Mécanismes modulant l'épissage alternatif du pré-mRNA de la NCAM murine

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UlVll ..

Université de Sherbrooke

MÉCANISMES MODULANT L'ÉPISSAGE ALTERNATIF DU PRÉ-mRNA DE LA NCAMMURINE

par

Jocelyn Côté

Thèse présentée à la Faculté de médecine en vue de l'obtention du grade de

philosophiae doctor (Ph.D.) en Microbiologie

l+I

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0-612-40518-4

TABLE DES MATIERES

Table des matières . . . 1

Liste des figures . . . II Liste des articles . . . V Liste des abréviations . . . VI Résumé ... . Introduction . . . l Préambule 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 Chapitre 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 Préambule II . . .

29

Chapitre II . . . . . . . . 30 Préambule III . . . . . . 44 Chapitre III . . . 45 Discussion . . . 83 Conclusions . . . . . . . . . . . 96 Remerciements . . . 97 Références . . . 99

LISTES DES FIGURES

Intro<luction:

Figure 1: Reconnaissance initiale des signaux d'épissage et définition de l'unité

intronique et exonique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 Figure

2:

Représentation schématique des deux étapes catalytiques de la réactions d'épissage et synthèse de la voie de formation des complexes d'épissage . 6 Figure 3: Régulation par épissage alternatif de la cascade de détermination des

sexes et de l'expression somatique de la transposase de l'élément

P chez

Drosophila melanogaster . . .

14 F!gure 4: Épissage alternatif de l'exon Nl de c-src . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 Figure 5: Épissage alternatif du pré-mRNA de CT/CGRP . . . . . . . . . . . . . . . . 17 Figure 6: Structure protéique et génomique de NCAM . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

Chapitre 1:

Figure 1: Structure des substrats de RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 Figure 2: Pontage aux ultraviolets des substrats de RNA E et M dans différents

extraits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

Figure 3: La bande de 65 kDa correspond à U2AF5 ... 25

Figure 5: Les séquences du site d'épissage 5' influencent la liaison d'U2AF65 • • • • 27 Figure 6: La liaison efficace U2AF5 _{requière la présence du snRNP U l . . . . . . . 27}

Chapitre II:

Figure l: Épissage

in vitro

des pré-mRNAs simplifiés de NCAM . . . . . . . . . . . 32 Figure 2: Caractérisation des molécules en lasso produites par l 'épissage des

substrats D, E et M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 Figure 3: Modèle structural . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 Figure 4: Validation du modèle structural par mutagénèse dirigée . . . . . . . . . . . 35 Figure 5: La formation de la structure influence la sélection des sites d'épissage 5' 36 Figure 6: La formation de la structure réduit l'assemblage des complexes

Ut-dépendant au site d'épissage 5' de El8 . . . . . . . . . . . . . . . 38 Figure 7: La formation de la structure entraîne une liaison peu efficace de U2AF5 ₃₉ Figure 8: Formation d'une structure secondaire dans un intron d'a-globine . . . . . 40

Chapitre III:

Figure 1: Épissage alternatif de l'exon 18 de NCAM

in vivo . . .

75 Figure 2: Régulation de la sélection du site d'épissage 5' de El8 ... 76 Figure 3: Régulation de la sélection du site d'épissage 3' de El8 . . . . . . . . . . . . 77 Figure 4: Des séquences dans l'exon constitutif El7 favorisent l'épissage El7/El9 78 Figure 5: Alignement des séquences de El 7 chez différentes espèces de

vertébrés et formation de complexes neuro-spécifiques renfermant

des protéines SR sur El 7 . . . 80

Figure 6: Épissage

in vitro

en présence d'un compétiteur d' ARN contenant

Discussion

Figure 1:

les séquences de E17 . . . . . . . 82

Schéma d'intégration des mécanismes de régulation de l'inclusion neuro-spécifique de l'exon 18 de NCAM . . . 95

LISTES DES ARTICLES

Chapitre 1: The Ul small Nuclear Ribonucleoprotein/5' splice site interaction affects U2AF65 binding to the downstream 3' splice site.

Chapitre II: Natural base pairing interactions between 5' splice site and branch site sequences affect mammalian 5' splice site selection.

Chapitre

m:

Sequences within a constitutive exon are bound by SR proteins and modulate NCAM alternative splicing.

LISTE DES ABRÉVIATIONS

RNA . . . . . . . . . . . . . . Acide ribonucléique ATP

Bru

Adénosine triphosphate Bromouridine

°C . . . . . . . . . . . . . Degré Celsius cpm . . . . . . . . . . . . . . coups par minute

dCTP . . . . . . . . . . . . . désoxycytidine triphosphate

DMEM . . . . . . . . . . . . "Dulbecco's modified Eagle medium" DMSO . . . . . . . . . . . . . Diméthylsulfoxide

DNA . . . . . . . . . . . . "Deoxyribonucleic acid" DNase . . . . . . . . . . . . . Désoxyribonucléase

dNTPs . . . . . . . . . . . . . Désoxynucléotides triphosphates DTT . . . . . . . . . . . . . . Dithiothréitol

EDTA . . . . . . . . . . . . . "Ethylenediamine-tetraacetic acid" fmol . . . . . . . . . . . . . . Femtomole

h . . . . . . . . . . . . . . heure

Hepes . . . . . . . . . . . . . Acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-éthanesulfonique kDa . . . . . . . . . . . . . . Kilodalton

M . . . . . . . . . . . . . Molaire mg . . . . . . . . . . . . . Milligramme min . . . . . . . . . . . . . . . Minute

ml . . . . . . . Millilitre mM . . . Millimolaire nt . . . . . . Nucléotide

PAGE . . . "Polyacrylamide gel electrophoresis" PCR

pmol

"Polymerase chain reaction" picomole

RNase . . . Ribonucléase

RT-PCR . . . . "Reverse transcriptase-polymerase chain reaction" SOS . . . . . . Sodium dodécyl sulfate

snRNA . . . "Smalt nuclear ribonucleic acid" snRNP . . . "Smalt nuclear ribonucleoprotein" U . . . "Units"

UTP . . . . Uridine triphosphate

UV . . . Ultra violet

v/v Volume/volume

µg . . . Microgramme

RFsUMÉ

L'exon El8 du pré-mRNA de la NCAM murine est épissé alternativement. Afin de déterminer les facteurs en cis et en trans impliqués dans cet épissage alternatif, un système

in vitro a été mis au point. Ce système a permis d'observer une régulation histo-spécifique de l'utilisation du site d'épissage 5' et du site d'épissage 3' de El8 et ce, en absence de la majorité des séquences de El8 et des introns tlanquants. L'utilisation d'un substrat d'épissage renfermant seulement l'unité d'épissage El8-El9 réduite à une taille minimale a permis de mettre en évidence un appariement de bases entre les positions +5 et +8 du site d'épissage 5' de El8 et -30 à -33 en amont du site d'épissage 3' de El9. De plus, lorsque testées dans le contexte d'un pré-mRNA contenant les sites d'épissage 5' de El7 et de El8 en compétition pour le site d'épissage 3' de E19, des mutations en amont du site de branchement majeur (aux positions -32 et -33) favorisent l 'épissage El8/El9 dans des extraits NIH3T3. Des mutations compensatoires introduites aux positions +7 et +8 du site d'épissage 5' de El8 neutralisent l'effet des mutations au site de branchement et défavorisent l'épissage El8/El9. L'ensemble des résultats présentés suggèrent donc que la structure se forme de façon précoce et interfère avec l'assemblage de complexes initiés au site d'épissage 5' de El8. Ce nouveau type d'interaction intronique pourrait exister dans d'autres pré-mRNAs eucaryotes.

Une délétion de 61 nt dans l 'exon constitutif El 7 entraîne une stimulation de l'inclusion de El8 in vivo dans les cellules neuronales N2a. L'utilisation du système in

d'épissage 5' de El7. Des protéines SR purifiées lient des séquences dans El7 et font partie d'un complexe se formant spécifiquement sur l'élément dans des extraits neuronaux. Des expériences de compétition supportent un modèle dans lequel la liaison des protéines SR à l'exon El7 assure qu'un niveau adéquat de messagers ne contenant pas El8 soit produit dans les cellules d'origine neuronale. D'un autre côté, i~absence de formation de

complexes sur El7 dans les extraits NIH3T3 suggère que l'épissage El7/E19 se fait par défaut dans les fibroblastes et ne requière aucune stimulation.

INTRODUCTION

Le niveau élevé de diversité et de spécialisation des cellules eucaryotes requière des mécanismes complexes et précis de régulation de l'expression des gènes. Cette régulation peut d'abord se faire au niveau de la transcription, puis lors de l'épissage des pré-mRNAs, de la polyadénylation et del 'édition ou finalement au niveau de la stabilité et du transport des RNAs messagers (mRNAs). L'épissage est d'une importance particulière, principalement lorsqu'un transcrit primaire est épissé de façon alternative pour générer des messagers encodant différentes protéines. L'épissage alternatif permet, par exemple, de générer jusqu'à 64 différents isoformes de la troponine T (Breitbart et al., 1989), et potentiellement au-delà de 1000 pour la glycoprotéine de surface CD44 (Sherman et al., 1996). De plus, l'expression de ces isofonnes peut être histo-spécifique et régulée pendant le développement. Dans la plupart des cas, les protéines générées par épissage alternatif partagent de grandes régions similaires et varient seulement dans des domaines spécifiques permettant ainsi une modulation fine de la fonction associée à ces protéines, tout en conservant la stabilité génomique des cellules (Smith et al., 1989). Par exemple, les pré-mRNAs de fosB et de CREM peuvent donner naissance à des activateurs ou à des répresseurs de la transcription par épissage alternatif (Foulkes et al., 1992; Foulkes &

Sassone-Corsi, 1992). L'épissage alternatif peut également influencer la localisation d'une protéine. Par exemple, l'inclusion spécifique de certains exons dans les messagers de fibronectine produits dans le foie, entraîne la production d'une forme plasmatique, tandis

que la fonne produite dans d'autres tissus se retrouve plutôt dans la matrice extracellulaire (Hynes, 1989).

L'expression des proto-oncogènes et des suppresseurs de tumeurs doit être régulée de façon très fine afin de prévenir la transformation d'une cellule normale en cellule cancéreuse. Il est maintenant bien documenté que plusieurs de ces gènes sont épissés de façon alternative. Par exemple, les récepteurs membranaires de type tyrosine-kinase,

src

et

ras

(Black, 1992; Cohen et al., 1989), les oncogènes nucléaires myb et mye (Shen-Ong, 1987; Kaye et al., 1988) ainsi que les suppresseurs de tumeurs p53 et wtl (Arai et al., 1986; Matlashewski et al., 1987; Bickmore et al., 1992) sont tous épissés alternativement. Finalement, l 'épissage alternatif constitue un aspect essentiel de la régulation du patron d'expression des molécules morphogénétiques. Chez la drosophile, l' épissage alternatif influence, entre autre, l'expression des gènes homéotiques Antennapedia et Ultrabithorax (Smith et al., 1989). Il est maintenant clair que chez les mammifères, l 'épissage alternatif est également important pour l'établissement du patron d'expression des molécules impliquées dans le développement. Par exemple, des formes épissées alternativement ont été isolées pour 5 des 9 gènes "paired-box" (Pax-2, 3, 5, 6 et 8) (Stuart et al., 1993; Vogan et al., 1996; Zwollo et al., 1997).

Épissage constitutif

L 'épissage se fait via deux réactions consécutives de trans-estérification à l'intérieur d'un complexe ribonucléoprotéique appelé spliceosome. Celui-ci est formé par l'addition successive et dynamique de quatres "petites ribonucléoproteines nucléaires" (U 1, U2, U4/U6 et US snRNPs) ainsi qu'un nombre encore grandissant de facteurs protéiques non-associés aux snRNPs (Moore et al., 1993). Les séquences cis requises dans le pré-mRNA consistent en un site d'épissage 5', un site de branchement, une région riche en pyrimidines, ainsi qu'un site d'épissage 3' dont les consensus respectifs sont: /GURAGU, YNYURAC, poly Y et YAG/ (/correspond aux sites de clivage; R=purine; Y=pyrimidine et N=G, A, U ou C) (Senapathy et al., 1990, Anderson & Moore, 1997).

Le premier événement de reconnaissance des signaux d'épissage se fait au niveau du site d'épissage 5', via un appariement de bases avec le snRNA Ul, ainsi qu'au niveau de la séquence riche en pyrimidine et du AG au site d'épissage 3', où se lie un facteur protéique appelé U2AF5 (Black, 1995; Reed, 1996). La liaison du snRNP Ul à un site d'épissage 5' peut, grâce à des interactions par delà l'exon, favoriser la liaison de U2AF5 _{à un site}

d'épissage 3' en amont. Ces évidences ont donné naissance au modèle de l"'exon definition" voulant que l'unité exonique soit la première reconnue sur le pré-mRNA (Hoffman & Grabowski, 1992; Robberson & Berget, 1990; Staknis & Reed, 1994). Plusieurs protéines sont également impliquées dans la formation d'un pont entre le site d'épissage 5' et le site d'épissage 3' permettant ainsi une délimitation de l'unité intronique (Fig. 1). Les protéines SR, une famille de facteurs d'épissage renfermant un domaine de

liaison au RNA (RRM) ainsi qu'une région C-terminale riche en dipeptides d'arginines (R) et sérines (S) sont importantes pour la formation de ces interactions (Fu, 1995; Manley &

Tacke, 1996; Chabot, 1996). Le domaine RS des protéines SR leur permet d'interagir simultanément avec la petite sous-unité protéique d'U2AF, U2AF35, et la protéine de 70 kDa spécifique au snRNP Ul (Wu & Maniatis, 1993; Staknis & Reed, 1994; Zuo & Maniatis, 1996). Un second groupe d'interactions a récemment été mis en évidence chez la levure et implique Mud2p, une protéine ressemblant à U2AF5, BBP, une protéine responsable de la reconnaissance du site de branchement, ainsi qu'une autre protéine associée à Ul, Prp40p (Abovich & Rosbash, 1997; Berglund et al., 1997). U2AF5 _et

SFl, l'orthologue mammifère de BBP, interagissent fortement dans un test de double-hybrides et font tous deux parties des complexes d'épissage précoces, ce qui suggère qu'au moins certaines de ces interactions protéines-protéines sont conservées chez les mammifères (Aming et al., 1996; Abovich & Rosbash, 1997; Berglund et al., 1997). Basé entre autre sur l'observation qu'il n'existe aucun homologue connu des protéines SR chez la lewre, il a été proposé que ce nouveau groupe d'interactions pourrait constituer la voie majeure de communication entre le site d'épissage 5' et le site d'épissage 3' et que la voie impliquant les protéines SR serait plutôt impliquée dans la définition de l'unité exonique (Abovich & Rosbash, 1997). Une protéine récemment décrite, Urp, interagit avec U2AF5 et les protéines SR et pourrait avoir un rôle similaire à U2AF35 _{à cette étape}

(Tronchère et al., 1997), ce qui suggère également que plusieurs voies parallèles peuvent prendre place à cette étape et que les mécanismes impliqués pourraient s'avérer plus complexes qu'initialement soupçonné.

Ces différentes définissent le premier complexe d" épissage, "'oomrfiltment complex"' ou complexe d"engagement, qlli permet le recrntement

Celui-ci, grâce à son avec , He le de branchemerirt

appariement de ainsi que plusieurs contacts protéines~

site 5' site de branchement site 3' site 5'

Figure 1: Reconnaissance initiale des signaux c!'épissage et définition de ï'unité intronique

et exonique.

un

RNA et permet la formation B (Zamore et aL, Gozani et , 1996;

Valcirœl et , 1996). Cette étape est la première requérant la présence

œ

ATP ~ qui est

probablement hydrolysé par

U2AF5 _{(Fleckner et}

une hélicase de type "DEAD-box" recrutée par

mode de recrutement snRNP U2 indépendant de

U2AF5 _{a été mis en évidence récemment et laisse entrevoir des voies alternatives de} formation du spliœosorne à cette étape également (MacMillan et , 1997). Le complexe C est finalement formé par ~~~·H·~,.. du tri-snRNP [U4/U61l'i1U5]. Des réarrangements

s· splice site branchsile 3' splice site

'

'

'

Exon 1 ÔGU~AGU A-Py-AG. Exon 2

2'0H

"'·

... .

Step 1

1

5' splice site cleavage _{and lariat formation}

c~

~-~'OH + A--AG~~· --~ ...

·""'

Step 2

c

G 0 _A---OH

3' splice site cleavage and exon ligation

+

5· SS BP 3' SS

î î î

1Exon1 IGu~AGU---A-Py-AGl Exon 2 l Pre-mRNA U1

t

SR-proteins U2AF Ul U2AF ·-®-,a,----, c=::::J---A-cJi.____J SF3b SF3a (,....\~~\ __ 17S U2t ~j~ 12S U2 Jb

œePi

U4/U6 us U4/U5/U6

t

ATP U2 tri-snRNP specific proteins

~

~

~SF4

i

ATP

r

·1ate" splicing proteins PSF ATP Commit ment Complex E Pre-Splicing Complex A Earl y Splicing Complex B Late Splicing Complex

c

Post-Splicing Complex

Figure 2: (à gauche) Représentation schématique des deux étapes catalytiques de transestérification de la réaction d'épissage des pré-mRNAs. (à droite) Synthèse de la voie de formation des complexes d'épissage (tiré de Kriimer, 1996).

le site d'épissage 5' et le snRNA U2, ce qui amènera la juxtaposition dans l'espace de l'adénosine au site de branchement et de son site d'attaque nucléophilique (Sharp, 1994; Nilsen, 1994; Adams et al., 1996). La première réaction de transestérification, amène le clivage au site d'épissage 5' et la formation d'un intermédiaire sous forme de lasso. Par ia suite, d'autres réarrangements se produisent et la seconde réaction de catalyse entraîne le relâchement des exons ligués entre eux (mRNA) ainsi que de l'intron sous forme de lasso. La seconde réaction est moins bien comprise que la première chez les eucaryotes supérieurs. Par contre, des travaux récents laissent entrevoir un certain niveau de conservation fonctionelle avec le spliceosome de la levure S.

cerevisiae.

Chez cet organisme, plusieurs facteurs spécifiquement requis pour la deuxième réaction ont été caractérisés (Prpl6, Prp17, Prpl8, Slu7 et Ssflp) et une étape de réarrangement structural A TP-dépendante précédant la transestérification a été mise en évidence (U men & Guthrie, 1995). Un homologue humain de Prpl8 a récemment été découvert, et il a été démontré que cette protéine peut être substituée par la protéine de la levure dans une réaction d'épissage (Horowitz & Krainer, 1997). Ces résultats suggèrent qu'au moins certains aspects du mécanisme de la seconde réaction d'épissage ont été conservés durant l'évolution. Chez les mammifères, d'autres données commencent à émerger concernant l'identité des facteurs essentiels pour la deuxième étape. Il est connu que suite à la première réaction, trois polypeptides associés au snRNP US remplacent U2AF5 _{et lient la}

séquence riche en pyrimidine (Chiara et al., 1997). PSF, un facteur liant également la région riche en pyrimidine ainsi qu'une protéine d'environ 70 kDa (p70 ou AG75) sont aussi requis pour la seconde réaction (Patton et al., 1993; Gozani et al., 1994; Chiara et

al, 1996; Wu & Green, 1997). Malgré l'absence de preuve formelle, plusieurs évidences suggèrent que la composante RNA des snRNPs (U6 et/ou U2) est responsable de la catalyse à l'intérieur du spliceosome (Nilsen, 1994; Madhani & Guthrie, 1994; Umen & Guthrie, 1995). Par contre, il est clair que la présence de protéines responsables de stabiliser et/ou déstabiliser certaines interactions snRNA-snRNA et snRNA-pré-mRNA est également requise.

Épissage alternatif

Les signaux d'épissage de base sont faiblement conservés chez les eucaryotes supérieurs et ne peuvent à eux seuls fournir la spécificité et la précision requise pour la sélection et le pairage correct des sites d'épissage sur de grands pré-mRNAs. De plus, ce niveau de complexité se trouve accru lorsque l'épissage alternatif est considéré, puisque des sites reconnus et utilisés dans certains types cellulaires peuvent être ignorés dans d'autres cas. Il existe différents types d'épissage alternatif, le plus souvent rencontré étant celui des exons de type cassette. On peut également retrouver des paires d'exons mutuellement exclusifs, des sites 5' ou 3' alternatifs, des introns qui seront épissés ou inclus dans le pré-mRNA, des exons mutuellement exclusifs renfermant des sites de polyadénylation distincts ou encore des promoteurs distincts qui entraîneront l'utilisation d' exons alternatifs, sans compter plusieurs variantes possibles de chacun de ces types d'épissage alternatif. Il est donc nécessaire de faire intervenir d'autres éléments agissant

en cis ainsi que des facteurs trans pouvant moduler l'interaction initiale des facteurs d'épissage constitutif, tel que le snRNP Ul et U2AF, avec le pré-mRNA.

Dans certains cas, des facteurs d'épissage alternatif peuvent compétitionner de façon directe avec des facteurs constitutifs comme U2AF65 _{et le snRNP U2 pour leur site}

de liaison respectif (Valcarcel et al., 1993; Lin & Patton, 1995; Singh et al., 1995; Kanopka et al, 1996; Chan & Black, 1997). Les séquences entourant un site d'épissage peuvent aussi influencer leur fréquence d'utilisation. Un des exemples les mieux caractérisé de ce type de séquences sont les "enhancer" exoniques de type purine-riche. Ceux-ci se retrouvent dans plusieurs exons constitutifs et alternatifs, sont liés par différentes sous-populations de protéines SR (Black, 1995; Fu, 1995; Manley & Tacke, 1996; Chabot, 1996; Yeakley et al., 1996; Du et al., 1997) et peuvent influencer l'interaction des facteurs constitutifs au site d'épissage 3' (Lavigueur et al., 1993; Wang et al., 1995) ou 5' (Humphrey et al., 1995). De façon intéressante, un élément de type purine-riche peut avoir un effet négatif sur l'utilisation d'un site d'épissage 3' lorsque positionné dans un intron (Kanopka et al., 1996). Récemment, un nouveau type d'"enhancer" exonique A/C-riche fonctionnant via les protéines SR, a été identifié par une méthode de sélection in vivo (Coulter et al., 1997). Les protéines SR peuvent également influencer l'épissage alternatif en absence de sites de liaison spécifique, plus précisément en favorisant la sélection des sites d'épissage 5' ou 3' proximaux sur différents pré-mRNAs (Horowitz & Krainer, 1994; Fu, 1995; Manley & Tacke, 1996; Chabot, 1996). Cet effet est antagonisé in vitro et in vivo par la protéine hnRNP Al (Mayeda & Krainer, 1992;

Yang et al., 1994). Il est proposé que l'effet observé des protéines SR sur la sélection des sites 5' est médié par la stabilisation ou le recrutement du snRNP Ul, via l'interaction du domaine RS des protéines SR et de Ul 70 kDa (Eperon et al., 1993; Kohtz et al., 1994). Des kinases spécifiques pouvant phosphoryler le domaine RS des protéines SR ont été caractérisées (Woppmann et al, 1993; Gui et al., 1994a,b; Colwill et al., 1996; Rossi et al., 1996). Cette phosphorylation est requise pour la liaison spécifique de SRp40 sur un "enhancer" d'épissage (Tacke et al., 1997) ainsi que pour les interactions protéines-protéines essentielles aux fonctions dans l'épissage de ASF/SF2 (Xiao & Manley, 1997). De plus en plus d'études portent d'ailleurs sur l'implication de la phosphorylation/déphosphorylation dans l 'épissage, autant au niveau de la formation du spliceosome (Mermoud et al., 1994), de la réaction d'épissage proprement dite (Tazi et al, 1992; Mermoud et al., 1992; Tazi et al., 1993), ainsi que de la localisation nucléaire des facteurs d'épissage (Gui et al., 1994a; Colwill et al., 1996).

Des séquences introniques peuvent également influencer positivement l'utilisation d'un site d'épissage (Huh & Hynes, 1994; Zhao et al., 1994; Del Gatto & Breathnach, 1995; Lou et al., 1995; Min et al., 1995, Sirand-Pugnet et al., 1995a; Carlo et al., 1996; Ryan & Cooper, 1996; McCullough & Berget, 1997; Wei et al., 1997). Un nombre grandissant de séquences exoniques et introniques sont rapportées comme ayant un effet négatif sur la reconnaissance des sites d'épi'>sage avoisinants (Gontarek et al., 1993; Siebel et al., 1994; Amendt et al., 1994; Caputi et al., 1994; Siebel et al., 1995; Chan & Black, 1995; Staffa & Cochrane, 1995; Del Gatto et al., 1996; Adams et al., 1997). Il est

intéressant de noter que la liaison de ASF/SF2 ou de SC35, deux membres de la famille des protéines SR, à une séquence intronique riche en pyrimidine stimule l'utilisation du site d'épissage S'en amont ou l'inhibe, respectivement (Gallego et al., 1997). Finalement, la formation de structures secondaires dans le pré-mRNA peut aussi influencer la sélection des sites d'épissage par différents mécanismes. Premièrement, on retrouve plusieurs exemples de structures secondaires naturelles ou artificielles, qui influencent négativement l'utilisation d'un site d'épissage par encombrement stérique ou séquestration de ce site (Solnick, 1985; Eperon et al., 1986; Solnick & Lee, 1987; Halfter & Gallwitz, 1988; Helfman et al., 1990; Clouet d'Orval et al., 199la,b; Deshler & Rossi, 1991; Libri et al., 1991; Estes et al., 1992; Goguel et al., 1993; Liu et al., 1995; Sirand-Pugnet et al., 1995b; Blanchette & Chabot, 1997). Dans d'autres cas, des structures secondaires stables peuvent permettre de rapprocher des signaux d'épissage naturellement trop éloignés pour être utilisés (Chebli et al., 1989; Goguel & Rosbash, 1993; Libri et al., 1995; Charpentier

& Rosbash, 1996), ou encore faciliter la présentation d'un site d'épissage adjacent (Newman, 1987; Kister et al., 1993). Des structures secondaires spécifiques peuvent aussi servir de sites de reconnaissance pour des protéines régulatrices (Shi et al., 1997) ou, comme dans le cas du pré-mRNA de levure

rp/32,

permettre la formation d'un complexe stable avec le produit du gène, la protéine ribosomale L32, et le snRNP U 1, prévenant ainsi l'entrée du snRNP U2 dans le spliceosome (Vilardell & Warner, 1994).

L'organisme

Drosophila melanogaster,

grâce aux possibilités offertes par la compréhension de sa génétique, est un modèle d'étude puissant dans le domaine de

l 'épissage alternatif (Hodges & Bernstein, 1994). En effet, les exemples d 'épissage régulés les mieux caractérisés proviennent de cet organisme. Parmi ceux-ci on retrouve la cascade de détennination sexuelle des cellules somatiques (McKeown, 1992; Moore et al., 1993; Chabot, 1996 et Fig. 2; en haut). Le premier déterminant de la cascade est l'expression femelle-spécifique de gène "sex-lethal" (sxl) à partir d'un promoteur précoce sensible au ratio des chromosomes X par rapport aux autosomes (2X:2A). SXL influence l'épissage alternatif du prochain gène impliqué dans la cascade, "transformer" (tra). En absence de SXL, le site d'épissage 3' fort de l'exon 3 de tra est utilisé par défaut et ceci résulte en la production d'une forme tronquée et non-fonctionnelle de la protéine TRA. Lorsque SXL est présent, il se lie fortement à

ce

site d'épissage 3', empêchant ainsi la liaison de U2AP5

et, par le fait même, favorise la sélection d'un site d'épissage 3' alternatif situé en aval permettant maintenant la production d'une protéine TRA fonctionnelle (Sosnowski et al., 1989; Inoue et al., 1990; Valcarcel et al., 1993; Granadino et al., 1997). SXL inhibe également l'inclusion d'un exon mâle-spécifique dans son propre pré-mRNA, lorsque l'expression se fait à partir d'un promoteur tardif (Bell et al., 1988). Dans ce cas, SXL lie de façon coopérative des séquences introniques riche en U de part et d'autre de l'exon alternatif (Horabin & Schedl, 1993; Samuels et al., 1994; Wang & Bell, 1994). Ces complexes interagissent alors avec les snRNP U 1 et U2 liés au site d 'épissage 5' et 3', respectivement, empêchant ainsi la formation des complexes d'épissage (Deshpande et al., 1996; Granadino et al., 1997). Finalement, TRA, aidé de la protéine TRA-2, influencera l'épissage de "doublesex" (dsx). TRA, TRA-2 ainsi que différentes protéines SR, lient de façon coopérative un élément exonique contenant des motifs répétés formant ainsi un

complexe capable de stimuler l'utilisation du site d'épissage 3' en amont (Tian & Maniatis, 1992, 1993, 1994; Heinrichs & Baker, 1995; Lynch & Maniatis, 1995, 1996). Cet élément, appelé dsxRE, fût d'ailleurs le prototype des enhancers d'épissage mentionnés

précédemment. Le pré-mRNA de la transposa.se de l'élément P contient un intron qui n'est épissé que dans les cellules germinales (Fig. 2; en bas). Cet événement de régulation entraîne la production d'un répresseur de la transposition (66 kDa) dans les cellules somatiques et de la transposa.se de 87 kDa dans les cellules germinales (Craig, 1990). La

rétention de cet intron dans les cellules somatiques est médiée par l'entremise d'un facteur soma-spécifique, PSI, qui entraîne la formation d'un complexe renfermant entre autre le snRNP Ul et une protéine de type hnRNP, hrp48, sur un pseudo-site d'épissage 5' situé en amont du site d'épissage 5' authentique (Siebel et al., 1994, 1995; Adams et al., 1997).

sxl tra j ( TRA2 Î

j

dsx

9

Cf

Somalie cells - repressor oî transposition

Germ celis - P element transposase

F'igure 3: Régulation par épissage alternatif de la cascade de déterminatïon des sexes et de

de

le

multitude de gènes sont épissés de façon alternative dans le système nerveux pour produire des isoformes neuro-spécifiques ayant des fonctions distinctes et précises (Burke, 1992; Stamm, 1994)" Par analogie à ce est connu chez la drosophile, un

modèle d'épissage défaut"

responsable du patron neuro-spécifique. Toutefois, jusqu'à maintenant aucun facteur. d'épissage histo-spécifique n'est encore connu et il semble plutôt que l'abondance relative de facteurs exprimés de façon ubiquitaire serait responsable du patron d'épissage alternatif associé à un type cellulaire donné. Le gène c-src murin renferme un exonde 18 nt, Nl, qui est inclu de façon spécifique seulement dans les messagers neuronaux (Levy et al., 1987; Martinez et al., 1987 et Fig. 3).

•, ' .·:3

4

Epissage neuronal

Figure 4: Épissage alternatif de l'exon NI de c-src.

Dans les cellules non-neuronales, la petite taille de l'exon Nl ainsi que des éléments introniques négatifs situés de part et d'autres de celui-ci, entraînent son exclusion (Black, 1991; Chan & Black, 1995). Récemment, il a été démontré que l'élément négatif situé dans la séquence riche en pyrimidine en amont de l'ex on alternatif, est lié de façon spécifique par PTB (Chan & Black, 1997). Dans les cellules neuronales, l'inclusion de Nl est rendue possible grâce à la formation d'un complexe renfermant plusieurs protéines sur un élément intronique situé en aval de Nl (Min et al., 1995). Ce complexe renferme entre autre la protéine hnRNP F ainsi qu'un nouveau facteur d'épissage, KSRP, qui est plus

abondant dans les cellules neuronales mais qui est tout de même exprimé dans tous les

types cellulaires (Min et al., 1995, 1997). Récemment, l'épissage d'un autre petit exon (24 nt) inclus de façon neuro-spécifique dans les messagers du récepteur GABA"' "(2, a été décrit et semble régulé par un mécanisme similaire (Zhang et al., 1996; Ashiya &

Grabowski, 1997). Dans les cellules non-neuronales, un complexe impliquant encore une fois PTB se forme sur des sites répresseurs situés de part et d'autre du site de branchement et dans l'exon alternatif. Ce complexe interférerait avec la liaison du snRNP U2 pour inhiber l'épissage de l'intron en amont de l'exon alternatif (Ashiya & Grabowski, 1997). L'inclusion neuro-spécifique est médiée via des éléments positifs chevauchant les éléments répresseurs

par

un mécanisme encore inconnu (Zhang et al., 1996). Une forme alternative de PTB se retrouvant majoritairement dans les neurones pourrait potentiellement influencer différenciellement l'épissage alternatif (Ashiya & Grabowski, 1997; Chan & Black, 1997). L 'épissage alternatif du pré-mRNA de la "calcitonin/calcitonin gene-related peptide" (CT/CGRP) implique l'inclusion alternative d'un exon terminal (exon 4) à l'intérieur d'un transcrit contenant six exons (Fig. 4). L'épissage menant à la production de CT représente la voie par défaut, et requière l'inclusion de l'exon 4 comme exon terminal et la polyadénylation à ce site. L'épissage menant à la production de CGRP est restreint à

quelques types cellulaires. incluant les neurones, et requière l'exclusion de l'exon 4, la ligation directe de l'exon 3 à l'exon 5 et la polyadénylation à la fin de l'exon 6 (Amara et al., 1982; Crenshaw et al., 1987). Comme c'est le cas pour plusieurs unités alternatives, les signaux d'épissage, et de polyadénylation dans ce cas, de l'exon 4 sont relativement faibles, ce qui contribueraient à son exclusion dans les neurones (Yeakley et al., 1993; van

Oers et al., 1994). Il été proposé que l'inclusion de l'exon 4 dans les autres types cellulaires serait médiée grâce à la stimulation de la polyadénylation à ce site, par l'entremise d'un élément intronique situé en aval de l'exon 4 (Lou et al., 1995). Cet élément renferme un site d'épissage 3' (région riche en pyrimidine et CAG) directement juxtaposé à un site d'épissage 5'. Récemment, il fut démontré que le snRNP Ul, ASF/SF2 ainsi que PTB sont requis pour l'activation maximale de la polyadénylation via cet élément, ce qui constitue un exemple nouveau où un évenement d'épissage différentiel est en fait contrôlé au niveau de la polyadénylation (Lou et al., 1996). L'épissage des exons terminaux du pré-mRNA des chaînes lourdes IgM serait également régulé au niveau de la polyadénylation (Takagaki et al., 1996). Ces résultats, ainsi que plusieurs travaux démontrant un lien entre l'épissage et la transcription (Steinmetz, 1997), nous indiquent qu'il sera nécessaire dans le futur d'étudier ces différents processus cellulaires d'un point de vue plus concerté.

CT thyroid C cells A CGRP neuronal cens .---__,/ intron enhancer _J exon4 J

JiS

!._. ---' 168

3' sptice site 5' splice site

A

CUCCGCUCCUCUUCCAG GUAAGACUGAGGAAUUUUUUAUUUU

Mes travaux au doctorat ont porté sur l'épissage alternatif de la "neural cell adhesion molecule" (NCAM) de souris. NCAM est une glycoprotéine membranaire renfermant cinq boucles de type immunoglobuline (Fig. 5) impliquée dans des interactions cellules-cellules de type homophiliques et est importante pour l'établissement des patrons cellulaires lors de l'embryogénèse précoce (Edelman, 1988; Rutishauser & Jessel, 1988). Plus tard dans le développement, NCAM est aussi impliquée dans la croissance des axones (Landmesser et al., 1988), la migration des neuroblastes (Silver & Rutishauser, 1984) ainsi que différents aspects de la myogénèse (Dickson et al. , 1990). On observe trois isoformes majeurs de NCAM qui furent nommés NCAM-120, 140 et 180 en vertu de leur migration sur gel SOS-PAGE. NCAM-120 ne possède pas de domaine trans-membranaire et est plutôt ancrée à la membrane par l'entremise d'un glycosyl-phosphatidylinositol. Les isoformes NCAM-140 et NCAM-180 possèdent tous deux un domaine trans-membranaire,

111ais

diffèrent par la présence d'un domaine cytoplasmique de 267 acides aminés (Cunningham et al., 1987). Ces trois isoformes sont générés par épissage alternatif et par l'utilisation de signaux de polyadényla:ion différentiels dans la région 3' du pré-mRNA (Barbas et al., 1988).

L'isofonne NCAM-180 s'accumule aux sites de contacts cellules-cellules, est moins mobile dans le plan de la membrane et interagit avec le cytosquelette, suggérant l'importance fonctionnelle du domaine cytoplasmique dans le phénomène d'adhésion

cellulaire (PoUerberg et aL ~ _Ce cytoplasmiq11e est codé un exorii

unique (ex on 1 de nt, l' indusion est régulée, de 180 k:Da

et sorn messager respectif ne se retrouvent que dans les tissus d'origine et dans une plus forte proportion dans les cellules neuronales différenciées (PoUerberg et aL , Bal1ithe1s et a.Li 1988). H existe ég2Jement autres d'épissage

tviembrnne cell u!aire NCAM.-120

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18 . If-, ~---:• '----~-~ ~JC-.-1-t-~--' Epissage neuronal Y79)

Figure 6: Structure protéique et génomique de NCA1\1. Les différents domaines d'épissage alternatif sont indiqués. LP..s codons STOP sont représentés par des cerdes noirs et les sites de polyadénylation par pA.

région 5' du pré-mRNA de NCAM, qui code pour la portion N-terminale (extra-cellulaire) de la protéine. On retrouve un exon-cassette de 30 nt, l'exon 7t ou VASE, dont l'inclusion

entre les exons 7 et 8 est régulée pendant le développement (Santoni et al., 1989). La seconde région de diversité est appelée "muscle-specific domain" et se situe entre les exons 12 et 13, où peuvent être insérés de façon combinatoire quatre petits exons de 15, 48, 42 et 3 nt, en plus de l'exon SEC, qui entraîne la production d'une forme sécrétée de NCAM (Gower et al., 1988; Hamshere et al., 1991). Le pré-mRNA de NCAM renferme donc à

la fois un des plus grands exons alternatif connus, l'exon 18, et le plus petit, le triplet AAG. Le site d'épissage 5' de El8 joue un rôle important dans la régulation de l'inclusion de cet exon puisque son utilisation augmente pendant le développement des cellules neuronales, même lorsque placé dans le contexte d'un pré-mRNA hétérologue (Tacke & Goridis, 1991).

Nous avons utilisé un système d'épissage

in vitro

afin de mettre en évidence les éléments impliqués dans la régulation de l'épissage alternatif neuro-spécifique de la NCAM murine. Nos résultats ont documenté la présence d'un appariement de bases impliquant les nucléotides aux positions +5 à +8 du site d'épissage 5' de El8 et aux positions -3 à

-6

par

rapport au site majeur de branchement. Cette structure semble se former de façon précoce dans des extraits non-neuronaux, lorsque les interactions définissant l 'intron amènent à proximité l'une de l'autre ces deux régions. Nos résultats suggèrent qu'il y a alors déstabilisation de ces interactions (liaison de U2AF au site d'épissage 3' et formation des complexes Ul-dépendant au site d'épissage 5') produisant ainsi un effet négatif sur la

sélection du site d'épissage 5' de El8. En poursuivant l'étude des séquences cis

importantes pour la régulation, nous avons mis en évidence un élément situé dans l 'exon constitutif El 7, celui-ci ayant une influence positive sur l'utilisation du site d 'épissage 5' adjacent dans des extraits neuronaux. L'effet de cet élément est médié via la formation d'un complexe renfermant des protéines SR et un ou plusieurs facteurs neuro-spécifiques incluant.

PRÉAMBULEI

Article #1: L'interaction entre le snRNP Ul et le site d'épissage 5' influence la liaison de U2AF5 au site d'épissage 3' en aval.

publié dans: "The Journal of Biological Chemistry" en 1995.

Auteurs: Jocelyn Côté, Jude Beaudoin, Roland Tacke et Benoit Chabot.

CootJibution: J'ai effectué toutes les expériences présentées dans les figures de cet article. Jude Beaudoin a initié le projet sur l 'épissage alternatif de NCAM et a construit les plasmides pSPE et pSPD. Roland Tacke nous a fournis le clone génomique de souris de NCAM.

(

(

THE JOLllL"l'AI. rn· B1oux;1cAL CllEMJ!'lïKY

Cl 1995 by The Americnn Society for Booch,•nu.iry nnd ~loleculnr 81oloi:y, lnc.

Vol. 270. :"o. Il, l•sue of February 24, pp. 4031-4036, 1995

l'rinted in U.S.A.

The Ul Small Nuclear Ribonucleoprotein/5' Splice Site Interaction

Affects U2AF

65

_{Binding to the Downstream 3' Splice Site*}

<Received for publication, October 6, 1994, and in revised form, December 1, 1994)

Jocelyn Côté:j:, Jude Beaudoin§, Roland Tacke1111, and Benoit Chabot••

From the Département de Microbiologie, Faculté de Médecine, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec JlH 5N4,

Canada and 11Centre d'immunologie, Centre National de la Recherche Scientifique de Marseille-Luminy,

F-13288 Marseille Cédex 9, France

In the gene of the neural cell adhesion molecule, the 5' splice site of the alternate exon 18 plays an important role in establishing regulated splicing profiles. To un-derstand how the 5' splice site of exon 18 contributes to splicing regulation, we have investigated the interac-tion of the U2AF66 splicing factor to pre-mRNAs that contained portions of the constitutive exon 17 or the alternate exon 18 fused to exon 19 and separated by a shortened intron. Despite sharing an identical 3' splice site, only the pre-mRNA that contained a portion of exon 17 and its associated 5' splice site displayed efficient U2.AF65 cross-linking. Strikingly, a G -+ U mutation at

position +6 of the intron, converting the 5' splice site of exon 18 into that of exon 17, stimulated U2AF'5 cross-linking. The improved cross-linking efficiency ofU2.AF65 to a pre-mRNA carrying the 5' splice site of exon 17 required the integrity of the 5' end of Ul but not of U2 small nuclear RNA. Our results indicate that neural cell adhesion molecule 5' splice site sequences influence U2AF615 _{binding through a Ul small nuclear}

ribonucleo-protein/U2AF interaction that occurs at the commit-ment stage of spliceosome assembly, before stable bind-ing of the U2 smalt nuclear ribonucleoprotein. Thus, the 5' splice sites of exons 17 and 18 differentially affect U2.AF65 binding to the 3' splice site of exon 19. Facto:-& that modulate Ul small nuclear ribonucleoprotein bind-ing to these 5' splice sites may play a critical rolc in regulating exon 18 skipping.

The first step of splicing of nuclear pre-mRNAs occurs through cleavage at the 5' splice site with concomitant joining of the intron 5' end to the 2' hydroxyl of a residue in the branch site region of the intron. The second step of splicing promotes the excision of the lariat intron and the ligation of the exons. In mammals, mutations at the invariant G 1 and U2 positions of the intron allow branch formation, sometimes at a reduced rate, and often prevent the second step of splicing leading to the accumulation of lariat intermediate ( 1 ). Mutations at other

• The costa of publication ofthis article were defrayed in part by the payment of page charges. This article must therefore be hereby marked

"aduertisement" in accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to

indicate this fnct.

:j: Recipient of a studentahip from the National Sciences and Engi-neering Research Council of Canada.

§ Present address: Département de Biologie, Faculté des Sciences, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canaùa JlK 2RL

Il Present address: Dept. ofBiological Sciences, Columbia University, New York, NY 10027.

.. Supported by a grant Crom the Medical Research Council of Can-ada. A Research Scholar of the Medical Research Council of CanCan-ada. To whom correspondence should be addressed: Département de Microbi-ologie, Faculté de Médecine, Université de Sherbrooke, 3001, 12th Ave. North, Sherbrooke, Québec, Québec JlH 51:\4. Canada. Tel.: 819-564-5295; Fax: 819-564-5392.

positions of the 5' splice site reduce splicing efficiency and frequently promote the utilization of cryptic 5' splice sites (1). Pre-mRNA splicing takes place in the spliceosome, a large multicomponent complex that is sequentially assembled on the pre-mRNA and that contains small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs)1 ( 1-3). The 5' splice site region is initially recognized by the Ul snRNP (4). The branch site region is recognized by the U2 snRNP (5) and requires prior binding of the non-snRNP splicing factor U2AF65 _{to the downstream polypyrimidine}

tract-AG at the 3' splicejunction (6, 7). Other factors that have been shown to associate with 3' splice site sequences include the intron-binding prolein associated with U5 snRNP (8) and hnRNP proteins Al, Cl/C2, D, and I/PTB (9, 10).

In mammals, early pre-spliceosome complexes formed in the absence of ATP contain several factors including U2AF and Ul snRNP (11-13). 'T'he U2 snRNP has also been detected in related complexes (14). Because the formation of ATP-inde-pendent splicing complexes i11 more efficient when both 5' and 3' splice sites are present (13, 14), it was suggested that the 5' splice site is important in fixing the use of a 3' splice site by mediating an interaction between Ul snRNP and U2AF (13).

An interaction between Ul snRNP and U2AF has recently received support from the demonstrRtion that members of the serine-arginine-rich family of splicing factors (e.g. SF2/ASF

arid SC35) can interact both with U2AF35 _{(15) and y,jth the Ul}

snRNP-70 kDa protein (15, 16). A network of interactions in-volving Ul snRNP-70 kDa/(SC35/SF2)/U2AF35_/U2AF65 _may

therefore be critical to commit the use of a pair of 5' and 3' splice sites. On the other hand, 5' splice site sequences down-stream from a weak 3' splice site have been shown to facilitate U2AF65 _{binding in a process that requires the participation of}

other factor(s) (17}. Thus, a similar network of interactions involving Ul snRNP and U2AF is possibly assembled across the exon to stimulate the use of a weak 3' splicc site.

The pre-mRNA encoding the larger neural cell adhesion mol-ecules <NCAMJ is alternatively spliced to yiel<i two mRNAs differing by the incorporation of a 801-nucleotide exon (exon 18) (18). The 5' splice site ofexon 18 is a crucial element in the regulation of exon 18 skipping since its replacement with an a-globin 5' splice site abolishes regulation (19). Moreover, the use of the 5' splice site of exon 18 is up-regulated in difîeren-tiating cella, even when placed in the context of an a-globin pre-mRNA (19). To gain a better understanding of the molec-ular mechanisms involved in exon 18 skipping, we have inves-tigated RNA-protein interactions on pre-mRNA substrates car-rying various 5' splice sites. We find that the 5' splice site of exon 18 does not favor efficient U2AF65 _{binding to the 3' splice}

site of exon 19. In contrast, a single mutation that con verts the

1 _{The abbreviations used are: snRNP, small nuclear}

ribonucleopro-tein; NCAM, neural cell adhesion molecule; PCR, polymerase chain reaction.

4032 Ul snRNP / U2AF65 _Interaction

5' splice site of exon 18 into that of exon 17 improves the interaction ofU2AF65 with the 3' splice site, in a process that requires the Ul but not the U2 snRNP.

MATERIALS AND METHODS

Plasmid Constructions and RNA Substrates-pSPE consists of a Pstl-Taql fragment containing the 5' splice site region of exon 18,

followed by a SacI-EcoRI fragment containing part of exon 19 and the

upstream intron. pSPD was obtained by deleting a HincII-SmaI

frag-ment from pSPEl 7-E18-E19-553 (a pSP64 derivative containing the 5' splice site ofboth exon 17 and exon 18 as well as the 3' splice site of exon 19).

In Vitro Mutagenesis-Site-directed mutagenesis was achieved by

overlap extension using the polymerase chain reaction (PCR) (20). The overlapping mutagenic oligonucleotides were (5' to 3'): edl, GAGAG-GACGTACTCGGTCTT; eAdl, GAGAGGACTCACCCCGTCTITGCTG; and the corresponding complements (ed2 and eAd2). The flanking oli-gonucleotides were: SP6, TTGTCGTTAGAACGCGGCTA; and Nfl, TT-GCTTGGTACCCATCATGC. The first PCRs were carried out with 15 pmol of each pair of oligonucleotides (SP6-edl, ed2-Nfl, SP6-eAdl, and eAd2-Nfl) in a 100-µ,l reaction containing 4 mM dithiothreitol, 10 mM

Tris-HCl, pH 7.5, 1.5 mM MgC12 , 50 mM KCl, 0.25 mM each dNTPs, 3 µ,g

of bovine serum albumin, 0.01 µ,g ofboiled pSPE, and 1 µ,l ofTaq DNA

polymerase (Pharmacia Biotech Inc.). The reactions were covered with mineral oil and incubated in a thermal cycler using the "touchdown" procedure (21). PCR-generated fragments from this first set ofreactions were then used directly (10 µ,l) for a second round of amplification using flanking oligonucleotide primers. The mutagenized fragments were substituted into pSPE at the PstI-BamHI site~ to give rise to pSPM and pSPW. The sequence of recombinant molecules was confirmed by DNA sequencing.

In Vitro Transcription and Incubations-Pre-mRNA substrates were

synthesized using the SP6 RNA polymerase from corresponding linear templates, in the presence of m7GpppG, 5-bromodeoxyuridine

(Boeh-ringer Mannheim) and [a-32_{P]UTP (22). Full-length transcripts were}

gel-purified before use. Oligonucleotide-directed RNase H cleavage was accomplished as described in Chabot (22) for RNA substrates and as described by Black et al. (4) for snRNA targeting. To generate D3' and

E3' RNAs, we used oligonucleotides complementary to the 5' splice site regions (Ne9, ATCCCTCCTACTCCACGTAC; NelO, TGGACAAA-GAGAGGCCGTAC) Oligonucleotides complementary to nucleotides 1-12and1-14 ofUl and U2 snRNAs, respectively, were used to target snRNP inactivation. Nuclear extracts and S-100 were prepared accord-ing to Dignam et al. (23). Extracts were depleted of endogenous ATP by

incubation at 30 °C for 30 min (11).

UV Cross-linking-Approximately 3 fmol of RNA substrates (50,000

cpm, Cerenkov) were incubated for 10 min, unless indicated otherwise, in a standard splicing reaction (24) without RNase inhibitors. A 5-µ,l aliquot was removed from each reaction, irradiated 20 min with UV, and digested with RNase A as described (25). Cross-linking products were analyzed by electrophoresis on 9% sodium dodecyl sulfate-polyac-rylamide gels. Gels were scanned on a Corning 750 densitometer.

U2AF Purification and U2AF Depletion-U2AF purification was

ac-complished following a modification of the procedure described by Zamore et al. (7). First, a HeLa nuclear extract was adjusted to 0.5 M

KCl and loaded on a heparin-agarose column. Following a washing step with Buffer A (20 mM Hepes-KOH, pH 7.9, 3 mM MgC12 , 0.1 mM

Na2EDTA, 1 mM dithiothreitol, 10% (v/v) glycerol, and 0.05% (v/v)

Nonidet P-40) containing 0.5 M KCl, the column was eluted with Buffer A containing 1 M KCl. The eluate was loaded directly on poly(U)-Sepharose 4B (Pharmacia), and the column was washed with Buffer A containing 2.4 M KCL U2AF was eluted with Buffer A containing 2 M guanidine hydrochloride and 100 mM KCl. The eluted fraction was dialyzed in Buffer B (Buffer A containing 20% (v/v) glycerol + 100 mM

KCl). Depletion ofU2AF was accomplished by loading a nuclear extract adjusted to 1 M KCl onto a poly(U)-Sepharose column as described previously (7, 17, 26). The flow-through fraction (ô.U2AF), which should contain PTB (17, 27), was dialyzed against buffer D (23). Western analyses were performed as described (28).

RESULTS

Differential U2AF65 Binding to the 3' Splice Site of Exon

19-As the 5' splice site sequence of exon 18 plays an

impor-tant role in fixing the frequency of inclusion of the alternate exon 18 (19), we wished to investigate whether this 5' splice site influenced specific RNA-protein interactions. To address

E ~F=====----1 _{55 80 29 42} E19 '--~73'---' ES' E3' E19 CGA/GUACGl! M

-/

E19 !iGQ/GU.1.?ô.G!! w

-/

E19 D E17 E19 85 99 9 DS' 1 E17 03' E19 L1 _u A 67 243 99

Fm. 1. Structure of the RNA substrates. Large boxes indicate

exons. Thin boxes and lines indicate intron sequences downstream of

exon 18 and exon 19, respectively. The black area in NCAM introns

indicates the presence of a plasmid-derived polylinker region. The adenovirus Ll-L2 A RNA is depicted in black, exons being represented

by boxes. The length (in nucleotides) of each exon and of intron regions

is indicated. The mutations introduced at the 5' splice site of exon 18 to generate M and W RNAs are underlined. Note that in W RNA, an AG

dinucleotide located 10 and 11 nucleotides ups1;ream of the 5' splice junction was artifactually converted to CC.

this question in vitro, we constructed simple NCAM substrates containing the 3' portion of exon 18 with its donor splice site fused to the 5' portion of exon 19 and its acceptor splice site (E RNA; Fig. 1). We also constructed a substrate containing the 3' portion of the constitutive exon 17 with its respective donor splice site fused to the 5' portion of exon 19 and its acceptor splice site (D RNA; Fig. 1). 32_{P-Labeled RNA substrates}

syn-thesized with bromodeoxyuridine were tested in a UV cross-linking assay in HeLa extracts. Under standard splicing con-ditions, the UV cross-linking assay revealed that E and D RNAs cross-linked to a protein with an apparent molecular mass of 65 kDa (Fig. 2A, lanes 1 and 2). Interestingly, this protein cross-linked considerably more efficiently to D RNA. The same difference in the efficiency of cross-linking was ob-served in extracts incubated at 0 °C (Fig. 2A, lanes 3 and 4), in extracts that had been depleted of endogenous ATP by prein-cubation at 30 °C (Fig. 2A, lanes 5 and 6), as well as in a HeLa S-100 extract (Fig. 2B, lanes 2 and 3). Notably, the length of the incubation period at 30 °C affected the magnitude of the differ-ence in the intensity of the 65-kDa protein cross-linked to E and D RNAs; the difference was clearly visible in a HeLa nuclear extract (H191) following a 4-min incubation at 30 °C (Fig. 2A, lanes 1 and 2), but was considerably reduced or lost after 10 min of incubation (Fig. 2B, lanes 4 and 5, and C, lanes

7 and 8). The length of the incubation period at 30 °C that yielded a maximal difference in the intensity of the 65-kDa band varied between different nuclear extract preparations (data not shown). A difference in the intensity of the 65-kDa

24

(

(

(

(

Ul snRNP / U2AF65 Interaction 4033

A

B

c

+

_{-<0~..,_'-"l'-"l ~~..,.}

_-<0"v~~t

_.t

oÛ ~.q,. c:f3 '-"l ~ ~ ~ ~ "v·

---

---

----EDEDEDED EEADEADE 20097.4 --u2AF65 69--U2AF65 46-12345678 1 2 3 4 5 12345678

FIG. 2. UV cross-linking to E and D RNAs in various extracts. A, cross-linking assays in splicing mixtures containing a HeLa extract (H191) were performed with E and D RNAs following an incubation of 4 min at 30 °C (lanes 1 and 2), an incubation at 0 cc (lanes 3 and 4), an incubation

of 4 min at 30 cc in an ATP-depleted extract (lanes 5 and 6) and in an ATP-depleted e:.."tract supplemented with exogenous ATP, creatine phosphate and MgC12 (lanes 7 and 8). The position of molecular weight markers is indicated. B, cross-linking assays were performed following an incubation

of 10 min with D and E RNAs in a HeLa S-100 and nuclear ertract (Hl91). A purified U2AF fraction was also incubated with D RNA prior to cross-linking (lane 1). The position ofU2AF65 _{and molecular weight markers is indicated. A band that may correspond to U2AF}35 _{is detected in}

the purified U2AF fraction (lane 1). C, cross-linking assays using D, E, and A RNAs were carried out following a 10-min incubation at 30 °C in the H191 extract (lanes l, 6-8) and in the same extract adjusted to 2.5 mM EDTA (lanes 3-5). A HeLa extract depleted ofU2AF by chromatography on poly(U)-Sepharose was used in lane 2. The position ofU2AF65 _{and molecular weight markers is indicated.}

band between D and E RNAs after 10 min of incubation could be obtained when the mixture was adjusted to 2.5 mM Na2EDTA (Fig. 2C, lanes 4 and 5). As the addition ofNa2EDTA

to splicing extracts allows spliceosome formation but prevents the first step of splicing (29), our result suggest that the 65-kDa protein preferentially associates with early assemblies. Thus, specific splicing complexes displaying differences in the inter-action of the 65-kDa protein may be short-lived and chased into more advanced stages of assembly in which the 65-kDa protein is either not binding or binding with a similar efficiency.

Several results suggested that the 65-kDa protein corre-sponds to U2AF65 , a splicing factor that recognizes the poly-pyrimidine tract-AG of3' splice site sequences (6, 17, 25). First, the 65-kDa band apparently co-migrated with the cross-linking product obtained with a highly purified U2AF fraction (Fig. 2B,

lane 1). Second, the 65 kDa-cross-linking product was not

de-tected in a extract depleted of U2AF by poly(U)-Sepharose chromatography (Fig. 2C, lane 2). Third, to address the possi-bility that this protein might be the 62-kDa hnRNP I/PTB protein, which shares with U2AF65 _{the ability to bind to 3'} splice site sequences (10, 27), we performed a Western blot analysis .using anti-U2AF65 _{and anti-PTB antibodies (kindly} provided by M. R. Green (Worcester) and M. Garcia-Blanco (Duke), respectively). The migration of the 65-kDa cross-linked product (Fig. 3, lane 4) precisely coincided with the position of U2AF65 _{detected using the anti-U2AF antibody (lanes 1 and 2).} In contrast the anti-PTB antibody revealed a doublet band migrating significantly faster than the 65-kDa band (Fig. 3,

lane 5). This analysis rules out PTB as the 65-kDa protein

displaying differential cross-linking. Finally, two U2 snRNP-associated spliceosomal proteins of molecular mass similar to U2AF65 _{have been reported to cross-link to pre-mRNA (SAP 61} and SAP 62; Ref. 30). It is unlikely that SAP 61 and/or SAP 62 correspond to the 65-kDa protein that we detect since, in con-trast to the 65-kDa protein, these proteins do not associate with pre-mRNA in extracts depleted of ATP (30). Moreover, the difference in cross-linking of the 65-kDa protein to D and E RNAs continued to be detected in extracts in which the U2 snRNP was inactivated (see below).

69- U2AF65- 46-1 2 ::::IPTB 3 4 5

FIG. 3. The 65-kDa band corresponds to U2AF65• Purified U2AF and nuclear extracts were either loaded directly on a 10% SDS-polyac-rylamide gel (lanes 1, 2, and 5, as indicated) or subjected to a cross-linking assay with labeled D RNA before loading (lanes 3 and 4). Proteins were trarisferred onto a nitrocellulose filter, and Western analyses were performed with 1251-protein A and anti-U2AF65

(anti-pepD (25); lanes 1 and 2) or anti-PTB antibody (lane 5).

To address whether the U2AF65 _{cross-linking signal resulted} from binding to the 3' splice site of exon 19, we used a short-ened D transcript terminating a few nucleotides before the branch site region (D5' RNA; Fig. 1). The decreased efficiency of U2AF65 _{cross-linking to D5' RNA (Fig. 4A, lane 3) suggests} that the bulk of the U2AF65 _{cross-linking signal originated} from binding to the 3' splice site region of exon 19. In contrast, the efficiency of U2AF65 _{cross-linking to a shortened E} tran-script (E5' RNA; Fig. 1) remained similar to that ofE RNA (Fig. 4A, lane 4 J, indicating that U2AF65 _{cross-linked poorly to the 3'} splice site of E RNA but that it cross-linked with limited effi-ciency to other regions of the RNA. Thus, U2AF65 binds less efficiently to the 3' splice site of exon 19 when it is paired with the 5' splice site of exon 18. Alternatively, it is possible that U2AF65 _{binds to the 3' splice site of E RNA but in a} configu-ration that is less reactive to UV cross-linking. To address this 25