Rôles physiologiques et modes d'action des eicosanoïdes produits par les cytochromes P450 dans le poumon

Universite de Sherbrooke

Roles physiologiques et modes d'action des eicosanoides

produits par les cytochromes P450 dans le poumon.

par

Caroline Morin

Departement de Physiologie et Biophysique

These presentee a la Faculte de medecine et des sciences de la sante en vue de l'obtention du grade de

Philosophiae Doctor (Ph.D.) en Physiologie et Biophysique

Avril2010

Composition du Jury

Dr Ahmed Chraibi: President, Departement de Physiologie et Biophysique Dr Eric Rousseau: Directeur de recherche, Physiologie et Biophysique Dr Pierre Sirois : Evaluateur interne, Departement de Pharmacologie, IPS Dr Anne-Marie Lauzon, Examinateur externe, Department of Medicine, Meakins Christie Laboratories, McGill University

1*1

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RESUME :

Roles physiologiques et modes d'action des eicosanoi'des produits par les cytochromes P450 dans le poumon. Par Caroline Morin

La liberation de l'acide arachidonique (AA) de la membrane des cellules par les phospholipases activees, le rend accessible pour etre metabolise par plusieurs enzymes impliquees dans la biosynthese des eicosanoi'des. Ceux-ci incluent les cyclooxygenases (COX), les lipoxygenases (LOX) et plusieurs isoformes des cytochromes P450 (CYP450) qui produisent les acides epoxy-eicosatrienoi'ques (EET) et les acides hydroxy-eicosatetraenoi'ques (HETE). Tandis qu'une attention considerable a ete accordee aux roles des eicosanoTdes derives des COX et des LOX, relativement peu de donnees sont disponibles sur les roles potentiels des eicosanoi'des produits par les CYP450 sur la reactivite des muscles lisses des voies respiratoires (MLVR). L'objectif general de ce projet etait de determiner les modes d'action de ces eicosanoi'des bioactifs sur les tissus pulmonaires humains. L'idee etant de mieux cerner les mecanismes cellulaires et moleculaires actives lorsque ces tissus sont traites avec differents mediateurs lipidiques (eicosanoi'des) et inflammatoires (cytokines). Pour cela les proprietes electrophysiologiques, pharmacomecaniques et biochimiques susceptibles d'etre modulees par ces eicosanoi'des sur les MLVR ont ete analysees. Premierement, nous avons demontre que l'acide 14,15-epoxy-eicosatrienoi'ques (14,15-EET) hyperpolarise et relaxe les MLVR humains via l'activation des canaux potassiques de grande conductance active par le Ca2+ (BKca). De plus, nous avons demontre que cet epoxy-eicosanoi'de diminue la sensibilite au Ca2+ des bronchioles permeabilisees a la P-escine, ce qui est correle avec une baisse du niveau de phosphorylation et d'expression de la proteine CPI-17 (protein kinase C-potentiated myosin phosphatase inhibitor). Par la suite, nous avons mis au point un modele d'hyperreactivite bronchique (HRB) induit par un pretraitement des tissus au tumor necrosis factor a (TNFa). Ce modele nous a permis d'evaluer les effets anti-inflammatoires des epoxy-eicosanoi'des. Nous avons demontre que ces eicosanoi'des interferent avec l'activation du Nuclear Factor K B (NFKB) via leur interaction avec le peroxisome proliferator-activated receptors y (PPARy). De plus, le 14,15-EET et l'acide 17,18-epoxy-eicosatetraenoi'que (17,18-EpETE) diminuent l'hypersensibilite au Ca2+ des bronchioles pretraitees au TNFa, en interferant avec la voie de signalisation de p38 mitogen-activated protein kinase (p38-MAPK), ce qui entralne une reduction de la phosphorylation et de l'expression de la proteine CPI-17. L'introduction de siRNA diriges contre les transcrits de la CPI-17 dans les bronchioles humaines traitees au TNFa a permis de mettre en evidence le role crucial de cette proteine dans l'HRB. Cette etude a aussi permis de demontrer que l'epoxyde hydrolase soluble (sEH) est surexprimee dans les bronchioles humaines traitees au TNFa et dans les biopsies de patients asthmatiques. L'utilisation d'un inhibiteur pharmacologique de la sEH, le 12-(3-adamantyl-ureido)-dodecanoic acid (AUDA), a permis d'augmenter la biodisponibilite des epoxy-eicosanoi'des et leurs effets benefiques sur les tissus bronchiques traites au TNFa. Les strategies experimentales etablies ont permis de definir les modes d'action de ces eicosanoi'des et de demontrer leurs roles potentiels contre l'HRB.

TABLE DES MATIERES

LISTE DES ILLUSTRATIONS IV

LISTE DES SYMBOLES ET ABREVIATIONS VII

RESUME

INTRODUCTION 1

Anatomie et physiologie des voies respiratoires 1

Physiologie des cellules musculaires lisses des voies respiratoires 5

Controle nerveux du systeme respiratoire 5

Recepteurs et modulateurs des muscles lisses respiratoires 8

Controle de la tension mecanique des MLVR 9

Modulation de la tension par controle du potentiel de membrane 12

Couplage pharmacomecanique 13

Sensibilisation de l'appareil contractile 16

Mecanismes de l'hyperreactivite bronchique 19

Role de la sensibilite au Ca2+ : voie des Rho-kinases et de la PKC/CPI-17 23

Metabolisme de l'acide arachidonique 26

Roles et modes d'action connus des eicosanoi'des 28

But et objectifs specifiques de 1'etude 32

ARTICLE 1 37

Mise en contexte et contribution des auteurs 38

Resume 40

Article 1: Epoxyeicosatrienoic Acid Relaxing Effects Involve Ca -Activated K Channel Activation and CPI-17 Dephosphorylation in Human Bronchi

Morin C, Sirois M., Echave V., Gomes M M. & Rousseau E.

Publie dans Am J Respir Cell Mol Biol. 41

Abstract 42

Introduction 43

Materials and Methods 45

Results 49

Discussion 63

Article 2: EET Displays Anti-Inflammatory Effects in TNFa -Stimulated Human Bronchi: Putative Role of CPI-17

Morin C, Sirois M, Echave V, Gomes M.M, & Rousseau E.

Publie dans Am JRespir Cell Mol Biol. 78

Abstract 79

Introduction 80

Materials and Methods 83

Results 87

Discussion 103

References 108

ARTICLE 3 115

Mise en contexte et contribution des auteurs 116

Resume 118

Article 3: CPI-17 Silencing Reduced Responsiveness in control and TNFa-Treated Human Bronchi.

Morin C, Sirois M, Echave V & Rousseau E.

Publie dans Am JRespir Cell Mol Biol. 119

Abstract 120

Introduction 121

Materials and Methods 122

Results 126

Discussion 134

References 138

ARTICLE 4 142

Mise en contexte et contribution des auteurs 143

Resume 145

Article 4 : 17,18-EpETE Targets PPARy and p38MAPK to Mediate its Anti-Inflammatory Effect in Lung: Role of sEH

Morin C, Sirois M, Echave V, Albadine R & Rousseau E.

Accepte dans Am J Respir Cell Mol Biol. 146

Abstract 147

Introduction 148

Materials and Methods 151

Results 155

Discussion 180

DISCUSSION 192 Production endogene d'EET dans les muscles lisses des voies respiratoires 192 Effets relaxants et hyperpolarisants des EET sur les muscles

lisses bronchiques 195

Effets des EET sur la sensibilite au Ca2+ des muscles lisses bronchiques 196 Effet modulateur du 17,18-EpETE sur le tonus des muscles lisses bronchiques.. 197 Effets anti-inflammatoires des epoxy-eicosanoi'des sur les

bronchioles humaines 199

Implication de p38-MAPK dans les effets anti-inflammatoires

des eicosanoides 202

Role de la CPI-17 dans l'hyperreactivite bronchique 203 Utilisation des siRNA pour demontrer le role de la CPI-17 204 Implication de p38-MAPK dans la sensibilisation au Ca2+ des

branches humaines 206

Implication des recepteurs PPARy dans la regulation de la proteine CPI-17 208 Implication de l'epoxyde hydrolase dans le poumonhumain 208

CONCLUSION 210

PERSPECTIVES 211

REMERCIEMENTS 214

BIBLIOGRAPHIES 216

LISTE DES ILLUSTRATIONS

Schema 1. Voie aerienne de conduction et zone respiratoire du systeme respiratoire..3 Schema 2. Coupe histologique d'une bronche et du parenchyme pulmonaire 5 Tableau 1. Bronchoconstricteurs et bronchodilatateurs des muscles lisses respiratoires

et leurs recepteurs associes 9

Schema 3. Les differents modes de couplages responsables de la tension des cellules

de muscles lisse des voies respiratoires 10

Schema 4. Cascade d'activation induite par les agonistes muscariniques via l'augmentation intracellulaire de Ca2+ qui amene a la contraction du muscle lisse. ...11

Schema 5. Chevauchement fonctionnel entre les voies muscariniques et P2-adrenergiques dans le mecanisme de contraction des MLVR 16 Schema 6. Voies impliquees dans la sensibilite au Ca2+ des MLVR qui est

independante du Ca2+ 18

Schema 7. Representation de Phyperreactivite bronchique 20 Schema 8. Cascade metabolique de Pacide arachidonique 27

Schema 9. Preuve de concept: conservation et reactivite aux agonistes pharmacologiques des bronchioles controles et cultivees pendant 3 jours 34

Schema 10. Coloration a eosine-hematoxyline realisee sur des coupes histologiques derivees de bronchioles humaines fraiches et cultivees pendant 3 et 15 jours 35 Schema 11. Diagramme resumant les modes d'action du 14,15-EET et du

17,18-EpETE dans les muscles lisses bronchiques humains 207

ARTICLE 1

Figure 2 : 14,15-EET relaxes KC1 induced tensions partially via an IbTx sensitive

process 52

Figure 3 : Effects of MS-PPOH and 14,15-EEZE on human bronchi 54 Figure 4 : 14,15-EET hyperpolarizes human airway smooth muscle cell 56 Figure 5 : Effect of 14,15-EET on Ca2+ sensitivity 58

Figure 6 : Effect of 14,15-EET on PDBu-induced tonic responses in intact and

P-escin-permeabilized organ culture bronchi 60

Figure 7 : Western blot analyses of homogenates derived from control, eicosanoid

and PDBu treated human bronchi 62

ARTICLE 2

Figure 1 : Pharmacological challenges reveal that 14,15-EET opposes the effects of

TNFa pretreatments in human culture bronchi 89

Figure 2 : 14,15-EET increased IKBOC expression in TNFa pretreated bronchi 91 Figure 3 : TNFa left-shifted Ca2+ sensitivity in human bronchi, while 14,15-EET

concomitant pretreatment abolished this effect 93

Figure 4 : Effect of 14,15-EET on PDBu-induced tonic responses in

P-escin-permeabilized TNFa treated bronchi 95

Figure 5 : Western blot analyses and determination of CPI-17 transcript expression in control, TNFa and eicosanoid treated human bronchi 98 Figure 6 : Effect of 14,15-EET on U-46619 induced responses in permeabilized

TNFa treated bronchi 100

Figure 7 : 14,15-EET increases the detection level of pll6Rip in both control and

TNFa pre-treated human bronchi 102

ARTICLE 3

Figure 1 : CPI-17 silencing using reversible permeabilized human bronchi coupled

to siRNA-XtremeGene complexes 127

Figure 4 : CPI-17 silencing reduces MYPT1 phosphorylation in TNFoc-treated

bronchi and EET treatment 133

ARTICLE 4

Figure 1 : Pharmacological inhibition and detection of sEH in TNFa pretreated

human bronchi 158

Figure 2 : Detection of sEH by immunofluorescence microscopy in lung tissue

sections derived from biopsies of human bronchi 160

Figure 3 : The PPARy antagonist, GW9662, reverses the anti-inflammatory effect

of eicosanoid on TNFa-treated bronchi 163

Figure 4 : 17,18-EpETE modulate COX2 activity and expression level in

TNFa-treated bronchi 165

Figure 5 : Western blot analyses of p38-MAPK in control, TNFa and

eicosanoid-treated human bronchi 168

Figure 6 : Effect of the p38-MAPK inhibitor, SB203580, and epoxy-eicosanoids on

Ca sensitivity in TNFa-treated bronchi 170

Figure 7: Effect of p38-MAPK inhibitor and eicosanoid treatment on

phosphorylation levels of CPI-17 and MYPT1 172

Figure 8 : Effect of PPARy antagonist and eicosanoid treatment on CPI-17

expression levels in TNFa-treated bronchi 175

Figure 9 : Additive effects of 14, 15-EET and 17, 18-EpETE on reactivity and

anti-inflammatory properties 178

Figure 10 : Functional diagram summarizing the mode of action of 17,18-EpETE and 14,15-EET on intracellular mechanism involved in TNFa-stimulated human

[Ca2+]i -2+ •

LISTE DES SYMBOLES ET ABREVIATIONS

Concentration intracellular de CaZT libre

AA Acide arachidonique

ACh Acetylcholine

AUDA 12-(3-adamantyl-ureido)-dodecanoic acid BKca Canal K+ de grande conductance active par le Ca

CaM Calmoduline COX CPI-17 CYP450 DHA DHET DPA EC50 EET EPA EpDHF EpETE ERK1/2 HETE HRB IbTx 2+ Cyclooxygenase

"protein-kinase C-potentiated myosin phosphatase inhibitor" Cytochrome P450

"Docosahexaenoic acid"

Acide dihydroxyeicosatrienoique "Docosapentaenoic acid"

Concentration efficace produisant 50% de I'effet Acide epoxyeicosatrienoi'que

Acide eicosapentaenoique

"Epithelium-Derived Hyperpolarizing Factor" Acide epoxyei'cosatetraenoique

"Extracellular Signal-Regulated Kinase" Acide hydroxyei'cosatetraenoique Hyperreactivite bronchique Iberiotoxine

KATP LBA LOX MAPK MCh MLCK MLCP MLV MLVR MPOC MRLC MSPPOH NFKB nH p38-MAPK PDBu PGE2 PGF2a PPARy sEH SERCA siRNA TNFa

Canal potassique active par l'ATP Lavage broncho-alveolaire

lipoxygenase

"Mitogen-activated protein kinase" Methacholine Chloride

Kinase des chaines legeres de la myosine Phosphatase des chaines legeres de la myosine Muscles lisses vasculaires

Muscles lisses des voies respiratoires Maladie pulmonaire obstructive chronique "Myosin regulatory light chain"

N-methylsulfonyl-6-(2-propargyloxyphenyl)hexanamide Nuclear factor kappa B

Coefficient de Hill

"p38-Mitogen-activated protein kinase" Phorbol 12,13-Dibutyrate

Prostanglandine E2 Prostanglandine F2 alpha

"peroxisome proliferator-activated receptor y" "soluble Epoxide Hydrolase"

Pompe du Reticulum Sarco[Endo]plasmique Ca2+/ Mg2+- ATPase "small interfering RNA"

INTRODUCTION

Anatomie et physiologie des voies respiratoires

Le systeme respiratoire a pour principale fonction de fournir une oxygenation adaptee du sang arterielle. Afin de remplir cette fonction, l'air doit etre amene au niveau de la zone de I'appareil respiratoire ou les echanges ont lieu (MARIEB, 1999). D'un point de vue fonctionnel, le systeme respiratoire est divise en deux zones: une zone de conduction et une zone d'echange respiratoire. Les voies aeriennes de conduction extra pulmonaire comprennent les fosses nasales, le pharynx, le larynx, la trachee et les branches. Les voies de conduction extra pulmonaires humidifient, purifient et ajustent la temperature de l'air inspire. La purification et l'humidification sont realisees par la muqueuse respiratoire. Celle-ci est constitute d'un epithelium pseudostratifie fait de cellules ciliees, de nombreuses cellules a mucus et un tissu conjonctif sous-jacent comprenant de nombreuses glandes seromuqueuses (TORTORA et al., 2001). Les modifications de temperature sont realisees par la riche vascularisation du tissu conjonctif situe sous 1'epithelium. La lumiere des voies aeriennes de conduction est maintenue ouverte grace a une armature squelettique faite d'os et de cartilage. Le diametre des lumieres des differentes voies aeriennes est controle par les cellules musculaires lisses situees dans la paroi de ces structures. Le larynx qui fait partie des voies de conduction est construit pour empecher la penetration des corps etrangers dans le poumon et pour permettre la phonation. La trachee est une voie respiratoire tubulaire qui s'etend du larynx au milieu du thorax ou elle se divise en branches souches droite et gauche. La paroi de la trachee comprend:

une sous-muqueuse composee de glandes seromuqueuses qui secretent le mucus, de cartilage hyalin et une adventice faite de conjonctif areolaire. Des fibres musculaires lisses transverses forment le muscle tracheal (TORTORA et al., 2001). La contraction du feuillet musculaire lisse, diminuant ainsi son diametre, a pour role d'accroitre la force de poussee de l'air expire pour favoriser la sortie du mucus de la trachee pendant la toux. L'epithelium tracheal est cylindrique, pseudostratifie et cilie. II repose sur une membrane basale et une sous muqueuse, une couche de tissu conjonctif contenant les glandes seromuqueuses qui contribuent a la production de mucus (TORTORA et al., 2001). L'epithelium est compose de trois types principaux de cellules : les cellules ciliees, les cellules secretrices et les cellules basales. Les cellules ciliees ont pour fonction principale de capter les particules de matiere entrant dans les voies respiratoires en propulsant le mucus charge de poussiere en direction du pharynx. Les cellules secretrices existent sous differentes formes et represented de 15 a 25% des cellules constituant l'epithelium. Les cellules a mucus sont les principales productrices de mucus respiratoire.

Les voies aeriennes de conduction intra pulmonaires comprennent les bronches intra pulmonaires qui se divisent en bronchioles, tubes de diametre decroissant ne possedant pas de squelette cartilagineux. L'epithelium bordant les bronchioles de grand diametre est compose de cellules ciliees et de quelques cellules a mucus. Celui des petites bronchioles est de type cylindrique simple, les cellules a mucus etant remplacees par les cellules de Clara (MARIEB 1999). De plus I'epaisseur de leur paroi diminue de meme que le diametre de leur lumiere. La region la plus distale de la

divisent en canaux alveolaires qui se terminent au niveau de zones renflees, les sacs alveolaires, constitues chacun d'alveoles. L'epithelium des sacs alveolaires et des alveoles comprend deux types de cellules : les pneumocytes de type I, tres aplatis qui composent la majeure partie du revetement des alveoles et des sacs alveolaires, et les pneumocytes de type II qui synthetisent le surfactant qui est un phospholipide qui reduit la tension de surface (GARTNER et al., 1997, TORTORA et al., 2001). La zone d'echange gazeux est associee a un reseau capillaire extremement riche, alimentee par les arteres pulmonaires et drainee par les veines pulmonaires. Les capillaires de type continus entourent chaque alveole, et les cellules endothelials sont en relation etroite avec les pneumocytes de type I. En fait, dans plusieurs endroits la membrane basale de ces deux types cellulaires fusionne en une seule membrane basale, la barriere alveolocapillaire etant alors la plus fine possible ce qui facilite les echanges gazeux. Comme le poumon contient de tres nombreuses alveoles, ces petits espaces serres les uns contre les autres sont separes de leurs alveoles voisins par des parois d'epaisseurs variables, les cloisons alveolaires. Les cloisons inter-alveolaires les plus fines contiennent souvent des pores inter-alveolaires par lesquels Pair passe d'un alveole a l'autre. Des macrophages sont presents dans les alveoles et les cloisons inter- alveolaires. Ces cellules d'origine monocytaire arrivent au poumon par la circulation sanguine, ou elles se differencient et deviennent des nettoyeurs tres efficaces (GARTNER et al., 1997). Elles sont eliminees au rythmes de 50 millions par jour ou elles sont transportees des bronchioles jusqu'au pharynx par le mucus et

microvasculaire, induire la toux et augmenter ou induire 1'inflammation. Les voies respiratoires sont sous le controle de deux composants principaux du systeme nerveux autonome : le systeme nerveux sympathique et le systeme nerveux parasympathique (Revue par VAN DER VELDEN et al., 1999). Ceux-ci sont constitues de trois differents types de fibres nerveuses, soit les fibres excitatrices cholinergiques, les fibres inhibitrices adrenergiques ainsi que les fibres adrenergique non-cholinergique (NANC), qui peuvent etre soit excitatrices (e-NANC), soit inhibitrices (i-NANC). Les fibres de type cholinergiques constituent 1'innervation excitatrice predominate dans les voies respiratoires. Le neurotransmetteur associe a ce systeme neuronal est 1'acetylcholine, une molecule ayant la capacite de se fixer autant aux recepteurs de type muscarinique qu'aux recepteurs nicotiniques (Revue par STEPHENS et al., 2001). De nombreuses cellules possedent ces deux types de recepteurs pour l'acetylcholine a leur surface, tant les cellules neuronales que les cellules non-neuronales telles les macrophages, les lymphocytes, les mastocytes, les muscles lisses et les cellules epitheliales. Les fibres adrenergiques controlent les vaisseaux sanguins bronchiques, mais aucune innervation des muscles lisses pulmonaires n'a ete demontree chez l'humain. Les recepteurs P-adrenergiques sont exprimes sur les muscles lisses des voies respiratoires et provoquent une bronchodilatation lorsqu'ils sont actives (Revue par CANNING, 2006).

Le systeme non-adrenergique non-cholinergique inhibiteur (i-NANC) est le seul mecanisme neuronal bronchorelaxant des voies respiratoires decrit jusqu'a maintenant (Revue par CANNING, 2006). Les neurotransmetteurs de ce systeme efferents sont les purines, le peptide vasoactif intestinal (VIP) et le NO. Bien que considered comme

etant les neurotransmetteurs du systeme i-NANC, il est a noter que le VIP et le NO sont aussi liberes par les fibres cholinergiques, ainsi que par plusieurs cellules non-neuronales comme les lymphocytes ou les macrophages. Le VIP est un des neuropeptides les plus abondants retrouves dans le poumon et dans la muqueuse nasale. En plus d'etre un puissant bronchodilatateur, le VIP a la capacite de moduler la reponse immune de facon importante (Revue par CANNING, 2006). Par exemple, il inhibe l'activite des lymphocytes T actives, la production de cytokines pro-inflammatoires et de NO. II stimule aussi la production de cytokines anti-inflammatoires comme l'IL-10 (Revue par WIDDICOMBE, 1998). Chez l'humain, des etudes ont rapportees un deficit en VIP chez les sujets asthmatiques (OLLERENSHAW et al., 1989 ; CARDELL et al., 1994).

Le systeme excitateur non-adrenergique non-cholinergique est le deuxieme systeme neuronal excitateur present dans les voies respiratoires. Les fibres nerveuses de type e-NANC sont des fibres afferentes non-myelinisees qui protegent les voies respiratoires contre des irritants ou des particules chimiques presentes dans Pair ambiant. Elles sont appelees fibres C en reference a leur sensibilite pour la neurotoxine « capsaicine », un compose retrouve dans les piments forts. Lorsque les fibres C sont mises en presence d'une quantite importante de capsaicine, elles vident completement le contenu de leurs vesicules, remplies de neuropeptides excitateurs comme la substance P ou le peptide relie au gene de la calcitonine (CGRP). Les fibres situees dans le poumon sont d'origine vagale et spinale, alors que les fibres qui

epitheliale. Leur extremite contient des vesicules remplies de neuropeptides bioactifs. Les principaux neuropeptides retrouves dans ces vesicules sont le CGRP et les tachykinines, une famille de molecules qui comprend la substance P, les neurokinines A et B, ainsi que les neuropeptides K et -y. La neurokinine A et la substance P sont generees a partir du meme gene, le preprotachykinine A. On trouve la neurokinine A sur les nerfs presents dans l'epithelium, autour des vaisseaux sanguins et dans la couche de muscle lisse (Revue par WIDDICOMBE, 1998). Sa presence dans les lavages broncho-alveolaires (LBA) est significativement augmentee chez les sujets asthmatiques provoques avec un allergene, compare aux sujets asthmatiques non-pro voques (Revue par JOOS, 2001). C'est aussi un puissant bronchoconstricteur. La substance P est un puissant agent vasodilatateur et constricteur des muscles lisses. Elle est liberee lorsque les fibres C sont activees par des stimuli chimiques ou mecaniques. La liberation de substance P induit de nombreux effets pouvant contribuer aux changements observes dans les voies respiratoires des asthmatiques. Elle provoque la contraction des muscles lisses, la secretion des glandes sous-muqueuses, la vasodilatation, une augmentation de la permeabilite vasculaire, la stimulation des nerfs cholinergiques, celle des mastocytes, des lymphocytes T et B, des macrophages ainsi que la chemoattraction des eosinophiles et l'adhesion vasculaire des neutrophiles (Revue par CANNING et al., 2001).

Recepteurs et modulateurs des muscles lisses respiratoires

On retrouve a la surface des cellules de MLVR une population diverse de recepteurs auxquels se lient les neurotransmetteurs et autres modulateurs. Le tonus des cellules

de MLVR est regule par les effets de ces facteurs responsables de l'activation des adrenocepteurs, des recepteurs cholinergiques (muscariniques M3 et M2), au VIP, aux tachykinines, au CGRP, des recepteurs histaminergiques et plusieurs recepteurs additionnels actives par des mediateurs lipidiques ou des derives des cellules du systeme immunitaire ou epitheliales (Revue par BARNES 1998, Revue par STEPHENS 2001).

Tableau 1 : Bronchoconstricteurs et bronchodilatateurs des muscles lisses respiratoires et leurs recepteurs associes (Revue par BARNES 1998).

BRONCHGCONSTRICTQfiS B80NCH0DILAT0RS Mutators Hstami! C^teuteiws Thrwrtaa* Pre»|tof!din Dj Prossa^andtn Fh topr«t»es (ttefet-activangtaar Serotonin" Sradfkinin fe*3felm-1 tenoftte* Angiotensin II Receptor H, CjsLT, TP TP{0(*J TPffP] TP Ptf SHTj % IT. A* AM Msurotrammtet feeyWwIine SixtareeP Meuroliriin A CGRPf Neuropeptide f Choteptofaiin' Boratein/»! Receptor u>m mt M, cmm K. ecu, m BrwhodtSatof Epinephrine ¥»©sftt# intestinal pepftJe PAW FtetiglarefcEj Rratacjdm Adrenomedulit Atrial rtatruite peptide Nitric onde teapot fc-fcjrswgfc mi _Pill EP P AM Guan)%lc^teA Gaat^qetetsaJubte)

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Controle de la tension mecanique des MLVR

Le couplage excitation-contraction des MLVR se fait selon deux modes: le couplage electromecanique et le couplage pharmacomecanique, ce dernier survient suite a une stimulation effectuee par un agent pharmacologique et il est associe a peu ou pas de

Ces deux mecanismes ont pour effet d'augmenter la concentration du Ca + libre dans le cytosol amenant la cellule a se contracter suivant une cascade d'activation biochimique (Revue par SOMLYO et al., 1994; Revue par JANSSEN, 2002). Eventuellement des mecanismes compensateurs permettent de controler la relaxation des MLVR. Au niveau intracellulaire et moleculaire, quatre ions Ca2+ vont se fixer a la calmoduline (CaM). Le complexe Ca-CaM va se Her a la kinase des chaines legeres de la myosine (MLCK) ce qui la rend active. Ce nouveau complexe va utiliser l'adenosine-5' -triphosphate (ATP) pour transferer un groupement phosphate sur une chaine legere de la myosine ce qui va ensuite augmenter les interactions entre les myosines phosphatees et les filaments d'actine pour provoquer la contraction des cellules de muscles lisses (Schema 4).

Schema 4- Cascade d'activation induite par les agonistes muscariniques via l'augnientation intracellulaire de Ca2+ qui amene a la contraction du muscle

lisse. L'augmentation du Ca2+ intracellulaire provenant des reserves internes et du milieu extracellulaire induit une cascade d'activation amenant a la phosphorylation

Les changements de la concentration du Ca intracellulaire libre ([Ca ]j) des MLVR peuvent etre decomposes en deux etapes: une est transitoire et rapide, elle survient toujours suite a un stimulus pharmacologique, puis une seconde etape de type soutenue qui suit la premiere phase si seulement le stimulus et le Ca2+ extracellulaire sont toujours presents (PACAUD et BOLTON, 1991). Ces deux voies impliquent une augmentation du [Ca2^ qui provient soit des reserves calciques intracellulaires pour la premiere phase transitoire, soit du milieu extracellulaire pour la seconde phase soutenue, apres que les reserves calciques aient ete videes (PACAUD et BOLTON, 1991). Lorsque le stimulus est termine, le [Ca2+]; est repompe dans les reserves intracellulaires par la pompe Ca2+-Mg2+-ATPase (SERCA). II est aussi extrude de la cellule par des pompes calciques ATP-dependant et l'echangeur Na+/Ca2+, situes dans le sarcolemme (Revue par JANSSEN, 2002)

Modulation de la tension par controle du potentiel de membrane

Le potentiel de membrane des cellules musculaires lisses varie de -47 a -60 mV. Deux types de canaux ioniques intervient dans la modulation du potentiel de membrane des MLVR : des canaux K+ et des canaux C1-, tous deux dependants du Ca2+. Le couplage electromecanique consiste en une contraction initiee par une depolarisation du sarcolemme et il est medie par les canaux calciques actives par le voltage (VOC) (MORAN et al., 1999, Revue par STEPHENS et al., 2001). Ce mode de couplage est observe lors d'experiences au cours desquelles la concentration extracellulaire de K+ est augmentee de facon a reduire la force electromotrice agissant sur ces cations. Dans ce cas, la contraction des cellules de MLVR est causee par une diminution relative des

conductances K de la cellule au profit d'une contribution plus importante des conductances anioniques (CI"). I/augmentation de la contribution des conductances CI" a pour effet de depolariser la membrane, ce qui active les canaux Ca2+ dependant du voltage et permet l'entree de Ca2+ dans la cellule. Cette augmentation de Ca2+ cytoplasmique initie la meme cascade enzymatique qu'une augmentation transitoire provoquee par la liberation de Ca2+ des compartiments intracellulaires (BORON et al., 2003). Au contraire, l'activation par le Ca2+ des canaux potassiques dependants du Ca (BKca) provoque une augmentation de la conductance potassique done une sortie de K+ ce qui entraine une hyperpolarisation et une inactivation de Pinflux Ca2+, done une diminution du tonus musculaire (MORAN et al., 1999, Revue par STEPHENS etal., 2001).

Couplage pharmacomecanique

Dans le cas d'un couplage pharmacomecanique, la hausse de Ca2+ intracellulaire n'est pas due a une depolarisation de la membrane. Les differents types de couplage pharmacomecaniques s'effectuent par I'intermediaire de cascades de signalisation complexes, extracellulaire, transmembranaire et intracellulaire qui modulent le tonus des MLVR sans generer de potentiel d'action. Ce mecanisme peut-etre initie suite a la liaison d'un agent pharmacologique comme l'histamine ou 1'acetylcholine (ACh), sur leurs recepteurs respectifs. Un neurotransmetteur, l'ACh par exemple, lorsqu'il est libere dans les synapses ganglionnaires, active les recepteurs nicotiniques du neurone postganglionnaire. Cette activation produit un potentiel d'action qui se propage le

d'ACh. Celle-ci va activer les recepteurs muscariniques M2 et M3 situes a la membrane des cellules musculaires lisses, ce qui active la PLC, la production d'IP3 et la liberation de Ca2+ des reserves intracellulaires ce qui induit une augmentation du tonus. Le recepteur M2 present a la membrane presynaptique est aussi active par l'ACh et permet la formation d'une boucle de retroaction negative qui limite la relache subsequente de neurotransmetteur (Revue par STEPHENS et al., 1998).

Le controle biochimique du mecanisme de la contraction est initie par la liaison de l'ACh avec le recepteur M3. Cette liaison active une proteine Gq/n qui va a son tour induire l'activation de la phospholipase Cp (PLCp). La PLCp va catalyser l'hydrolyse de la phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2), situe dans la membrane sarcolemmale, en inositol 1, 4, 5-triphosphate (InsPa) et en diacylglycerol (DAG). L'InsP3 diffuse dans le cytosol vers Pinterieur de la cellule et va ensuite se Her a son recepteur (InsPaR) situe dans la membrane du reticulum endoplasmique (RE) qui contient les reserves de Ca2+ intracellulaire (Revue par ROUX et al., 1998; Revue par STEPHENS et al, 1998). La liaison de l'InsP3 sur son recepteur canal va faire augmenter la probabilite d'ouverture de ce dernier et permettre la liberation rapide de Ca2+ des reserves intracellulaires (Schema 4). Suite a cette augmentation transitoire du [Ca2+]i libre, une partie de ce Ca2+ va se Her a la CaM pour induire la cascade d'activation amenant la contraction des MLVR. L'augmentation du [Ca2+]; libre a d'autres effets comme l'activation du canal CI" dependant du Ca2+ qui va initier la depolarisation cellulaire (Revue par JANSSEN, 1998). L'augmentation du [Ca2+]; peut egalement activer le recepteur sensible a la ryanodine (RyR) permettant ainsi la

relache d'une plus grande quantite de Ca libre du RS et qui va activer ulterieurement des canaux K+ actives par le Ca2+ (Kca) impliques dans l'hyperpolarisation membranaire des MLVR (Revue par BARNES, 1998).

Le DAG, le second produit de I'hydrolyse de la PIP2 par la PLCp, reste dans la membrane plasmique ou il active la proteine kinase C membranaire (PKC) qui va aussi participer a la regulation de la tension du MLVR. Une fois activees, la PKC favorise la contraction des MLVR par la phosphorylation de canaux calciques voltage dependant, mais aussi en sensibilisant l'appareil contractile. Cette sensibilisation a lieu en phosphorylant la proteine CPI-17 qui va inhiber l'activite phosphatase de la MLCP pour ainsi faciliter la phosphorylation de la MLC et induire la contraction des cellules de MLVR (Revue par ROUX et al., 1998). Cependant, la PKC va aussi induire la phosphorylation du recepteur p2-adrenergique qui, avec la liaison de son ligand, est implique dans la relaxation des MLVR et ce, en induisant une augmentation de Padenosine-3',5'-monophosphate cyclique (AMPc) intracellulaire a partir de l'ATP via l'activation de la proteine Gs et de 1'adenylate cyclase (AC). Lorsque l'ACh active le recepteur M3, il active aussi le recepteur muscarinique M2 situe dans le sarcolemme des cellules des MLVR (Schema 5). Le recepteur M2 active une proteine G! qui a pour fonction d'inhiber l'AC et ainsi de diminuer la formation de l'AMPc a partir de l'ATP intracellulaire. Une augmentation de l'AMPc active la proteine kinase A (PKA) qui active la phosphatase des chaines legeres de la myosine (MLCP) et le repompage du Ca2+ par la pompe SERCA dans les reserves intracellulaires (Revue par ROUX et al., 1998). La MLCP enleve le groupement

cette voie module la sensibilite des myofilaments de myosines du complexe Ca-CaM. Deux mecanismes peuvent impliques dans ce phenomene de sensibilisation de l'appareil contractile : l'inhibition de la myosin light chain phosphatase (MLCP) et la phosphorylation de proteines regulatrices (Schema 6). Plusieurs messagers intracellulaires peuvent modifier l'activite de la MLCP dont le DAG ou l'acide arachidonique (AA). Divers agonistes sensibihsants stimulent la production d'AA via l'activation de la phospholipase A2 (PLA2). Le DAG et l'AA activeraient un PKC qui inhiberait l'activite de la MLCP par la phosphorylation de la CPI-17, une proteine specifique du muscle lisse et inhibitrice de la MLCP. L'effet sensibilisant des agonistes bronchoconstricteurs peut aussi impliquer les proteines G dont principalement une petite proteine G appelee Rho. La voie des Rho-kinases est activee par les thromboxanes ou par le U-46619 (un analogue du tromboxaneA2 qui se lie au recepteur TP) et qui va activer la proteine Gi2,i3. Celle-ci active un facteur d'echange nucleotidique, nomme p115Rho GEF, qui lui active la proteine RhoA-GDP en echangeant la guanosine-5'-diphosphate (GDP) pour de la guanosine-5'-triphosphate (GTP). Le complexe RhoA-GTP, active la Rho-kinase qui va ajouter un groupement phosphate a partir de l'ATP sur la MLCP. La phosphorylation de la MLCP rend celle-ci inactive en l'empechant de dephosphoryler les tetes de myosine favorisant la contraction (Revue par SOMLYO et SOMLYO, 2003). Done le tonus des MLVR est la resultante d'un equilibre dynamique entre la phosphorylation et la dephosphorylation de la myosine. Les Rho-kinases sont egalement impliques dans diverses reponses cellulaires comme l'activation de la transcription, la motilite,

Par exemple, l'asthme qui est decrit comme un desorde inflammatoire chronique des voies aeriennes; cette inflammation est secondaire a un infiltrat polymorphe, comprenant notamment des eosinophiles, des lymphocytes et des mastocytes. Cette inflammation entrame des symptomes qui sont en general en rapport avec une obstruction bronchique diffuse et variable, reversible spontanement ou sous l'effet du traitement, par ailleurs cette inflammation est la cause d'une hyperreactivite bronchique a de nombreux stimuli. Certaines atteintes de la structure bronchique, telles que la fibrose sous-epitheliale et des alterations du muscle lisse des branches, ont egalement ete decrites chez les sujets qui souffrent d'asthme. (Revue par FOLKERT et al., 1998; Revue par LEGUILLETTE et al., 2008)

Mecanismes de 1'hyperreactivite bronchique

L'hyperreactivite bronchique (HRB) est associee a diverses pathologies respiratoires. Parmi celle-ci l'asthme est a mettre au premier rang en raison de l'intensite de l'HRB observee et de la haute frequence avec laquelle elle s'associe a cette pathologie. En termes de prevalence l'HRB touche 10 a 15 % de la population en generale, presque 100 % des asthmatiques couramment symptomatiques, 40 % des asthmatiques chroniques, 50 % des personnes souffrant de bronchites chroniques et de 25 a 50 % des patients atteints de fibrose kystique. Elle semble plus frequente chez les femmes que chez les hommes (Revue par COBURN 1989, Revue par LOUIS et al, 1994). L'HRB est caracterisee par une reponse bronchoconstrictrice exageree aux stimuli non specifiques lorsque comparee aux reponses chez les sujets normaux. Elle est la

manipuler le Ca par les cellules de muscles lisses, un changement de la morphologie ou de la geometrie des voies aeriennes et des processus inflammatoires qui endommagent l'epithelium menant a la liberation de cytokines et mediateurs lipidiques (Revue par MIDDLETON, 1984; Revue par HARGREAVE et al.,1986; Revue par JANSSEN, 1998). Tous ces mecanismes semblent etre impliques dans le developpement et le maintien de l'HRB, mais aucun de ceux-ci n'a donne une explication entierement satisfaisante a ce phenomene. Ce qui peut probablement s'expliquer par le fait qu'il n'y a pas de mecanisme unique mais plutot un ensemble de facteurs et differents mecanismes qui seraient responsables de la mise en place de l'HRB dans les differents pathologies respiratoires et phenotypes d'asthmes.

Cependant, il a ete demontre que le niveau d'HRB depend de problemes inflammatoires qui modifient la structure de l'arbre bronchique et le statut fonctionnel des muscles lisses. Chez des patients asthmatiques ayant de l'HRB, il a ete decrit que le role de barriere de protection de l'epithelium respiratoire est diminuee ou parfois inexistante (CHAKIR et al., 2001). Cette perte d'integrite et de fonctionnalite de l'epithelium bronchique serait causee par la liberation de mediateurs inflammatoires et de produits cytotoxiques comme les proteines cationiques (dont la major basic protein), des enzymes proteolytiques (metalloprotease matricielle-9) et des proteases (tryptase, chymase) par les cellules sanguines (Revue par FOLKERTS et NUKAMP, 1998). Plusieurs liens ont ete etablis entre la perte d'un epithelium fonctionnel et l'hyperreactivite des voies respiratoires. Les dommages a l'epithelium causent la perte

voies respiratoires et atteindre plus facilement la sous-muqueuse ou ils peuvent induire des reactions inflammatoires severes. II peut y avoir exposition des terminaisons nerveuses afferentes non-myelinisees resultant en une diminution de leur seuil d'activation et en une facilitation de leur stimulation par les agents inflammatoires. Une augmentation de la reactivite menant a l'HRB peut se produire car 1'epithelium secrete des substances qui augmentent la contractilite des MLVR (Revue par STEPHENS et al., 2003).

Bien que les animaux ne developpent pas spontanement de l'asthme, l'HRB peut etre reproduit dans des modeles animaux suite a une exposition avec des allergenes. Les modeles animaux d'HRB et d'inflammation des voies aeriennes ont ete developpes pour une variete d'especes y compris les chevaux, les chats, les moutons, les cobayes, les rats et les souris (Revue par HIROTA et al., 2005). Dans ces modeles, Phyperreactivite des voies respiratoires peut etre induite par une sensibilisation systemique et par inhalation avec un allergene, tel que Povalbumine. Apres une breve exposition a l'allergene, les souris sensibilisees developpent une HRB transitoire qui est associee a l'accumulation de cellules et de mediateurs inflammatoires dans les poumons et les voies respiratoires. II est demontre qu'un profil inflammatoire de type Th2 contribue a l'HRB, bien que la contribution relative des differentes cellules et mediateurs reste a etre elucidee (Revue par FOLKERTS et NIJKAMP, 1998; Revue par ORDONEZ et al., 2000). En depit de la precieuse information acquise par l'usage de ces modeles de sensibilisation allergique, ils ne presentent pas une inflammation chronique des voies respiratoires et des changements structuraux qui caracterisent

l'asthme chez l'homme. Ces changements structuraux sont observes dans la paroi des voies respiratoires sous-epitheliales, de la fibrose, de l'hyperplasie et de l'hypertrophie des cellules musculaires lisses qui peuvent aboutir a un epaississement de la paroi des voies aeriennes. L'augmentation de la densite des MLVR peut-etre du a plusieurs facteurs tels que la proliferation cellulaire induite par des mediateurs inflammatoires ou des facteurs de croissances, la migration cellulaire, ou en raison de l'hypertrophie causant le retrecissement des voies respiratoires (Revue par MITZNER et al., 2000).

Role de la sensibilite au Ca2+ : voie des Rho-kinases et de la PKC/CPI-17

En plus des changements structuraux observes dans les voies respiratoires certaines donnees suggerent que des changements fonctionnels au sein des MLVR qui tentent a augmenter la contraction pourraient contribuer a l'HRB. Plusieurs etudes realisees dans des modeles in vitro et in vivo demontrent qu'un changement dans l'activation des voies conduisant a la sensibilite aux Ca2+ des myofilaments, telle que la voie des Rho Kinases et de la PKC/CPI-17, contribuent a une augmentation de la reactivite des muscles lisses (Revue par SOMLYO et SOMLYO, 2000; Revue par GOSEN et al., 2004; SCHAAFSMA et al., 2004). Les differences dans la contractilite des MLVR peuvent impliquer une modulation de la sensibilite au Ca2+ des myofilaments, du a une augmentation des niveaux de phosphorylation de la MLCP et de la MLC. Une augmentation de sensibilite au Ca2+ des MLVR a ete demontree en conditions physiopathologiques, c'est-a-dire dans certains modeles animaux suite a une exposition allergenique ou par un traitement de cellules avec des cytokines et d'autres

COBBAN, 2003; SAKAI et al., 2005a). De plus, des etudes ont montre que l'activation de la voie Rho kinase jouait un role cle dans la promotion de l'hyper-contractilite des cellules musculaires lisses. Dans un modele de rats sensibilises a l'ovalbumine, des experiences sur des tissus bronchiques permeabilises ont reveles que 1'augmentation de reactivite induite par l'acetylcholine (ACh) etait diminuee par un traitement avec un inhibiteur de proteines Rho (Clostridium botulinum C3 exoenzyme) (CHIBA et al., 2003; CHIBA et al., 2004a). Par consequent, il a ete confirme qu'une surexpression de la proteine RhoA etait responsable de l'augmentation de reactivite a l'ACh. Dans les MLVR de rats, il a ete etabli que le TNFa, un mediateur important de 1'inflammation associee a l'induction de l'HRB, pourrait etre responsable de ces changements de contractilite, car cette cytokine augmente l'expression de RhoA et par consequent l'activation de la voie des Rho-kinases (CHIBA et al., 2003). De plus d'autres cytokines telles que l'IL-13 et IL-4, ont aussi ete liees a l'HRB et a l'augmentation de sensibilite au Ca des myofilaments (TLIBA et al., 2003; CHIBA et al., 2009).

Une autre voie de signalisation qui module la sensibilite au Ca2+ dans les cellules de muscles lisses est la voie de la PKC et de la CPI-17. Bien que moins connue et etudiee dans ce type cellulaire, cette voie de signalisation controlee par la proteine CPI-17 represente une candidate probable dans la modulation de la sensibilite au Ca2+ des myofilaments en condition normale et pathologique (YAMAWAKI et al., 2001; Revue par SOMLYO et SOMLYO, 2003). D'ailleurs une etude a demontree un niveau plus eleve d'activation et d'expression de la proteine CPI-17 dans les MLVR

de rats, ce qui resultait en une augmentation de la sensibilite au Ca de l'appareil contractile suite a une stimulation par l'ACh (SAKAI et al., 2005b). Toutefois, au niveau bronchique chez l'humain, le role specifique de la voie PKC/CPI-17 dans l'HRB n'a jamais ete demontre et reste incertain.

Des mediateurs lipidiques tels que les isoprostanes qui sont un groupe de prostaglandines produit par les radicaux libres polyinsatures suite a la peroxydation des lipides membranaires, ont ete rapportes pour avoir la capacite d'induire de l'HRB (Revue par JANSSEN, 2001). La production d'isoprostanes augmente pendant les periodes de stress oxydatif associe a diverses maladies, y compris I'asthme, les maladies pulmonaires obstructives chroniques, la maladie pulmonaire interstitielle, la fibrose kystique, et l'hypertension. Un niveau eleve d'isoprostanes a ete detectes chez des individus normaux exposes a l'ozone, la fumee de cigarette, ou d'autres allergenes qui sont tous associes a l'HRB (Revue par JANSSEN, 2001). Les isoprostanes, 8-isoPGE2 et 8-isoPGF2a, sont de puissants vasoconstricteurs dans presque tous les lits vasculaires et ils sont egalement responsables d'exercer des effets excitateurs chez les MLVR humains et bovins. Fait interessant, l'effet des isoprostanes, n'est pas tant une reponse contractile, mais plutot une amelioration des reponses aux histaminergiques et cholinergiques. En particulier, le 8-isoPGE2 augmente la reactivite et la sensibilite des MLVR a un seuil de concentration plus faible et cause la brochoconstriction au carbachol et a l'histamine, sans aucun changement apparent de la reponse contractile maximale (CATALLI et JANSSEN, 2004).

Par consequent, l'HRB reste un probleme important qui justifie l'etude du couplage pharmacomecanique dans les MLVR. De plus, Phypertrophie et l'hyperplasie du muscle lisse, dans les cas d'asthme chronique, justifient que Ton s'attarde a mieux etudier les mecanismes moleculaires impliques dans la signalisation intracellulaire qui module la reactivite des MLVR.

Metabolisme de l'acide arachidonique

L'acide arachidonique (AA) fait partie integrante de la structure de la membrane plasmique et elle est principalement esterifiee en position sn-2 des phospholipides. L'AA entrant dans la composition de la phosphatidylcholine est libere de la membrane de la liaison ester a la position sn-2 du phospholipide par une activite specifique de la phospholipase A2 (PLA2) cytosolique qui est dependante du Ca2+ et de sa phosphorylation. L'AA peut egalement etre hydrolyse des phospholipides membranaires par la PLC, la DAC-lipase et le 2-monoacylglycerol (MAG) lipase. Une fois libere dans le milieu intracellulaire l'AA devient un important second messager qui est directement responsable de la modulation d'enzymes clefs telles que la PKC et les MAPK. Cependant, apres sa synthese l'AA peut etre metabolise par plusieurs voies enzymatiques ou etre reincorpore a un phospholipide membranaire par une enzyme acyltranferase. Par ailleurs, sa conversion en un nombre important de metabolites oxydes joue plusieurs roles fondamentaux complexes dans la biologie cellulaire (von EULER et al., 1936; BERGSTROM et al., 1959; SAMUELSSON et al., 1980; SIROIS et al., 1981; CHACOS et al., 1982; OLIW et al., 1982; Revue par BORGEAT et al., 1985; Revue par SPECTOR, 2008).

Role et mode d'action connus des eicosanoides

Les prostaglandines produites par les voies des COX sont des agents de signalisation paracrine et autocrine qui activent de nombreux recepteurs membranaires a 7 segments transmembranaires couples a des proteines G. Certaines prostaglandines telles que les thromboxanes et PGFa sont des mediateurs importants de Pinflammation et de puissants bronchoconstricteurs. Tandis que d'autres prostaglandines (PGE2) et les prostacyclines sont des bronchodilatateurs qui possedent des proprietes anti-inflammatoires (BERGSTROM, 1967; von EULER, 1968). Les produits des lipoxygenases sont des bronchoconstricteurs qui augmentent la secretion de mucus et la permeabilite vasculaire dans l'asthme (POFF et al., 2004; GONZALEZ-PERIZ et al, 2007; Revue par RICHTER et al., 2007). Les metabolites des COX et des LOX sont bien connues comme etant d'importants modulateurs du tonus bronchiques et des reactions inflammatoires des MLVR (SIROIS et al., 1981; Revue par BORGEAT et al., 1985; SIROIS et al., 1985). Tandis qu'une attention considerable a ete apportee pour determiner les roles des eicosanoides derives des cyclooxygenases (COX) et des lipoxygenases dans la reactivite bronchique, relativement peu de donnees sont disponibles considerant les roles potentiels des eicosanoides produits par les CYP450 sur la reactivite des muscles lisses des voies respiratoires (MLVR). Ce qui justifie que Ton s'attarde a mieux etudier les modes d'action et mecanismes moleculaires qui soutendent la signalisation intracellulaire de ces eicosanoides produits par les CYP450 epoxygenases et hydroxylases dans le poumon humain et sur la reactivite des MLVR.

Plusieurs metabolites des CYP450 sont connus pour jouer un r61e non negligeable dans la regulation du tonus vasculaire et pulmonaire. La voie enzymatique des CYP450 epoxygenases et hydroxylases produisent respectivement les acides epoxy-eicosatrienoi'ques (EET) et les acides hydroxy-eicosatetraenoi'ques (HETE) a partir de l'AA (CHACOS et al., 1982; OLIW et al., 1982; Revue par FLEMING, 2008; Revue par SPECTOR, 2008). Les enzymes CYP450 co-hydroxylases responsables de la production de 20-HETE a partir de l'AA sont exprimes dans les reins, le foie et le poumon humain. Le 20-HETE a pour effet de contracter les arterioles renales, cerebrales et mesenteriques (Revue par KROETZ et al., 2005; Revue par MIYATA et al., 2005). L'activite vasoconstrictrice du 20-HETE implique l'activation de la PKC et de la voie des MAPK ainsi qu'une inhibition des canaux BKCa (Revue par ROMAN, 2002). Au niveau du poumon, chez le cobaye, le 20-HETE est connu pour avoir des effets depolarisant et contracturant via l'activation de canaux cationiques non selectifs, les TRPC (BASORA et al., 2003; CLOUTIER et al., 2003; ROUSSEAU et al., 2005).

Les enzymes qui sont responsables de la production des EET sont les CYP450 epoxygenases nommes 1A, 2B, 2C, 2D et 2J. lis sont exprimes dans les cellules epitheliales ciliees et non ciliees ainsi que dans les cellules endotheliales (ZELDIN et al., 1995; Revue par ROMAN, 2002; MEDHORA et al., 2003). L'epoxygenation de l'AA par les CYP450 a pour consequence la generation de quatre regioisomeres des EET; le 5,6-, 8,9-, 11,12-, et le 14,15-EET. Au niveau des cellules des poumons

ete detectes au niveau proteiques et des transcrits en ARNm, et ces isoformes sont responsables de la production des 4 regioisomeres des EET (ZELDIN et al., 1995). Les EET sont connus pour leur capacite a moduler le tonus des muscles lisses vasculaires et des voies respiratoires. Dans plusieurs lits vasculaires les regioisomeres des EET sont de puissants vasodilatateurs. lis ont d'abord ete decri comme etant des facteurs hyperpolarisants derives de l'endothelium, c'est-a-dire qu'ils sont produits par les cellules endotheliales et qu'ils ont des effets directs sur les cellules de muscles lisses vasculaires (MLV). Cet effet passe via l'activation de canaux potassiques actives par le calcium (BKca), ce qui inhibe I'entre de Ca2+ causant une hyperpolarisation et resultant en une relaxation des cellules de MLV (DUMOULIN et al., 1998; SAL VAIL et al., 1998; BENOIT et al., 2001; LARSEN et al., 2006; SUN et al., 2008). Les EET sont aussi connus pour avoir des effets anti-infiammatoires au niveau du lit vasculaire. NODE et al., (1999) ont montre que le 11,12-EET avait la capacite de diminuer l'expression de VCAM-1 et le nombre de monocytes qui adherent a la surface des cellules endotheliales dans les arteres de souris traitees au TNFa. De plus, il a ete demontre que le 11,12-EET possedent de puissants effets anti-inflammatoires, car ils inhibent la IKK ce qui empeche l'activation de NFKB et par consequent la transcription de genes pro-inflammatoires dans les cellules endotheliales bovines (Revue SPIECKER et al., 2005). Le 11,12-EET ou la surexpression de CYP450 epoxygenases 2J2 peuvent aussi jouer un role important dans la regulation de l'equilibre fibrinolytique des vaisseaux par l'induction de t-PA (tissue plasminogen activator) sans affecter l'expression de PAI-1 (plasminogen activator inhibitor-1) (NODE et al., 2001; Revue par SPIECKER et al., 2006). Au

niveau pulmonaire, sur les branches de cobayes, l'ajout exogene d'EET hyperpolarise et active les canaux BKCa des cellules de MLVR (BENOIT et al., 2001). Malgre le fait que les EET pourraient etre stockes dans les phospholipides membranaires apres esterification des lysophospholipides en position sn-2, leur demi-vie est essentiellement determinee par I'activite enzymatique de I'epoxyde hydrolase soluble (sEH) qui facilite 1'hydroxy lation du groupe epoxy et produit les DHET correspondants, des composes plutot inactifs sur la reactivite des muscles lisses (FANG et al., 2001). L'inhibition de la sEH prolongerait done le temps de demi-vie des EET, ce qui renforcerait leurs effets autocrines et paracrines benefiques. II a ete rapporte que l'AUDA, un inhibiteur de la sEH, augmente les effets anti-inflammatoires des EET dans les cellules endotheliales via une augmentation de I'activite transcriptionnelle de PPARy induite par les EET (LIU et al., 2005).

L'acide eicosapentaeno'ique (EPA) et d'autres acides gras polyinsatures (PUFA) comme l'acide docosahexaenoi'que (DHA) peuvent aussi etre metabolises par les enzymes CYP450 epoxygenases pour produire plusieurs classes de metabolites oxygenes. L'EPA peut servir d'alternative comme substrat a ces enzymes tel que demontre dans les microsomes hepatiques et renaux de rat (LAUTERBACH et al., 2002). Les principaux metabolites de l'EPA qui resultent de l'epoxygenation par les CYP450 inclus les acides epoxy-eicosatetraenoiques (EpETEs) 5,6- 8,9- 11,12- 14,15-et le 17,18-EpETE. Les CYP450 epoxygenases responsables dans la production de l'acide 17,18-epoxy-eicosatetraenoTque (17,18-EpETE) sont les isoformes CYP1A,

les metabolites epoxydes derives de l'EPA ont des capacites similaires aux EETs pour activer les canaux BKca et causer la vasodilatation (ZHANG et al., 2001; LAUTERBACH et al., 2002). II a aussi ete demontre par des experiences de patch clamp que le 17,18-EpETE active des canaux BKCa et que cette activation est directe via une interaction de cet eicosano'ide avec la sous-unite a du canal dans les cellules de muscles lisses vasculaires (MLV) de rongeurs (HERCULE et al., 2007). Ces eicosanoTdes produits par les CYP450 epoxygenases pourraient done etre impliques dans une variete de processus physiologiques qui sont relies a l'HRB, comme 1'inflammation et le controle des voies de signalisation intracellulaires. Cependant, les effets des ces eicosanoTdes sur la reactivite des muscles lisses et dans la mise en place de l'hyperreactivite n'ont jamais ete evalues au niveau pulmonaire chez l'humain.

BUTS ET OBJECTIFS SPECIFIQUES DE L'ETUDE

Plusieurs pathologies respiratoires sont causees par des reactions immuno-inflammatoires et resultent en une HRB plus ou moins severe, qui met en jeu des mecanismes de signalisation inter et intracellulaire (Revue par ZURIER, 1974; Revue par BURDON et al., 1980; WALTERS et al, 1981; Revue par O'CONNOR et al, 1989; Revue par BUC et al, 2009). Les mediateurs lipidiques produits par les CYP450 epoxygenases et derives des acides gras omega 3 et omega 6 pourraient avoir un role dans l'HRB et moduler le couplage pharmacomecanique des cellules de muscles lisses bronchiques humains. Plusieurs etudes realisees sur des structures du lit vasculaire demontrent que ces eicosanoTdes ont la capacite de moduler la tension mecanique des cellules de muscles lisses vasculaires (Revue par FLEMING, 2008;

les roles potentiels des eicosanoi'des produits par les CYP450 sur la reactivite des MLVR.

Le but du projet de recherche etait de determiner le mode d'action des eicosanoi'des bioactifs de nouvelles generations produits par les CYP450 sur les tissus bronchiques humains. Le but etait de mieux cerner les mecanismes cellulaires et moleculaires actives lorsque ces tissus sont traites avec ces mediateurs lipidiques en condition normale et inflammatoire. Pour cela les proprietes electrophysiologiques, pharmacomecaniques et biochimiques susceptibles d'etre modulees par ces eicosanoi'des ont ete analysees sur les MLVR humains.

Les tissus bronchiques humains ont ete obtenus a partir de lobes pulmonaires reseques par les Drs Vincent Echave et Marco Sirois (chirurgiens). Ces lobes sont rapidement diriges en pathologie dans une solution saline sterile. Par la suite, les pathologistes dirigent vers notre laboratoire les sections de lobe non-utilise pour les analyses pathologiques standards. Les bronchioles distales sont alors dissequees dans la salle de culture en condition steriles et utilisees pour les differentes experiences.

Dans un premier temps, nous avons demontre que l'utilisation des tissus bronchiques frais et cultives jusqu'a 3 jours representaient un modele viable pour l'etude physiologique des metabolites de l'AA et de l'EPA (EET, 20-HETE, 17,18-EpETE). Les proprietes electrophysiologiques, pharmacomecaniques et histologiques ont ete

reactivite des tissus a different agents pharmacologiques myotropes positifs (methacholine, histamine, U46619) et negatifs (isoproterenol) a ete evaluee par des mesures de tension isometrique et aucune difference significative n'a ete observee entre le tissus frais et cultive jusqu'a 3 jours dans un milieu de culture standard supplements avec 0.3% d'antibiotiques (Schema 9).

U-46619 CM) ° mi m ttl 1 » 0 OM 0J1 0.1 1 10 [ Metbadiofae j (IL\ J [ kproteraid ] iiiSh

Schema 9 : Preuve de concept: conservation et reactivite aux agonistes pharmacologiques des bronchioles controles et cultivees pendant 3 jours. Courbes concentrations reponses (CCRC) au U-46619, a la methacholine et a 1'isoproterenol sur des tissus frais et cultives pendant 3 jours dans un milieu DMEM-F12 sans serum. Des mesures de sensibilite au Ca2+ realisees sur des anneaux bronchiques provenant

de tissus frais et cultives permeabilises a la B-escine ont demontre des reactivites similaires suite a l'ajout de [Ca2+] libre. Les mesures de potentiel membranaire et

Pactivite des canaux ioniques reconstitues dans des bicouches lipidiques planes enregistrees a partir de tissus bronchiques frais et cultives pendant 3 jours n'ont montrees aucunes differences signiflcatives. Par consequent, les analyses histologiques apres coloration a l'hematoxyline-eosine realisees a partir de

2. Evaluer si les EET ont des effets anti-inflammatoires sur les bronchioles humaines. Premierement pour verifier cet objectif nous avons mis au point un modele d'HRB induit par un pretraitement des bronchioles au TNFa d'une duree de 48 heures. Ce modele qui se caracterise par une augmentation de la reactivite et de la sensibilite au Ca2+ des myofilaments nous a permis d'evaluer les effets anti-inflammatoires du 14,15-EET et du 17,18-EpETE.

3. Identifier le role et 1'implication de la proteine CPI-17 en condition normale et dans un modele in vitro d'HRB chez l'humain. Cet objectif a ete realise suite a 1'introduction de siRNA dirige contre les transcrits de la CPI-17 dans les bronchioles humaines traitees ou non au TNFa. La reduction des transcrits de la CPI-17 par l'utilisation de siRNA a ete comparee a l'effet d'un traitement au EET afin de determiner l'efficacite de cet eicosanoi'de a diminuer le niveau d'activation et d'expression de la CPI-17, ce qui resulterait en une reduction de la reactivite des bronchioles.

4. Demontrer par quels mecanismes les epoxy-eicosanoi'des exercent leurs effets anti-inflammatoires dans un modele d'HRB induit par le TNFa. Pour cet objectif, l'interaction de ces epoxy-eicosanoi'des avec les recepteurs nucleaires PPARy et la voie de signalisation p38MAPK, ont ete interrogees dans differentes conditions, puisque ces voies metaboliques sont connues pour moduler l'expression de marqueurs important de 1'inflammation.

ARTICLE 1 :

LES EFFETS RELAXANTS DU 14,15-EET SUR LES BRONCHIOLES HUMAINES IMPLIQUENT L'ACTIVATION DE

CANAUX BKCa ET LA DEPHOSPHORYLATION DE LA

PROTEINE CPI-17.

Caroline Morin, Marco Sirois, Vincent Echave, Marcio Gomes et Eric Rousseau

Article publie dans American Journal of Respiratory Cell and Molecular

Mise en contexte et contribution des auteurs

Jusqu'a present plusieurs evidences ont demontre les effets relaxants des EET dans plusieurs lits vasculaires (Revue par SPECTOR, 2008). Ces etudes revelent que les 4 regioisomeres des EET activent des canaux Kca, ce qui induit une hyperpolarisation du potentiel de membrane et resulte en une vasodilatation des arteres coronaires, mesenteriques, renales et cerebrales (Revue par CAPDEVILA et al., 2000). Ces eicosanoi'des ont de plus ete decrit comme des facteurs hyperpolarisants derives de l'endothelium et il ete demontre que des inhibiteurs des CYP450 epoxygenases diminuent la vasodilatation induite par l'AA (Revue par CAPDEVILA et al., 2000). Ceci confere done un role important pour les CYP450 epoxygenases localises au niveau de l'endothelium pour la vasodilatation, independamment du NO et des prostacyclines dans plusieurs lits vasculaires. D'autres etudes ont demontre que les EET avaient la capacite de diminuer la migration ainsi que la proliferation des cellules de muscles lisses vasculaires, deux caracteristiques importantes dans l'atherosclerose et les maladies proliferatives vasculaires (Revue par SPIECKER et LIAO, 2005).

Cependant, ces metabolites de l'acide arachidonique produit par les cytochromes P450 epoxygenases sont peu connus pour avoir des effets modulateurs dans la physiologie respiratoire humaine. Le but de cet article etait done de mettre en evidence les effets pharmacomecaniques et electrophysiologiques des EET dans un nouveau modele in vitro de bronchioles humaines en culture. Ce travail decrit I'effet de ces eicosanoides bioactifs derives des acides gras a>6 sur la regulation de plusieurs proteines et voies de signalisation intracellulaires impliquees dans le controle de la

tension des MLVR, tel que I'activation de canaux ioniques et la diminution de sensibilite des myofilaments au Ca2+.

Le Dr Eric Rousseau a supervise ce travail de recherche et assure la correction de Particle scientifique. Les Drs Vincent Echave et Marco Sirois ont effectue le recrutement des sujets qui ont participe a cette etude par I'obtention de la signature du formulaire de consentement a la recherche aupres de leurs patients atteint de carcinome pulmonaire et en attente d'une chirurgie thoracique. Le Dr Marcio Gomes et l'ensemble des techniciens du laboratoire de pathologie nous ont permis de recuperer les exhantillons de poumon vivant dans des conditions optimales et ils ont fait les analyses macroscopiques des tissus pulmonaires residuels. Pour ma part, j'ai conceptualise l'ensemble du travail, mis au point et adapte les techniques pour Putilisation de tissus bronchiques humains, realise les analyses et redige Particle scientifique.

Resume

Les acides epoxy-eicosatrienoi'ques sont produit par les cytochromes P450 epoxygenases a partir de l'acide arachidonique. Ces metabolites sont d'importants modulateurs du tonus vasculaires, par contre au niveau respiratoire peu de donnees sont disponibles sur leurs effets physiologiques. Le but de 1'etude etait de demontrer les mecanismes responsables de l'effet relaxant du 14,15-EET sur les muscles lisses des voies respiratoires des bronchioles humaines. Des mesures de tensions isometriques realisees sur des tissus frais et cultives pendant 3 jours demontrent que les EET induisent un effet relaxant dependant de la concentration sur les bronchioles humaines precontractees avec 1 uM MCh et 10 uM AA. Un pretraitement des tissus a 1'IbTx diminue partiellement la relaxation induite par les EET. Des mesures, a la l'aide de la technique de microelectrodes classique, ont demontre que le 14,15-EET induit un effet hyperpolarisant dependant de la concentration et que cet effet est amplifie en presence de 1 uM indometacine. Une partie de l'effet relaxant au 14,15-EET passe par une diminution de la sensibilite au Ca2+ des myofilaments tel que demontree sur des tissus bronchiques permeabilises a la B-escine. De plus, cet eicosanoTde abolit les reponses contractiles au PDBu, un activateur de PKC sur les bronchioles contrdles et permeabilis^es a la B-escine. Le 14,15-EET interagit avec la voie de la PKC / CPI-17 en diminuant le niveau de phosphorylation de la proteine CPI-17 qui est responsable de 1'inhibition de la MLCP, tel que demontre par immunobuvardage. Ces resultats demontrent que le 14,15-EET hyperpolarise et relaxe les MLVR via 1'activation de conductances potassiques et la diminution de la sensibilite des myofilaments au Ca2+.