Amylose de la bêta-2 microglobuline : caractérisation de l'épitope reconnu par un anticorps monoclonal : étude préliminaire de la bêta-2 microglobuline et de l'épitope par dichroïsme circulaire

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Amylose de la bêta-2 microglobuline : caractérisation de

l’épitope reconnu par un anticorps monoclonal : étude

préliminaire de la bêta-2 microglobuline et de l’épitope

par dichroïsme circulaire

Michel Sève

To cite this version:

Michel Sève. Amylose de la bêta-2 microglobuline : caractérisation de l’épitope reconnu par un an-ticorps monoclonal : étude préliminaire de la bêta-2 microglobuline et de l’épitope par dichroïsme circulaire. Sciences pharmaceutiques. 1995. �dumas-01871783�

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J.L.

[Données à caractère personnel]

Je remercie:

Monsieur le professeur A. FA VIER, président du jmy.

Pour l'honneur que vous me faites en acceptant la présidence de cette thèse. Madame le professeur A.M. MARIOTTE, jmy de thèse.

D'avoir accepté de juger ce travail, dont vous êtes à l'origine. Madame le docteur C. EBEL, jmy de thèse.

D'avoir accepté de juger ce travail.

Monsieur le docteur J.L LAFOND, jmy de thèse. D'avoir suivi notre travail, tout au long de son déroulement.

Si ce travail a abouti, je le dois à vos conseils, à votre patience, et à votre disponibilité.

3

-Cette thèse est le résultat de travaux réalisés à l'Institut de Biochimie de l'Université de Pavie (Italie), dans le cadre d'un programme d'échange ERASMUS

Que soient ici remerciés La Communauté Economique Européenne, l'Université J. Fourier, le service des relations internationales et le conseil général de l'Isère.

Je remercie Mme le professeur G. FERRI, Mr le professeur U. CONTE, le docteur P. GIUNCHEDI pour leur accueil trés chaleureux.

Toute ma gratitude va à Mme le professeur M. STOPPINI, à Mr le docteur V. BELLOT! et à Melle le docteur P. MANGIONE pour tout l'enseignement qu'ils m'ont apporté et pour leur patience face

à

mon italien trés imparfait.

Je remercie Angelo, Antonio, Antonella et tous les chercheurs de l'Institut pour tous les moments agréables, passés en leur compagnie et pour leurs aides, tant au niveau scientifique que linguistique.

Que Andrea Marola et Sabrina di Na tale trouvent ici les remerciements les plus sincères.

Maman,

Je te dédie ce travail.

Il est le fruit de tout l'enseignement que tu nous a apporté. Que ta mémoire reste gravée suffisamment fort dans nos coeurs.

Je remercie mon frère Laurent pour ses conseils, ses explications des phénomènes physiques et pour toutes les discussions scientifiques que nous avons eues.

Je remercie mon père, Laurent, Frédéric et toute ma famille pour leur soutien moral.

Que soit aussi ici remercié,

5

-Table des matières

I. Introduction ... 7

II. Le Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH). .. ... 9

1. Définition ... 12 2. Génétique du CMFI ... 12 a. Chez la souris. . ... 12 b. Chez l'homme ... 12 3. Structure du CMFI. .. ... 13 4. Structure de la.J."2-m ... 16 a. Structure primaire ... 16 b. Structure secondaire ... 16

III. Les amyloses ... 21

1. Définition ... 21

2. Propriétés physico-chimiques des dépôts amyloïdes ... 21

a. Ultrastructure des fibrilles ... 21

b. Coloration par le Rouge Congo ... 23

c. Motif de diffraction par les rayons X ... 24

3. Autres constituants des dépôts amyloïdes ... 25

a. La composante amyloïde P (SAP) ... 25

b. Les glycosaminoglycanes (GAG) ... 26

c. Les protéases et les inhibiteurs des protéases. .. ... 27

d. L'Ubiquitine ... 29

IV. L'amylase de la

~2-m

... 30

1. Définition ... 30

2. Métabolisme de la~2-m _{... 30}

3. Signes pathologiques de !'amylose des dialysés. . ... 31

4. Etiologie de !'amylose A)Q-m. .. ... 35

a. Concentration élevée en f32-m ... 35 b. f32-m fragmentée ... 35 c. f32-m glyquée. . ... 36 d. Oxydation de la f32-m ... 36 e. Conditions inflammatoires ... 37 f. Membranes de dialyse ... 38 5. Traitement. ... 38

V. Production et utilisation d'un anticorps monoclonal anti-)î2-m .. 40

VI. Matériel et méthodes ... 43

1. Purification de laft2-m ... 43

2. Electrophorèse sur gel d'agarose ... 43

3. Electrophorèse en milieu dénaturant. ... .44

4. hnmunotransfert ... 45

5.

Purification de l'anticorps 14H3 ... .46

6. Dosage de laP,2-m et de l'anticorps 14H3 ... 46

a. méthode spectrophotométrique. . ... .46

b. Dosage des protéines selon Lowry ... 47

7. Carboxymethylation de la

j'Q.-m. . ...

.4 7 8. Analyse des acides aminés ... .48

9. Digestion par l'endoprotéase Arg-C ... 49

10. Séparation des peptides ... .49

11. Détermination de la séquence en acides aminés ... .50

12. Reconnaissance des peptides par méthode ELISA ... 50

13. Détermination de l'épitope par méthode ELISA indirecte ... 51

14. Dichroïsme circulaire ... 54

VII. Résultats. . ... 60

1.

Purification de la p2-m . ... 60

2. Analyse des acides aminés et Dosage de la p2-m. . ... 60

3. Caractérisation de l'épitope reconnu par l'anticorps 14H3 ... 64

4 Dichroïsme circulaire de la f>2-m. . ... 72

5

Dichroïsme circulaire de l'heptapeptide ... 75

6 Structure tridimensionnelle ... 77

VIII. Conclusion et perspectives ... 79

IX. Bibliographie. .. ... 82

7

-I. Introduction.

Dans le passé, une défaillance du système rénal était synonyme de décès

à

court-terme. La mise au point de méthodes de dialyse a permis de suppléer le mauvais fonctionnement de cet organe. On observe aujourd'hui un accroissement du nombre de cas diagnostiqués pour une insuffisance rénale en phase terminale. Aux USA, en 1991. 165000 patients ont été traités, et on estime que ce nombre dépassera 300000 en l'an 2000 [MANSKE 1994]. Actuellement, le meillem· traitement est la transplantation rénale, mais le nombre d'actes chirurgicaux reste modeste, à cause de la faible quantité de donnem·s d'organe. La dialyse est donc le moyen le plus employé pour le traitement de l'insuffisance rénale chronique.

La mise au point de nouvelles techniques médicales peut être à l'origine de du v.oMbve

complications. L'augmentationVéle patients sous dialyse au long cours, a fait apparaîb·e une nouvelle pathologie, l'amylase des dialysés, décrite pour la première fois au début des années 80. Elle est due à l'agrégation d'une protéine, la p2 microglobuline CP2-m) sous fo1me de dépôts amyloïdes au niveau des synoviales des aiticulations, du canal carpien, du col du fémm·. elle s'accompagne d'une érosion osseuse et de lésions péri-aiticulaires, responsables de douleurs trés invalidantes.

La ~2-m est une protéine du système majeur d'histocompatibilité de type 1,

normalement présente au niveau sanguin. Elle est a été découve1te en 1968 par Ingemar Berggard qui l'isole pour la première fois à partir de l'urine de malades atteints de tubulopathies [BERGGARD 1968]. Mais c'est seulement en 1985 qu'elle apparait comme le constituant principal des dépôts amyloïdes chez les dialysés.[GEJYO 1985]

Le terme d'amylase regroupe des maladies de séméiologies très différentes, caractérisées par une aggrégation pathologique de protéines sous f01me de fibrilles. Bien que le mécanisme biochimique de ce dépôt ne soit pas actuellement connu, on a mis en évidencecertaines analogies entre les diverses protéines responsables. Nous venons que la compréhension du phénomène d'aggrégation est renduf difficile par le grand nombre de facteurs mis en jeu.

Afin de tenter d'éclaircir ce mécanisme, les chercheurs de l'Institut de Biochimie de l'Université de Pavie ont décidé de produire un anticorps monoclonal reconnaissant la P2-m. Cet anticorps a montré des propriétés inttressantes d'inhibition de la formation de fibrilles amyloïdes, mais aussi de désorganisation des fibrilles déjà fonnées.

Notre travail a consisté à mettre en évidence l'épitope reconnu par cet anticorps par une méthode de dosage immunoenzymatique sur phase solide, puis à étudier la structure de la ~2-m par une technique spectrométrique, le dichroïsme circulaire.

9

-II. Le Complexe Majeur d'Histocompatibilité.

1. Définition.

Le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH), ou antigène d'histo-compatibilité, a été mis en évidence chez la souris en 1930 par Gorer et Snell. U est appelé système H-2. Il a été découvert chez l'homme en 1958 par Dausset, et a reçu le nom de système HLA (Human Leucocyte Antigen).[BACH 1989a]

Le CMH est un complexe glycoprotéique présent à la surface de toutes les cellules nucléées. Il contrôle de nombreuses fonctions immunologiques (Cf tableau I). Considéré comme une carte d'identité cellulaire, il est à la base de la reconnaissance du soi et du non-soi, phénomène capital dans le rejet des allogreffes.

On en différencie 2 catégories :

*

CMH de classe I : Cet antigène est responsable de la stimulation des lymphocytes T et du phénomène de lymphocytotoxicité.

*

CMH de classe II : Il est responsable de la transformation blastique des cellules T dans la réaction lymphocytaire mixte.

Il existe une différence de répartition entre ces 2 classes d'antigènes. Le CMH 1 est présent sur toutes les cellules diploïdes, alors que le CMH II n'est présent que sur les lymphocytes B, les lymphocytes T activés, les macrophages, les monocytes, les cellules dendritiques, les cellules de Langerhans de la peau et les spe1matozoïdes.

La sttucture des molécules du CMH, proche de celle d'autres protéines de surface, telles que les récepteurs des cellules T ou les récepteurs CD4 et CD8, a permis de les classer dans la super famille des immunoglobulines (Cf figure 1). Ces protéines dériveraient d'un gène ancestt·al unique.

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Principales fonctions contrôlées par

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1

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Figure 1 - Super famille des immunoglobulines chez la souris.

Les gènes codant pour l'antigène Thy-1, les Ig, les antigènes CD4 et CD8, le

récepteur T et les antigènes du CMH sont issus d'un gène ancestral commun.

(d'après [BACH 1989b] p.131).

2. Génétique du CMH.

[CHARRON 1993] a. Chez la souris.

Le système H2 de classe I est codé par des gènes présents dans 2 sous-régions du CMH (H-2K et H-2D). Il existe pour chacun des locus H-2 une multiplicité d'allèles, d'où l'existence de nombreuses molécules H-2 différentes. Les antigènes de classe II sont codés par une région I située entre H-2K et H2-D, divisée en 2 sous-régions I-A et I-E.

b. Chez l'hom1ne.

Le complexe HLA est situé sur le bras court du chromosome 6 et son organisation est proche de celle du système H-2 de la souris.

Les gènes codant pour la classe I sont situés du coté télomérique, sur une longueur d'environ 2000 Kbases. Cette zone comprend 2 sous-régions A et HLA-B contenant les locus majeurs codant pour les antigènes de classe I (au moins 25 et 45 allèles respectivement). Il existe une sous-région plus petite HLA-C comportant 11 allèles. Récemment, 4 régions HLA-E,F,G et H viennent d'être découvertes.

Les gènes codant pour la classe II sont situés du coté centromérique, sur une longuem· de 1000 Kbases. Cette zone compmie une région HLA-D divisée en 3 sous-régions DP, DQ et DR, et les gènes TAP-1, TAP-2, LMP-2 et LMP-7, impliqués dans la matmation et le trafic intracellulaire des molécules du CMH-I.

Ces 2 zones sont séparées par les gènes de classe III (500 à 1000 Kbases), codants pour les facteurs du complément C4, B7 et C2, et pom la 21-hydroxylase. Les gènes codant pour le TNF (Tumor Necrosis Factor) et pour la protéine du choc thermique HSP-70, s'intercalent entre les gènes de classe III et de classe I.

-13

-3

.

S

truc

ture

du

CMH

I.

L'obtention d'une protéine purifiée et soluble a pennis son étude biochimique et ladétermination de sa structure. La partie extracellulaire du complexe peut être isolée à partir de cellules lymphoblastoïdes en culture ou à partir de cellules extraites de la rate

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Un traitement par lapapaïne clive lachaîne peptidique au niveau

1Hir

de son insertion dans lamembrane cellulaire.

Le CMH I .est une glycoprotéine, composée d'une chaîne lourde polymorphe (45 KDa), codée dans le CMH et associée à la~2-m non polymorphe, codée en dehors

du CMH. [BJORKMAN 1987,SAPER 1991].La chaîne lourde (PM 44000) comporte 3 segments (Cffigure 2 et 3):

Segment transmembranaire.(Acidesaminés 284-307)

C'est un segment de 26Da riche en acides aminés hydrophobes, ce qui assure l'ancrage de la molécule dans ladouble couche lipidique membranaire. Il présente une structure hélicoïdale qui exclue les quelques acides aminés hydrophiles du contact lipidiqueet qui permet lastabilité de lamolécule dans lamembrane.

Segment intracellulaire.(Acides aminés 308-312, coté C-terminal). Ce segment hydrophile est au contact du cytosquelette. Segment extracellulaire.(Acides aminés 1-283, coté N-terminal)

Ce segment hydrophile est divisé en 3 domaines (al, a2, a3) d'environ 90 acides aminés chacun. Les 2 premiers domaines (al, a2) qui comportent des séquences homologues, sont nettement plus polymorphes et supportent la fonction de reconnaissance antigénique. Le site de reconnaissance est constitué de 2 longues hélices a smmontant un ll ~ f01mant une poche d'environ 25

A

de long sur 10

A

de large. Les parois de ce récepteur sont constituées par les chaînes latérales des hélices et le fond par les chaînes latérales des feuillets~ centraux.

Le domaine al supporte un polysaccharide riche en mannose, lié à un groupement NH₂ libre de ASP86 par une molécule de N-acétylglucosamine. Ce groupement est branché à la protéine au niveau du réticulum endoplasmique lors de la synthèse protéique. Les domaines a2, a3 et la ~2-m contiennent chacun un pont

disulfure, le domaine al en étant dépourvu.

Le domaine cx3 et ~2-m maintiennent la structure fo1mée par les 2 premiers

domaines. L'association de la ~2-m à la châme lourde est nécessaire à la fonction de

15

-Figure 2 - Représentation schématique du complexe majeur d'histocompatibilité

type I. c E ~ !/) ~ o. "' .D c:!. _a. ro E 0 QJ ro _{E u} Q ro E !/) o.

Figure 3 - Représentation stéréoscopique en ruban des carbones

a

du CMH I du

4. Structure de la~2-m

La~2-m est présente dans toutes lesmolécules du CMHI.C'est une protéine de

12 KDa codée chez l'homme par un gène de 6-7 Kbases, situé sur le chromosome 15. Son associationà la chaine lomde a lieu trés tôt lors de la biosynthèse au niveau du réticulum endoplasmique. Sa Liaison non-covalenteàla chaîne lourde assure le maintien de laconformation de l'ensemble.

a. Stn1cture primaire.

Sa séquence de 99 acides aminés (Cffigure 4), est caractérisée par une quantité importante de résidus chargés négativement (aspattate et glutamate), de résidus aromatiques (phenylalanine, tyrosine, tryptophane) et par une faible quantité de glycine et d'alanine comme lemontre letableauII.

Elle présente une homologie imp01tante avec le domaine CH3 des immunoglobulines et le domainea3de la châme lourde du CMH (différence de position moyenne 1ms: 1.4

A

avec a3, 1.6

A

avec CH3)[PETERSON 1972, SAPER

1991].(Cf figure 5)

b. Stn1cture secondaire.

La~2-m est fotmée de 2 feuillets béta antiparallèles superposés, reliés par un

pont disulfure (Cys25-Cys80) [BECKER 1985, BJORKMAN 1987]. Le schéma de la structure secondaire est représentésàla figure 4. Le premier feuillet, comp01tant 4 séquences de structure béta antiparallèles fmme de nombreuses liaisons avec les domainesa3et al. Le deuxième feuillet, comportant 3 séquences de structure béta antiparallèles constitue une des faces externes du complexe HLA, en interaction avec le solvant. La composition en acides aminés (tableau III) montre une différence entre les 2 feuillets. On retrouve une quantité imp01tante d'acides aminés aromatiques dans lepremier, et seulement 2 dans le second.

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On peut également noter la richesse en acides aminés chargés situés au niveau de la boucle fo1mant charnière entre les 2 feuillets. Au moment de la synthèse, cette zone initie peut-être le repliement de la molécule par liaisons ioniques, facilitant ainsi la fmmation des 2 feuillets. Cette structure est stabilisée par la fermeture du pont disulfme. La molécule possède 5 résidus praline situés au niveau des boucles~ ~ m

ce qui favorise le repliement en stiuctm·e~

Les groupements hydrophobes situés majoritairement au mveau des stmctures~ sont masqués au solvant, ce qui diminue l'énergie de lamolécule, et a

pour conséquence la stabilisation de celle-ci. Le graphe 6 représente l'index d'hydrophobie de chaque acide aminé en fonction de la séquence primaire de la~2-m

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protéines fKLAPPER 1977] Groupements aliphatiques, non-polaires

Glycine 7.5

Alanine 9.0

Valine 6.9

Leucine 7.5

Isoleucine 4.6

Praline 4.6

Groupements aromatiques

Phénylalanine 3.5

Tyrosine 3.5

Tryptophane 1.1

Groupements polaires, non-charf!éS

Sérine 7.1 Thréonine 6.0 Cvstéine 2.8 Méthionine 1.7 Asparagine 4.4 Glutamine 3.9 Groupements charf(és ~a m Aspartate 5.5 Glutamate 6.2

Groupements char}fés positivement

Lysine 7.0

Arginine 4.7

Histidine 2.1

Tableau Il

Composition en acides aminés de laj32-m comparée

à

lavaleur moyenne des autres protéines.

3 2 7.1 7.1 5 5 5 6.1 2 9.1 5 2 1 4 3 8.1 8.1 8.1 5 4

Non olaire Polaire Aromati ue Char é+ Char é - NbAA 1-17 6 5 1 4 1 17 35.3% 29.4% 5.9% 23.5% 5.9% FI 18-31 4 5 3 2 0 14 28.6% 35.7% 21.4% 14.3% 0% 59-73 3 4 6 0 2 15 20% 26.7% 40% 0% 13.3% 45-58 3 3 1 4 3 14 21.4% 21.4% 7.2% 28.6% 21.4% Total 16 17 11 10 6 60 26.7% 28.3% 18.3% 16.7% 10% 32-44 6 1 1 5 13 46.2% 7.7% 7.69% 38.45% F2 74-87 4 3 3 3 14 28.6% 21.4% 21.4% 21.4% 88-99 3 3 ,., .) 2 12 25% 25% 25% 16.7% Total 13 7 7 10 39 33.3% 17.9% 18% 25.7%

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Les

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1. Définition.

Le terme d'amylose vient du latinamylumet du grecamylon,qui ont donné amidon. L'amylose définissait initialement l'affinité de l'iode pour la substance amyloïde.

Aujourd'hui, !'amylose regroupe un ensemble de pathologies dues à des dépôts de protéines extra ou intracellulaires, sous forme de plaques ou de nodules. Ces pathologies se distinguent par la nature du constituant protéique principal, qui estàla base de leur classification (Cftableau IV). Toutes ces protéines ont en commun une structure secondaire de typefeuillet béta antiparallèle. Certaines protéines ne fibrillent qu'aprés une protéolyse (protéine~ amyloïde dans la maladie d'Alzheimer), d'autres

non~2-m

2. Propriétés physico-chimiques des dépôts amyloïdes.

Les dépôts amyloïdes montrent des caractéristiques communes indépendamment de leurcomposition protéique.

a. Ultrastn1cture des fibrilles.

En microscopie classique, les dépôts amyloïdes ne montt"ent qu'une apparence amorphe. Par contre, en microscopie électt"onique, ils apparaissent composés de fibres non ramifiées, non cristallines, de longueurvariable et d'une épaisseur généralement de 6à12 nm. Seules les fibrilles présentes dans la maladie d'Alzheimer montrent une épaisseur d'environ 22 nm. Chaque fibrille semble composée de 2 filaments opaques aux électt·ons, séparés par une zone plus claire. [NISHI 1990, LANSBUR Y 1992]

Amy

lose

Proté

ine

précurseur

AA Protéine sérique amyloïde (SAA)

AL

Chaînes légèresdes immUlloglobulines AH Chaû1es lourdes des immll11oglobulines

ATTR T ransthyrétine

AApoAl Apolipoprotéine Al

A Gal Gelsoline Asn 187

A Cys Cystatine C Gln 68 ~ Précurseur de la~ protéine

~2m ~2-m l l

AS cr Protéine de Scrapie

A Cal Calcitonine

AANF

Facteur natriurétique atriale AIAPP Polypeptide amyloïde des îlots de

Langerhans

ALys Lysozyme His 67, Thr 56

AFib Fibrinogène Val 526, Leu 554

Tab

leau

IV

Classification des divers types d'amylase en fonction de laprotéine déposée

23

-De nombreuses cellules sont présentes au voisinage des fibrilles. On observe une grande quantité de macrophages avec des vacuoles de phagocytose en nombre élevé, parlois remplies de fibrilles amyloïdes. Le réticulum endoplasmique de ces macrophages est trés développé, ce qui est le signe d'une intense activité de synthèse.

b. Coloration par le Rouge Congo. [PUCHTLER 1962]

Le rouge congo (Cf figure 7) est un des plus vieux colorant utilisé dans l'industrie textile pour teinter le coton.

NH2 NH2

N=N N=N

S03Na S03Na

Figure 7 -

Formule chimique développée du rouge congo.

Toutes les dépôts amyloïdes patiagent la propriété de fixer le rouge congo avec apparition d'une biréfringence rouge / verte, observable sous microscope à lumière polariséeJet d'une modification du plan de polarisation de la lumière (dichroïsme). On peut noter que cette coloration n'est pas spécifique des structures fibrillaires béta. (De nombreux polymères linéaires, tel que la cellulose, fixent le rouge congo ).

L'apparition d'un dichroïsme signifie que la structure fixant le rouge congo est anangée en motifs linéaires, ordonnés, présumés parallèles. Mais les caractéristiques physico-chimiques de cette fixation restent inconnus, bien que deux modèles possibles, basés sur l'empilement de feuillets béta, aient été proposés.

c. Motif de diffraction par lesrayons X.

L'analyse des fibrilles par diffraction des rayons X montre un motif répétitif [LANSBURY 1992]. Mais la nature non-cristalline de ces fibrilles rend difficile l'interprétation de ces résultats. La diffraction est composée d'une réflection majeure à 4. 7

A,

perpendiculaire à l'axe des fibres. Si l'on considère un modèle basé sur une géomètrie plane et trans de chaque feuillet, cette diffraction pounait être due à l'espace situé entre chaque boucle de structure~ Une autre réflectionà5-10

A

peut c01Tespondre à l'espace situé entre chaque feuillet~ espace vaiiant en fonction des

acides aminés. La fmmation de fibrilles amyloïdes résulterait d'un empilement de feuillets de type béta d'aprés un modèle d'organisation proposé par Marsh [MARSH 1955].(Cf figure 8). Mais selon moi, ce modèle est probablement imparfait car, bien que compatible avec les données exposées ci-dessus, il ne tient pas compte de la torsiondes feuillets béta antiparallèles.

F

igure

8

-

Représentation schématique des fibrilles basée sur une stn1cture béta. Les reflections majeures par les rayons X correspondraient

à

la distance entre chaque séquence béta (4.7

A)

et à la distance entre chaque feuillet (5-10

A

)

.

[MARSH 1955]

25

-3. Autres constituants des dépôts amyloïdes.

La formation de dépôts fibrillaires semble nécessiter une concentration élevée en protéine amyloïde, mais l'analyse biochimique a révélé la présence d'autres molécules qui joueraient un rôle dans le processus d'agrégation. Il s'agit de la protéine amyloïde sérique P (SAP : Semm Amyloid P component) et des glycosaminoglycanes (GAG).

a. La composante amyloïde P (SAP).

La SAP est une glycoprotéine plasmatique décamérique composée de sous-unités identiques de 204 acides aminés, associées de façon non-covalente en 2 anneaux pentamériques. Chaque sous-unité possède 2 sites de fixation du calcium impliqués dans le phénomène d'amylase. La SAP partage plus de 50% de sa séquence en acides aminés avec la protéine C réactive (protéine de l'inflammation) et les histones H ₁ et H_4. Sa structure secondaire, riche en feuillets béta antiparallèles et sa structure tridimensionnelle la rapproche de la concanavaline A. [EMSLEY 1994]

La SAP ne montre ni polymorphisme, ni hétérogénéité, et aucune mutation n'a été observée dans l'espèce humaine, ce qui suggère l'impotiance de ses fonctions, bien que son rôle physiologique reste obscure.

La SAP est retrouvée normalement dans les membranes basales, dans le sang à une concentration de 33+/- 10 mg/l chez la femme et de 43 +/- 14 mg/l chez l'homme. Elle se lie à l'ADN et à la chromatine plasmatique (peut-être à cause de sa structure proche des histones), à la fibronectine, à la protéine fixant C4 et aux glycosaminoglycanes. [PEPYS 1982]

Dans !'amylose, elle est présente dans les dépôts sous une fo1me intacte [CAMPISTOL 1992, STENSTAD 1993]. Sa fixation sur les fibrilles amyloïdes est calcium-dépendante, ce qui permet de la séparer des biopsies amyloïdes par ajoût d'un chélatant du calcium (EDTA ou cifrate). D'autre pait, elle montre une résistance

élevée, calcium-dépendante,à la protéolyse. La diminution de la concentration en calcium facilite l'attaque de la protéine par des enzymes protéolytiques. Cette résistanceà laprotéolyse pourrait contribuer à lapersistance des dépôts amyloïdes par laformation d'une couche superficielle protectrice.

b. Les Glycosaminoglycanes (GAG).

Des études dans les années 60 ont montré que les GAG peuvent s'accumuler dans les dépôts au cours des amyloses de type AL et AA. Snowet al[SNOW 1987] confirment ce résultat en utilisant le bleu Alcian pom colorer des coupes de tissu d'amylose. Ils observent une association intime entre les GAGs et les dépôts dans les amyloses AA, AL, dans l'amylose familial cutanée, dans les plaques neuritiques et les angiopathies congophiliques de cerveau d'Alzheimer et dans les carcinomes médullaires de la thyroïde. Ces GAGs sont surtout de type trés sulfaté (Hépaiine, sulfate d'héparan, sulfate de kératine, chondroïtine sulfate, ...). Par contre, ils ne trouvent pas de sulfate de de1matane et peu de GAG polycarboxylés (acide hyaluronique), contrairement à Amga [ARUGA 1993], qui découvre la présence d'acide hyaluronique associé ou proche des plaques amyloïdes.

L'influence de ces GAGs sur la f01mation des fibrilles amyloïdes n'est pas encore trés claire. Mais, leurprésence pounait, en association aveclaSAP, catalyser la première étape d'aggrégation de la protéine principale. Il a en effet été montré par dichroïsme circulaire une influence des GAGs sur la conformation de certains peptides, orientant leur configuration vers une structure~ alors que ces mêmes

-27

-c

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Les

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.

Les inhibiteurs plasmatiques des protéases forment environ 10% des protéines plasmatiques humaines. Ils contrôlent le remodelage du tissu conjonctif, la coagulation, la fibrinolyse, l'activation du complément, les réactions inflammatoires. Dans de nombreux tissus, Il y a normalement un équilibre dynamique entre les protéases et leurs inhibiteurs. On différencie :

-Inhibiteurs des proteases al.(alPI) ou alantitrypsine. -alantichymotlypsine.(al-ACT)

-Antithrombine III. (AT III). -a2 antiplasmine.

-Inhibiteur du C1.

-a2 macroglobuline. (a2MG)

-Inhibiteur local des proteases: Tissue inhibitormetalloproteinase (TIMP). Campistolet al[CAMPISTOL 1992] monn·ent la présence de a2MG, alPI, ATIII et de TIMP dans les dépôts amyloïdes ~2-m

a2 macroglobuline. (a2MG) : C'est une glycoprotéine tétramérique de 720 KDa formée de 4 sous-unités de 180 KDa. Elle inhibe une grande quantité de protéinases appaiienant aux 4 classes catalytiques (sérine, cystéine, aspaiiique, metallo -protéinase).

Antithrombine III (ATIII) : C'est une glycoprotéine sérique qui joue un rôle majem dans le contrôle des sérine-protéases dans les réactions en cascade de la coagulation (inactivationde lathrombine). Sa concentration est augmentée en présence d'héparine.

Inhibiteurs des protéases al.(alPI) ou al antitrypsine : C'est une glycoprotéine qui possède une séquence en acides aminés proche de celle de l'ATIII. Son premier rôle est le contrôle de l'activité de l'élastase des neutrophiles. Elle est aussi inhibiteur des sérine-protéases.

Inhibiteurlocaldes protéases (TIMP) :C'est une glycoprotéine de 28500 Da qui inhïbe une variété de métalloprotéines (collagénase, gélatinase, ...). Elle est produite par les fibroblastes et les monocytes / macrophages. Son rôle est de moduler la dégradation des tissuspar lesmetalloprotéines pendant l'inflammation.

Par contre l'alACT n'est pas un composant localisé dans les dépôts, mais présent dans le tissuconjonctif environnant. [CAMPISTOL 1992, ARUGA 1993] En ce qui conce1ne les protéases, Stoneet al[STONE 1993] montrent la présence d'une quantité imp01iante d'élastase et de cathepsine G dans les dépôts des amyloses de type AL, AA, ATTR, ~2-m AApoAl. Ces 2 protéases sont nmmalement présentes

dans les granules azurophiles des polynucléaires neutrophiles, etàun moindre degré, dans les monocytes. Leur activité est inhibé par le PMSF (Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride), un inhibiteurdes sérine-protéases. Bien que leurprésence pourrait être due à la lyse de neutrophiles lors de l'extraction, la quantité retrouvée n'est pas compatible avec le faible nombre de ces cellules observées dans les coupes tissulaires.

L'implication des protéases et de leurs inhibiteurs dans le phénomène d'amylose n'est pas encore trés clair. Outre le fait que leur présence est le signe d'une inflammation locale, leur concentration importante, est-elle la cause, la conséquence ou est-elle indépendante des dépôts amyloïdes?

29

-Une hypothèse émise [STONE 1993] est qu'elle serait la conséquence de conditions inflammatoires locales. Il y aurait alors affluence de globules blancs. La lyse de certains entrainerait la libération d'enzymes lysosomiales, avec diminution du pH autour de 5. La production d'inhibiteurs des protéases serait alors augmentée. Il s'en suivrait la formation de complexes protéases-inhibiteurs qui s'associeraient aux autres constituants. Il faut aussi considérer que certaines protéines amyloïdes sont retrouvées sous forme dégradées dans les dépôts (AL à partir des chaines légères d'immunoglobulines, AA à partir de la protéine amyloïde sérique A ou SAA, AP à partir du précurseur de la

p

protéine ou PPP). Il semble qu'une protéolyse soit nécessaire au phénomène d'aggrégation. La f01mation de ces dépôts entrainerait la synthèse de protéases, qui induirait la synthèse d'inhibiteurs des protéases. Mais cette dernière hypothèse pose des problèmes dans le cas de l'AP2-m qui ne semble pas necessiter de protéolyse préltminaire .

.A. d. L'ubiquitine.

L'ubiquitine est une protéine de bas poids moléculaire (8,6 KDa), présente dans le choc thennique et qui semble servir de signal au déclenchement d'une protéolyse intracellulaire ATP-dépendante. Okada et al [OKADA 1993] montrent une

augmentation significative de la concentration de l'ubiquitine au niveau plasmatique chez les patients dialysés. La découverte d'ubiquitine dans les dépôts de P2-m, dans les dépôts cérébraux au cours de la maladie d'Alzheimer suggère sa patiicipation dans le phénomène d'amylose. Atuga et al [ARUGA 1993] ne la retrouve seulement que dans

certains organites intracellulaires des cellules infiltrées. Mais ces auteurs pensent que l'utilisation d'une méthode immunologique de détection est discutable, car les épitopes de l'ubiquitine peuvent être masqués par la protéine amyloïde ou par d'autres constituants.

IV

.

L

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1

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.

L'insuffisance rénale chronique est, actuellement, dans la majorité des cas traitée par hémodialyse ou par dialyse péritonéale. Ces techniques permettent l'extraction des toxines et des déchets de l'organisme normalement éliminés du sang par le rein. Mais l'augmentation des dialyses chroniques s'est accompagnée de l'apparition de nouvelles complications, telles que le syndrôme du canal carpien , des périarthrites, des spondylarthropathies et des lésions osseuses avec tisques de fractures. Ces complications sont dues à laformation de dépôts amyloïdes.

L'isolation et l'analyse de ces dépôts faite en 1985 par Gejyo et son équipe [GEJYO 1985, GEJYO 1986] a révélé leur composition majoritaire en~2-m La

concentration élevée de la~2-m chez les patients souffrant d'une insuffisance rénale

chronique était connue, mais de nombreux autres composés sanguins, augmentés dans cette pathologie, pouvaient aussi être impliqués dans ces dépôts. Cette nouvelle fo1me d'amylose a reçu le nom de ~2-m dans le classement des amyloses. Le mécanisme

d'aggrégation reste à ce jourinconnu.

2

.

Mé

tabo

l

isme

de

la

~2-m

La~2-m est synthétisée par toutes les cellules nuclées porteuses de l'antigène

HLA. Un organisme sain produit 2,4 +/-0,67 mg/Kg/jour de~2-m [KOCH 1992].

La~2-m s'associe à la chaine lourde du CMH 1, le complexe protéique formé est

incorporé à lamembrane cellulaire.

Aprés lamort cellulaire, ou au cours du remodelage des membranes, la~2-m se

sépare de la chaine lourde. Sa petite taille lui pe1met alors de migrer dans les espaces interstitiels et de rejoindre lacirculation sanguine où on laretrouve à une concentration de 1,2 +/-~ mg/l [GEJYO 1986].

31

-Les reins jouent un rôle important dans le catabolisme de la ~2-m puisqu'il

semble que ce soit l'unique lieu de dégradation. Chez l'adulte, 95 à 98% de la ~2-m

sé1ique est filtrée librement par le glomérnle. Elle est réabsorbée, puis métabolisée par les cellules du tubule proximal. Seule une très faible quantité reste n01malement dans les urines. Par contre, le nouveau-né présente une protéinurie physiologique avec un taux de P2-m de l'ordre de 1,4 mg / g de créatinine. Ce taux augmente pendant la première semaine de vie, puis décroît, alors que le taux d'albumine décroît régulièrement

à

partir de la naissance [TSUKAHARA 1994]. Ce pic de P2-m s'explique par une maturation incomplète des tubules rénaux dans les premiers jours de vie. Chez les prématurés, la fuite urinaire des protéines est plus importante, avec un taux urinaire de B2-m trés élevé (jusqu'à 80 mg / g de créatinine). Ces mesures confirment le rôle prépondérant des tubules rénaux dans le catabolisme de la B2-m. On comprend alors qu'un fonctionnement défectueux des tubules puisse provoquer une protéinurie riche en ~2-m chez les insuffisants rénaux chroniques avec diurèse

conservée.

3. Signes pathologiques de l'amylase des dialysés.

Chez ce1tains patients, les premiers symptômes cliniques apparaissent après 4

à

5 ans de dialyse. La fréquence de ces symptômes devient impmiante après 10 ans et ils sont pratiquement retrouvés chez tous les patients après 15 ans de dialyse.

Les principaux signes cliniques de cette pathologie amyloïde sont [BARDIN 1987, FUCHS 1987, SANCHEZ 1993] :

*

Le syndrome du canal carpien. Il se manifeste par l'apparition d'une masse sous-cutanée sur la face postérieure de la main, entrainant une compression du nerf médian (Voir photographie 9A). Seule une intervention chirnrgicale pe1met d'éliminer ces dépôts (photographie 9B).

*

Arthrite.

* Spondylarthropathie desttuctive. *Kystes osseuxjuxta-articulaires.

* Fractures spontanées de la tête du fémur avec des lésions ostéolytiques.

* Dépôts massifs dans les membranes synoviales, dans les capsules S)11oviales, dans l'os subchondral, dans les tendons. (Voir photographie 10)

* Dépôts dans les petits vaisseaux du coeur, des poumons, du foie, du tractus gastt·ointestinal.

* Erosion osseuse des plateaux ve1iébraux avec une compression des racines nerveuses au niveau des cervicales et une sub-luxation vertébrale.

Tous ces symptômes sont tt·és douloureux et invalidants pour le patient. Ils augmentent le risque de morbidité, déjà tt·és élevé chez les insuffisants rénaux chroniques.

Figure 9 A et B - A:

Photographje de la partie postérieure de la main d'un

patient présentant un syndrome du canal carpien.

B:

Elimination par voie

chirurgicale d'un dépôt amyloïde sm un tendon de la main. Cette opération

penneifle diminuer la compression du nerf médian par la masse amyloïde.

Figure 10 -

Photographie des genoux d'un patient sous hémodialyse clu·onique,

montrant une localisation ai1iculaire de l'arnylose.

-35

-4.

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~2-m

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62

-m

.

Au cours de l'insuffisance rénale, la concentration sérique de la~2-m augmente

jusqu'à 60 fois sa valeur physiologique [BARDIN 1987], avec 1me moyenne aux environs de 40 mg/ml [GEJYO 1986]. Chez ces patients, le taux de~2-m sanguine

varie de façon inverse avec le tauxde filtration glomérulaire. La concentration sérique augmente quand le GFR (Glomerular Filtration Rate) diminue, notamment pour un GFR inférieurà 2.1 ml/mn.

Toutefois, une élévation prolongée de la concentration sérique en~2-m et

l'apparitionde lapathologie ne sont pas directement conélés [GEJYO 1986]. Certains patients présentant une concentration élevée en~2-m ne développent pas d'amylose,

même aprés de nombreuses années de dialyse [BARDIN 1987]. Chez d'autres patients, on ne retrouve pas de dépôts amyloïdes, même aprés 10 ans de dialyse, mais la concentration sérique de~2-m bien qu'inférieure, n'est pas significativement différente

de celle d'autres patients [LILLO 1986]. Le développement du syndrome du canal carpien n'est pas non plus corrélé au taux de'~2-m [GEJYO 1986]. Le taux sérique de

la P2-m ne peut donc pas servir de marqueur de cette pathologie. Ceci suggére l'intervention d'autres facteurs. (SAP, GAG, protéolyses, glycations, Inflammation, cellules...).(Cfchapitre II: Amyloses)

b

.

62-m

fragmen

tée

.

Alors que les travaux initiaux montraient la présence de P2-m intact dans les dépôts, ce1tain travaux [LINKE 1989, LINKE 1993, GEJYO 1993] rapportent la présence de fragments de~2-m Un heptapeptide, conespondant aux résidus 13-19 de

c. 62-m

glyquée.

Miyata et al [MIYATA 1993] montrent la présence chez les patients, d'une {32-m {32-modifiée par glycation (produits ter{32-minaux de réactions de Maillard), plus acide. De nombreux produits de glycation ont un rôle dans le remodelage des tissus. En pathologie, l'accumulation de protéines glyquées powTait intervenir dans les pathologies vasculaires associées au diabète et au vieillissement par des mécanismes similaires [BROWNLEE 1988]. Les auteurs montrent que la P2-m modifiée induit un chimiotactisme des monocytes et une sécrétion de cytokines (TNFa, ILlP) par les macrophages, qui seraient responsables des phénomènes inflammatoires et de la destruction des tissus. [MIYATA 1994]

d. Oxydation de la

62-m.

;>al"

Le traitement de la P2-m par des dérivés de l'oxygène ( obtenus\tTadiation "/) a pour conséquence une disparition de la bande d'électrophorèse à 12 KDa et une formation de liaisons intermoléculaires, stables au SDS et aux conditions réductrices.[CAPEILLERE 1991]

L'exposition à OH" seul, ou à OH· et à 0_2·-, en présence d'oxygène, provoque la formation de dérivés de la P2-m possédant un pH isoélectrique plus acide. Ceci est à rapprocher de la découverte, faite dans l'ultrafiltrat de patients, de 2 nouvelles P2-m [ODANI 1990, MIYATA 1993], ayant un pHi plus acide (5,38 et 5,22) que la P2-m native (5,7) [BERGGARD 1968].

L'étude de la P2-m par dichroïsme circulaire, aprés attaque par OH", indique un changement de conformation. La protéine passe d'une stluctue P à une stiucture aléatoire. Cette attaque radicalaire s'accompagne de la fmmation de ponts inte1moléculaires dityrosine, décelables en spectrofluorimétrie.

37

-L'exposition de la J32-m aux radicaux oxygénés entraine l'apparition de 2 espèces protéiques (18 et 25 KDa), une diminution de la J32-m (12 KDa), une augmentation d'un dérivé de la J32-m (8 KDa) et une augmentation des ponts dityrosine. Ceci pourrait s'expliquer par la formation de dimères (2x12 KDa, 2x8 KDa, 8+ 12 KDa) [CAPEILLERE 1991]. Il est interréssant de noter que le poids moléculaire des protéines fo1mées in vitro est trés proche de celui des protéines retrouvées dans les dépôts amyloïdes ou dans l'urine des patients (815; 12; 17 et 24 KDa) [GEJYO 1986,

LINKE 1989, LINKE 1993, GEJYO 1993]. Ces observations permettent d'avancer l'hypothèse d'un rôle important de l'oxydation de la J32-m dans la physiopathologie de l'amylase. Cette hypothèse est d'autant plus vraisemblable, qu'il existe chez les insuffisants rénaux chroniques, une altération des systèmes protecteurs antioxydants [RICHARD 1991].

e. Conditions inflaimnatoires.

Différentes études semblent donner un rôle important à l'inflammation [CAMPISTOL 1992, ARUGA 1993, STONE 1993, NAKASHIMA 1993]. Elle résulterait d'une activation de cellules telles que les monocytes, les macrophages et les polynucléaires entrainant la synthèse de diverses cytokines (Interleukine 1, TNFa), de protéases et d'0_2·-. La production de SAP, un des constituants des dépôts amyloïdes, est augmentée par !'interleukine I [SIPE 1982].

Cette activation peut être causée par les membranes de dialyse, par une concentration élevée d'urée [NAKASHIMA 1993]. La formation de cristaux d'apatite au niveau articulaire, pourrait être le facteur déclanchant d'une réaction inflammatoire locale, favorisant les dépôts de J32-m.

f

.

Membranes

de

d

ia

lyse

.

Les membranes, utilisées dans l'hémodialyse, ont été mises en cause comme facteur déclenchant de l'amylase (Synthèse de protéines de l'inflammation, désorption de~2-m modifiée [CLARK 1994].

On constate chez les patients sous dialyse péritonéale (CAPD: Continuous Ambulatory Peritoneal Dialysis) un taux sanguin en~2-m infétieuràcelui des patients

sous hémodialyse. Mais Cette technique est souvent utilisée chez les patientsàdiurèse conservée. Pourtant il n'y a pas de différence significative du nombre d'amylose entre ces 2 groupes [MAIORCA 1993]. L'apparition des symptômes chez les patients sous CAPD confnme laprésence d'autres facteurs.

5

.

Tra

i

temen

t

.

Actuellement, aucune thérapie médicamenteuse n'existe. La cause principale de l'amylase~2-m est l'abscence de catabolisme par le rein de la~2-m ce qui provoque

une augmentation de laconcentration sérique. Les premières approches thérapeutiques, s

ou plutôt préventives consitentàéliminer la~2-m par l'utilisation de membranes de

dialyses petméables ou capables d'adsorber cette protéine.

L'exposition du sang à n'imp01te quelle smface rutificielle provoque pratiquement instantanément l'adhésion de certaines protéines plasmatiques. Cette adhésion de protéines de bas et moyen poids moléculaires dépend du flux sanguin, de la température et de la nature du matériau de la membrane. Un matériau poreux peut être un factem· additionnel imp01tant dans l'adsorptionde petites molécules capables de pénétrer dans les pores.

Les premières membranes en cellulose ou en cuprophane ne possédaient pas ces propriétés. L'utilisation de membranes à haut flux, en polysulfone ou en polyacrilonittile (type AN69) pennettent de diminuer la concentration sérique de la

P

2-m [MROWKA 1993, CLARK 1994]. Toutefois, cette efficacité est encore limitée

-39

-car le taux de f32-m reste 10à15 fois supérieuràla nonnale. Aprés 8 mois de dialyse, la production de~2-m étant nettement supérieure aux possibilités d'épuration de ces

membranes, son tauxplasmatique revientàun niveau élevé.

Par contre, l'utilisation de ces membranes de nouvelle génération, aboutit à une diminution du nombre de cas d'amylose [MROWKA 1993]. Ceci peut être imputéà une baisse de la concentration sérique de la~2-m mais aussiàune meilleure

biocompatibilité de ces membranes. Ce résultat estàrelativisé, car Clark et al [CLARK 1994] ont montré lapossibilité d'une désorption au cours de ladialyse d'une f32-m modifiée. Cette ~2-m pounait être le promoteur de la polymérisation sans

V

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a -~2-m

A la suite de travaux sur l'amylase de type AL [BELLOT! 1993] etafin d'étudier le phénomène de fibrillation de la~2-m Les chercheurs de l'Institut de

Biochimie de l'Université de Pavie (Italie) ont décidé de produire un anticorps monoclonala -~2-m selon latechnique de Kahleret al [KOHLER 1975].

Les lymphocytes d'une souris BALB/s préalablement immunisée contre la P2-m_, sont fusionnés avec des cellules de myélome murin de la ligne SP2/oAg 14, par une solution de PEG 4000 à 45%. Les hybridomes formés sont cultivés sur plaque à 96 puits. Après 15 jours, !'hybridome contenant des anticorpsa -~2-m est sélectionné

aprés vérification par méthode immuno-enzymatique (ELISA) directe. Le milieu de culture, riche en anticorps est prélevé et conservé au frais.

Cette technique a permis la production d'un anticorps monoclonal de type IgG appelé 14H3.

A l'aide de l'anticorps sélectionné, l'équipe de l'Institut, en collaboration avec le Professeur P. Braidotti de l'Hôpital S. Paolo de Milan, a réalisé une analyse immunohistochimique par microscopie électronique d' une biopsie synoviale infiltrée par des dépôts amyloïdes. Le résultat présenté sur lafigure 11 montre la fixation de l'anticorps 14H3 conjugué à des particules d'or colloïdale sur lesfibrilles d'amylase.

in vitro, l'anticorps 14H3 a montré une capacité à inhiberlafibrillogenèse de la B2-m. Cette inhibitionest maximale pour un rapport molaire B2-m/ Ac situé entre 10/1 et 50/1.

Les chercheurs de l'Institut ont alors voulu vérifier si l'anticorps avait un effet sur les fibrilles déjà forméesinvivo.Dans ce but, du tissu infiltré d'amylase de B2-m, prélevé dans le canal carpien d'un patient sous hémodialyse chronique depuis 10 ans, fut incubé 12 heures à 4°C avec l'anticorps 14H3. L'observation sous microscope électronique, montre une transfo1mation de lastructure fibrillaire en un état d'agrégats amorphes.(voir figure 12)

41

-Figure 11 - Biopsie synoviale analysée au microscope électronique (x 20000),

après irnrnunocoloration avec l'anticorps 14H3 conjugué

à

des paiticules

d'or

colloïdal.

Figure 12 -

Matériel a:myloïde extrait du tunnel carpal.

A :

Non traité,

B :

Traité avec l'anticorps :monoclonal 14H3. Les flèches montrent une zone fibrillaire.

43

-VI. Matériel

et méthodes.

1. Purification de la

P2-m.

La protéine est purifiée à partir d'urine de patients présentants une protéinurie tubulaire, selon la méthode de Bernier et Putnam [BERNIER 1964].

Les urines (environ 800 ml) sont dialysées contre de l'eau distillée pendant 48 heures. Le dialysat est lyophilisé, puis le résidu sec est repris avec 5 ml d'un tampon Tris HCl 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4.

La solution est mise sur une colonne de filtration sur gel (Séphacryl® S300, 2.5x100 cm) équilibrée avec le même tampon. L'élution est conduite à température ambiante avec un débit de 20 ml/h. L'absorbance de chaque :fraction récupérée est lue à 280 nm. Celles contenant la P2-m sont réunies et dialysées pendant 48 heures contre un tampon KH₂P0₄ 5 mM, pH 8,0. (Solvant A)

Le dialysat est déposé en petites quantités (1 à 2 ml) sur une colonne échangeuse d'ions MonoQ (Pharmacia), montée sur un appareil de FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography: Chromatographie Basse pression en phase liquide). L'élution est réalisée avec un gradient linéaire de 0 à 100% d'un solvant B : KH₂P0₄ 0,5 M, pH 8.0 en 40 minutes, à un débit de 0,5 ml/mn. L'absorbance à 280 nm est mesurée en s01iie de colonne. A la fin de chaque élution, la colonne est régénérée par injection de 1 ml d'un tampon KH₂P0₄ lM pH 8,0, puis rééquilibrée pendant 30 minutes avec le solvant A.

2. Electrophorèse sur gel d'agarose.

La pureté des échantillons est vérifiée selon la technique de Jeppsson et al

[JEPPSSON 1979] sur une plaque de gel d'agarose de 5 mm d'épaisseur.

Le gel est préparé avec un agarose à 0,8 % dans une solution de barbiturate de sodium 25 mM et de lactate de Calcium 2 mM, pH 8,6.

La migration est conduite dans une chambre électrophorétique réfrigérée à 4 °C, avec le même tampon et à un ampérage constant de 200

mA

pendant 45 mn.

Le gel est mis dans une solution d'acide picrique 80% et d'acide acétique 20% pendant 30 minutes. Il est ensuite coloré par une solution de bleu de Coomassie à

0,2%, méthanol 45% et acide acétique 10 %. La décoloration est réalisée avec une solution de méthanol et d'acide acétique à la même concentration que celle utilisée pour la coloration, puis le gel est séché.

3. Electrophorèse en milieu dénaturant.

La méthode utilisée est celle de Laemli U.K. [LAEMLI 1970] qui emploie le SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) comme dénaturant dans un gel d'ac1ylamide 12%, N,N'-methylène Bis-acrylamide 1 %.

L'échantillon des protéines à analyser (0,2-0,6 mg/ml) est mélangé à un tampon Tris HCl 20 mM, EDTA 10 mM pH 8,3 contenant 1 % de 2-Mercaptoéthanol et 1 % de SDS. La solution est chauffée 5 mn au bain-marie et déposée sur le gel (15 µl). La séparation est réalisée sous un ampérage constant de 35

mA

avec une réfrigération par circulation d'eau. L'ajout de bleu de bromophénol à l'échantillon permet le suivi de la migration qui est arrêtée à 0,5 cm du bord ·inférieur du gel.

Le gel est coloré par une solution de bleu de Coomassie 0,25% (p/v), méthanol 30% acide acétique 5% et eau 65%.

Lors d'une électrophorèse préliminaire à un immuntransfe1i, le gel n'est pas coloré et les protéines sont directement transférées sur une membrane de nitrocellulose.

45

-4. hmnunotransfert.

L'immunotransfert (Westemblot) est réalisé en respectant les conditions décrites par Johnston et al [JOHNSTON 1982]. Le gel d'ac1ylamide est appliqué sur une plaque de nitrocellulose, préalablement trempée dans du méthanol, puis dans un tampon phosphate OJl M pH 7,0. L'ensemble est monté dans une chambre de transfert, remplie d'un tampon Tris HCl 20 mM, Glycine pH 8,6. Le transfert est réalisé à ampérage constant de 20 mA pendant 2 heures avec une réfrigération par circulation d'eau.

Aprés le transfert :

1. La plaque de nitrocellulose est trempée 2 heures dans un tampon phosphate de sodium 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 contenant 10% de FBS (Foetal Bovine Se1um) afin de saturer les sites de fixation.

2. Puis 2 heures à 4°C. dans une solution de l'anticorps 14H3.

3. La plaque est ensuite lavée plusieurs fois dans une solution de Na.Cl 0,9% contenant OJ 1 % de Tween 20.

4. Puis laissée 1 heure à 4°C. dans une solution d'un anticorps IgG de lapin anti-Ig de souris marqué par une peroxydase, dans un tampon phosphate de sodium 10 mM, Na.Cl 150 mM, pH 7,4. (solution d'anticmps à 1;3 g/l dilué au 1:500).

5. La plaque est lavée comme au 3.

6. La solution de révélation est préparée par mélange d'une solution à lmg/ml d'imidazol et de diaminobenzidine, avec 100 µl d'H₂02 30%. La plaque est mise dans

cette solution où le développement est instantané. Puis elle est séchée sur un papier filtre.

5. Purification de l'anticorps 14H3.

La purification est réalisée selon la méthode de Johnstone et al [JOHNSTONE 1982] par chromatographie d'affinité sur une colonne de protéines G de Staphylococcus aureus (Pharmacia®).

La colonne (1 ml), équilibrée avec un tampon phosphate de sodium IO mM. NaCl OJ 15 M, pH 7,4, est chargée avec 5 ml de milieu de culture de l'hybridome, puis lavée avec 20 ml du même tampon pour éluer les protéines non fixées. L'anticorps est ensuite décroché avec une solution de Glycine, HCl 0_, 1 M, pH 2,5. Les fractions contenant l'anticorps sont recueillies, neutralisées par 40 µl de tampon Tris HCl 2 M, pH 10,0, et dialysées contre un tampon phosphate de sodium 10 mM, NaCl 0, 15 M, pH7,4.

6. Dosage de la

~2-m

et de l'anticorps 14H3.

Les dosages sont réalisés avec 2 méthodes différentes :

a. méthode spectrophotométrique.

L'absorbance de la solution de ~2-m est lue à 280 nm dans une cellule de 1 cm,

et la concentration est calculée par :

C-A/lE

A : Absorbance de l'échantillon à 280 nm.

1 : Longueur de la cuve en cm.

E: Coefficient d'absorption molaire en M-1.cm-1. C : Concentration de l'échantillon en M.

-47

-l'appareilest étalonné avec letampondans lequelest solubilisée laprotéine. Le coefficient d'absorption pour la P2-m est 1,71 g-lJ.cm-1, soit un coefficient d'absorption molaire Ede 19,85.l0-3 M-1.cm-l à 280 nm.[BERGGARD 1968]

Le coefficient d'absorption pour l'anticorps 14H3 est 1,3 g-lJ.cm-1.

b

.

Dosage

des

pro

té

ines

se

lon

Low

ry

.

·

Dans un micro-tube Eppend01f, la solution de protéineàdoser est p01iéeàun volume de 200 µl par ajout d'eau distillée .0,5 ml d'acide trichloroacétique 10% sont ajoutés à une température de 0°C. Chaque tube est centrifugé 15 minutes à 13000 rpm à une température de 0°C. Le smnageant est versé doucement et le bord inte1ne de la partie supérieure de chaque tubeest séchée avec un papier filtre.

Le précipité est repris avec 0.2 ml de Na_{2C03 3% dans NaOH N/10. Après} agitation, 1 ml de réactif cuprotartrique (92% Na_2C03 à3% dans NaOH N/10, 4% tatirate de Na,Kà4%, 4% CuS0₄à 2%) est ajouté. La suspension est agitée et aprés 10 minutes d'attente à température ambiante, 0, 1 ml de réactif de Folin sont ajoutés sous agitation.

Après une attente de 30 minutes à l'obscurité, l'absorbanceest lue à 660 nm. La courbe d'étalonnage est obtenue selon lamême procédure, avec des quantités croissantes (10 µg à 30 µg) d'albumine bovine (BSA SigmaTM).

7

.

Carboxyme

thy

la

t

ion

de

la

~2-m

La cai·boxymethylation des résidus cystéine est réalisée selon la méthode de Swenson et al[SWENSON 1982].

La protéine,àla concentration de 2-6 mg/ml, est mélangéeàun tampon Tris HCl 1 M., pH 8,0, guanidine 6 Met EDTA 10 mM. La solution est mise sous un flux

d'azote pendant 60 minutes à température ambiante et sous agitation. On ajoute leDIE (1,4-dithiothreitol: HS-CHrCHOH-CHOH-CHrSH) à une quantité molaire 10 fois supérieureà laconcentration des groupements SH de lasolution protéique. La solution est portéeàune température de 40-50°C pendant 3 à 4 heures sous azote.

Puis, on refroidit à température ambiante et on ajoute de l'acide Iodo-acétique (ICH2COOH), à une concentration molaire 1,5 fois supérieure à laconcentrationtotale en groupements SH, et on incubeàl'obscurité, sous azote, pendant 30 minutes.

La réaction est bloquée par ajout d'un excès de~- a a l et lasolution

est mise sous dialyse contre de l'eau distillée pendant 48 heures, puis elle est lyophilisée.

8. Analyse des acides aminés.

Pour ladétermination du contenu en acides aminés, une quantité d' environ 0, 05 mg de protéine S-carboxyméthylée est mise dans un tube à hydrolyse. On ajoute 300

µl d'HCl 6 M, puis on congèle letube.

L'échantillon est dégazé sous vide (20 mm Hg), à basse température (Acétone et neige carbonique: environ -70°C), puis le tube est fermé à laflamme et porté à 110°C pendant 24 heures.

Le tube est ensuite refroidi, ouveli et déshydraté sous vide. Le résidu est repris avec un tamponCitrate 0,2 M, pH 2,2.

L'analyse des aeides aminés est réalisée par chromatographie d'échange d'ion et coloration en soitie de colonne par laninhydrine selon la méthode de Moore [MOORE 1968]. L'opération est faite sur un analyseur automatique Chromakon 500 (Kontron®).

49

-9. Digestion par l'endoprotéase Arg-C.

La digestion enzymatique est réalisée selon la méthode de Schenkein [SCHENKEIN 1977] à partir de la protéase extraite de la glande salivaire sous-maxillaire de souris.

La protéine S-carboxyméthylée (environ 1 mg) est reprise avec 0,3 ml de tampon NH₄HC0₃ 0,1 M., pH 8,0. L'hydrolyse se déroule pendant 12 heures en respectant un rapp01t enzyme/substrat de 1 :25 à 37°C. pendant 12 heures.

L'excès d'enzyme est inactivé en pmtant la solution à -20°C.

10. Séparation des peptides.

Les peptides, obtenues par digestion avec la protéase Arg-C, sont séparés par HPLC sur phase inverse (Chromatographe liquide WATERS™, colonne µBondapak C18 de dimension 30 cm x 3,9 mm, diamètre des patticules: 10 µm). La colonne est équilibrée avec une solution acqueuse d'acide trifluoroacétique (TFA) à 0,05% (Solvant A).

Un aliquote de la solution de peptides, correspondant à 20 nM est injecté. L'élution est conduite en 60 minutes, à température ambiante, à un débit de 1,5 ml/mn, avec un gradient de 0 à 50% d'un solvant B (TFA 0,05% dans l'acétonitrile). L'absorbance est lue à 220 nm, et chaque pic est recueilli manuellement.

Un aliquote de 200 µl de chaque fraction est lyophilisé et utilisé pour la reconnaissance par l'anticorps 14H3 par une méthode ELISA directe. Le reste est concentré et sera utilisé pour la détermination de la séquence en acides aminés.

11. Détennination de laséquence en acides aminés.

Les peptides isolés sont analysés selon la méthode d'Edman, par un appareil automatique Beckman modèle 890M, utilisant une solution de phénylisothiocyanate à 2)5%.

L'analyse est réalisée sur un échantillon contenant de 0,5à1 nmole de ~

mélangé à une solution eau/acétonitrile à proportion égale. La réaction d'Edman entraine le détachement séquentiel des acides aminés à partir de l'extrémité N-terminale: en milieu acide et à chaud, ces acides aminés sont transformés en la phénylthiohydantoïne con-espondante (PTH-acide aminé).

L'identification des dérivés phénylthiohydantoïnes est faite par HPLC. Chaque dérivé est recueilli dans un tube et repris avec 50 µl d'un mélange eau/acétonitrile 1: 1 contenant0)1o/o de TF A, avec 0,25 nmole de PTH-norleucine, utilisée comme standard

inten1e. 20 µl de ce mélange est injecté dans le chromatographe et séparé sur une colonne Ultrasphere ODS équilibrée avec un mélange de 74% d'acétate de sodium 10 mM, contenant 0, 1 % de TFA, pH 4,85 (solvantB). La séparation est effectuée à 40°C., suivant laméthode de Pucciet al [PUCCI 1983].

L'identification des dérivés PTH inconnus est réalisée par comparaison de lem tempsde rétention avec celui du standard.

12. Recom1aissance des peptides par méthode ELISA.

La reconnaissance des peptides par l'anticorps 14H3 est faite par latechnique ELISA, selon laméthode de Clevelandet al [CLEVELAND 1986] sur une plaque à 96 puits.

1. Dans chaque puit, sont déposés 1OO µl d'antigène (peptide à reconnaître) à 2 µg/ml dans NaHC0₃50 mM, pH 9,5. La plaque est mise à incubation à 4°C pendant 12 heures.