Régulation des gènes C/EBPS par des voies de signalisation intracellulaire dans les cellules épithéliales intestinales

This manuscript bas been reproduced from the microfilm master. UMI films the text directly from the original or copy submitted. Thus, some thesis and dissertation copies are in typewriter face, wbile others may be from any type of computer printer.

The quality of this reproduction is dependent upon the quality of the copy submitted. Broken or indistinct print, colored or poor quality · illustrations and photographs, print bleedthrough, substandard margins,

and irnproper alignment can adversely affect reproduction.

In the unlikely event that the author did not send UMI a complete manuscript and there are missing pages, these will be noted. Also, if unauthorized copyright material had to be removed, a note will indicate the deletion.

Oversize materials (e.g., maps, drawings, charts) are reproduced by sectioning the original, beginning at the upper left-hand corner and continuing from Ieft to right in equal sections with small overlaps. Each original is also photographed in one exposure and is included in reduced form at the back of the book.

Photographs included in the original manuscript have been reproduced xerographically in this copy. Higher quality 6' x 9" black and white photographie prints are available for any photographs or illustrations appearing in this copy for an additional charge. Contact UMI directly to order.

UMI

A Bell & Howell Information Company

300 North Zeeb Road. Ann Arbor MI 48106-1346 USA

RÉGULATION DES GÈNES C/EBPS PAR

DFS VOIES DE SIGNALISATION INTRACELLULAIRE DANS LES CELLULES ÉPITHÉLIALES

INTESTINALES IEC-6

par: Nadine Pelletier

Département d' Anatomie et de Biologie cellulaire

Mémoire présenté à la Faculté de médecine en vue de l'obtention du grade de

maître ès sciences (M.Sc.)

l+I

Acquisitions and

Bibliographie Services Acquisitions et services bibliographiques 395 Wellington Street Ottawa ON K1 A ON4 Canada 395, rue Wellington OttawaON K1AON4 Canada

The author bas granted a

non-exclusive licence allowing the

National Library of Canada to

reproduce, loan, distnbute or sell

copies of this thesis in microform,

paper or electronic formats.

The author retains ownership of the

copyright in this thesis. Neither the

thesis nor substantial extracts from it

may be printed or otherwise

reproduced without the author' s

permission.

Your Ille V~ référenœ Our file Nottll réMrenœ

L, auteur a accordé une licence non

exclusive permettant à la

Bibliothèque nationale du Canada de

reproduire, prêter, distnbuer ou

vendre des copies de cette thèse sous

la forme de microfiche/film, de

reproduction sur papier ou sur format

électronique.

L, auteur conserve la propriété du

droit d,auteur qui protège cette thèse.

Ni la thèse ni des extraits substantiels

de celle-ci ne doivent être imprimés

ou autrement reproduits sans son

autorisation.

0-612-21813-9

TABLE DES MA TIÈRFS

TABLE DES MATIÈRES ... ii

LISTE DES FIGURES ... vii

LISTE DES ABRÉVIATIONS ... ix

RÉSUMÉ ... xi

1. INTRODUCTION ... 1

1. Organisation de l'intestin grêle ... 1

2. Différenciation de l'intestin ... 2

3. Régulation moléculaire de l'intestin ... 4

4. Les facteurs de transcription C/EBPs ... 5

4.1 Caractéristiques ... 5

4.2 Rôle de C/EBPa dans la différenciation et la prolifération cellulaire .. 6

4.3 Rôle de C/EBP,S et C/EBPô dans la réponse inflammatoire ... 8

II. MATÉRIEL Ef MÉfHODES ... 12

l. Culture cellulaire ... 12

2. Isolement des ARNmetanalyseparNorthern ... 12

2.1 Extraction de l' ARN total ... 12

2.2 Buvardage Northem ... 13

2.3 Préparation de fragments d' ADN pour les sondes radioactives ... 14

2.4 Hybridation ... 15

3. Étude de l'expression des protéines ... 16

3.1 Extraction des protéines nucléaires ... 16

3.2 Buvardage Western ... 16

3.3 Détection des protéines ... 18

4. Incorporation de thymidine tritiée ... 19

5. Activité de liaison des protéines àl' ADN ... 20

5.1 Extraction des protéines nucléaires ... 20

5.3 Gel de rétention ... 21

6. Étude de la demie-vie des ARN m ... 22

7. Analyses statistiques ... 23

m.

RÉSULTATS ... 24

1. Régulation de l'expression des ARNm des isoformes C/EBPs après stimulation de différentes voies de signalisation intracellulaire ... 24

2. Régulation de l'expression des protéines C/EBPs après stimulation de différentes voies de signalisation intracellulaire ... 29

3. Capacité des complexes C/EBPs et NF-KB à lier l'ADN après stimulation de différentes voies de signalisation intracellulaire ... 33

4. Régulation de l'expression des ARNm des gènes APPs après stimulation de différentes voies de signalisation intracellulaire ... 34

5. Régulation de l'expression des ARNm du gène p21 après stimulation de différententes voies de signalisation ... 37

N. DISCUSSION ... 42

1. Régulation des gènes C/EBPs par différentes voies de signalisation intracellulaire ... 42

1.1 Régulation des gènes C/EBPs par la voie de la PKA ... .43

1.2 Régulation des gènes C/EBPs par la voie de la PKC ... 45

1.3 Régulation des gènes C/EBPs par la voie du ca2_{+ •••••••••••••••••••••• .45}

1.4 Effet de la PKA, de la PKC et du Ca2+ sur la capacité des complexes C/EBPs et NF-KB à lier l' ADN ... .46

2. Régulation des gènes APPs par différentes voies de signalisation intracellulaire ... 48

2.1 Régulation du gène haptoglobine par la voie de la PK.A, de la PKC et du

ea

2_{+ •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.••• 48}

2.2 Régulation du gène thiostatin par la voie de la PKA, de la PKC et du Ca2_{+ ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.•.••• 49}

2.3 Régulation du gène al-acide glycoprotéine par la voie de la PKA, de la PKC et du Ca2_{+ .••••••••••••.••••••••••.•••••••••••••••••••••••••••.••.•.•... 51}

3. Régulation du gène p21 (WAFI/CIPI) par différentes voies de signalisation intracellulaire ... 52

3.1 Régulation du gène p21 par la voie de la PKA, de la PKC et du

ea

2_{+ •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.•••••••••••••.• 53}

REMERCIEMENTS ... 57

LISTE DES FIGURES

FIGURE 1. Effet de différentes voies de signalisation intracellulaire sur les niveaux d' ARNm des isofonnes C/EBPs ... 25

FIGURE 2. Quantification des niveaux d' ARNm des isoformes C/EBPs en réponse à la stimulation par différentes voies de signalisation intracellulaire ... 26

FIGURE 3. Effet de différentes voies de signalisation intracellulaire avec la cycloheximide sur les niveaux d' ARNm des isoformes C/EBPs ... 28

FIGURE 4. Effet de la thapsigargine avec l'actinomycine D sur la demie-vie des ARNm des isofonnes C/EBPs ... 30

FIGURE S. Effet de différentes voies de signalisation intracellulaire sur les niveaux des protéines des isofonnes C/EBPs ... 31

FIGURE 6. Quantification des niveaux de protéines des isoformes C/EBPs en réponse à la stimulation par différentes voies de signalisation ... 32

FIGURE 7. Effet de différentes voies de signalisation intracellulaire sur la capacité des complexes C/EBPs et NF-KB à lier I 'ADN ... 35

FIGURE 8. Effet de différentes voies de signalisation intracellulaire sur les niveaux d' ARNm des gènes APPs ... 36

FIGURE 9. Effet de l'induction de différentes voies de signalisation intracellulaire sur

laprolif ération descellulesIEC-6 ... 3 8

FIGURE 10. Effet de différentes voies de signalisation intracellulaire sur les niveaux

d' ARNm de p21 ... 40

FIGURE 11. Quantification des niveaux d' ARNm de p21 en réponse à une stimulation

LISTE DES ABRÉVIATIONS

ADN: acide désoxyribonucléique

ARN: acide ribonucléique

bZIP: basique-zipper

C/EBP: protéine liant l'enhancer CCAAT

(" CCAAT /Enhancer binding protein ") CROP 10: protéine homologue à C/EBP

DMEM: DTI: FBS: GAPDH:

h:

HNF l: IBMX: IEC-6:

kD:

kb: PBS: PMSF:

("C/EBP- homologous protein ") Milieu d'F.agle modifié de Dulbecco dithiothréitol

sérum bovin foetal

gl ycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase heure

facteur nucléaire des hépatocytes 3-isobutyl-l-méthyl xanthine

cellules épithéliales intestinales de crypte kilodalton

kilobase

tampon phosphate salin

rpm: révolution par minute SDS: dodécyl sulfate de sodium

TBE: tampon tris-borate

TBS:

tampon tris salin

TPA: phorbol 12-myristate 13-acétate

µg: microgramme

µl: micro litre

µM: micromolaire

µCi: micro Curie

RÉGULATION D~ GÈNES C/EBPS PAR D~ VOIES DE SIGNALISATION

INTRACELLULAIRE DANS LES CELLULES ÉPITHÉLIALES INTESTINALES IEC-6.

par: Nadine Pelletier

Mémoire présenté à la Faculté de médecine en vue de l'obtention du diplôme de maître ès sciences (M.Sc.), Université de Sherbrooke, Québec.

Dans ce travail, nous avons étudié la régulation des facteurs de transcription C/EBPs en réponse à différentes voies de signalisation intracellulaire. Nous avons utilisé la lignée épithéliale intestinale de crypte de rat IEC-6 afin de mieux comprendre le rôle des C/EBPs dans la différenciation et la prolifération de l'intestin. Nous avons vérifié, par Northern, l'expression des ARNm de C/EBPa, C/EBP,8 et C/EBPIS suite à la stimulation des cellules IEC-6 par la forskoline et l'IBMX qui stimulent la PKA, le TPA qui stimule la PKC et la thapsigargine qui augmente la concentration de Ca2_{+ cytoplasmique. La} forskoline et l'IBMX induisent les niveaux d' ARNm des trois C/EBPs avec différentes cinétiques tandis que le TPA induit seulement les niveaux d' ARNm de C/EBPa et de C/EBP,8. La thapsigargine induit les niveaux d' ARNm des trois isoformes par un mécanisme de régulation post-transcriptionnel sans affecter les niveaux de protéines. Nous avons démontré que les variations des niveaux d' ARNm, induits par les trois voies de signalisation, étaient indépendantes d'une synthèse nouvelle de protéines. Les analyses des niveaux de protéine

par

Western nous ont permis de constater une induction des trois isoformes en accord avec celle des ARNm suite à une stimulation par la forskoline et l'IBMX. De plus, nous avons observé que le patron d'expression des protéines C/EBPa et C/EBP{:l concorde avec celui des ARNm après une stimulation par le TPA. La capacité de liaison à I 'ADN des C/EBPs n'est pas affectée significativement par les voies de la PKA, de la PKC et du Ca2+. Nous avons démontré que les voies de la PKA et de la PKC peuvent moduler l'expression de certains gènes de la réponse inflammatoire comme l 'haptoglobine et le thiostatin. De plus, la stimulation de ces différentes voies inhibe la prolifération cellulaire des cellules IEC-6 en absence et en présence de sérum. Finalement, nous avons observé que ces différentes voies pouvaient induire à des niveaux variables l' ARNm de p21, un gène très important dans l'arrêt de la prolifération cellulaire. Ces résultats suggèrent des cibles potentielles des facteurs de transcription C/EBPs, soient des gènes de la réponse inflammatoire et le gène p21, dans les cellules épithéliales intestinales.

1. INTRODUCTION

1. ORGANISATION DE L'INTESTIN GRÊLE.

L'épithélium intestinal provient de l'endoderme germinal (Haffen et al., 1989) et est composé de deux compartiments distincts, soient les cryptes de Lieberkühn et les villosités. Les cryptes représentent le compartiment de prolifération cellulaire. Les cellules pluripotentes des cryptes migrent le long de l'axe crypte-villosité, cessent leur prolifération et se différencient en quatre types cellulaires déterminés. Les cellules se

différencient en entérocytes, cellules à mucus et cellules entéroendocrines pendant le processus de translocation cellulaire vers le sommet de la villosité (Gordon, 1989). Les cellules différenciées sont ensuite relâchées dans la lumière intestinale à l'extrémité des villosités 2 à 3 jours après le début de la migration. Contrairement à ces trois types cellulaires, les cellules destinées à devenir les cellules de Paneth se différencient en migrant vers la base de la crypte (Gordon, 1989).

Les cellules souches situées à la base de la crypte sont responsables du renouvellement constant de l'épithélium intestinal (Bjerknes et Cheng, 1981). Le très grand potentiel de division cellulaire des cellules souches leur permet de remplacer de façon continue l'épithélium intestinal. Les cellules souches peuvent se régénérer et donner naissance à d'autres cellules souches ou se diviser en cellules filles qui, par des mécanismes peu connus, prendront la décision de devenir l'un des quatres types

cellulaires différenciés (Potten et Loeffler, 1990).

2. DIFFÉRENCIATION DE L'INTESTIN.

La différenciation des cellules intestinales mène à l'expression de plusieurs gènes spécifiques à chaque type cellulaire. Chaque type de cellules intestinales a une régulation bien définie qui déterminera sa fonction respective. Par exemple, les cellules à mucus produisent et sécrètent du mucus (Neutra et Forstner, 1987), les cellules entéroendocrines produisent des hormones comme la sérotonine (Rombout

et al.,

1986) et les cellules de Paneth produisent des lysozymes inhibant l'invasion bactérienne (Erlandsen et Chase, 1972). Les entérocytes sont des cellules absorbantes qui produisent plusieurs enzymes digestives de l'intestin (Husiker

et al.,

1986). Certaines enzymes, notamment la sucrase-isomaltase et la lactase, permettent l'hydrolyse des disaccharides qui pourront par la suite être absorbés par la cellule.

En plus d'une régulation spécifique au type cellulaire différencié, le patron de régulation génétique est très complexe et montre des gradients d'expression le long des axes crypte-villosité et proximo-distal, en plus d'une régulation temporelle lors du développement. Chez la souris adulte par exemple, la sucrase-isomaltase est présente seulement dans les entérocytes de la villosité et non dans la crypte. De plus, contrairement au colon qui n'exprime pas de sucrase-isomaltase, l'intestin proximal démontre des quantités importantes de cette enzyme. Certaines enzymes sont uniquement produites après la naissance. La sucrase-isomaltase et la tréhalase sont absentes dans

l'intestin pendant la première et deuxième semaine après la naissance. Lors du sevrage, l'activité de ces deux enzymes augmente très rapidement et atteint une activité maximale

à la quatrième semaine (Henning, 1985).

Des mécanismes de différenciation intrinsèques aux cellules épithéliales permettent le développement de l'intestin. Ce programme génétique, déjà établi chez les rongeurs au 15e jour embryonnaire, est modulé par des facteurs comme la matrice extracellulaire, les hormones et les facteurs de croissance. L'interaction des cellules entre elles et avec les constituants de la matrice extracellulaire joue un rôle déterminant dans la prolifération, la différenciation et la migration cellulaires (Rana et al., 1994; Haffen et al., 1989). Les hormones (glucocorticoïdes, insuline) et les facteurs de croissance (EGF) sont d'importants modulateurs de l'expression des enzymes de la bordure en brosse et contribuent au développement continu de l'intestin (Ménard et Calvert, 1990).

Les protéines kinases A et C pourraient jouer un rôle important dans la transmission de signaux impliqués dans la régulation de la prolifération et de la différenciation épithéliale intestinale. Par hybridation in situ, Saxon et al. (1994) ont observé que la distribution de plusieurs types de PKC le long de l'axe crypte-villosité était différente, suggérant un rôle potentiel des protéines kinases C dans l'arrêt de prolifération et l'établissement de la maturité cellulaire. La famille des PKC semble être impliquée dans la différenciation des cellules de carcinome de côlon HT-29 en culture (Delézay et al., 1995). L'activité de la PKA augmente lorsque l'activité de la PKC diminue pendant la différenciation des cellules de carcinome de côlon humain Caco-2

(Pignata et al., 1994). De plus, l'augmentation de l'activité de la PKA coïncide avec l'expression de marqueurs de différenciation tels que la sucrase-isomaltase et l'apolipoprotéine Al.

3. RÉGULATION MOLÉCULAIRE DE L'INTESTIN.

Les mécanismes moléculaires responsables de la régulation des gènes spécifiques aux cellules intestinales le long des axes crypte-villosité et céphalocaudal sont peu connus. Des études récentes ont démontré l'importance de régulateurs positifs et négatifs dans l'établissement des patrons d'expression le long des deux axes. En effet, l'utilisation de souris transgéniques exprimant un gène rapporteur (hormone de croissance humaine) sous le contrôle de promoteur spécifique à l'intestin, révèle que des séquences situées dans les régions régulatrices sont d'une grande importance dans la régulation différentielle des gènes le long de l'axe céphalocaudal (Crossman et al., 1994; Markowitz et al., 1993). Par exemple, l'expression correcte du gène ILBP (ileal binding protein) le long de l'axe proximo-distal dépend d'une séquence régulatrice située entre les nucléotides 145 et +48. Des séquences du promoteur ILBP en amont du nucléotide -145 contiennent des suppresseurs temporels qui retardent l'expression du gène ILBP lors du développement (Crossman et al., 1994). Cette complexité dans le patron d'expression génétique s'explique par la présence de multiples sites d'interaction avec des facteurs de transcription. Par exemple, le promoteur de la sucrase-isomaltase contient des sites d'interactions pour plusieurs protéines comme cdx2 et HNF-1 (Suh et al., 1994; Wu et

al., 1994). Ces facteurs de transcription régulent positivement l'expression de la sucrase-isomaltase dans les entérocytes. Les facteurs nucléaires des hépatocytes HNF-la et HNF-1{3 sont impliqués dans la régulation de plusieurs gènes spécifiques au foie et à l'intestin grêle (Xanthopoulos et Mirkovitch, 1993). Des variations dans la concentration de chaque facteur de transcription peuvent provoquer des effets majeurs dans leur fonction de trans-activateur ou de trans-répresseur. La combinaison des facteurs de transcription exprimés dans une cellule donnée lui confère son phénotype désigné.

4. LES FACTEURS DE TRANSCRIPTION C/EBPs.

4.1 CARACTÉRISTIQUES.

La famille C/EBP comprend plusieurs protéines régulatrices de gènes spécifiques. Ces facteurs de transcription sont caractérisés par la présence d'une région riche en acides aminés basiques qui se lient à l' ADN, et d'un domaine de dimérisation dit de fermeture de glissière à leucines (leucine zipper) (Johnson, 1993; Vinson et al., 1989; Landschulz et al., 1988). Cette région de dimérisation permet aux membres de la famille C/EBP de former des homodimères ou des hétérodimères (Landschulz et al., 1988). Leur extrémité amino-terminale comprend différents domaines responsables de l'activation transcriptionnelle par interactions avec des composantes du complexe transcriptionnel de base. Aucun intron n'est présent dans la séquence des gènes C/EBPs.

CROP-6 10. La protéine C/EBPa est le premier membre de cette famille de facteur de transcription identifié à partir du foie de rat (Johnson et al., 1987; Landschulz et al.,

1988). C/EBPa peut se dimériser avec d'autres membres de la famille C/EBP (Cao et al., 1991). La séquence du cDNA de C/EBP,S révèle que C/EBP,S est identique à la protéine activatrice du foie (LAP) (Descombes et al., 1990), NF-IL6 (Akira et al.,

1990), IL-6DBP (Poli et al., 1990) et CRP2 (Williams et al., 1991) et que C/EBPo est identique à CRP3 (Williams et al., 1991). La protéine CHOP-10 peut seulement former des hétérodimères avec C/EBPa et C/EBP,S et agir en tant qu'inhibiteur dominant de la transcription en diminuant leur capacité de lier l'ADN (Ron et Habener, 1992) ou les diriger vers d'autres sites spécifiques (Ubeda et al., 1996). De plus, cette protéine est induite lorsque l' ADN est endommagé (Friedman, 1996).

4.2 RÔLE DE C/EBPa DANS LA DIFFÉRENCIATION ET LA PROLIFÉRATION CELLULAIRE.

En plus de posséder une activité antimitotique, C/EBPa est impliqué dans la différenciation de certains types cellulaires (Umek et al., 1991). Dans les adipocytes et les hépatocytes, l'expression de C/EBPa est restreinte aux cellules différenciées. C/EBPa peut stimuler la transcription de différents gènes marquant l'état différencié (Christy et al., 1989; Friedman et al., 1989; Kaestner et al., 1990). Des études démontrent aussi clairement le rôle de C/EBPa dans l'arrêt de prolifération (Umek et al., 1991; Mischoulon et al., 1992) et dans l'activation de gènes spécifiques aux

adipocytes (Lin et Lane, 1992; Samuelsson et al., 1991) et aux hépatocytes (Friedman et al., 1989). L'utilisation de vecteurs exprimant l' ARN anti-sens de C/EBPa dans les cellules 3T3-Ll, pouvant être induites en adipocytes par un milieu de différenciation, mène à l'inhibition d'expression de C/EBPa et de marqueurs de différenciation (Lin et Lane, 1994). Le phénotype différencié est rétabli en transfectant ces lignées exprimant l' ARN anti-sens de C/EBPa, avec un vecteur exprimant C/EBPa sens (Lin et Lane, 1992). De plus, une étude démontre qu'une surexpression de C/EBPa dans des préadipocytes 3T3-Ll induit l'expression de gènes spécifiques aux adipocytes et l'accumulation de triglycérides cytoplasmiques (Lin et Lane, 1994): la protéine C/EBPa de 42 kD suffit donc au déclenchement du programme de différenciation cellulaire sans avoir recours à des agents hormonaux. Une protéine de 30 kD, issue du même ARN messager de C/EBPa par utilisation d'un site d'initiation de traduction différen~ est exprimée principalement dans le tissu adipeux, le foie et l'intestin (Birkenmeier et al., 1989; Ossipow et al., 1993; Zhaodan et al., 1991). L'expression constitutive de cette protéine mène à une différenciation des préadipocytes sans affecter la prolifération cellulaire, contrairement à p42 (Lin et al., 1993). Tout comme la forme de 42 kD, !'isoforme de 30 kD est capable de transactiver des gènes spécifiques aux hépatocytes (McKeon et Pham, 1991) et aux adipocytes (Lin et al., 1993).

Une mutation du gène C/EBPa par recombinaison homologue a démontré l'importance de C/EBPa dans le métabolisme et le maintien d'énergie. Le développement de ces souris jusqu'à la naissance se fait normalement. Celles-ci meurent cependant quelques jours après la naissance (Wang et al., 1995). Le niveau d' ARNm de

la glycogène synthétase est réduit de 50 à 70%, ce qui concorde avec l'absence de glycogène dans le foie. Des enzymes impliquées dans le métabolisme du glucose telles que la phosphoénolpyruvate carboxykinase et la glucose-6-phosphatase ne sont plus exprimées après la naissance, ce qui indique un rôle essentiel de C/EBPa dans le contrôle de l'expression de différents gènes du métabolisme cellulaire. De plus, aucune accumulation de triglycérides cytoplasmiques n'est observée dans les adipocytes. Ces observations démontrent encore une fois l'importance de C/EBPa dans le contrôle de l'expression de gènes spécifiques aux adipocytes et aux hépatocytes.

4.3 RÔLE DE C/EBPP ET C/EBPô DANS LA RÉPONSE INFLAMMATOIRE.

C/EBPP et ô sont impliqués dans l'expression de gènes induits lors de la réponse inflammatoire, comme l'haptoglobine, l'al-acide glycoprotéine et le thiostatin. L'haptoglobine et l'ai-acide glycoprotéine sont des gènes impliqués dans l'épuration de constituants provenant de la lyse cellulaire, et dans la restauration et l'interaction cellulaire. Ce sont des inhibiteurs de protéases (Engler, 1995). Le gène thiostatin, spécifique au rat, est un inhibiteur de cystéine protéinase et est impliqué dans la coagulation du sang (Müller-Ester! et al., 1986). C/EBPP et ô induisent le gène de l'al-acide glycoprotéine en réponse à une inflammation provoquée par la térébenthine (Ray et Ray, 1994). D'autres promoteurs de gènes de la réponse inflammatoire, comme ceux de l'haptoglobine et du thiostatin (T-kininogène), possèdent des sites d'interactions aux C/EBPs (Baumann et al., 1992). C/EBPP induit l'expression du gène haptoglobine dans

des cellules d'hépatomes de rat (Natsuka et al., 1991). En plus d'être d'importants modulateurs des gènes de la réponse inflammatoire, les C/EBPs peuvent induire l'expression des gènes codant pour les cytokines. NF-IL6 est impliqué dans l'activation des promoteurs de l'IL-6 et de l'IL-8 dans la lignée cellulaire P19 (Matsusaka et al.,

1993).

Une mutation du gène C/EBP~ par recombinaison homologue démontre

l'importance de C/EBP~ dans la régulation de gènes de la réponse inflammatoire tels que

les gènes codant pour les protéines de sérum amyloïde P et A. Une réponse inflammatoire provoquée par l'injection sous-cutanée de térébenthine démontre que le patron d'expression des ARNm de l'haptoglobine et de l'hémopexine n'est pas affecté dans les souris mutantes, ce qui est très différent des études faites in vitro. Par contre, la régulation des ARNm des gènes encodant les protéines du sérum amyloïde Pet A est affectée (Fattori et al., 1995). Contrairement aux observations faites in vitro, la cytokine IL-6 est augmentée chez les souris mutantes. Ceci implique C/EBPP dans la régulation négative de l'IL-6 in vivo. Une étude a démontré que les souris NF-IL6 -/-sont sensibles aux infections bactériennes par Listeria et Salmonella (Tanaka et al., 1995). Les facteurs de trancription C/EBPs jouent donc des rôles très importants au niveau de la prolifération, de la différenciation cellulaire et de la réponse inflammatoire.

4.4 EXPRESSION DES C/EBPs DANS L'INTESTIN.

Les mécanismes moléculaires qui régulent l'expression de gènes exprimés dans l'intestin sont très peu connus. Plusieurs études ont démontré une expression des facteurs de transcription C/EBPs dans l'intestin (Birkenmeier et al., 1989; Chandrasekaran et Gordon, 1993; Blais et al., 1995; Boudreau et al., 1996). De plus, certaines séquences régulatrices des gènes Fabpl (Simon et al., 1993) et sucrase-isomaltase (Traber et al.,

1992) contiennent des sites d'interactions potentiels des C/EBPs. Puisque dans le foie et le tissu adipeux, les facteurs de transcription C/EBPs ont un rôle très important au niveau du contrôle de la prolifération et de la différenciation cellulaire, on peut émettre l'hypothèse que ces facteurs pourraient représenter des médiateurs moléculaires importants dans la régulation de certaines fonctions intestinales. Afin de vérifier la régulation des C/EBPs dans les cellules épithéliales intestinales, nous avons utilisé la lignée cellulaire IEC-6 (Quaroni et May, 1980). Cette lignée intestinale épithéliale non-transformée provient de la crypte de jeunes rats avant le sevrage et ne se différencie pas en culture cellulaire. C'est un modèle d'étude de prolifération cellulaire très utilisé (Podolski, 1993).

Dans ce travail, nous avons voulu déterminer les mécanismes de régulation des C/EBPs dans les cellules épithéliales intestinales en réponse à différentes voies de signalisation intracellulaire telles que celles de la PKA, de la PKC et du Ca2_{+. Nous}

avons mesuré les niveaux d' ARNm par Northern, les niveaux de protéines par Western et la capacité des complexes à lier l' ADN par gel de rétention. Nous avons aussi analysé

l'expression de gènes cibles des C/EBPs, tels que l'haptoglobine, l'al-acide glycoprotéine, le thiostatin et p21 par Northem. Nos résultats démontrent une régulation différentielle des isoformes C/EBPa,

fJ

et

o.

De plus, nous avons démontré des cibles potentielles pour ces facteurs de transcription, à sa.voir les gènes induits lors de la réponse inflammatoire ou impliqués dans le contrôle de la prolifération cellulaire.

Il.

MATERIELETMETHODES

1. CULTURE CELLULAIRE.

La lignée épithéliale intestinale de crypte de rat IEC-6 provient de A. Quaroni (Comell University, Ithaca, NY). Les cellules sont cultivées dans un milieu DMEM (Gibco-BRL, MD) en présence de IO% de sérum bovin foetal (FBS) (ICN, OH), 2 mM de L-glutamine avec 100 U/ml de pénicilline et 100 µg/ml de streptomycine à 37°C, 5 % C0_2• Le milieu est remplacé par du DMEM sans sérum 24 heures avant la stimulation par la forskoline (10 µM) (Calbiochem, CA) et l'IBMX (3-isobutyl-1-methyl-xanthine) (100 µM), le TPA (0.16 µM), la thapsigargine (1 µM), la cycloheximide (40 µg/ml) et l'actinomycine D (10 µg/ml) (Sigma Chemicals, MO). Ces agents sont ajoutés aux cellules à une confluence de 80-90 % .

2. ISOLEMENT DES ARNS ET ANALYSE PAR NORTHERN.

2.1 EXTRACTION DE L' ARN TOT AL.

Les ARNs totaux sont préparés selon la méthode d'extraction au guanidinium isothyocyanate-phénol (Chomczynski et Sacchi, 1987). Les cellules sont centrifugées à 1500 rpm pendant 5 minutes et resuspendues dans 0.5 ml de solution dénaturante (4 M guanidinium thiocyanate, 0.025 M citrate de sodium pH 7.0, 0.1 M 2-mercaptoéthanol

et 0.5 % N-laurylsarcosine), 0.05 ml acétate de sodium 2 M pH 4.0, 0.5 ml de phénol acide saturé dans 0.05 M acétate de sodium pH 4.0 et 0.2 ml de chloroforme:alcool isoamylique 24: 1. Après une centrifugation à 4°C à 13000 rpm pendant 20 minutes, le surnageant est récupéré et l' ARN total est précipité dans 1 ml d'isopropanol à -20°C pendant 30 minutes. Après centrifugation, le culot d' ARN est resuspendu dans 0.3 ml de solution dénaturante afin d'éliminer les contaminants résiduels. L' ARN est finalement reprécipité dans 0.3 ml d'isopropanol à -20°C pendant 30 minutes, centrifugé à 13000 rpm pendant 15 minutes, lavé dans de l'éthanol 70 % et resuspendu dans de l'eau bidistillée stérile.

2.2 BUV ARDAGE NORTHERN.

Le buvardage Northem est décrit par Foumey et al. (1988). Les ARNs totaux (20 µg) sont séparés par électrophorèse sur gel d'agarose 1 % contenant du tampon MOPS (0.01 M acide sulfonique 3-[N-Morpholino] propane sodium, 0.05 M EDTA, 0.048 M acétate de sodium) et 5 % de formaldéhyde à 80 V pendant 5 heures. Les ARNs sont transférés sur une membrane de nylon (Nytran, Schleicher and Schuell, Ont.) dans une solution de lO X SSC (1.5 M chlorure de sodium, 150 mM citrate tri-sodique) pendant 12 heures par capillarité (Sambrook

et al.,

1989). Après le transfert, la membrane est séchée pendant 2 heures sous vide à 80°C et traitée aux U.V. pendant 2 minutes avec l'appareil "DNA transfer lamp" de Fotodyne (Bio/Can Scientific, Ont.).

2.3 PRÉPARATION DE FRAGMENTS D'ADN POUR LES SONDES RADIOACTIVES.

Les fragments d' ADN de C/EBPœ, C/EBPP et C/EBPô proviennent de Steve McKnight et celui de p21 de Bert Vogelstein. Les fragments d' ADN de l'haptoglobine (1040 pb), du thiostatin (854 pb) et de l'œl- acide glycoprotéine (637 pb) ont été isolés par RT-PCR à partir d' ARNm du foie de rat. Après digestion enzymatique, les fragments d 'ADN sont isolés sur gel et purifiés avec la trousse d'isolement de fragments d' ADN Wizard PCR Preps (Promega, WI). Les enzymes de restriction (Pharmacia Biotech Inc., Qué.) ont été utilisées selon les recommandations du manufacturier.

In sert Longueur Site de restriction Références

C/EBPcx 1.8 kb HindIII, BamHI Friedman et al.

(1989)

C/EBP(j 1.5 kb EcoRI, XhoI Cao et al. (1991)

C/EBPô 1.0 kb EcoRI, BamHI Cao et al. (1991)

p21 0.8 kb EcoRI, HindIII Vogelstein, Bert

(comm. pers.)

GAPDH 1.0 kb PstI Piechaczyk et al.

Le système d'extension d'amorces Multiprime (Amersham Life Science, CA) est utilisé pour marquer les fragments d' ADN avec le [a-32_P]dCTP.

2.4 HYBRIDATION.

La méthode de préhybridation et d'hybridation employée est décrite par Singh et Jones (1984). La membrane est incubée dans la solution de préhybridation (0.12 M Tris-HCl pH 7.4, 0.6 M NaCl, 0.008 M EDTA, 0.1 % pyrophosphate de sodium, 0.2 % SDS, 0.06 % d'héparine) dans un sac scellé, à 65°C avec agitation pendant 2 heures. La membrane de nylon est par la suite incubée dans la solution d'hybridation (solution de préhybridation contenant 10% de dextran sulfate) contenant la sonde radioactive dans un volume de 3 à 5 ml pendant la nuit. La membrane est finalement lavée dans une solution de 2 X SSC à température de la pièce pendant 30 minutes, et à 65°C avec agitation dans une solution de 0.1 X SSC et 0.1 % SDS pendant 30 minutes. La membrane est exposée dans une cassette à autoradiographie (FBXC, Fisher Scientific, PA) avec un écran contre un film XAR-5 ou BioMax (Kodak, NY) à -80°C. Les signaux sur le film sont quantifiés par densitométrie à l'aide d'un appareil Ultroscan (Pharmacia LKB XL) et normalisés par rapport au contrôle GAPDH.

3. ÉTUDE DE L'EXPRESSION DES PROTÉINES.

3.1 EXTRACTION DES PROTÉINES NUCLÉAIRES.

Après avoir lavé les cellules dans un tampon phosphate 1 X froid (0.00134 M KCI, 0.00073 M KH2P04, 0.068 M NaCl, 0.004 M Na2HP04), celles-ci sont centrifugées pendant 5 minutes à 1500 rpm à 4°C. Le culot est resuspendu dans 100 µl de tampon de lyse (0.010 M Hepes pH 7.9, 0.001 M EDTA, 0.060 M KCl, 0.5 % NP-40, 0.001 M dithiothréitol, 0.001 M phénylméthylsulfonylfluoride) et incubé à 4°C pendant 5 minutes. Après centrifugation, le culot est resuspendu dans 100 µl de tampon de solubilisation (0.0625 M Tris-HCl pH 6.8, 2.3 % SDS, 0.1 % glycérol, 0.001 % de bleu de bromophénol), soniqué deux fois sur glace pendant 10 secondes et recentrifugé pendant 15 minutes à 13000 rpm à 4°C. Le surnageant est récupéré et congelé dans l'azote liquide.

3.2 BUV ARDAGE WESTERN.

Les protéines sont séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (15%) selon la méthode utilisée par Thomas et Kornberg (1975).

Overlay Gel d'entassement Gel de séparation Acrylamide

-

13.3%

-30:0.08 Acrylamide

-

-

49.5% 30:0.15 Tris-HCl pH 6.8

-

12.5%

-lM Tris-HCl pH 8.8 15%

-

25% lM SDS 10 % 1% 1% 1% F.au bidistillée 84% 74% 25% Persulfate 2% 0.5% 0.25% d'ammonium TEMED

-

0.05% 0.05%

Les gels d'entassement et de séparation sont dégazés avant d'être coulés. Le gel de séparation est recouvert d'une solution "overlay" lors de la polymérisation. Le tampon d'électrophorèse est de type Laemmli (0.025 M Tris-base, 0.192 M glycine, 0.1 % SDS).

Les échantillons (20-50 µ.g) sont chauffés à 100°C avant d'être déposés sur gel. La migration des protéines dure environ 5 heures, soit 45 minutes à 70 V à travers le gel d'entassement et 4 heures à 170 V dans le gel séparateur. Le poids moléculaire des protéines est identifié grâce à un marqueur coloré (Rainbow Marker (15 à 200 kD), Amersham Life Science, CA).

Le transfert des protéines est effectué sur une membrane de nitrocellulose (Bio-Rad, CA) pendant 2 heures à 40 V dans un tampon de transfert (0.025 M Tris-base, 0.192 mM glycine, 20 % méthanol). A la fin du transfert, la membrane est récupérée et lavée deux fois à l'eau bidistillée. Les protéines sont colorées au rouge de ponceau (Sigma Chemicals, MO) et décolorées par deux lavages de 10 minutes avec du PBS l X. Les protéines sont dénaturées dans du guanidine 6 M (0.020 M Tris-HCl pH 7.5, 0.05 M NaCl, 0.001 M EDTA, 0.001 M DTT) pendant 30 minutes (Ron et al., 1992). La membrane est ensuite lavée deux fois avec du PBS l X contenant 0.2 % de Tween-20 pendant 10 minutes. Les quantités relatives des protéines sont vérifiées par coloration d'un gel avec du bleu de Coomassie (Bio-Rad, CA).

3.3 DÉTECTION DES PROTÉINES.

Pour bloquer les sites antigéniques, la membrane est déposée dans du TBS (0.020 M Tris-HCl pH 7.5, 0.137 M NaCl) contenant 10 % de lait écrémé et 0.05 % de Tween-20 pendant 2 heures à 37°C. La membrane est ensuite incubée avec les anticorps primaires dilués dans la solution de blocage, toute la nuit à l4°C (C/EBPa) ou à la température de la pièce (C/EBPiS et C/EBPo). Ces anticorps polyclonaux de lapin purifiés par affinité proviennent de Santa Cruz Biotechnology (CA). Les anticorps sont utilisés aux concentrations suivantes: anti-C/EBPa à 0.4 µglml, anti-C/EBPiS à 0.1 µg/ml et anti-C/EBPo à 0.4 µg/ml.

incubée avec les anticorps secondaires anti-IgG de lapin conjugués à la peroxidase (Amersham Life Science, CA) (dilution 1:750 dans la solution de blocage précédente) pendant l heure avec agitation à la température de la pièce. Puis la membrane est lavée deux fois dans du TBS-0.05 % Tween-20 pendant 10 minutes à la température de la pièce. Les complexes immuns sont détectés par le système ECL (Super Signal Substrate Western Blotting, Pierce). L'énergie dégagée sous forme lumineuse est détectée sur un film à autoradiographie XAR-5 (Kodak, NY).

4.0 INCORPORATION DE THYMIDINE TRITIÉE.

La synthèse del' ADN dans les cellules IEC-6 est mesurée de facon similaire à la technique décrite par Cross et Quaroni (1991). 15,000 cellules par puits sont déposées dans une boîte à 24 puits (Falcon, Beckton Dickinson, NJ). Après 24 heures, le milieu est remplacé par du milieu sans sérum ou avec sérum. Après 24 heures d'incubation, la forskoline et l'IBMX, le TPA et la thapsigargine sont ajoutés au milieu pendant 14 heures. l µCi de [3_{H]thymidine est alors ajouté au milieu pendant 5 heures. Le milieu} est par la suite retiré et les cellules sont lavées deux fois avec du PBS l X. Les cellules sont traitées avec l ml d'acide trichloroacétique 10% durant 10 minutes à 4°C. Cette étape est répétée une deuxième fois et les cellules sont rincées deux fois à l'eau bidistillée. Les cellules sont solubilisées dans 1 ml de NaOH (0.3 M) pendant 30 minutes à 37°C et par la suite neutralisées avec 100 µl de HCl (l.5 N). 550 µl des extraits totaux sont ajoutés à 6 ml de liquide à scintillation (Ready Safe, Beckman, CA) et comptés dans

.

.

un compteur à scintillation (LS 6800, Beckrnan, CA).

5. ACTIVITÉ DE LIAISON DES PROTÉINES À L' ADN.

5.1 EXTRACTION DES PROTÉINES NUCLÉAIRES.

Les protéines sont préparées selon la technique de Stein et al. (1989). Les cellules sont rincées deux fois au PBS 1 X et centrifugées à 1500 rpm pendant 5 minutes. Le culot est resuspendu dans 100 µl de tampon de lyse avec NP-40, laissé sur glace pendant 5 minutes et centrifugé pendant 30 secondes à 15000 rpm à 4°C. Le culot est resuspendu dans 500 µl de tampon de lyse sans NP-40 et centrifugé 30 secondes à 15000 rpm à 4°C. Le culot est recueilli dans 100 µl de tampon de resuspension nucléaire (0.25 M Tris-HCI pH 7.8, 0.06 M KCI, 0.001 M DTT, 0.001 M PMSF) et soumis à trois cycles de congélation dans l'azote liquide et décongélation à 37°C. Après une centrifugation de 15 minutes, le surnageant est récupéré, aliquoté, congelé dans de l'azote liquide et gardé à -80°C .

5.2 PRÉPARATION DES OLIGONUCLÉOTIDES POUR LES SONDES RADIOACTIVES.

Facteur de trancription Oligonucléotides Références

NF-IL6 5'TGA TTGTGCAA TGT Akira et al. , 1990

AGA TTGTGCAATGT3'

NF-KB 5'GGGGAA TITCCGGG Leonardo et Baltimore,

GAATITC3' 1989

Les oligonucléotides correspondant aux sites de liaison des facteurs de transcription sont synthétisés (Gibco-BRL, MD), appariés et marqués au [32_{P]. Les}

oligonucléotides correspondant à NF-IL6 et à NF-KB comportent des bouts francs et sont marqués à leurs extrémités 5' par la réaction d'échange du groupement phosphate avec le [

y

2_{P] A TP en présence de la T4 polynucléotide kinase (Pharmacia). Le protocole}

employé est celui décrit par Sambrook et al. (1989).

5.3 GEL DE RÉTENTION.

L'activité de liaison des facteurs de transcription à l' ADN est vérifiée par des essais de liaison in vitro, d'après la méthode de Asselin et al. (1989). 5 µg de protéines nucléaires sont ajoutées à 1.5 µIde tampon glycérol 10 X (0.1 M Tris-HCI pH 7.5, 0.5 M NaCl, 0.01 M DIT, 0.01 M EDTA, 50 % glycérol), 1.0 µl dldC (0.25 µgl µl) (Pharmacia) et 1.0 µl de sonde (20-50 cps) et le tout est incubé pendant 30 minutes à la

température de la pièce. Le mélange réactionnel est déposé sur un gel d'acrylamide 5% (acrylamide-bisacrylamide, 38: 1) dans un tampon TBE 0.5 X (0.04 M Tris-borate, 0.04 M acide borique, 0.001 M EDTA) pendant 2 heures à 150 V, après une pré-électrophorèse d'au moins 15 minutes à 150 V.

Acrylamide 2.4 g Bisacrylamide 0.064 g Glycérol 50% 2.0 ml TBE 10 X 2.25 ml Ammonium persulfate 0.01 g TEMED 0.05 ml Eau bidistillée 38.7 ml

Le gel est par la suite séché pendant l heure à -80°C et exposé contre un film Kodak XAR-5.

6. ÉTUDE DE LA DEMIE-VIE DES ARNm.

Les cellules sont incubées préalablement pendant une heure avec la forskoline et l'IBMX et le TPA ou pendant 2 heures avec la thapsigargine. Ces temps représentent les inductions maximales des ARNm des C/EBPs. Par la suite, une concentration de 10

µg/ml d'actinomycine D (Sigma) est ajoutée au milieu. Après 15, 30, 45, 60 et 90 minutes d'incubation à l'actinomycine D, les cellules sont soumises à une extraction d' ARN par la méthode décrite précédemment (voir section 2.1). L'expression des

ARNm est analysée par la méthode du buvardage Northem décrite à la section 2. La membrane est exposée dans une cassette à autoradiographie (FBXC, Fisher Scientific, PA) contre un film XAR-5 (Kodak, NY) à -80°C.

7. ANALYSES STATISTIQUES.

Toutes les études statistiques sont réalisées grâce à un test "t" de student pairé à une direction. Dans les histogrammes, elles sont représentées par une moyenne qui est accompagnée de son erreur standard (S.E.M.). Les différences statistiques sont fixées à 95 % (p

<

0.05).

m.

RÉSULTATS

1. RÉGULATION DE L'EXPRESSION DES ARNm DES ISOFORMES C/EBPs APRÈS STIMULATION DE DIFFÉRENTES VOIES DE SIGNALISATION INTRACELLULAIRE.

Afin de mieux comprendre la régulation des isoformes C/EBPs dans les cellules intestinales IEC-6, nous avons induit ces cellules par différents agents stimulant une voie de signalisation cellulaire spécifique. Dans un premier temps, nous avons vérifié la modulation de l'expression des ARNm de C/EBPa, C/EBP/3 et de C/EBPô par Northem. Lorsque les cellules sont induites par la forskoline et l 'IBMX en absence de sérum, des agents stimulant la PKA, les ARNm des trois isoformes sont modulés. Les niveaux d'ARNm de C/EBPa augmententjusqu'à une heure et restent élevés jusqu'à 24 heures, avec des niveaux d'induction d'environ 3.3 fois à 24 heures (p<0.06). C/EBP/3 est exprimé transitoirement avec un niveau d'induction maximal à une heure (4.9 fois) (p <0.0002). Les ARNm de C/EBPô augmentent plutôt à long terme à partir de 4 heures jusqu'à 24 heures (3.7 fois) (p<0.002) (Figures 1 et 2A).

Lorsque les cellules sont induites par le TPA, un agent qui stimule la PKC, seuls les ARNm de C/EBPa et de C/EBP/3 sont régulés (Figures 1 et 2B). Les ARNm de C/EBPa sont induits transitoirement avec des niveaux d'induction (3.6 fois) (p<0.03) maximaux à deux heures. L' ARNm de C/EBP/3 augmente plus rapidement avec un pic

INTRACELLULAIRE SUR LES NIVEAUX D' ARNm DES ISOFORMFS C/EBPs.

Les ARNs totaux sont isolés des cellules IEC-6 traitées à la forskoline (10 µM) et à l'IBMX (100 µM), au TPA (0.16 µM) et à la thapsigargine (1 µM) pendant 0.5 heure à 24 heures. Les ARNs sont hybridés séquentiellement à des sondes spécifiques à C/EBPa, C/EBP/j, C/EBPô et au contrôle GAPDH qui donne une mesure des quantités relatives d' ARN dans chaque puits.

0 0.Sh Hi 2!! 411 1211 24h _{0 ilSh Ui 2h 4h Uli 24!i 0 O.Sill H1 2h 4h !2h 24h} C/EBPa C/EBPj3 féJ " · " • • ·-

~

/ C/EBPS GAPDH

C/EBPs EN RÉPONSE À LA STIMULATION PAR DIFFÉRENTES VOIES DE SIGNALISATION INTRACELLULAIRE.

Les niveaux d'induction des ARNm des trois isoformes en réponse à la forskoline et à l'IBMX (A), au TPA (B) et à la thapsigargine (C) ont été mesurés par analyse densitométrique par rapport au contrôle GAPDH. Les résultats représentent la moyenne des données et l'erreur standard (n=3}.

6

E

-z

::c

₅

0::

c

_D,, et

_<

₄ -ï:i C) ~

-

_~

3

:l

_w

-~ @

w

,?:;

-

₀

₂

-z

-1

0

B)

₈

7

-E

-

₆

-z

:I'.: ~ c ~ Œl.

5

-i:Ji

<

(!)

₄

)!(

-

-::3 Il. ~ OO

3

-~

w

.:?:

-

_{0 2}

-z

-1

-0

9

8

E

-

_::c

₇

:z

_c

o:'. _Il.

₆

<( _<t ~ (!)

5

><

-

Il. ₄ ~ _OO! ru @

w

₃

.~

-

₀

z

-

₂

-1

0 1 D C/IEBPot rnl C/EBPf} 1 lm :C/EBPô

1

1 _! __ ,l_,i_.' :il 2 4 12 24 Heures {hj TPA :r

-1

_:;

_~

_!i! ~l[ - jj ' :;: --::: __ .,:_,::',_: __ .:·: (\: 111 ;.; _: ___ ,.: __ .. :':_ .. ·'· 11:::1 ,Il --D C/EBPœ W CIEBP~ Il C/EBPô 0 5 1 2 4 12 Heures (h) Thapsigargine

1

~~~ :i: 1 Ill

1

Ill OC/EBPœ [] C!EBPf) C/EBPô

1

0 0,5 1 2 4 1 Meures {h~

d'expression à une heure (5.3 fois) (p<0.0008). Les niveaux de C/EBPo ne sont pas affectés de façon significative par le TPA (Figures 1 et 2B).

Une stimulation par la thapsigargine, un agent qui augmente la concentration de

ea

2_{+ dans le cytoplasme, entraîne des augmentations des niveaux d' ARNm des trois}

isoformes à partir de 30 minutes jusqu'à 4 heures (Figures 1et2C). C/EBP(j et C/EBPô ont des niveaux d'induction plus importants (5.6 et 6.0 fois) (p<0.02, p<0.005) que C/EBPa (4.0 fois) (p<0.005) après 4 heures. De plus, nous avons démontré que l'ionomycine, un agent qui augmente la concentration intracellulaire de Ca2_{+, pouvait}

induire les ARNm des trois isoformes C/EBPs de façon similaire à la thapsigargine (non montré). L'expression du gène constitutif GAPDH confirme que les modulations observées ne sont pas dues à une variation dans la quantité des ARNs totaux. Toutes les inductions observées ont été normalisées par rapport au temps oh (valeur 1).

Afin de vérifier si la régulation des gènes C/EBPs dépend d'une synthèse nouvelle de protéines, nous avons mesuré les niveaux d' ARNm après une stimulation à la forskoline et à l 'IBMX, au TP A et à la thapsigargine en absence ou en présence de l'inhibiteur de synthèse protéique, la cycloheximide. Dans les trois cas, nous avons observé une induction des trois isoformes par les trois agents même en présence de cycloheximide (Figure 3).

Nous avons voulu vérifier si l'induction des ARNm des isoformes C/EBPs dépendait d'une régulation post-transcriptionnelle des ARNm après une stimulation à la forskoline et l'IBMX, au TPA et à la thapsigargine en présence d'un inhibiteur de la transcription, l'actinomycine D. Alors que la forskoline et l'IBMX et le TPA n'affecte

INTRACELLULAIRE AVEC LA CYCWHEXIMIDE SUR LES

NIVEAUX D' ARNm DES ISOFORMES C/EBPs.

Les cellules IEC-6 sont traitées préalablement à la cycloheximide (40 µg/ml) pendant 10 minutes. Ensuite, la forskoline et l'IBMX ou le TPA sont ajoutés au milieu pendant l heure et la thapsigargine pendant 2 heures. Les ARNs totaux sont extraits et hybridés à des sondes spécifiques aux C/EBPs. Le GAPDH est utilisé comme un contrôle des niveaux d' ARN dans chaque puits.

CHX

+ +

-

_{- + +}

_{+ +}

AGENTS

-

+ + -

-

_{+ + -}

_{- + +}

-C/EBPa ... ~~~

..

•

•

,,

_~ "4 ""'

..

~-~,_'.,

-..

_•

C/EBPP C/EBPô

••

GAPDH ..;.,. '·.1!-"

•••••

•

••••

•

•••

pas de façon significative la demie-vie des ARNm des trois isoformes (non montré), la thapsigargine augmente la demie-vie des ARNm de C/EBPa (

>

240 min), C/EBP/j ( - 80 min), et C/EBPô (-80 min) (Figure 4) par rapport à la demie-vie normale des ARNm isolés de cellules traitées uniquement à l 'actinomycine D (C/EBPa, - 60 min; C/EBP/j,

- 38 min; C/EBPô, - 25 min).

2. RÉGULATION DE L'EXPRESSION DES PROTEINES C/EBPs APRÈS STIMULATION DE DIFFÉRENTES VOIES DE SIGNALISATION INTRACELLULAIRE.

Afin de vérifier si les modifications observées au niveau de l'expression génétique se répercutaient sur les niveaux de protéines, nous avons effectué une étude par Western en utilisant des anticorps polyclonaux spécifiques à chacun des trois C/EBPs (Figures

5 et 6). Une augmentation des trois isoformes est observée après un traitement à la forskoline et l'IBMX. La forme de 42 kD de la protéine C/EBPa est augmentée jusqu'à 24 heures avec des niveaux d'induction de 5.5 fois (p<0.03) (Figures 5 et 6A). La forme de 30 kD de C/EBPa (Lin

et al.,

1993) suit le même patron d'expression. La protéine C/EBP/j de 36 kD (LAP) atteint une expression maximale à 2 heures et 4 heures avec des inductions de 3.6 (p < 0.005) et 3. 7 fois (p < 0.001) respectivement. Cette augmentation suit le patron d'induction des ARNm observé à 1 heure (Figures 1 et 2A). La protéine C/EBP/j de 20 kD (LIP) suit le même patron d'expression. La protéine C/EBPô est augmentée à long terme, soit à partir de 4 heures jusqu'à 24 heures

SUR LA DEMIE-VIE DES ARNm DES ISOFORMES C/EBPs.

Les cellules IEC-6 sont traitées pendant 2 heures avec la thapsigargine. Les ARNs totaux sont préparés après un traitement de 15 à 90 minutes à l'actinomycine D (10 #Lg/ml). Les ARNs totaux sont hybridés à des sondes spécifiques aux C/EBPs et à GAPDH qui sert de contrôle des niveaux d' ARN dans chaque puits.

ACTINOMYCINE D ACTINOMYCINE D 0 15' 30' 45' 60' 90' 0 15' 30' 45' 60' 90' C/EBPa

...

C/EBP~

,~,,-,,.

C/EBP8

• il • • .. •

GAPDH

••••••

INTRACELLULAIRE SUR LES NIVEAUX DES PROTÉINES DES ISOFORMES C/EBPs.

Les cellules IEC-6 sont traitées à la forskoline (10 µM) et à l'IBMX (100 µM) et au TPA (0.16 µM) pendant 30 minutes à 24 heures. 50 µg (C/EBPa), 40 µg (C/EBPo) et 20 µg (C/EBP,S) d'extraits nucléaires sont séparés sur un gel SDS-PAGE et transférés sur une membrane de nitrocellulose pour les immunodétections. La quantité de protéines a été vérifiée par coloration au bleu de Coomassie (non montré).

0 0.5b lb 2b 4b 12b 24b _{0 0.5b lb 2b 4b 12b 24h} C/EBPa

~----·- ·~ $~=-=-

~--~ ~ --~ """""' ... ~ =::;.. -- p42

---

p30 - ·- ··~--~

·-

--~-·--

LAP

C/EBPf3

LIP

__

.,...,.

_{- -~-... p33} C/EBP8

-.--..~-..-...--ISOFORMES C/EBPs EN RÉPONSE À LA STIMULATION PAR DIFFÉRENTES VOIES DE SIGNALISATION.

Les niveaux d'induction des protéines des trois isoformes en réponse à la forskoline et l'IBMX (A) et au TPA (B) ont été mesurés par analyse densitométrique par rapport à un contrôle (coloration au bleu de Coomassie). Les résultats représentent la moyenne des données et l'erreur standard (n=3).

(4.7 fois) (p<0.04) (Figures 5 et 6A).

Les cellules IEC-6 stimulées au TP A démontrent des variations dans les niveaux des protéines C/EBPa et C/E8P/j. Les protéines C/EBPa et C/EBPP ont des patrons d'expression transitoire. C/EBPa a des niveaux d'induction de 2.3 fois (p<0.05) après 2 heures tandis que C/EBPP a des niveaux d'induction de 5.4 fois (p<0.001) après 2 heures (Figures

5

et 68). Leur régulation suit le patron des ARNm (Figures 1 et 28). Même si on observe des variations clans les niveaux de la protéine C/EBPô, le TPA n'affecte pas C/E8Pô de facon significative, tout comme les ARNm (Figures 1et28). Aucune modification dans les niveaux de protéines des trois isoformes C/EBPs n'est observée lorsque les cellules sont traitées à la thapsigargine et l'ionomycine (non montré).

3. CAPACITÉ DES COMPLEXES C/EBPs ET NF-K8 À LIER L' ADN APRÈS STIMULATION DE DIFFÉRENTES VOIES DE SIGNALISATION INTRACELLULAIRE.

La capacité des facteurs de transcription à lier ou à transactiver un gène spécifique peut être modifiée par différentes voies de signalisation intracellulaire (Hunter et Karin, 1992). Nous avons voulu vérifier si les voies de la PKA, de la PKC et du Ca2_{+ pouvaient modifier la capacité des complexes C/E8Ps à lier l' ADN dans les}

cellules IEC-6. Aucune de ces différentes voies de signalisation ne semble affecter significativement la capacité de ces facteurs de transcription à lier le site spécifique

NF-IL6 (Figure 7 A). Par contre, la capacité du complexe NF-KB à lier un oligonucléotide

spécifique est augmentée après 0.5 heure par le TP A et la thapsigargine, mais non par la forskoline et l'IBMX (Figure 7 A). La spécificité de chaque complexe a été vérifiée en ajoutant aux protéines nucléaires un excès (10 X et 50 X) d'oligonucléotides non radioactifs (Figure 7B).

4. RÉGULATION DE L'EXPRESSION DES ARNm DES GÈNES APPS APRÈS STIMULATION DE DIFFÉRENTES VOIES DE SIGNALISATION INTRACELLULAIRE.

Il est important de déterminer les cibles potentielles des facteurs de transcription. Il a été démontré que C/EBP/3 et C/EBPo participent à l'activation de gènes impliqués lors d'une réponse inflammatoire dans le foie (Ray et Ray, 1994). Puisque nous avons démontré que les C/EBPs étaient régulés par différentes voies de signalisation, nous avons voulu vérifier si des gènes de la réponse inflammatoire tels que l 'haptoglobine, le thiostatin et l'al-acide glycoprotéine pouvaient être modulés par l'activation d'une voie spécifique ou par l'activation d'un ensemble de voies de signalisation. Nous avons observé pour la première fois récemment que ces gènes étaient exprimés dans les cellules épithéliales intestinales IEC-6 en réponse à certaines cytokines (IL-113 et TNFa) et hormones (glucocorticoides) après 12 heures de stimulation (Boudreau et al., soumis). Alors quel' ARNm de l'al-acide glycoprotéine n'est pas induit, les niveaux d' ARNm de l 'haptoglobine et du thiostatin augmentent à long terme après un traitement à la

INTRACELLULAIRE SUR LA CAPACITÉ DES COMPLEXES C/EBPs ET NF-dl À LIER L'ADN.

Les cellules IEC-6 sont stimulées à la forskoline et à l 'IBMX, au TP A et à la thapsigargine pendant 0.5 à 4 heures. Les extraits nucléaires sont préparés et mélangés à un oligonucléotide double-brin marqué au 32_{P correspondant au site NF-IL6 ou NF-KB.}

Les complexes formés sont séparés de la sonde libre sur un gel d'acrylamide (A). La spécificité de chaque complexe est vérifiée par une compétition avec un excès ( lOX ou 50X) d'oligonucléotides NF-IL6 ou NF-KB froid (B).

0 0,Sb lb 2b 4b 0 O,Sh lb 2b 4b 0 O,Sb lb 2b 4b

NF-IL6

...

NF-KB

B) NF-IL6 NF-KB

INTRACELLULAIRE SUR LES NIVEAUX D' ARNm DES GÈNES APPs.

Les cellules IEC-6 sont traitées à la forskoline et à l 'IBMX, au TP A, à la thapsigargine et à une combinaison de ces différents agents pendant 12 heures. Les ARNs totaux sont extraits et hybridés à des sondes spécifiques à l'haptoglobine, au thiostatin et à GAPDH qui donne une mesure des quantités relatives d' ARN dans chaque puits (A). Les niveaux d'induction des gènes APPs en réponse à la forskoline et à l'IBMX, au TPA, à la thapsigargine et à la combinaison de ces différents agents ont été mesurés par analyse densitométrique par rapport au contrôle GAPDH. Les résultats représentent la moyenne des données et l'erreur standard (n=3) (B).

~ Niveaux d'ARNm ~ __,.. ~ 0~1'\)W~01Q)~00©0.,àl\.) 1 Contrôle FI! t~'jf'·=·=·=i=.=·=·=·=·=;·=·=·=·=·=·=·=·=·=·=·=·=·=·=·=·=·=·=·=·=·=·=·=·=·=·=·=· ... -... ,.-.-... ·.···-·.-.,

TPA

THAP

t::::~~

1 l,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:::;;,,,,,,,t'''''''::::========================r=====================''''''''''''''m''''''''''''' F/I TPA F/I THAP

r--1

TPATHAP~

F/I TPA Tl-IAIP

• fil] -1

:r:

d Ill _, "C 0 -W _{,-t• OCl} Cl! !li ~ ::!'; 0 :i cr ::i ro CONTRÔLE F/I TPA THAP F/I TPA F/I THAP TPA THAP Fil TPA THAP

>

~

~ ~ _~

=

0 ~ 0 "1 '1 (ff) t=1 ~·· 1"'1 0 ~

>

t;;d t::î ~ _~

=

eJ ..._, ~ _~ ~

•

1

_..

•=

a

•

% ~

c

•

,,

el

forskoline et l'IBMX et au TPA (non montré). L'induction de l'activité PKA par la forskoline et l'IBMX mène à une élévation des niveaux d' ARNm de l'haptoglobine (9.0 fois) (p<0.001) après 12 heures de traitement alors que le TPA ne les affecte pas (Figures SA et B). Les niveaux d' ARNm du thiostatin sont induits uniquement par la voie de la PKC (3. 7 fois) (p <0.02) après 12 heures de traitement (Figures 8A et B). La thapsigargine ne semble pas réguler les gènes haptoglobine, thiostatin et œ 1-acide glycoprotéine. En effet, l'addition de thapsigargine à des cellules traitées au TPA ou à la forskoline et IBMX entraîne une inhibition de l'induction de ces gènes (Figures SA et B). De plus, aucune synergie n'est observée entre les voies de la PKA et de la PKC sur la régulation des gènes APPs.

5. RÉGULATION DE L'EXPRESSION DES ARNm DU GÈNE p21 APRÈS STIMULATION DE DIFFÉRENTES VOIES DE SIGNALISATION INTRACELLULAIRE.

La protéine p21 (W AF/CIP) joue un rôle très important dans le contrôle de la prolifération cellulaire. Cette protéine interagit avec les complexes cycline/Cdk et participe à l'inhibition de la prolifération cellulaire (Zeng et El-Deiry., 1996). Des études démontrent que la surexpression de C/EBPœ entraîne un arrêt de prolifération de plusieurs types cellulaires (Umek et al., 1991; Mischoulon et al., 1992). Une cible de C/EBPa récemment identifiée dans des cellules humaines est la protéine p21 (Timchenko et al., 1996). Nous avons voulu vérifier si la forskoline et l'IBMX, le TPA et la

SIGNALISATION INTRACELLULAIRE SUR LA PROLIFÉRATION DES CELLULES IEC-6.

La forskoline et l 'IBMX, le TP A et la thapsigargine sont ajoutés aux cellules IEC-6 en absence (A) ou en présence (B) de sérum. L'incorporation de [3_{H]-thymidine est mesurée}

tel que décrit dans la section Matériel et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentage par rapport à des contrôles avec sérum ou sans sérum. Les valeurs obtenues sont une moyenne de 2 expériences effectuées indépendamment six fois.

8)

w

40000

w

_a::

35000

0

a.

_a::

₃₀₀₀₀

0 (.)

₂₅₀₀₀

z

w

₂₀₀₀₀

z

-c 15000

-

~

>-

_J:

₁₀₀₀₀

1-...

₅₀₀₀

J: et) ...._.

0

w

12000

-w

_a:::

0

a.

a::

0

(.)

z

10000

8000

~

6000

-c

~

4000

>-J: 1-

2000

..

-SER +SER Fii TPA THAP

-SER

-SER +SER Fii TPA THAP

+SER

thapsigargine affectaient la prolifération cellulaire des cellules IEC-6 en présence ou en absence de sérum. Des essais d'incorporation de thymidine tritiée démontrent que ces trois agents inhibent la prolifération cellulaire en absence de sérum de 86 % (forskoline et IBMX), de 73 % (TPA) et de 94% (thapsigargine) (Figure 9A). La même inhibition est observée en présence de sérum soit de 65 % (forskoline et IBMX), de 50 % (TPA) et 70 % (thapsigargine) (Figure 9B).

Nous avons voulu vérifier le patron d'expression des ARNm de p21 en réponse à différentes voies de signalisation, en rapport avec la diminution de prolifération cellulaire observée. Des observations préliminaires démontrent que la voie de la PKA induit les niveaux d' ARNm de p21de6.3 fois (p<0.02) de façon transitoire avec un pic d'expression à une heure (n=2) (Figures 10 et 1 IA). La voie de la PKC induit moindrement et de façon transitoire l' ARNm de p21 d'environ 3 fois après une heure de traitement (n=2) (Figures 10 et llB). La thapsigargine augmente plutôt les niveaux d'ARNm de p21 à plus long terme (n=l).

INTRACELLULAIRE SUR LES NIVEAUX D' ARNm DE p21.

Les cellules IEC-6 sont traitées à la forskoline et à l'IBMX, au TPA et à la thapsigargine pendant l heure à 12 heures. Les ARN totaux sont extraits et hybridés à des sondes spécifiques à p2 l et à GAPDH qui donne une mesure des quantités relatives d' ARN dans chaque puits.

0 lh 2h 4h 12h 24h p21

••••••

GAPDH

••••••

0 lh 2h 4h 12h 24h

•

•••••

0 lh 2h 4h ~

...

.

.

.

..

RÉPONSE À UNE STIMULATION PAR DIFFÉRENTES VOIES DE SIGNALISATION INTRACELLULAIRE.

Les niveaux d'induction des ARNm de p21 en réponse à la forskoline et l'IBMX (A) ou au TPA (B) ont été mesurés par analyse densitométrique par rapport au contrôle GAPDH. Les résultats représentent la moyenne des données et l'erreur standard (n=2).

IV. DISCUSSION

1. RÉGULATION DES GÈNES C/EBPs PAR DIFFÉRENTES VOIES DE SIGNALISATION INTRACELLULAIRE.

Cao et al., (1991) ont démontré une expression de C/EBPcx, C/EBPP et C/EBPô dans certains tissus comme le foie, le tissu adipeux et l'intestin. Des études antérieures suggèrent que C/EBPcx est un bloqueur de la prolifération cellulaire et un activateur de gènes spécifiques à l'état différencié des hépatocytes et des adipocytes (Umek et al., 1991; Christy et al., 1989). En plus d'être des initiateurs de la différenciation cellulaire (Yeh et al., 1995), C/EBPP et C/EBPô peuvent transactiver des gènes de la réponse inflammatoire dans le foie (Natsuka et al., 1991; Nishio et al., 1993; Ray et Ray, 1994).

À ce jour, aucun rôle potentiel des facteurs de transcription C/EBPs n'a été démontré dans l'intestin. Nous avons d'abord voulu déterminer si certaines voies de signalisation pouvaient moduler l'expression des C/EBPs. Ensuite, nous avons voulu déterminer si ces voies de signalisation intracellulaire pouvaient moduler l'expression de cibles potentielles de ces facteurs de transcription soient des gènes induits lors de la réponse inflammatoire ou impliqués dans le contrôle de la prolifération cellulaire.

Ce travail décrit la régulation des facteurs de transcription C/EBPcx, C/EBP{j et C/EBPô par différentes voies de signalisation intracellulaire soient celles de la PKA, de la PKC et du Ca2_{+. Nous avons remarqué que les ARNm ainsi que les protéines des}