo-oxygenase
Control
Central venous pressure Diacyglycerol
Diastolic arterial blood pressure Dimethyl sulphoxide
Glutamate651
Endothelin A Receptor Antagonist Trial In Heart Failure Enzyme de conversion de l'endotheline
Endothelin-converting enzyme-like I Enzyme immunoassay
Endothelin Antagonist Bosentan For Lowering Cardiac Events in Heart Failure
Enzyme synthetisant le monoxyde d'azote Endotheline
Glyceraldehyde-3 -phosphate-dehydrogenase
Kinase des r^cepteurs couples aux proteines G de type 2 Histidine591
Histydil-leucine Heart rate
Insuffisance cardiaque chronique Inositol triphosphate
XI KW/BW Lung/BW LV +dP/dt LV/BW LV-EDP LVSP MAP MAPK MMP-2 NEP 24.11 NO NO2/NO3 PBS PDZ PE-50 PGD2 PGEi PGI2 PI3K PIP PKC PLA2 PLC PLD PP ppET-1 PR RIA RTK RV/BW SBP Ser SGH SPC-tau TFA
Kidney weight over body weight ratio Lung weight over body weight ratio
Indice de contractilite cardiaque du ventricule gauche Left ventricle weight over body weight ratio
Pression de fin de diastole du ventricule gauche Left ventricular systolic pressures
Mean arterial blood pressure Mitogen-activated protein kinase M&alloprot£ase de la matrice-2
Endopeptidase neutre 24.11 ou n^prilysine Monoxyde d'azote
Nitrite/nitrate levels Phosphate buffered saline
Postsynaptic density of the Drosophila septate junction protein Discs-large, and the epithelial tight junction protein ZO-1
Polyethylene catheters Prostaglandin D2 Prostaglandin Ei Prostacycline
Phosphatidylinositol-3-phosphate Pression insufflatoire pulmonaire Proline kinase C Phospholipase A2 Phospholipase C Phospholipase D Pulse pressure preproET-1 Phosphoramidon Radioimmunoassay R^cepteur tyrosine kinase
Right ventricle weight over body weight ratio Systolic arterial blood pressure
Serine
Syrian golden hamsters Subtilisine des pro-proteines-Isovolumetric relaxation Trifluoroacetic acid
TGF-p Facteur de croissance transformant-beta Thiorphan
TrP Tryptophane
TxA2 Thromboxane A2
V SMC Vascular smooth muscle cells Ion zinc
Selon la base de donn^es MeSH de la "National Library of Medicine" des Instituts Nationaux de la Sante des Etats-Unis, la pharmacologic peut etre definie comme l'etude de l'origine, de la nature, des proprietes et des actions des medicaments. Cette definition inclut aussi l'etude des effets des medicaments sur les organismes vivants. Dans un sens plus large i.e., selon le dictionnaire Le petit Larousse illustre, la pharmacologic repr6sente l'etude scientifique des medicaments et de leur emploi.
Dans le laboratoire du Dr P. D'Orleans-Juste, les travaux de recherche sont axes vers une meilleure comprehension des m^canismes relies a la physiologie, la physiopathologie et de facon importante, a la pharmacologic de l'endothelium cardiovasculaire. L'endothelium constitue en effet cette couche monocellulaire qui tapisse la paroi interne des vaisseaux sanguins et des cavites cardiaques. Depuis plusieurs armies, l'importance de l'endothelium a ete mise en evidence a travers la decouverte de plusieurs substances produites par les cellules endotheiiales et qui, une fois liberees, peuvent agir de facon autocrine ou paracrine pour moduler les fonctions des cellules environnantes. Par exemple, Tun des facteurs synthetises par l'endothelium et qui a ete le plus mediatise a ce jour, est sans doute le monoxyde d'azote (NO), dont les mecanismes de production, d'action et de regulation sur les fonctions cardiovasculaires ont ete mis en evidence par les Drs Furchgott, Ignarro et Murad, leur valant le prix Nobel de medecine en 1998.
Dans le cadre des travaux de cette these, nous nous sommes interesses a la pharmacologic des endotheiines (ETs), une famille d'autacoi'des dont l'une des sources majeures de production est constituee par les cellules endotheiiales. Ce projet s'est done concentre sur l'etude pharmacologique in vivo des recepteurs de l'ET-1 et des enzymes impliquees dans sa formation.
3
C'est en 1988 que Yanagisawa et al (1988) ont rapporte l'existence de l'ET, un peptide de 21 acides amines isoie a partir du sumageant de cellules endothelials d'aorte porcine en culture. De par ses puissantes propri&es vasopressives et ses effets soutenus dans le temps, la decouverte de l'ET a suscite un fort engouement dans la communaute scientifique. De nombreux travaux ont par consequent 6te entrepris dans le but de determiner les voies de biosynthese, les fonctions physiologiques et les alterations physiopathologiques dans lesquelles l'ET pouvait 6tre implique afin, bien evidemment, de pouvoir contrecarrer les effets pathologiques eventuels en employant des agents pharmacologiques.
En 1989, 2 autres isotypes de l'ET ont ete clones chez l'humain (INOUE et al, 1989). Ceux-ci ont ete appetes ET-2 et ET-3, en reference a l'ET-1 initialement rapport6e par Yanagisawa et al. (1988).
Par la suite, en 1990, 2 equipes ont simultan£ment clone et caracterise" les 2 recepteurs a sept domaines trans-membranaires couples aux prolines G specifiques des ETs (ARM et al, 1990; SAKURAI et al, 1990). Ces derniers ont ete denommes r^cepteurs ETA et ETB. Un troisieme recepteur appeie ETc a 6t6 mis en evidence, mais ce dernier n'a ete retrouve que chez le xenope (KARNE et al, 1993).
Enfin, au debut des annees 1990, la caracterisation pharmacologique de 1'enzyme responsable de la production de l'ET-1 biologiquement active a ete realisee (IKEGAWA et al, 1990; OHNAKA et al, 1991). Cette enzyme a ete nomme enzyme de conversion de l'ET (ECE), par analogie au processus de biosynthese de l'angiotensine-II (TURNER & HOOPER, 2002). Neanmoins, comme nous le verrons plus tard durant l'introduction du present document, les travaux de caracterisation moieculaire,
biochimique et pharmacologique de l'ECE ont mene" a la ctecouverte de 10 formes difftrentes d'ECE.
A travers la presente these, la voie de biosynthese classique de l'ET-1 ainsi que les caract£ristiques pharmacologiques d'un nouvel isotype de l'ET-1 compost de 31 acides amines et denomme' ET-1 (1-31) (NAKANO et al, 1997) seront dans un premier temps d£crites. Dans un deuxieme temps, nous exposerons les principales caract£ristiques biochimiques et pharmacologiques des r£cepteurs ETA et ETB de l'ET-1, en insistant particulierement sur les m^canismes d'attenuation des effets vasculaires de l'ET-1 m£di£s par le r^cepteur ETB. L'ensemble de ces donn^es nous permettra d'une part, de mettre en evidence les elements qui nous ont amends a postuler l'existence d'une voie alternative de biosynthese de l'ET-1 a partir de l'ET-1 (1-31) et, d'autre part, de mettre en evidence les elements qui nous ont amenes a postuler qu'un antagonisme du r£cepteur ETB pourrait induire des effets physiopathologiques neTastes.
Par consequent, en pr&entant les resultats obtenus au cours de nos travaux, nous tenterons de d^montrer que le recepteur ETB, de par sa double localisation vasculaire sur les cellules endotheliales et les cellules musculaires lisses, diminue les effets pharmacologiques de l'ET-1 (1-31) mais aussi les effets physiologiques et pathologiques de l'ET-1 in vivo, via des m^canismes de regulation dififerents impliquant notamment le monoxyde d'azote et la clairance de l'ET-1 plasmatique.
5 1. Metabolisme de l'ET-1
Les voies de synthese et de degradation de l'ET-1 ont &e bien 6tudiees et sont relativement complexes. D'un point de vue anatomique, l'ET-1 est largement distribue" avec, en conditions physiologiques, une expression plus elev£e au niveau de la medulla resale et des poumons, tandis qu'au niveau de l'aorte, du cceur, du cerveau ou du foie, l'ET-1 est retrouve" en moins grande quantite (DOUSSET & JACOB, 1992). Les enzymes impliqu^es dans la synthese de l'ET-1 sont ainsi pr^sentes dans de nombreux tissus et organes. N6anmoins, le schema de biosynthese demeurant relativement similaire quelque soit le type cellulaire etudie, nous allons principalement nous concentrer au cours des prochaines sections, aux enzymes exprim£es au niveau des cellules originellement rapport^es pour synthesiser l'ET-1 i.e., les cellules endotheliales vasculaires (YANAGISAWA et al. ,1988).
Tout d'abord, il est important de savoir qu'au niveau de la cellule endoth&iale, la s^cr^tion d'ET-1 est polarised. En effet, cette s£cr&ion se fait majoritairement vers la face basolat&ale de la cellule (WAGNER et al, 1992). Par ailleurs, l'ET-1 peut 6tre soit continuellement relache" par les cellules endoth&iales vasculaires, soit relache" en reponse a des stimuli physiologiques ou pathologiques a partir des granules de stockage sp^cifiques de ces cellules i.e., les corps de Weibel-Palade (RUSSELL & DAVENPORT, 1999).
L'endopeptidase neutre 24.11 (indiquee en rouge dans la figure) est responsable de la degradation de l'ET-1. L'endopeptidase neutre 24.11 (indiquee en gris dans la figure) peut aussi Stre impliquee dans la formation d'ET-1 a partir de la bigET-1 (LEBEL et ah, 1996). SPC-1 et -2: Convertases de type subtilisine des pro-proteines-1 et -2 ; MMP-2 : Metalloprotease de la matrice-2 ; K: Lysine ; R: Arginine ; W : Tryptophane ; V : Valine.
1.1 Premieres etapes de maturation
La preproET-1, un peptide de 212 acides amines, constitue le premier produit g&i£r£ apres 1'activation du gene codant pour l'ET-1. Ce pr£curseur est transform^ en proET-1 via l'activite enzymatique de la peptidase signal. La furine, appetee aussi convertase de type subtilisine des pro-proteines-1 (SPC-1), est une en2yme de maturation de la famille des subtilisines presente dans les cellules endotheliales (LAPORTE et al, 1993). C'est elle, ainsi que l'isoforme SPC-7, qui prendra le relais dans le processus de maturation de la proET-1. Par consequent, SPC-1 et SPC-7 seront les enzymes responsables de la formation de la bigET-1 a partir de la proET-1 (KIDO et al, 1997; BLAIS et al, 2002). Chez l'humain, ou des niveaux de l'ordre du fentomolaire peuvent etre retrouv^s dans la circulation sanguine periphfrique, la bigET-1 est constituee de 38 acides amines. La forme mature et biologiquement active de 21 acides amines, appetee ET-1, sera quant a elle obtenue apres clivage prot^olytique de la bigET-1. L'importance physiologique de la conversion de big-ET en ET-1 est par ailleurs illustr£e par les propri&es vasoconstrictrices superieures de l'ET-1 par rapport a la bigET-1 (entre 100 et 200 fois), tandis que laproET-1 est d^pourvue d'activite vasomotrice (RUBANYI & POLOKOFF,
1994).
De facon interessante, MATSUMURA et al. (1990) ont observe que chez le rat, les effets presseurs in vivo de la bigET-1 sont abolis par le phosphoramidon, un inhibiteur des metallopeptidases, tandis que les effets presseurs de l'ET-1 ne sont pas affected. Cette observation suggerait done que la bigET-1 n^cessitait une convertion en ET-1, via l'activite d'une enzyme sensible au phosphoramidon i.e., l'enzyme de conversion de l'endotheline (ECE) (MCMAHON et al, 1991). Cependant, il faudra attendre 1994 pour
que les caracteristiques biochimiques de l'ECE soient simultan&n^nt r£v61£es par 2 Squipes independantes (XU et al, 1994; SHIMADA et al, 1994).
1.2 Enzymes de conversion de 1'endotheline
L'ECE (Figure 2) est une metalloendopeptidase zinc-dependante dimenque, appartenant a la grande famille de la ngprilysine (famille Ml3) dans laquelle on retrouvera entre autres la neprilysine (NEP24.11 ou endopeptidase neutre 24.11), la thermolysine, les prolines KELL, et l'ECELI (endothelin-converting enzyme-like I) (TURNER et al, 2000). Trois isotypes de l'ECE ont &6 identifies a ce jour. Ces isotypes sont d<5nomm<§s ECE-1 (XU et al., 1994), ECE-2 (EMOTO & YANAGISAWA, 1995) et ECE-3 (HASEGAWA et al., 1998) et sont codes par des genes diffSrents.
De par sa large distribution i.e., l'ECE-1 est principalement exprim6 par les cellules endotheliales, mais aussi par les cellules musculaires lisses vasculaires et les neurones (TAKAHASHI et al., 1995;( BARNES & TURNER, 1999; KORTH et al., 1999;) tandis que l'ECE-3 n'est retrouve" que dans 1'iris des bovins (HASEGAWA et al., 1998), l'ECE-1 est consider comme l'isotype le plus important d'un point de vue physiologique et est par consequent, l'isotype le plus £tudie\ A ce propos, il est int^ressant de noter que les souris dont le gene codant pour l'ECE-1 a 6t6 invalids par recombinaison homologue, meurent in utero et pr^sentent des anomalies crano-faciales identiques a celles observees chez les souris dont le gene codant pour l'ET-1 a 6t6 invalid^ (KURIHARA et al., 1994; YANAGISAWA et al., 1998).
Quatre membres de l'isotype ECE-1 ont ete repertories jusqu'a present: l'ECE-1 a (SHIMADA et al, 1995), l'ECE-lb (SHIMADA et al, 1995), l'ECE-lc (SCHWEIZER
et al, 1997) etTECE-ld (VALDENAIRE et al, 1999). Un seul gene, localise sur le
chromosome 1 (lp36) et poss^dant 4 promoteurs alternatifs, est responsable de la synthese des 4 membres de l'isotype ECE-1 (VALDENAIRE et al, 1995; VALDENAIRE et al, 1999). Ces diffSrents membres se distinguent uniquement par leur fragment N-terminal, qui leur confere une localisation subcellulaire differente. En effet, les membres ECE-la, ECE-lc, et ECE-ld sont retrouves chez l'humain au niveau de la membrane plasmique, le domaine catalytique oriente du cote" extracellulaire (VALDENAIRE et al, 1999). L'ECE-lb est en revanche retrouv6 au niveau intracellulaire, notamment dans des structures vesiculates p^rinucteaires s'apparentant a l'appareil de Golgi (SCHWEIZER et al, 1997; AZARANI et al, 1998). De facon interessante, MULLER et al (2003) ont sugge>6 que l'ECE-lb pourrait agir comme un modulateur de l'activite" extracellulaire et de la localisation intracellulaire de PECE-1 en formant des h6t£rodimeres avec les autres membres de cette famille.
Finalement, MEIDAN et al. (2005) ont re^cemment rapport^ l'existence dans les cellules endoth&iales d'un nouveau membre de l'ECE-1 produit par ^pissage alternatif. Ce nouveau membre provient de 3 ARNm differents (ECE-lb sv, ECE-lc sv et ECE-ld sv) qui coderaient tous pour une seule et m§me proteine. Cette proline, ECE-1 sv, qui ne possede pas de domaine transmembranaire, est dot£e d'une activity catalytique 6quivalente a celle des autres membres de l'ECE-1, mais est en revanche uniquement localised dans le cytosol et non dans la fraction particulaire.
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L'ECE-2, le deuxieme isotype de l'ECE, possede 59% d'homologie avec l'ECE-1, et hydrolyse aussi la bigET-1 en ET-1. Cependant, l'ECE-2 est uniquement retrouve" au niveau intracellulaire, notamment au niveau du trans-Golgi, avec un pH d'activity optimum acide (EMOTO & YANAGISAWA, 1995). De plus, 4 membres de l'ECE-2 ont 6te identifies et appetes ECE-2a-l, ECE-2a-2, ECE-2b-l et ECE-2b-2 (IKEDA et
al, 2002). Contrairement a l'ECE-1, les differences observers dans la partie
cytoplasmique N-terminale de l'ECE-2 n'alterent pas la distribution subcellulaire de ses 4 membres mais modifient en revanche leur distribution tissulaire. En effet, l'ECE-2a-l et l'ECE-2a-2 sont exprimes de facon ubiquitaire tandis que l'ECE-2b-l et l'ECE-2b-2 sont majoritairement exprimes au niveau du cerveau, du cervelet et de la medulla des surrenales (IKEDA et al, 2002). Par ailleurs, les souris dont le gene codant pour l'ECE-2 a 6te invalid^ sont viables et ne pr^sentent aucune anomalie apparente, soulignant ainsi le r61e preponderant joue" par l'ECE-1 dans la conversion de la bigET-1 en ET-1 mature et biologiquement active (YANAGISAWA et al, 2000).
Enfin, tres peu de choses sont connues quant a l'ECE-3, le dernier isotype de l'ECE. En effet, seuls Hasegawa et al (1998) ont mis en evidence l'existence de l'ECE-3, au niveau de l'iris des bovins. D'une masse mol£culaire l^gerement sup&rieure aux autres isotypes (140 KDa versus 130 KDa pour l'ECE-1 et l'ECE-2), l'ECE-3 se caractfrise par une selectivity nettement superieure envers la bigET-3 compared a la bigET-2 ou la bigET-1, avec un Km environ cent fois plus eleve pour ce dernier pr£curseur. N6anmoins, 1'importance phsyiopathologique de l'ECE-3 demeure jusqu'a pr^sennt totalement inconnue.
1.3 Endopeptidase neutre 24.11
L'enzyme impliquee de facon preponderate dans la degradation de l'ET-1 est l'endopeptidase neutre 24.11 (VIJAYARAGHAVAN et al, 1990). Elle est abondamment presente en peripheric, surtout au niveau des cellules epitheiiales de la bordure en brosse intestinale et reiiale i.e., tubule proximal et distal du nephron (ROQUES et al, 1993). Cette enzyme, tel que mentionne precedemment, fait partie de la famille Ml3 des m&allopeptidases (TURNER & TANZAWA, 1997). Les sites susceptibles d'etre cibles par l'endopeptidase neutre lors du clivage protdolytique de l'ET-1 sont repr£sent£s par les acides amines hydrophobes identifies par FAGNY et al. (1991) soit: Ser4, Leu6, Vall2, Phel4, Hisl6, Leul7, et Ilel9. Cependant, l'activite de degradation de l'endopeptidase neutre 24.11 n'est pas specifique a l'ET-1. En effet, cette enzyme inactive egalement, la bradykinine, le facteur natriuretique de l'oreillette (ANP) et certains neuropeptides (substance P) et enkephalines (ROQUES et al, 1993).
Par ailleurs, il est important de noter que l'endopeptidase neutre 24.11 n'est pas uniquement impliquee dans la degradation de l'ET-1. En effet, elle joue egalement un r61e dans la conversion de la bigET-1 en ET-1, tel que nous l'avons precedemment demontre dans le parenchyme pulmonaire de cobaye en utilisant le thiorphan, un inhibiteur seiectif de l'endopeptidase neutre 24.11 (ROQUES et al, 1980; LEBEL et al,
14 1.4 MetalIoprot6ases de la matrice
L'implication des metalloprot^ases de la matrice dans les voies de biosynthese de l'endotheline a &e mise en evidence par FERNANDEZ-PATRON et al. (1999). Ces derniers ont en effet rapporte" la participation de la metalloprot^ase de la matrice-2 (MMP-2), s£cr&£e entre autre par les cellules endotheliales et les cellules musculaires lisses vasculaires, dans le clivage de la bigET-1 pour gen&er un nouveau peptide de 32 acides amines appete ET-1 (1-32). Ce peptide possede des propri6t6s vasoconstrictrices superieures a celles de la bigET-1 (FERNANDEZ-PATRON et al, 1999) et favorise 1'adhesion des neutrophiles aux cellules endotheliales en conditions inflammatoires (FERNANDEZ-PATRON et al, 2001). Cependant, il est a noter que bien que l'ET-1 (1-32) produise ses effets biologiques sans clivages ulteiieurs en ET-1 (FERNANDEZ-PATRON et al, 2001), aucune Evidence ne semble indiquer jusqu'a ce jour la presence d'ET-1 (1-32) dans les fluides corporels humains tels que le sang ou l'urine.
1.5 Agents pharmacologiques controlant le mltabolisme de l'ET-1
Que ce soit a des fins therapeutiques pour limiter les taux d'ET-1 produit ou a des fins de recherche fondamentale pour 6tudier les m^canismes de regulation impliqu^s dans la biosynthese de l'ET-1, plusieurs inhibiteurs de la voie de biosynthese de l'ET-1 ont et£ d£velopp£s. De par l'homologie relative existant entre l'ECE-1 et l'endopeptidase neutre 24.11, soit 37% pour les formes humaines (SCHMIDT et al, 1994), plusieurs inhibiteurs deVeloppes a ce jour sont non selectifs pour ces 2 enzymes. Le Tableau 1 r^pertorie certains des inhibiteurs communement utilises en recherche fondamentale.
Comme nous l'avons mentionne" auparavant, le phosphoramidon (Figure 3a), un inhibiteur non-s&ectif de l'endopeptidase neutre 24.11 et de l'ECE-1, inhibe les effets pharmacologiques in vitro et in vivo de la bigET-1, empechant ainsi sa conversion en ET-1 (FUKURODA et al, 1990; MCMAHON et al, 1991). II est a noter que le phosphoramidon est relativement inefficace contre les isoformes de l'ECE-2 compares a celles de l'ECE-1, car cet inhibiteur est incapable de traverser les membranes plasmiques et done d'agir sur les isoformes intracellulaires des ECEs (RUSSELL & DAVENPORT, 1999).
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Tableau 1 : Liste non exhaustive des inhibiteurs selectifs et non-selectifs de l'endopeptidase neutre 24.11 (NEP) et de l'enzyme de conversion de l'endotheline-1 (ECE). Certains inhibiteurs bloquent egalement l'activitd de renzyme de conversion de l'angiotensine (ACE). L'annotation NEP/ECE traduit une selectivity plus importante de l'inhibiteur enzymatique envers l'endopeptidase neutre 24.11, compare" a renzyme de conversion de l'endotheline-1, et inversement pour l'annotation ECE/NEP.
Selectivity NEP NEP/ECE ECE/NEP ECE ECE/NEP/ACE
Thiorphan Phosphoramidon CGS 34043 FR 901532 SCH 54470
Compose CGS 26303 CGS 35066 SA6817
SLV306 CGS 35601
18 Par ailleurs, il existe des inhibiteurs selectifs de l'endopeptidase neutre 24.11, tel que le thiorphan (ROQUES et al, 1980) (Figure 3b), et des inhibiteurss&ectifs de l'ECE-1 parmi lesquels figure le CGS 35066 (Figure 3c), un inhibiteur qui possede 104 fois plus de specificity envers l'ECE-1 compart a l'endopeptidase neutre 24.11 (DE LOMBAERT et al, 2000). Cet agent pharmacologique possede en outre l'avantage d'6tre tres efficace tant in vitro qu'w vivo pour bloquer la conversion de la bigET-1 en ET-1 (JENG et al, 2000; TRAPANI et al, 2000).
2. ET-1 (1-31): un nouveau protagoniste du svsteme endotheline
2.1 Origine de l'ET-1 (1-31)
Bien que plusieurs Etudes aient suggere l'existence d'un isotype biologiquement actif de l'ET-1 poss&iant entre 27 et 31 acides amines (PATTERSON et al, 1990; KAW et al, 1992; HANSON et al, 1997), ce seront les travaux de NAKANO et al. (1997) et de KIDO et al. (1998) qui mettront en Evidence les voies de synthese de l'ET-1 (1-31). En effet, ces auteurs ont demontre que l'incubation de la bigET-1 humaine - peptide de 38 acides amines - avec la chymase des mastocytes purifies a partir du tissu conjonctif d'amygdales humaines, g£n£rait un peptide de 31 acides amines denomme' ET-1 (1-31), par opposition a l'ET-1 dite "classique" qui possede 21 acides amines. La formation de l'ET-1 (1-31) se fait apres clivage par la chymase de la liaison Tyr31-Gly32 de la bigET-1
(Figure 4).
Par ailleurs, des isotypes ET-2 (1-31) et ET-3 (1-31) sont aussi produits apres action de la chymase en presence respectivement de bigET-2 et de bigET-3. Les fonctions biologiques precises de l'ET-2 (1-31) et de l'ET-3 (1-31) demeurent encore inconnues
Les mastocytes responsables de la synthase de chymase sont non seulement retrouves dans les tissus et organes en contact avec l'environnement exterieur tels que la peau, les poumons ou le tractus digestif, mais aussi au niveau des vaisseaux sanguins et du coeur (WELLE M, 1997 ; DOGRELL & WANSTALL, 2004 ; DOGRELL & WANSTALL, 2005). Cependant, contrairement au niveau d'activation important de l'ECE clivant la bigET-1 en conditions physiologiques, l'activite de la chymase genErant l'ET-1 (1-31) dans ces memes conditions basales demeure relativement faible. En effet, la chymase est stocked sous forme inactive dans les granules de sdcr&ion des mastocytes. Ce n'est que lors de la relache de chymase dans la matrice extracellulaire, apres la degranulation des mastocytes induite par des stimuli m&aniques (chirurgies) ou biochimiques (facteurs libels par les macrophages), que celle-ci sera pleinement active (TAKAI et al, 1997; LESKINENe/a/.,2003).
Ne"anmoins, des niveaux d'ET-1 (1-31) equivalents a ceux de bigET-1 ont 6t6 mesurEs dans des Echantillons de poumons humains homog&i&sEs (OKISHIMA et al, 2001). Ces niveaux sont de l'ordre de 100-200 pg/g de tissu (OKISHIMA et al, 2001). Ainsi, si les dormers obtenues chez l'humain demeurent relativement ^parses, les informations recueillies par OKISHIMA et al (2001) soulignent ne"anmoins 1'importance d'Etudier les actions et les m£canismes physiologiques et/ou pathologiques dans lesquels l'ET-1 31) pourrait etre implique\ Les niveaux Equivalents d'ET-1 (1-31) et de bigET-1, bien moindres que ceux d'ET-1 (environ 1000 pg/g de tissu), pourraient en effet suggdrer l'existence d'une voie alternative de biosynthese de l'ET-1 a partir de l'ET-1 (1-31). Cependant, Pimportance de cette voie alternative en physiologie ainsi que ses implications en pathologie demeurent mal definies.
22 2.2 Actions biologiques de l'ET-1 (1-31)
Plusieurs effets pharmacologiques de l'ET-1 (1-31) ont ite jusqu'a present mis en Evidence.
L'ET-1 (1-31) a notamment 6te d£crit comme etant un agent contractile in vitro, agissant sur le systeme cardiovasculaire (KISHI et al, 1998), ou non cardiovasculaire (NAKANO et al, 1997; GOLDIE et al, 2000). KIDO et al (1998) ont par exemple montre" que l'ET-1 (1-31) induit la contraction tant des arteres coronariennes porcines que des trache^es de rats.
En accord avec ces Etudes fonctionnelles, l'ET-1 (1-31) a aussi 6te decrit comme un agent capable d'augmenter les concentrations intracellulaires de calcium dans les cellules vasculaires, telles les cellules musculaires lisses des arteres coronariennes (YOSHIZUMI et al, 1998a), ou les cellules non-vasculaires, telles les cellules musculaires lisses bronchiques (HAYASAKJ-KAJIWARA et al, 1999) ou les cellules r&iales m&angiales (YASUOKA et al, 1999). L'ET-1 (1-31) serait done non seuleument implique dans le controle des fonctions telles que la contraction, mais aussi dans la proliferation cellulaire ou la chimiotaxie. En effet, YOSHIZUMI et al (1998b) et YOSHIZUMI et al. (2000) ont respectivement montrS le role pro-prolife>atif de l'ET-1 (l'ET-1-3l'ET-1) sur les cellules musculaires lisses des arteres coronariennes et les cellules m^sangiales. De leur cote\ NIWA et al. (2000) ont rapporte l'implication de l'ET-1 (1-31) dans la production de monoxyde d'azote par les cellules endotheliales, tandis que CUI et al. (2001) ont d6montr£ la faculty de l'ET-1 (1-31) a agir comme un peptide chemotactique pour les neutrophiles et les monocytes.
Cependant, il est important de noter que jusqu'en 2001, aucune 6tude in vivo d&rivant les effets de l'ET-1 (1-31) n'avait ete rapportee dans la litterature.
24
2.3 ET-1 (1-31) : un agoniste intrinseque ?
Comme nous venons de le mentionner, plusieurs 6quipes ont rapporte" les effets de l'ET-1 (1-31) sur diverses preparations pharmacologiques ou diffiSrents types cellulaires. Cependant, un differend oppose toujours certains groupes de recherche. En effet, l'une des questions qui reste en suspens est de savoir si le peptide ET1 (131) agit per se -sans n^cessiter un clivage en ET-1, par exemple - ou s'il doit obligatoirement subir un clivage enzymatique avant de se Her aux recepteurs de l'ET-1 et induire ses effets ?
A travers ses nombreuses publications, le groupe dirige par le Dr Toshiaki Tamaki supporte l'idee d'une action intrinseque de l'ET-1 (1-31) (KIDO et al, 1998; YOSHIZUMI et al, 1998a, 1998b). Par exemple, KIDO et al. (1998) ont montre" que la presence de phosphoramidon - un inhibiteur non-seUectif de l'ECE et de l'endopeptidase neutre 24.11 - ne modifie pas l'effet contractile de l'ET-1 (1-31) sur la tracheae de rat, alors que l'effet induit par la bigET-1 est significativement diminue" par cet inhibiteur. Des resultats similaires ont ete obtenus par ce groupe de recherche etudiant les variations de calcium intracellulaire des cellules musculaires lisses vasculaires ou des cellules mesangiales humaines (YOSHIZUMI et al, 1998a; YASUOKA et al, 1999). YOSHIZUMI et al (1998b) ont aussi rapporte" l'absence d'effet du phosphoramidon sur la proliferation des cellules musculaires lisses des arteres coronariennes induite par l'ET-1(1-31).
En revanche, HAYASAKI-KAJIWARA et al. (1999) ont rapporte que les capacity de l'ETl (1-31) a augmenter les taux de calcium intracellulaire dans les cellules musculaires lisses bronchiques humaines sont sensiblement reduites lorsque le phosphoramidon ou le thiorphan - un inhibiteur non-s61ectif de l'ECE et de
l'endopeptidase neutre 24.11 et un inhibiteur selectif de l'endopeptidase neutre 24.11, respectivement - sont pr£alablement ajoutes aux preparations cellulaires. Ces dernieres donnees suggerent done que l'endopeptidase neutre 24.11 joue un role important dans les effets induits par l'ET-1 (1-31) et que par consequent, l'ET-1 (1-31) est inactifper se et n^cessite une conversion pour gen^rer un peptide actif in vitro. Ces arguments ont aussi ete relev6s par MAGUIRE et al. (2001) qui suggerent qu'une conversion pr£alable de l'ET-1 (1-31) pourrait expliquer les phinomenes contractiles observes sur les arteres mammaires et coronaires humaines.
Bien que le d£bat souleve" par l'activite intrinseque potentielle de l'ET-1 (1-31) puisse apparaitre comme une caract6ristique marginale de la pharmacologic des endotbilines, il s'agit, dans les faits, d'un concept important. En effet, si l'ET-1 (1-31) ne subit pas de clivage enzymatique et agit per se, ou si ce peptide de 31 acides amines est dive" pour g£n£rer un peptide autre que l'ET-1, ridentite" du ou des r£cepteurs implique\s) dans les effets biologiques du tri-undeca peptide reste a determiner.
26
3. Les recepteurs ETA et ET« de l'ET-1
Ce sont les travaux de WARNER et al. (1989) qui ont suggei£ pour la premiere fois l'existence de 2 entites r^ceptorielles pour m£dier les effets des ETs. lis ont en effet observe que l'ET-1 etait 10 fois plus puissante que l'ET-3 pour induire la vasoconstriction de l'aorte de lapin, alors qu'a l'oppos£, l'ET-3 induisait une vasodilation plus marquee du lit mesenterique de rat car la vasodilatation d£clench£e par l'ET-1 &ait contrecarree par la vasoconstriction concomitante. Cependant, ce seront ARAI et al. (1990) et SAKURAI et al. (1990) qui permettront respectivement 1'identification des recepteurs sp^cifiques de l'ET-1 nomm£s r^cepteurs ETA et ETB. Ces deux r^cepteurs qui, chez Phumain, possedent 59% d'homologie entre eux, appartiennent a la grande famille des r^cepteurs couples aux proteines G (classe A) (DAVENPORT, 2002). lis possedent des poids moteculaires d'environ 45-50 kDa, d£pendamment de leur niveau de glycosylation. Le recepteur ETA possede en effet 2
sites potentiels de N-glycosylation dans sa queue N-terminale extracellulaire tandis que le r&epteur ETB (Figure 5) n'en possede qu'un (SAKAMOTO et al, 1991; HAYZER et
3.1 Propri6t6s biochimiques
28
En utilisant notamment des recepteurs chimeres ETA et ETB, le groupe du Dr Tomoh Masaki a apporte plusieurs elements de comprehension au schema de fonctionnement des recepteurs de l'ET-1 (MASAKI et ah, 1999). En particulier, ces travaux ont permis de partager 1'architecture de ces recepteurs en deux domaines g£n£raux impliques dans 1'interaction ligand-recepteur. D'une part, la structure du recepteur incluant les domaines trans-membranaires IV-VI combine avec le fragment N-terminal du ligand determine la selectivite de 1'interaction ligand-recepteur. D'autre part, la structure du recepteur incluant les domaines trans-membranaires I, II, III, VII et les boucles intermediaires, combines avec la fraction C-terrninale du ligand, joue un role important dans l'affmite de la liaison entre le ligand et son recepteur, ainsi que dans l'initiation de la transduction du signal intracellulaire.
Les voies de signalisation qui peuvent etre activees lors de la liaison ET/recepteur sont nombreuses et dependent non seulement de l'identite du ligand et du recepteur, mais aussi du type cellulaire sur lequel est exprime le recepteur. La figure 6 illustre done les voies potentielles de signalisation activees par les recepteurs ETA/ETB avec, comme voie principale, celle activant la proteine Gq et induisant une augmentation du calcium
intracellulaire et une activation de la proteine kinase C. Ce sont en effet ces derniers mediateurs qui sont a Porigine, d'une part, des contractions puissantes et soutenues observees suite a l'activation du recepteur ETA et, d'autres part, de l'activation de la monoxyde d'azote synthase endotheiiale (eNOS) par le recepteur ETB (Figure 7).
Figure 7: Representation schematique des voies d'activation induites par l'ET-1 et conduisant a la contraction ou a la relaxation des cellules musculaires lisses vasculaires. Sous-unit^ a de la proline G (Ga); Cyclooxygenase (COX); Monoxyde d'azote
synthase endotMiale (eNOS); Acide arachidonique (AA); Prostacycline (PGI2); L-Arginine (L-Arg); Monoxyde d'azote (NO); Ricepteur de la prostacycline (IP); Enzyme de conversion de l'ET-1 (ECE); Calcium (Ca); Adenosine monophosphate cyclique (AMPc), Guanosine monophosphate cyclique (GMPc); Guanylate cyclase soluble (GCs); Proteme kinase A (PKA); Proline kinase G (PKG); Calmoduline (CaM); Chaine legere de la myosine (CLM); Kinase de la chaine legere de la mysosine (MLCK); Chaine legere de la myosine phosphorytee (CLM - P).
31
Tel que repr&entes a la figure 7, les effets contractiles de l'ET-1 au niveau des cellules musculaires lisses vasculaires, qui contrairement au coeur, ne contiennent pas de troponines, sont induits par 1'augmentation intracellulaire de calcium et l'activation subsequente du complexe calcium/calmoduline. Ainsi stimul^e, la calmoduline phosphorylera la kinase de la chaine 16gere de la myosine, ce qui aboutira a l'activation de cette kinase, a la phosphorylation de la chaine legere de la myosine en presence d'ATP et finalement, a une interaction des tetes de myosine avec les filaments d'actine et un glissement des filaments contraciles d'actine/myosine qui se traduira par le phenomene de contraction musculaire. La relaxation musculaire sera quant a elle induite par l'activation de la phosphatase de la myosine qui d^phosphorylera la chaine legere de la myosine (Figure 7).
Par ailleurs, tout comme plusieurs r£cepteurs couples aux prot&nes G, les recepteurs ETA et ETB sont la cible de phosphorylations par differentes kinases. FREEDMAN et al (1997) ont montre" que de facon equivalente, le r^cepteur ETA et le r^cepteur ETB sont phosphorytes d'une maniere agoniste dependante, puis d6sensibilis£s via la kinase des recepteurs couples aux prot&nes G de type 2 (GRK-2). Cependant, lorsque le r^cepteur ETA est lie" a l'ET-1 et subit l'endocytose, l'ET-1 reste intact et lie" a ce r^cepteur, m6me apres internalisation, ce qui pourrait permettre au complexe ET-l/r£cepteur ETA de poursuivre sa signalisation (CHUN et al, 1995). De plus, tandis que le r^cepteur ETA est dirige" vers la voie de recyclage pour etre r^exprime a la membrane plasmique de la cellule, le r£cepteur ETB est dirige vers la voie des lysosomes pour y etre degrade (BREMNES et al, 2000). Cette difference dans le devenir des recepteurs ETA et ETB apres internalisation, tel qu'illustre' a la figure 8, s'expliquerait par la presence d'un
motif aux caract&istiques structurales d'un ligand interne PDZ {Postsynaptic density of
the Drosophila septate junction protein Discs-large, and the epithelial tight junction protein ZO-1) dans la queue cytoplasmique du recepteur ETA, qui ne serait pas retrouv6
dans la queue C-terminale du recepteur ETB (PAASCHE et al, 2001; PAASCHE et al, 2005). Neanmoins, les proteines interagissant avec ce domaine et permettant au recepteur ETA d'etre dirige vers la voie de recyclage membranaire demeurent inconnues. Quoi qu'il en soit, les differences dans les voies d'internalisation des r^cepteurs ETA et ETB expliqueraient la nature soutenue des reponses biologiques induites par 1'activation du recepteur ETA, telles que les contractions musculaires de longue duree, tandis que le ciblage du recepteur ETB vers les lysosomes expliqueraient le r61e primordial joue" par ce recepteur dans la clairance plasmatique de l'ET-1 (voir section 4.2).
3.2 Proprietes pharmacologiques
Les r^cepteurs ETA et ETB se distinguent par leur affinite respective envers les divers
ligands ET-1, ET-2 et ET-3. En effet, le recepteur ETA possede une affinite" environ 10 fois sup&ieure pour l'ET-1 et l'ET-2 compare a l'ET-3 (HOSODA et al, 1991). En revanche, l'affinite du recepteur ETB est £quivalente quelque soit l'isotype consider^ (OGAWA etal, 1991).
Par ailleurs, les constantes d'inhibition de l'ET-1 evalu^es en utilisant le [125]I ET-1
sont similaires pour le recepteur ETA et ETB le., ET-1 = 3.5 x 10"9 M pour le recepteur
ETA et ET-1 .= 9.5 x 1010 M pour le recepteur ETB (MASAKI et al, 1994).
Enfin, en utilisant des approches pharmacologiques certains auteurs ont suggere" la presence de 2 populations distinctes de recepteurs ETB localises sur les cellules endoth£liales (ETBI) et musculaires lisses (ETB2) vasculaires (WARNER et al, 1993). N6anmoins, bien que caracteris^es pharmacologiquement, ces difterentes populations de recepteurs ETB semblent 6tre absentes chez l'humain. En effet, aucun gene distinct codant pour un recepteur ETBI OU ETB2 n'a iti mis en Evidence chez l'humain. De plus,
les recepteurs ETB presents sur les cellules endotheUiales et musculaires lisses humaines manifestent des proprietes de liaison 6quivalentes (FLYNN et al, 1998).
35 D'autre part, une distinction dans la localisation cardiovasculaire des r&epteurs ETA et ETB, notamment en ce qui a trait a la cellule musculaire lisse et a la cellule
endotheliale vasculaire, peut etre etablie (Figure 7). Chez l'humain, sur les cellules musculaires lisses vasculaires, le recepteur ETA est predominant, voire exclusif. En effet,
le niveau d'expression du recepteur ETB detecte equivaut tout au plus a 15% de la population des r^cepteurs des ETs que ce soit au niveau des arteres r&iales, pulmonaires et coronariennes, ou de la veine saphene, par exemple (DAVENPORT et al, 1995). En revanche, au niveau de la cellule endotheliale vasculaire, seul le recepteur ETB est present (EMORI et al, 1990; HIRATA et al, 1993). II faut toutefois noter que les cellules endotheliales des valves aortiques du lapin et du pore, ainsi que les cellules endoth&iales endocardiques humaines, possedent un recepteur ETA capable d'induire une augmentation intracellulaire de calcium, suite a son activation par l'ET-1 (AMANO et al, 1994; NISHIMURA et al, 1995; JACQUES et al, 2005).
Comme nous allons le voir en details plus loin (section 4), cette distinction dans la localisation vasculaire des r^cepteurs ETA et ETB, et plus particulierement celle du recepteur ETB, aura une implication fonctionnelle importante. Ainsi, si l'activation du recepteur ETB localise" sur les cellules musculaires lisses vasculaires induit une vasoconstriction, celle du recepteur ETB present sur les cellules endoth&iales vasculaires
induit une vasodilatation, via la liberation d'autaco'ides vasodilatateurs tels que le monoxyde d'azote et la prostacycline (PGI2) (voir figure 7 et section 4.3).
Enfin, l'&ude des differents effets m£dies par les recepteurs ETA et ETB n'aurait pas &e possible sans l'utilisation d'agonistes et d'antagonistes selectifs et non selectifs des recepteurs ETA et ETB, qu'ils soient peptidiques ou non peptidiques. Le Tableau 2
r£pertorie done les agonistes selectifs du recepteur ETB, tandis que le Tableau 3 repertorie les antagonistes des recepteurs ETA et ETB les plus commun^ment utilises.
II est important de noter qu'aucun agoniste s&ectif du recepteur ETA n'a 6t6 repertorie dans la derniere nomenclature des recepteurs de l'ET parue en 2002 (DAVENPORT, 2002). Cependant, certains auteurs ont attribue" a l'ET-1 (1-31) des propriety d'agoniste s&ectif du recepteur ETA (MAZZOCCHI et al, 2000; REBUFF AT et al, 2001). Par ailleurs, le groupe de recherche du Dr Alain Fournier a cr£e" des agents
pharmacologiques analogues a l'ET-1, tel que le [D-Lys(9)]cyclo(ll-15) ET-1 (9-21), qui bien que moins puissants que l'ET-1 constituent n^anmoins des agonistes sdlectifs du recepteur ETA (LANGLOIS et al, 2003).
Parmi les agonistes selectifs du recepteur ETB, il a &e* rapporte" que la sarafotoxine S6c, originellement issue du venin du serpent Atractaspis engaddensis, stimulerait des recepteurs autres que le recepteur ETB classique (FLYNN et al, 1995; MIASIRO et al, 1998). Par consequent, 1TRL-1620 apparait comme l'agoniste de choix a utiliser pour etudier les r^ponses mediees par le recepteur ETB (MIASIRO et al, 1998; D'ORLEANS-JUSTE et al, 2002).
Tableau 2 ; Agonistes s&ectifs du r^cepteur ETB.
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Agoniste Reference
[Ala1A11,15]-ET-l SAEKI et al, 1991 Sarafotoxine S6c WILLIAMS et al., 1991
BQ-3020 IHARA et al, 1992a
IRL-1620 TAKAI et al, 1992
II est a noter que le [D-Lys(9)]cyclo(ll-15) ET-1 (9-21) est le seul agoniste selectif du r^cepteur ETA repertorie" a ce jour (LANGLOIS et al., 2003)
Tableau 3 ; Liste non exhaustive des antagonistes s£lectifs et non-s&ectifs des r^cepteurs ETA et ETB utilises en recherche fondamentale.
Selectivity SelectifETA Mixte ETA/ETB SelectifETB
Compose BQ-123 FR 139317 BQ-485 LU135252 ABT-627 Ro 47-0203 BQ-788 PD-142893 RES-701-1 TAK-044 IRL-1038 IRL-2500 A-192621
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En ce qui conceme les antagonistes peptidiques des r^cepteurs ETA et ETB, une attention particuliere doit etre portee au BQ-123 et au BQ-788, qui ont etc" les premiers antagonistes vraiment selectifs developpes pour bloquer respectivement le r^cepteur ETA et le r&epteur ETB (IHARA et al, 1992b; ISHIKAWA et al, 1994).
Bien que la notion de selectivity d'un antagoniste pharmacologique envers le recepteur ETA OU ETB puisse paraitre relativement floue, compared a un antagoniste dit non-selectif ETA/ETB, il est gen&alement admis qu'une difference de selectivite
superieure a un facteur 100 delinit un antagoniste selectif, tandis qu'une difference inferieure a 100 d^finit un antagoniste non-selectif (DAVENPORT, 2002). Ainsi, parmi les antagonistes non peptidiques, ratrasentan (A-147627 ou ABT-627) est considere" comme un agent selectif du recepteur ETA, le bosentan (Ro 47-0203 ou Tracleer™) comme un agent non-selectif ETA/ETB et le compose" A-192621 comme un agent selectif
du recepteur ETB (OPGENORTH et al, 1996; VON GELDERN et al, 1999; D'ORLEANS-JUSTE et al., 2002; MOTTE et al, 2006).
4. Modulation du tonus vasculaire par PET-1
4.1 Contribution contractile des recepteurs ETA et ETB
Comme nous l'avons mention^ pr^cedemment, l'ET-1 a 6te initialement reconnu pour ses propri&6s contractiles puissantes etant, sur une base molaire, 100 fois plus puissant que la noradrenaline. De plus, le recepteur ETA est present de facon prepondeiante, sinon exclusive, sur les cellules musculaires lisses vasculaires. De par cette localisation, c'est done lui qui jouera le r61e le plus important dans les phenomenes de vasoconstriction induits par l'ET-1.
Neanmoins, il est important de noter que l'activation du recepteur ETB, lorsque present sur les cellules musculaires lisses vasculaires de certains vaisseaux et chez certaines especes animales uniquement, peut aussi induire une vasoconstriction in vitro et in vivo (PANEK et al, 1992; MORELAND et al, 1992; BURKE et al, 2000), y compris chez l'humain (SEO et al., 1994; HAYNES et al., 1995).
41 4.2 Importance de la clairance de l'ET-1 plasmatique
La clairance peut 6tre definie comme la quantity de substance retiree de la circulation sanguine par unite de temps. Une Elimination efficace de l'ET-1 circulante permettrait done de limiter les puissants effets vasoconstricteurs de ce peptide. II semble que malgre' la contribution contractile du recepteur ETB dans les phenomenes vasopresseurs induits par l'ET-1, le role joue" par ce recepteur pour moduler a la baisse les effets de l'ET-1 est preponderant a la fois chez l'animal (GRATTON et al, 1997; BERTHIAUME et al, 2000) et chez l'humain (STRACHAN et al, 1999; BOHM et al, 2003). En effet, de par la localisation du recepteur ETB sur les cellules endotheliales et la tres grande proportion de ces cellules dans le poumon (pres de 50% de l'endothelium de l'ensemble de la vascularisation), cet organe est l'un des lieux ou la densite de rEcepteurs ETB est la plus elevEe. Par consequent, le poumon est considere" comme l'un des endroits privilEgiEs de clairance de l'ET-1 plasmatique.
Ges considerations s'appuyant sur des Evidences anatomiques ont tout d'abord 6t6 supporters exp&imentalement chez le rat par DE NUCCI et al (1988) et FUKURODA et al. (1994) avant d'etre appuyEes par les travaux de DXJPUIS et al (1996b) qui ont montre le role important joue par les poumons dans la clairance de l'ET-1 plasmatique chez l'humain. En fonction de l'espece animale, les poumons sont en effet capables d'extraire entre 35 et 60% de l'ET-1 circulante en un seul passage (DUPUIS et al, 1996a; DUPUIS et al, 1998b), y compris chez l'humain, ou le taux d'extraction de l'ET-1 circulante est proche de 50% (DUPUIS et al, 1998a). De facon intEressante, cette clairance pulmonaire demeure inchangee apres un blocage du recepteur ETA tandis qu'elle est tres fortement reduite lorsqu'un blocage selectif du recepteur ETB est rEalisE,
mettant en Evidence le r61e capital joue par ce dernier recepteur (FUKURODA et al, 1994; DUPUIS etal, 1996a).
Par ailleurs, radministration d'un antagoniste selectif du recepteur ETB - comme le BQ-788 par exemple - induit une augmentation significative de la pression arterielle moyenne (BERTHIAUME et al, 2000) ou une augmentation de la resistance vasculaire peripherique totale (STRACHAN et al, 1999). Chez le lapin anesthesie, GRATTON et
al. (1997) ont de plus note" que suite a un blocage du recepteur ETB avec un antagoniste
selectif, une augmentation des taux plasmatiques non seulement de l'ET-1 immunoreactive, mais aussi du pr^curseur bigET-1, est observee. Ces r^sultats sont en accord avec ceux rapportes chez la souris het^rozygote ETB +/- puisque dans ce modele, une hypertension dependante du recepteur ETA se developpe, associee a une reduction de la clairance plasmatique de l'ET-1 (BERTHIAUME et al, 2000). Ces donn&s suggerent done que dans des conditions ou seulement 50-60% du recepteur ETB est fonctionnel, la clairance de l'ET-1 circulante est altered et par consequent, l'ET-1 pr^sente en plus grande concentration plasmatique agirait de facon predominante sur le recepteur ETA localise sur les vaisseaux de resistance.
La clairance de l'ET-1 circulante est done realisee par le systeme vasculaire - localise au sein d'un tissu ou non - via l'implication primordiale du recepteur ETB present a la surface des cellules endotheiiales. Si les poumons jouent un r61e important dans ce phenomene, d'autres organes tels que les reins et le coeur participent, dans une moindre mesure, au maintien des faibles niveaux plasmatiques de ET-1 (FUKURODA et al, 1994; BRUNNER & DOHERTY, 1996). De plus, une clairance independante du systeme vasculaire i.e., proprement tissulaire, a ete mise en evidence, notammment au
43
niveau du foie et des reins (BURKHARDT et al, 2000). Neanmoins, cette clairance tissulaire se ferait par un processus independant des r^cepteurs ETA/ETB, tel que rapporte pour la bigET-1 (BURKHARDT et al, 2000). Enfin, il est important de noter que si rimplication du r^cepteur ETB endothelial dans la clairance vasculaire de l'ET-1 plasmatique est bien etabli, aucune etude n'a jusqu'a present etudi£ l'implication du r^cepteur ETB present a la surface des cellules musculaires lisses vasculaires dans la clairance vasculaire de l'ET-1.
A la vue de tous les elements presentes ci-haut et des caracteristiques biochimiques distinctives des recepteurs ETA et ETB d^crites dans la section 3.1, le role primordial jou6 par le recepteur ETB dans le ph^nomene de clairance de l'ET-1 plasmatique apparait done li£, non seulement a sa localisation sur la cellule endotheliale vasculaire, mais aussi aux m^canismes distincts d'internalisation et de degradation qui le differencie du r£cepteur ETA (BREMNES et al, 2000) (Figure 8).
4.3 Importance des autacoi'des liberes par le recepteur ETB endothelial
Le recepteur ETB present sur les cellules endothelials vasculaires module les effets vasoconstricteurs de l'ET-1 non seulement en eliminant l'ET-1 de la circulation, mais aussi en activant la synthese et la relache du monoxyde d'azote et de la PGI2, ces derniers m&iiateurs agissant comme des antagonistes physiologiques de l'ET-1 (DE NUCCI et al, 1988). Depuis ces travaux initiaux, le rdle du recepteur ETB dans la production du monoxyde d'azote et de la PGI2 a et£ bien documents. TSUKAHARA et
al. (1994) ont notamment rapporte le couplage fonctionnel entre le recepteur ETB
endothelial et la eNOS, tandis que WEBB & HAYNES (1993) ont montre" la contribution importante de la PGI2 dans 1'attenuation des effets v&ioconstricteurs de l'ET-1. D'importance en therapeutique, VERHAAR et al. (1998) ont quant a eux rapporte le rdle primordial jou6 par le monoxyde d'azote libeie suite a l'activation du recepteur ETB dans les effets hypotenseurs induits par un antagonisme du recepteur ETA chez l'humain. En effet, la dilatation de l'artere brachiale induite par l'infusion de BQ-123, un antagoniste du recepteur ETA, est tres fortement r^duite lorsque la production du monoxyde d'azote est inhib^e. De facon similaire, la dilatation de l'artere brachiale observed apres 1'administration de 123 est diminu^e lors de la co-infusion de BQ-788, un antagoniste du recepteur ETB.
Par ailleurs, le monoxyde d'azote et la PGI2, ainsi que d'autres facteurs tels que les forces h&nodynamiques de cisaillement, l'ANP ou l'h^parine diminuent l'expression du transcrit de la preproET-1 et par la mSme, diminuent les taux circulants et les effets de l'ET-1 (MIYAUCHI & MASAKI, 1999). Par opposition, la transcription de la
45 preproET-1 est augmented par des facteurs tels que la thrombine, l'angiotensine II (Ang II) ou le facteur de croissance transformant-beta (TGF-P) (MIYAUCHI & MASAKI, 1999). Ces diffSrentes modulations sont attribuables a la presence dans le promoteur du gene codant pour la preproET-1, de sequences de reconnaissance pour les facteurs de transcription tels que c-Fos/c-Jun, NF-1 ou NF-kappaB (REMUZZI et al, 2002).
Enfin, le monoxyde d'azote et la PGI2 diminuent les effets pro-proliferatifs exerces par l'ET-1, en particulier sur les cellules endothelials, les cellules musculaires lisses vasculaires ou les cardiomyocytes (WARNER, 1999; NAKAKI et al, 1991). La regulation du niveau d'expression de l'ET-1 apparait done tres importante car tout dereglement de la production de ce peptide peut conduire au d&veloppement ou a la progression de diverses pathologies.
