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Caractérisation du mode de transmission de la
phéromone de butineuse entre les ouvrières de l’abeille
Apis mellifera
Christophe Debourg
To cite this version:
Christophe Debourg. Caractérisation du mode de transmission de la phéromone de butineuse entre les ouvrières de l’abeille Apis mellifera. [Stage] France. Université d’Auvergne - Clermont-Ferrand I (UdA), FRA. 2008, 71 p. �hal-02818822�
IUT Clermont 1- Génie Biologique - Université d’Auvergne Option analyses biologiques et biochimiques - Promotion 2008
Caractérisation du mode de transmission de la
phéromone de butineuse entre les ouvrières de
l’abeille Apis mellifera.
Stage réalisé du 14 Avril au 27 Juin 2008.
INRA – UMR 406 – Abeilles et environnement – Laboratoire de biologie de l’abeille - Domaine St Paul - Route de Marseille - 84140 MONTFAVET
Remerciements
Merci à Luc BELZUNCES directeur de l’unité « Ecologie des Invertébrés », pour m’avoir accueilli durant ce stage dans son établissement.
Je tiens à remercier mon maître de stage Yves LE CONTE, pour m’avoir reçu au sein de son laboratoire « Biologie et Protection de l’Abeille ». J’ai vraiment apprécié de le rencontrer, après l’avoir découvert par ses articles concernant les phéromones de l’abeille, et de partager ses connaissances et son enthousiasme concernant les recherches sur la biologie de l’abeille. Merci pour m’avoir guidé avec beaucoup de bienveillance dans mon travail.
Un grand merci également à Jean Christophe LENOIR, pour m’avoir suivi tout au long de ces 12 semaines, pour son soutien lors de mes expériences et pour avoir élargi nos discussions aux autres insectes sociaux notamment les fourmis. Merci pour m’avoir fait découvrir l’aspect analyse comportementale de l’abeille, désormais je regarde les abeilles avec beaucoup d’attention.
Merci à Alban MAISONNASSE et Thomas LE CONTE, pour tout ce qu’ils m’ont appris sur les manipulations des abeilles.
Je remercie Didier CRAUSER pour m’avoir fait part de ses remarques lors de mes interventions sur les ruches, pour la visite du magasin d’apiculture renommé ICKOWICZ et pour nos discussions sur le travail d’apiculteur.
Merci à Dominique BESLAY, Gregory SIMONCELLI et Nicolas BOYER pour leur soutien et leurs explications lors de l’utilisation de la chromatographie, et à Jean-Marc BECARD, pour l’aide qu’il m’a apportée en informatique. Merci à Wei Yu pour les viéos de Taï Chi.
Je remercie aussi tout le personnel de l’unité « Ecologie des Invertébrés » pour m’avoir si bien accueilli parmi eux, comme François FAIVRE D’ARCIER lors de mon travail au rucher couvert. Je remercie tous les membres de l’équipe pour leur aide, ainsi que pour toute la bonne ambiance, dans laquelle le travail s’est réalisé avec beaucoup de plaisir.
Sommaire Présentation de l’entreprise ... 9 L’INRA ... 9 L’INRA d’Avignon ... 9 Introduction – problématique ... 11 Etude bibliographique ... 13 L’abeille [1], [2], [3] ... 13
La communication des abeilles ... 17
Matériel et méthode... 25
Matériel ... 25
Méthodes ... 27
Résultats ... 33
Discussion ... 39
Liste des figures ... 42
Liste des tableaux ... 42
Liste des annexes... 42
Liste des abréviations ... 44
Liste des abréviations ... 44
Lexique... 46
Bibliographie ... 48
Historique Internet... 50
Annexes ... i Résumé ... Erreur ! Signet non défini. Abstract ... Erreur ! Signet non défini.
Présentation de l’entreprise
L’INRA
Créé en 1946, L’Institut National de la Recherche Agronomique est un établissement public à caractère scientifique et technologique, placé sous la double tutelle des ministères chargés de la Recherche et de l’Agriculture. Il a pour vocation de produire et de diffuser des connaissances scientifiques et des innovations. Ses recherches sont axées sur l’étude et la compréhension du vivant, des systèmes biologiques et des sciences et des technologies dans le domaine de l’agriculture, de l’alimentation et de l’environnement.
L’INRA développe une politique active de partenariat avec les organismes de recherche français et étrangers, avec l’enseignement supérieur et avec les acteurs socio-économiques dans le but d’obtenir des actions d’appui au développement agricole et au soutien de l’innovation technologique.
L’INRA d’Avignon
Créé en 1953, le centre d’Avignon est l’un des 21 centres régionaux de l’INRA, il se situe sur le site d’Agroparc à Montfavet près d’Avignon, pôle agroalimentaire de la région PACA. Parmi les 17 départements de recherche de l’INRA, 9 sont représentés dans les activités de recherche sur le centre.
Le Département Santé des Plantes et Environnement a pour mission d’étudier, de comprendre et de gérer les interactions entre les plantes cultivées et l’environnement biotique. Il est divisé en plusieurs unités de recherche dont l’écologie des invertébrés. Les domaines d’activité de cette unité sont la protection intégrée, l’écotoxicologie, la pollinisation entomophile et l’apidologie.
Le Laboratoire de Biologie de l’Abeille
Depuis 2001, une collaboration réunit le Laboratoire de Biologie de l’Abeille et le GRAPPA dans le but d’identifier et de doser les molécules de l’abeille. Les thèmes de recherche du laboratoire de biologie et de protection de l’abeille sont établis autour de 2 axes principaux d’étude :
• les mécanismes d’écologie chimique impliqués dans la régulation
comportementale et physiologique de ces insectes
• les relations entre Apis mellifera et le varroa Varroa jacobsoni : tolérance de l’abeille, action pathologique du parasite et dynamique des populations
Introduction – problématique
L’abeille européenne domestique Apis mellifera est très importante en agriculture. En plus de la production de miel et de produits utilisés en pharmacie, elle constitue un agent majeur de pollinisation. Cette pollinisation par les abeilles peut être indispensable à certaines cultures. C’est pourquoi il existe des enjeux économiques importants pour les connaissances concernant la biologie de l’abeille.
Il a par exemple été montré que 6 abeilles marquées radioactivement puis introduites dans une ruche ont apporté de la radioactivité à la majorité des abeilles ouvrières de cette ruche après une seule journée [1]. Ce qui illustre les échanges très importants entre les abeilles d’une même ruche. Ces échanges permettent l’harmonisation des comportements au sein de la ruche, et l’adaptation de la ruche aux différentes situations rencontrées. Selon ces situations, chaque abeille émet un mélange variable de molécules. Une partie de ces molécules qui sont perçues par ses congénères, signent l’appartenance à une même ruche, d’autres déclencheront chez eux un comportement spécifique. Ce sont ces dernières molécules médiatrices d’information qui portent le nom de phéromones, que le laboratoire de biologie de l’abeille étudie.
Dans notre étude, nous allons nous intéresser à la molécule oléate d’éthyle (OE), qui permet la régulation de l’âge de départ au butinage des abeilles. En effet il a été démontré que l’OE est une phéromone émise par les abeilles butineuses et que cette phéromone permet de réguler l’âge auquel les abeilles deviennent des butineuses.
Le Laboratoire de Biologie de l’Abeille analyse les communications entre les différentes abeilles composant la ruche. Dans notre cas, l’étude concerne la communication entre les nourrices et les butineuses. L’objectif est de mettre en évidence l’échange d’OE entre ces abeilles, et de le relier aux comportements observés, afin d’identifier le message qui permet à la ruche de réguler sa force de butinage.
Le déroulement de ce stage a donc consisté, en premier lieu, à mettre en évidence la transmission de la phéromone d’OE par trophallaxie. Pour ceci il a été nécessaire de mettre en place un test comportemental permettant d’observer les trophallaxies et de mesurer les quantités d’OE échangées. Enfin, tenter de relier la variation de la quantité d’OE au comportement de trophallaxie.
Figure 1 : Position systématique de l’abeille Apis [1]
A. mellifera appartient à la famille des Apidae
mellifera [1]
Figure 2 : répartition des espèces d’abeille [1]
Etude bibliographique
L’abeille
[1], [2], [3]Les abeilles appartiennent à la famille des Apidae (Figure 1) et au genre Apis, où les individus sont organisés en une colonie. On distingue dans ce genre 9 espèces, la plus répandue dans le monde est Apis mellifera, 8 autres espèces vivent en Asie du Sud – Est. Seules quelques unes sont utilisées par l’homme : il élève Apis mellifera en Europe et dans le monde entier, et les espèces asiatiques Apis cerana et Apis florea (Figure 2). Apis dorsata est seulement utilisée pour la cueillette du miel.
Parmi l’espèce Apis mellifera, il y a 23 sous espèces. Ces sous espèces sont utilisées par l’apiculture (Figure 3) pour créer des hybrides avec des caractéristiques intéressantes. L’abeille noire Apis mellifera mellifera est l’abeille autochtone en France, les abeilles Apis
mellifera carnica, caucasica et ligustica sont « importées » d’autres pays.
Le corps d’Apis mellifera est recouvert de cuticule, c’est une membrane externe constituée de chitine et qui contient de nombreuses molécules hydrocarbonées (Figure 4 a). La tête renferme les glandes hypopharyngiennes, labiales et mandibulaires. Elle porte les principaux organes des sens : deux yeux composés, deux antennes qui lui servent d’organe olfactif et les organes nécessaires à son alimentation. Son thorax abrite les glandes labiales thoraciques, qui connectées aux canaux des glandes labiales de la tête, s’ouvrent dans la bouche. L’abdomen porte sept paires de stigmates ; chez l’ouvrière il comprend la glande de Nasanov1 et l’intérieur de l’abdomen contient le système digestif dont le jabot.
Une colonie d’Apis mellifera regroupe dans une ruche entre 20 000 et 80 000 individus adultes, ainsi que les œufs et les larves. Une colonie d’abeilles est formée de trois castes d’individus adultes à la morphologie (figure 5) et aux rôles bien distincts, elle rassemble : 95 % d’ouvrières, normalement une seule reine, jusqu’à 1 000 à 4 000 mâles. La reine a un rôle central : elle pond les œufs, qui donnent naissance aux larves précurseurs des adultes femelles (les ouvrières) des reines, et des mâles (les faux bourdons). Diploïde, elle est le seul individu femelle fertile de la colonie et assure le maintien de la cohésion de la société.
1
Figure 3 : Les races d’abeille utilisées par les apiculteurs professionnels [4]
L’espèce A. mellifera se divise en plusieurs races ou sous espèces
a)
b)
Figure 4 : Le corps de l’ouvrière de l’abeille Apis mellifera [1]
a) vue externe b) coupe transversale On remarque la position des différentes glandes
Figure 5 : Les trois castes de l’abeille Apis mellifera [1]
Les ouvrières sont des femelles diploïdes stériles. Leur durée de vie diminue en même temps que leur activité augmente. Elles réalisent les tâches qui se répartissent entre les activités à l’intérieur de la ruche pour les jeunes ouvrières, puis les activités à l’extérieur de la ruche (Figure 6).
Le comportement et l’état physiologique des ouvrières change en fonction de leur âge : il y a un polymorphisme des ouvrières (tableau 1). Les ouvrières réalisent leur répertoire comportemental en fonction de leur âge, en même temps que différents organes très spécialisés se développent ou régressent, c’est le « polyéthisme d’âge ». La période à l’intérieur du nid dure une vingtaine de jours pendant lesquels les glandes mandibulaires (Figure 4), hypopharingiennes, protocérébrales, thoraciques et cirières sont très développées. Les abeilles assurent ensuite les fonctions de gardiennage et de butinage. Ces activités correspondent à des tranches d’âges modulées par différentes phéromones (Figure 7) [5].
Les mâles sont issus d’œufs non fécondés et ils sont haploïdes. A la fin de l’été, les ouvrières nourrices les chassent hors du nid, ils ne sont donc présents dans la ruche que quelques mois, du printemps à l’automne.
Toutefois, la colonie est également constituée d’individus immatures, ce sont les larves (Annexe 10) que l’on regroupe sous l’appellation de « couvain ». Le poids d’un œuf (0,12 mg) est multiplié par 1 375 en 21 jours pour obtenir une ouvrière. L’alimentation des larves est apportée par les ouvrières nourrices par les sécrétions des glandes hypopharyngiennes et mandibulaires avec des sucs digestifs, de l’eau, du miel et du pollen, jusqu’à l’operculation de leurs cellules ; ainsi durant le stade nymphal, elles ne reçoivent plus aucune nourriture.
La nymphe permet la formation des organes de l’adulte à partir de la larve. Elle est alors isolée des autres abeilles par une cellule de cire complètement operculée, il n’y a plus d’échange de nourriture.
Pour assurer le bon fonctionnement de la colonie, répondre aux besoins de cette dernière, et coordonner la division du travail ; les abeilles doivent donc impérativement communiquer entre elles.
Jour Tâche Stade physiologique
1 à 3 Nettoyeuse (Propreté des cellules)
3 à 10 Nourrice : alimentation des larves
Développement des :
• glandes hypopharyngiennes • glandes mandibulaires 11 à 18 Bâtisseuse : construction des
rayons de cire
Magasinière : réception du nectar à l’entrée de la ruche – stockage du pollen
• Atrophie des glandes nourricières • Développement des glandes cirières
18 à 21 Ventileuse : régulation du climat de la ruche
Gardienne : défense de la ruche
>21 Butineuse : récolte du pollen et du nectar
Tableau 1 : Répartition des activités des ouvrières
Figure 6 : Emploi du temps de l’ouvrière adulte [1]
Chaque tâche de l’ouvrière correspond à un âge différent
Figure 7 : Flexibilité du développement comportemental de l’ouvrière [5]
Une accélération ou un ralentissement du développement en butineuse est possible
Nourrices Butineuses Butineuses précoces 2. Accéleration Nourrices «âgées» 3. Retard Butineuses à nouveau nourrices 4. Réversibilité Nourrices Butineuses Nourrices Butineuses 1. Rythme normal Mue imaginale Age de l’ouvrière (jour) 10 15 20 25 30 0 35 5 40 Mue imaginale Age de l’ouvrière (jour) 10 15 20 25 30 0 35 5 40 10 15 20 25 30 0 35 5 40
La communication des abeilles
[1] [2] [4]La communication élaborée entre les individus de la ruche permet la régulation de la division temporelle du travail et le haut niveau d’organisation que l’on trouve au sein d’une colonie. Cette communication se fait grâce à différentes perceptions / émissions sensorielles ou chimiques.
Il existe notamment une communication chimique : tous les individus d’une colonie possèdent un même profil odorant formé par des molécules volatiles, présentes dans la cuticule des abeilles. Ce profil permet aux gardiennes de déterminer par contact antennaire si une butineuse entrant dans la ruche est bien une de leurs sœurs ou non. De plus, les signaux tactiles perçus par les antennes permettent aussi à une abeille de reconnaître la position des autres abeilles, et sont impliqués dans des comportements complexes comme la trophallaxie.
D’autres molécules sont émises dans des conditions particulières et permettent de déclencher ou d’inciter chez les autres abeilles des comportements spécifiques. Ce sont les phéromones, définies comme : « des substances sécrétées par des individus et qui, reçues par d’autres individus de la même espèce, provoquent une réaction spécifique, un comportement ou une modification biologique ». Extrêmement actives, elles agissent en quantités infinitésimales, si bien qu'elles peuvent être détectées, à plusieurs kilomètres. Chez les insectes, les phéromones sont généralement détectées par leurs antennes. Les phéromones sont généralement produites par des glandes exocrines ou des cellules glandulaires et dispersées dans le tégument. Elles peuvent être volatiles ou agir par contact, par exemple pour les composés cuticulaires des insectes, perçu par les récepteurs gustatifs. Les phéromones sexuelles des insectes contribuent dans certains cas à l'isolement reproducteur dans une même espèce [6].
On regroupe ces molécules selon que la réponse est rapide ou au contraire lente : les phéromones incitatrices ou « releaser pheromone », provoquent une modification comportementale rapide. Plusieurs centaines ont été découvertes, ce sont surtout des hormones sexuelles. Les phéromones modificatrices «primer pheromone », agissent sur la physiologie. Ces phéromones sont capables de modifier
profondément la physiologie des individus qui les reçoivent, avec un effet différé. Leur fonction principale est de coordonner le développement physiologique et comportemental de plusieurs individus. A ce jour seules six d’entre elles ont été découvertes dans le règne animal, car du fait de leur action à long terme elles sont plus difficiles à identifier. Elles agissent sur les interactions sociales, en particulier la régulation de la reproduction et la division du travail entre les membres de la colonie.
O OMe O OMe O OMe O OMe O OMe O OEt O OEt O OEt O OEt O OEt Palmitate de méthyle Stéarate de méthyle Oléate de méthyle Linoléate de méthyle Linolénate de méthyle Palmitate d'éthyle Stéarate d'éthyle Oléate d'éthyle Linoléate d'éthyle Linolénate d'éthyle 0,26 µg 0,26 µg 0,07 µg 0,05 µg 0,59 µg 0,09 µg 0,08 µg 0,03 µg 0,01 µg 0,18 µg
Figure 8 : Composés de la phéromone de couvain.
La phéromone de couvain est formée de 10 molécules en quantités différentes
OH O O OH O OH C H3 OH OMe O OH OMe OH OH OMe OH OH O OMe O OH OH O OH C H3 9-ODA
(R) 9-HDA HOB HVA
(E)-alcool coniferylique
hexadecan-1-ol ; alcool palmitique
Oléate de méthyle (S) 9-HDA
Acide linolénique
Figure 9 : Composés de la phéromone royale.
9 molécules composent cette phéromone
Les phéromones de l’abeille
Les phéromones de l’abeille sont les messagers de la communication, permettant de répondre aux besoins de la colonie et de coordonner la division du travail. Elles sont synthétisées par des glandes spécialisées, soit par des cellules glandulaires dispersées dans le tégument, soit par des glandes exocrines.
Ces différentes phéromones peuvent être constituées d’une ou de plusieurs molécules, ce que l’on nomme alors « bouquet phéromonal ». Elles peuvent être également émises simultanément ou successivement : à ce jour, les phéromones de couvain et mandibulaires de la reine sont les deux seules phéromones identifiées, qui agissent à la fois comme des molécules incitatrices et modificatrices.
La phéromone mandibulaire
La phéromone mandibulaire de la reine est constituée de 9 composés (Figure 9). Elle induit un changement physiologique lent, on parle de phéromone modificatrice ou « primer pheromone ». Ce sont quelques-unes des glandes de la reine qui produisent un ensemble de composés chimiques, distribuées dans toute la colonie par les ouvrières qui s’occupent de la reine et qui la passent à d’autres ouvrières. Elle permet :
• d’affirmer la présence de la reine aux autres abeilles, qui forment une cour d’abeilles lui prodiguant des soins
• d’attirer les mâles lors du vol nuptial
• d’empêcher le développement des ovaires des ouvrières (hormone modificatrice)
La phéromone de couvain
La phéromone de couvain est constituée de 10 esters éthyliques ou méthyliques d’Acides Gras (Figure 8) [7] dont l’OE. Cette phéromone provoque une réponse comportementale rapide, et une réponse comportementale lente.
• Le linoléate de méthyle stimule le dépôt de gelée royale dans les cellules de couvain [8].
Par contre, les larves plus âgées, produisent majoritairement des esters méthyliques. La présence de quatre esters de méthyle (MP, MO, ML, MLn) : le palmitate, l’oléate, le linolénate et le linoléate de méthyle suffisent à induire l’operculation de la cellule.
• De plus, cette phéromone est également impliquée dans la reconnaissance des différents castes du couvain par les ouvrières ; c’est ainsi que l’oléate de méthyle, composé majoritaire chez les nymphes royales, induit la reconnaissance et l’acceptation des cellules royales par les abeilles.
• Le palmitate d’éthyle et le linolénate de méthyle [9] inhibent également le développement des ovaires des ouvrières.
• Enfin, il a été montré que trois de ces substances phéromonales, le palmitate, le stéarate et
le linoléate de méthyle, modulent le comportement de nourrissage des larves par les nourrices.
• Le palmitate de méthyle ainsi que l’oléate d’éthyle stimulent le développement des
glandes hypopharyngiennes des nourrices, qui produisent de la nourriture pour les larves [10].
• Enfin, cette phéromone inhibe la production d’hormone juvénile (JH) présente dans
l’hémolymphe des ouvrières. L’hormone juvénile est produite par les corpora allata, elle régule le développement comportemental des ouvrières et le développement larvaire. Cette inhibition entraîne un retard significatif dans leur développement comportemental, surtout en ce qui concerne l’âge de ouvrières à devenir butineuse [11]. Une forte quantité de couvain à élever émet une forte quantité des esters éthyliques, ce qui retarde alors l’âge à lequel une nourrice abandonnera sa tâche pour aller butiner. Inversement, une dose faible de phéromone stimule le butinage des nourrices [12].
L’ensemble de ces effets montre que les larves influencent la physiologie des nourrices, augmentant l’âge auquel les nourrices vont changer d’activité pour aller butiner.
L’oléate d’éthyle, phéromone des butineuses
[9], [10], [11], [12]La molécule d’OE (figure 8) retarde l’âge du premier butinage des nourrices. L’effet sur le développement comportemental des ouvrières est indéniable [5] : un grand nombre de butineuses ralentit l’évolution des nourrisses en butineuse, alors qu’un petit nombre de butineuses accélère l’évolution des nourrisses en butineuse.
La molécule d’OE est présente dans le jabot des butineuses, mais ne semble pas être synthétisée spécifiquement par celles-ci. La transmission par trophallaxie des nourrices aux butineuses est notre hypothèse.
Biosynthèse de l’oléate d’éthyle
La biosynthèse de l’EO peut être le résultat de l’estérification d’un acide gras, l’acide oléique et d’un alcool : l’éthanol.
Une étude préliminaire [12] démontre que l’EO est présent dans le jabot [5] et non dans les glandes labiales, hypopharyngiennes et mandibulaires et que la sécrétion d’EO est bien propre aux abeilles et non aux plantes qu’elles butinent. On ignore s’il existe un organe
spécialisé dans la synthèse de l’EO chez l’abeille. Une hypothèse est que l’EO est sécrété ailleurs dans l’organisme de l’abeille, puis exporté et stocké dans le jabot.
Une de nos hypothèses est qu’il serait formé à partir de l’éthanol, qui serait produit par les bactéries en anaérobiose, par la fermentation alcoolique des sucres, estérifiant alors l’acide oléique. Une fermentation des sucres du nectar collecté par les butineuse semble possible, par la microflore des fleurs dont la levure Saccharomyces cerivisae (annexe 13), puisque le jabot est un milieu fermé pauvre en oxygène propice à la fermentation des sucres. Ces levures seraient récoltées en même temps que le nectar.
On peut supposer que cette réaction d’estérification est facilitée par la présence d’une enzyme spécifique. De plus, les acides gras (dont l’acide oléique) sont très nombreux dans tout le corps de l’abeille. La réaction d’estérification est un équilibre entre l’alcool et l’acide oléique d’une part, et l’ester et l’eau d’autre part, et il a été montré par CPG – SM que l’EO et son acide correspondant l’acide oléique sont présents dans les jabots des butineuses [10], c’est pourquoi il faudra prendre beaucoup de soins à ne pas utiliser d’alcool lors des manipulations. De plus, il serait peut être intéressant de doser l’éthanol, molécule volatile, en plus de l’OE lors de nos expériences.
Transmission de l’oléate d’éthyle
La grande quantité d’EO que l’on retrouve dans des jabots des butineuses nous laisse penser que le passage de cet ester d’une abeille à une autre pourrait bien se faire par trophallaxie. Lors de l’échange, le contact antennaire entre l’abeille donneuse et l’abeille receveuse est intense et ininterrompu. On peut penser que ce stimulus pourrait être pour la butineuse un signal déclenchant l’échange d’EO vers le jabot de la receveuse.
Matériel et méthode
Nous avons donc recherché le matériel et la méthode pour mettre en évidence l’échange par trophallaxie de l’OE chez l’abeille. Puisqu’il n’existait pas de telle méthode, nous en avons donc choisi une simple à mettre en œuvre avec le matériel disponible au laboratoire, et à partir des méthodes de mesure de l’OE déjà utilisées.
Pour pouvoir observer des trophallaxies entre les abeilles et mesurer l’échange d’OE entre les abeilles, il est nécessaire de pouvoir identifier les abeilles, puis de les isoler avant de les mettre en présence et de les observer :
• l’identification choisie est couramment utilisée en apiculture : c’est de peindre une marque de couleur sur le dessus du thorax
• l’isolement choisi : en cage pain, puis en boite de pétri
Enfin les modalités définies étaient de mettre en évidence l’échange par trophallaxie d’OE entre 2 abeilles choisies parmi les butineuse, les nourrices en effectuant 5 répétitions.
Matériel
Observations
• Pinces entomologistes • Boites de pétri plastique
• Rucher couvert avec climatisation réglée à 24°C, Ruches peuplées • Etuve Memmert Roucaire réglée à 34°C
• Caméra : Sony DCR-TRV50E, trépied, Lampe à lumière rouge • Logiciel Etholog : analyse comportementale
• Peinture automobile Motip 12 mL Broyage, centrifugation, fractionnement
• Centrifugeuse Biofuge primo R Heraeus
• Isohexane HPLC grade Fisher Scientific (fournisseur VWR)
• Ether diéthylique Fischer Chemicals – analytical reagent grade - redistillé • Standards internes : molécules C15, C17, C20 (fournisseur Sigma)(Annexe 2) • Poudre de silice (fournisseur Sigma)
• pipette Pasteur en verre Concentration
• Bouteille d’azote CPG
Figure 10 : Boite de pétri avec son fond et sa séparation mobile
On l’utilise pour nos observations de comportement
Figure 11 : cage Pain avec un nourrisseur de candi et un abreuvoir d’eau
Les abeilles prélevées sur la ruche sont introduites dans ces cages
Figure 12 : Dissection d’une abeille
Méthodes
Mise au point des méthodes
Dans un premier temps nous avons préparé les boites permettant de mettre en présence les abeilles. Elles ont été préparées en découpant des boites de pétri et munies d’une séparation mobile et de fonds en papier filtre (Figure 10).
Ensuite, nous avons ajouté un nourrisseur sur les boites de pétri, pour n’observer que les trophallaxies non alimentaires : les boîtes ont été adaptées afin d’y placer un nourrisseur de sirop. En effet les résultats précédents montraient des échanges de trophallaxie très importants a priori alimentaires. Nous avons souhaité masquer l’effet alimentaire pour n’obtenir que les trophallaxies non alimentaires qui sont a priori celles où l’OE est échangé.
Nous avons tout d’abord prélevé des abeilles butineuses de pollen à l’entrée d’une ruche et des abeilles sur un cadre de couvain, parmi celles qui plongent la tête dans une cellule contenant une larve, qui sont a priori des nourrisses. Une même ruche ne contient pas toujours de nombreuses larves sur un cadre et il est parfois difficile de faire la différence entre une abeille qui plonge la tête dans une alvéole de nectar ou dans une alvéole contenant une larve. C’est pourquoi pour les expériences suivantes des abeilles d’âge connu marquées à leur naissance ont été prélevées sur les cadres (Annexe 8).
De même nous avons alors séparé les butineuses en 2 groupes : les butineuses de nectar et les butineuses de pollen. En effet, les butineuses de nectar et de pollen n’interagissent pas avec les mêmes abeilles. Les butineuses de nectar interagissent avec les receveuses de nectar, les butineuses de pollen déchargent leur pollen et peuvent interagir avec les nourrices. Les butineuses de nectar ont été prélevées à l’entrée de la ruche d’abord parmi les abeilles ne portant pas de pollen, puis en repérant les abeilles en vol de retour à l’abdomen bien gonflé, enfin parmi celles qui régurgitent du nectar.
Les observations ont été réalisées à l’obscurité au rucher couvert climatisé à 24°C, en présence d’une lumière rouge. Les comportements ont été notés à l’aide du logiciel Etholog et de l’éthogramme réalisé (Annexe 6 et 7). Suite à l’investissement en temps important pour réaliser les expériences et à l’absence de retour possible sur les observations sans enregistrement, nous avons décidé de chercher un moyen d’enregistrer les observations. Nous avons donc utilisé une caméra numérique en mode vision nocturne et la source de lumière rouge.
Les essais à 15, 30, 45 et 60 min ont conduit à conserver un temps de jeûne de 60 min pour la suite des expériences.
Prélèvement des abeilles
On utilise une grille qui bouche l’entrée de la ruche ou la porte d’entrée de la ruche placée en position fermée, après un léger enfumage de l’entrée pour éloigner les abeilles gardiennes.
Les 50 butineuses de pollen
Elles sont prélevées en premier parmi les abeilles de retour à la ruche portant des pelotes de pollen, le matin vers 11h00.
Les 50 butineuses de nectar
Elles sont prélevées parmi les abeilles de retour à la ruche avec un abdomen bien
gonflé. On vérifie en pressant l‘abdomen avec une 2e pince que l’abeille régurgite du nectar.
Les 50 nourrices
Les nourrices sont prélevées en dernier, après ouverture de la ruche de travail. Le nombre nécessaire d’abeilles marquées d’âge de 4 à 8 jours est alors prélevé sur les cadres sortis un à un de la ruche (Annexe 8)
Nourrissement des abeilles
Les abeilles prélevées sont placées en cage Pain identifiée (Figure 11) avec un nourrisseur de sirop 50/50, un nourrisseur de candi et un abreuvoir d’eau. Les cages Pain avec leurs abeilles sont mises à l’obscurité au rucher couvert. Les abeilles sont donc nourries ad
Figure 13 : Fractionnement sur colonne de silice
On réalise plusieurs fractionnements à la fois
Figure 14 : Concentration sous flux d’azote
Observation
En début d’après midi, les abeilles sont placées dans les boites de pétri. Ensuite elles restent isolées pendant 1 heure. Enfin on retire la séparation de la boite et les abeilles sont filmées à l’aide de la caméra. En fin d’observation, les abeilles sont identifiées dans un tube Eppendorf et placées au congélateur. Après transfert des vidéos sur le PC les comportements sont observés et notés à l’aide du logiciel Etholog.
Dissection des abeilles
Les abeilles sont sorties du congélateur et fixées (Figure 12). Le jabot est prélevé après avoir enlevé le 2e sternite à l’aide de pinces fines sous loupe binoculaire. Le jabot est alors placé dans 500 µL d’une solution d’isohexane contenant 1 000 ng des standards de CPG C15 et C20 (annexe 2). De même pour le corps de l’abeille. Les flacons sont alors mis au congélateur.
Broyage des abeilles
Les tubes contenant les jabots et les corps des abeilles sont ressortis du congélateur. Leur contenu est broyé à l’aide d’un pilon en verre.
Centrifugation
Les flacons sont alors centrifugés à 4000 tours / min (en g ?) pendant 20 min à 4°C
Fractionnement
Le surnageant de centrifugation est fractionné sur la colonne de silice (Figure 13). Celle-ci est lavée par 4 mL d’isohexane à 1,5 % d’éther diéthylique, puis on dépose tout le surnageant de l’échantillon. A partir de ce moment on élue à l’aide d’isohexane à 6 % d’éther diéthylique et on récupère 3 mL de la sortie de colonne (annexe 1).
Concentration et CPG
Les 3 mL de l’étape précédente sont concentrés sous flux d’azote (Figure 14), jusqu’à obtenir un volume très faible transféré à l’aide d’une pipette Pasteur dans l’insert placé dans le flacon de CPG. Les échantillons précédents sont analysés par CPG avec une colonne adaptée à la recherche des esters de molécules hydrocarbonées. L’ensemble du matériel de verrerie utilisé est lavé 3 fois à l’eau puis 3 fois à l’eau distillée, puis séché au four à 400° C pendant une nuit. Les bouchons des tubes sont eux lavés à l’eau, puis à l’eau distillée, puis à l’isohexane.
Figure 15 : Poids moyen des jabots des abeilles témoins 0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0,030 T0 TF P o id s m o y e n e d e s j a b o ts ( g ) Nou P ol Nec
Dans les cages Pain
T0 : environ 2 heures après le prélèvement sur les ruches et la mise en cage Tf : T0 + environ 4 heures (en fin de manipulation de la journée)
On voit les poids moyens des jabots des abeilles témoins prélevés en début et fin de manipulation
Figure 16 : Poids moyen des jabots des abeilles des essais
0,000 0,010 0,020 0,030 0,040 0,050 0,060 0,070 0,080 0,090 Nou P ol Nec P o id s m o y e n d e s j a b o ts ( g )
En diade, après 1 h d’isolement et 10 min de contact
Résultats
Poids moyen des jabots des abeilles témoins (Figure 15)
• Il y a une augmentation du poids moyen des jabots des nourrisses entre T0 et Tf de 0,008 g à 0,014 g. Les nourrices sont probablement plus sollicitées pour fournir des trophallaxies alimentaires dans la ruche où il y a des larves à nourrir, que dans la cage Pain.
• Il y a une augmentation du poids moyen des jabots des butineuses de pollen entre T0
et Tf de 0,014 g à 0,021 g. Les butineuses de pollen sont prélevées à leur retour de butinage de pollen, pendant lequel elles utilisent probablement le nectar pour subvenir à leurs besoins alimentaires, et pour amalgamer les pelotes de pollen. Elles sont donc « affamées » lors de leur mise en cage Pain, où elles se nourrissent rapidement ce qui explique la prise de poids de leur jabot.
• Par contre le poids moyen du jabot des butineuses de nectar diminue très peu de 0,018
g à 0,016 g. Les butineuses de nectar ont donc déjà rempli leur jabot à T0 : par leur fonction, les butineuses de nectar ont la capacité de remplir leur jabot rapidement. Même si leur jabot a été vidé lorsqu’on a pressé leur abdomen lors du prélèvement, les butineuses de nectar l’ont rempli dans les conditions expérimentales en cage Pain.
Poids moyen des jabots des abeilles des essais (Figure 16)
• Les poids moyens des jabots des nourrices, des butineuses de pollen et des butineuses
de nectar sont semblables, environ 30 mg. De plus, ce poids moyen est à comparer aux poids moyens des jabots des abeilles en cage Pain qui n’était que de 20 mg au maximum : on a bien rempli les jabots de toutes les abeilles de chaque groupe par le nourrissement au sirop + candi, ceci était une condition nécessaire pour observer seulement les trophallaxies non alimentaires entre les abeilles.
Figure 17 : Réalisations des contacts et des trophallaxies 0 20 40 60 80 100 nect ar-n ourr ice polle n-ne ctar nect ar-n ecta r nour ric e-nou rric e polle n-po llen polle n-no urric e % d e s é q u e n c e s avec au moins un c ontac t
avec au moins une trophallax ie
On voit que chaque groupe d’abeille a réalisé des contacts
Figure 18 : Durée moyenne des trophallaxies
Sur les séquences vidéo, lorsqu’il y a eu au moins un échange
On voit les durées moyennes des trophallaxies des abeilles témoins 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 nect ar-n ourr ice polle n-ne ctar nect ar-n ecta r nour ric e-nou rric e polle n-po llen polle n-no urric e D u ré e m o y e n n e d e t ro p h a ll a x ie ( s )
Réalisations des contacts et des trophallaxies (Figure 17)
• Toutes les abeilles de chaque groupe étudié ont eues au moins un contact. Pour chaque
modalité, il y a eu une forte proportion de trophallaxie : presque 80% des rencontres aboutissent à au moins une trophallaxie.
• Seules 50% des rencontres entre 2 butineuses de nectar ont montré des trophallaxies.
• Sur les 8 essais butineuse pollen – nourrice, 2 n’ont pas présenté de trophallaxie. Parmi les 6 montrant des trophallaxies, seules celles de 23,93 sec et de 48,73 sec de trophallaxie en 10 min d’observation ont finalement pu être analysées pour l’OE. Dans la diade « 48,73 sec », la butineuse pollen ne possédait pas d’OE dans son jabot en fin d’observation, la nourrice non plus… On ne peut donc pas mettre en évidence de transfert d’OE.
Durée moyenne des trophallaxies (Figure 18)
• Lors des interactions avec les butineuses de nectar : les durées de trophallaxie sont faibles (< 5 s), quelque soit l’autre abeille.
• Quand on observe une interaction d’abeilles du même groupe, la durée de trophallaxie
est stable elle se situe à environ 5 secondes
• Il y a une interaction plus forte, environ 20 secondes, entre les butineuses de pollen et
Figure 19 : Quantité moyenne d’OE des jabots des abeilles témoins 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 T0 TF Q u a n ti té m o y e n n e d 'O le a te d 'é th y le (n g /a b e il le ) Nou P ol Nec Cages pain
Quantité moyenne d’OE des jabots des abeilles témoins
• On observe une absence d’OE dans les abeilles nourrices des groupes témoins T0 et
Tf ce qui correspond à l’absence d’OE pour un total de 30 abeilles.
• Pour les butineuses de pollen, il y a une faible diminution entre T0 et Tf de la quantité
d’OE par jabot d’abeille : on a environ 50 ng / jabot d’abeille.
• Pour les butineuses de nectar, on note une tendance à la baisse de la quantité d’OE dans les jabots des butineuses de pollen.
Discussion
Nous avons bien réuni les conditions permettant la réalisation et l’observation de trophallaxies non alimentaires pour les butineuses de pollen et de nectar, puis la mesure des concentrations en OE des jabots des abeilles (graphes 1 et 2).
Le taux d’OE des jabots des butineuses diminue de T0 à Tf, l’OE ne semble donc pas synthétisé par les butineuses, sinon leur taux d’OE dans le jabot augmenterait au cours du temps. Peut-être qu’il est fourni aux butineuses par d’autres abeilles, qui sont absentes dans nos conditions d’expérience.
Dans la diade « 48,73 sec », la butineuse pollen ne possédait pas d’OE dans son jabot en fin d’observation, la nourrice non plus… On ne peut donc pas mettre en évidence de transfert d’OE. Mais si on regarde les témoins T0 et Tf les butineuses de pollen ont de l’OE dans leur jabot, alors peut être que la butineuse de pollen de cette diade possédait de l’OE en début de manipulation, et qu’il est transféré à la nourrice mais qu’il ne se retrouve pas dans son jabot (Graphe 3). Les trophallaxies sont toujours suivies de nombreuses séquences de toilettage, peut être que les abeilles étalent à ce moment l’OE transféré lors de la trophallaxie ou du contact sur leur corps. Peut être aussi que c’est une butineuse particulière qui n’avait pas d’OE dans son jabot dès le début de l’expérience.
Mais si on regarde les témoins T0 et Tf les butineuses de pollen ont de l’OE dans leur jabot, alors peut être que la butineuse de pollen de cette diade possédait de l’OE en début de manipulation, et qu’il est transféré à la nourrice mais qu’il ne se retrouve pas dans son jabot.
Dans la diade « 24 sec », la butineuse de pollen possédait 148,21 ng d’OE dans son jabot à la fin de l’expérience alors que la nourrice n’en avait pas. Il ne semble donc pas qu’il y ait eu de transmission de l’OE de la butineuse vers la nourrice. Ce transfert n’a pas pu se faire dans le sens nourrice vers butineuse de pollen non plus, puisque les jabots des nourrices témoins ne contiennent jamais d’OE. Peut-être que l’OE est bien transféré mais dégradé de suite par la nourrice, les nourrices dégraderaient l’OE produit par les butineuses, les butineuses ne posséderaient pas cette capacité.
Nous avons montré que les trophallaxies des butineuses de pollen avec les nourrices d’âge 5 à 7 jours (les nourrices de 4 et 8 jours n’ont pas été utilisées) sont les plus longues. Par contre, il y a moins de trophallaxies avec les abeilles butineuses de nectar, ce qui est en accord avec la littérature [23], les butineuses de nectar transfèrent en effet le contenu de leur jabot à des abeilles receveuses plus âgées que les nourrices, ce qui pourrait être testé dans d’autres manipulations (graphes 4 et 5). Les nourrices ne possèdent jamais d’OE (sauf dans 2 cas dans nos essais, annexe 11) alors que une référence bibliographique [5] montre des nourrices de 7 jours qui en possèdent. Il serait intéressant de répéter les mesures sur différentes ruches et au cours de l’année, et de les réaliser en plus sur les autres groupes d’abeilles : abeilles receveuses de nectar, mâles…
Chez les butineuses de pollen, on note une diminution de la quantité d’OE dans les jabots, malgré une augmentation de leurs poids. Il ne semble donc pas y avoir de corrélation positive. De même pour les butineuses de nectar. Les témoins montrent que les jabots des nourrices ne contiennent pas d’OE, et que les poids des jabots des nourrices des témoins augmentent entre T0 et Tf. Ce qui est favorable à un passage par trophallaxie de nectar vers les nourrices, alors que quel que soit son binôme on ne retrouve jamais d’OE dans le jabot des nourrices.
Nous avons donc confirmé la présence d’OE dans le jabot des butineuses de pollen et de nectar, et son absence dans celui des nourrices. De plus, nous n’avons pas montré de transfert d’OE entre les jabots des butineuses et des nourrices. De futures analyses des corps des mêmes abeilles permettront de tester l’hypothèse de transfert de l’OE par contact cuticulaire entre 2 abeilles.
Liste des figures
Figure 1 : Position systématique de l’abeille Apis ... 12 Figure 2 : répartition mondiale des espèces d’abeille [1]... 12 Figure 3 : Les races d’abeille utilisées par les apiculteurs professionnels [3] ... 14 Figure 4 : Le corps de l’ouvrière de l’abeille Apis mellifera ... 14 Figure 5 : Les trois castes de l’abeille Apis mellifera ... 14 Figure 6 : Emploi du temps de l’ouvrière adulte [1] ... 16 Figure 7 : Flexibilité du développement comportemental de l’ouvrière [5] ... 16 Figure 8 : Composés de la phéromone de couvain... 18 Figure 9 : Composés de la phéromone royale. ... 18 Figure 10 : Boite de pétri avec son fond et sa séparation mobile... 26 Figure 11 : cage Pain avec un nourrisseur de candi et un abreuvoir d’eau ... 26 Figure 12 : Dissection d’une abeille... 26 Figure 13 : Fractionnement sur colonne de silice ... 30 Figure 14 : Concentration sous flux d’azote ... 30 Figure 15 : Poids moyen des jabots des abeilles témoins ... 32 Figure 16 : Poids moyen des jabots des abeilles des essais ... 32 Figure 17 : Réalisations des contacts et des trophallaxies ... 34 Figure 18 : Durée moyenne des trophallaxies ... 34 Figure 19 : Quantité moyenne d’OE des jabots des abeilles témoins ... 36
Liste des tableaux
Tableau 1 : Répartition des activités des ouvrières ... 16
Liste des annexes
Annexe 1: Protocole de fractionnement ...iii Annexe 2 : standards internes... v Annexe 3 : CPG [20] : Fiche Chromatographie ... vii Annexe 4 : résultats bruts de CPG ... ix Annexe 5 : Préparation des abeilles nourrices ... xi Annexe 6 : Grille d’analyse des comportements... xi Annexe 7 : éthogramme hiérarchisé...xiii Annexe 8 : calendrier de marquage des abeilles naissantes ...xiii Annexe 9 : développement des 3 castes de l’abeille Apis mellifera... xv Annexe 10 : Coupe longitudinale de la larve [7] ... xv Annexe Annexe 11 : les lipides en biologie ...xvii Annexe 12 : microbiologie du nectar ... xix
Liste des abréviations
AG Acide Gras
OE Oléate d’éthyle
9-ODA acide 9-oxo-(E)-2-décènoïque
tr Temps de rétention
CI Ionisation Chimique
CPG Chromatographie en Phase Gazeuse
9-HDA acide 9-hydroxy-2(E)-décénoïque
HOB parahydroxybenzoate de méthyle
HVA 4-hydroxy-3-méthoxyphényléthanol
CEMAGREF Institut de recherche pour l’agriculture et l’environnement
CNRS Centre National de la recherche scientifique
IFREMER Institut Français de Recherche pour l’Exploitation de la Mer
INRA Institut National de Recherche Agronomique
MP palmitate de méthyle
MO oléate de méthyle
ML linoléate de méthyle
MLn linolénate de méthyle
PACA Provence Alpes Côte d’Azur
L5 Larves de 5 jours
9-ODA acide 9-oxo-(E)-2-décènoïque
T0 Témoin de début d’expérience
Lexique
Caste : Ensemble des individus adultes assurant les mêmes fonctions chez les insectes
sociaux
Cellule ou Alvéole : cavité de section hexagonale délimitée par des parois de cire façonnées
par les ouvrières, où elles déposent les couvains et la nourriture
Chitine : polysaccharide azoté présent dans la cuticule des insectes et autres arthropodes. Cuticule : fine couche protéique se trouvant à la surface de l’insecte responsable de sa
protection et de sa pigmentation.
Glandes cirières : glandes localisées sur la face inférieure de l'abdomen d'une ouvrière entre
les troisième, quatrième et cinquième anneaux, qui sécrètent de la cire.
Glandes hypopharyngiennes : structures glandulaires situées dans la tête d'une abeille
ouvrière adulte qui produisent des sécrétions protéinées, qui sont données en nourriture au couvain, et aussi différents enzymes qui servent à la conversion du nectar en miel.
Glandes mandibulaires : glandes situées de part et d'autre de la tête de l'abeille. Chez les
jeunes ouvrières, ces glandes sont développées en production de nourriture de couvain. Chez les ouvrières plus âgées elles produisent une substance d'alarme.
Glande de Nasanov : glande située sur le segment apical de l'abdomen d'une abeille qui
sécrète une phéromone qui sert à attirer les autres abeilles mellifères.
Gelée royale : produit crémeux sécrété par les abeilles nourrices dans les glandes
hypopharyngiennes et mandibulaires. Elle est dérivée des protéines et des nutriments présents dans le pollen ingéré par les nourrices.
Hémolymphe : chez les insectes, il est l’équivalent de la lymphe et du sang des vertébrés,
dont la couleur est transparente ; il sert de réservoir d’eau et de glucose.
Mue : changement de cuticule chez la larve. Au cours du cycle évolutif, il y a cinq mues
larvaires et une mue nymphale.
Operculation : fermeture des cellules par une fine pellicule de cire.
Polyéthisme : chez les insectes sociaux, spécialisation d’un individu ou d’un groupe
d’individus dans une tâche particulière
Stigmate : partie de l'appareil respiratoire ; les trachées communiquent vers l'extérieur par des
Bibliographie
[1] DEGRANDI-HOFFMAN G & HAGLER J, 2000, The flow of incoming nectar through a honey bee (Apis mellifera L.) colony as revealed by a protein marker, Insectes Sociaux, Vol. 47, Issue 4, pp 302-306
[2] Le traité Rustica de l’apiculture. 2002. 3e édition. Collectif. Rustica Editions. Paris.
[3] Apiculture – Connaître l’Abeille – Conduire le rucher. 2005. 7e édition. Pierre Jean-Prost, Yves Le Conte. 7e édition. Editions Tec & Doc. Lavoisier. 698 p.
[4] Apiculture. L’élevage des reines. Les cahiers de l’élevage. 2008. Gilles Fert. Rustica éditions. Paris. 128 p.
[5] LEONCINI I., 2002, Pheromones et regulation sociale chez l’abeille Apis mellifera L. Indication d’un inhibateur du développement comportemental des ouvrières, Paris Grignon (INA), 244p.
[6] Biofutur. N° 286. Mars 2008. Pages 37- 40
[7] LE CONTE Y., MOHAMMEDI A. et ROBINSON GE, 2001, Primer effects of a brood pheromone on honeybee behavioural development. The Royal Society, Vol 268, p163-168.
[8] LE CONTE Y., SRENG L. et POITOUT S.H, 1995, Brood pheromone can modulate the feeding behavior of Apis mellifera. Chemo-ecology ,Vol 1, p6–12.
[9] SLESSOR K.N, WINSTON M.L, LE CONTE Y., 2005, Pheromone communication in the honeybee. Journal of Chemical Ecology, Vol 31, No 11.
[10] AUBERT Mélissa, 2005, Etude du transfert de la phéromone de butineuse par trophallaxie, chez l’abeille Apis mellifera, rapport de stage IUT Chimie Université Paul-Cézanne Aix – Marseille III
Historique Internet
15 et 16 avril 2008 http://www.listes-annuaires.com/images/abeille-1.gif http://environnement.ecoles.free.fr/reine.htm http://environnement.ecoles.free.fr/abeilles-taches.htm http://www.paulstarosta.com/gallery.asp?photo_id=68650 http://www.infovisual.info/02/041_fr.html http://www.cerimes.education.fr/index.php?page=bi_admin&op1=rech_mots_clefs,,,9 9,,,,,1,0,,,abeille 17 avril 2008 http://home.euphonynet.be/abeille/elv/phero1.html http://www.sfrs.fr/index.php?page=bi_admin&op1=plan,,,99,,,,,1,3564 http://coucoun54800.centerblog.net/3.html 24 avril 2008 http://tecfa.unige.ch/tecfa/teaching/UVLibre/0001/bin35/abeilles/societe/societe.html http://en.wikipedia.org/wiki/Octopamine 25 avril 2008 http://www.noel-apiculture.fr/actualites_abeilles.htm http://apis.melifica.chez-alice.fr/histnat.html 29 avril 2008 http://www.ip.usp.br/ebottoni/EthoLog/ethodnl.htmAnnexe 1: Protocole de fractionnement
Fractionnement
But :
L’intérêt du fractionnement est de séparer les différentes molécules se trouvant dans l’échantillon. Etant donné que nous souhaitons analyser seulement les esters de molécules hydrocarbonées, qui plus est se trouvant en faible quantité dans nos solutions, il est préférable de séparer les molécules hydrocarbonées des esters de molécules hydrocarbonées. En effet, les pics des molécules hydrocarbonées gênent pour l’observation en recouvrant les autres pics sur une large base de temps. De plus, ces molécules hydrocarbonées « salissent » la colonne. Enfin, le fractionnement peut permettre de « filtrer » des impuretés se trouvant dans notre échantillon.
Protocole :
• Préparation de la colonne de silice : Pipette pasteur avec au fond un peu de laine de verre puis on ajoute 0,71g de silice.
• On rince la colonne avec une solution d’iso-hexane à 1,5 % d’éther diéthylique (environ 4 mL).
• On ajoute le surnageant dans la colonne.
• On élue avec 3 mL d’iso-hexane à 1,5 % d’éther diéthylique = fraction (F1) où sont les molécules hydrocarbonées.
• Puis on élue la colonne de silice avec 3mL d’iso-hexane à 6% d’éther diéthylique = fraction 2 (F2) où sont les esters des molécules hydrocarbonées.
• On concentre 500 µ L de la solution F2 en passant le flacon sous un flux d’azote jusqu'à ce qu’il reste environ exactement 10µL.
• On introduit ensuite ce concentra de solution dans un insert, dans un flacon col haut de 2 mL avec un septum.
• On injecte dans le chromatographe sur une colonne polaire supelcowax (voir détails de la colonne).
Annexe 2 : standards internes
Standard Internes (STI)
• C15 : 1 Cis-10-pentadécènoate de méthyle O O C H3 Me • C17 : 0 Heptadécanoate de méthyle O O C H3 Me • C20 : 0 Arachidate de méthyle O O C H3 Me
Annexe 3 : CPG [20] : Fiche Chromatographie
Matériel utilisé : Shimadzu – GC 2014
Injecteur : Injecteur en mode split.
Colonne : capillaire polaire SUPELCOWAX® (longueur :
14,5 m ; diamètre interne : 0,10 mm ; épaisseur du film : 0,10 µm).
Détecteur : Détecteur à Ionisation de Flamme.
Les conditions d’analyse sont : Gaz vecteur : Hélium
Température et mode de l’injecteur : 250°C, mode split Température du détecteur : 270°C
Programme de montée en température pour la méthode d’analyse :
Pas de Température (°C/min) Température (°C) Durée (min)
… 90
40 195
1 201
40 270
Annexe 5 : Préparation des abeilles nourrices
Un cadre de couvain naissant est prélevé sur la ruche de travail. Ce cadre est placé à l’étuve une nuit, le lendemain (jour J) les abeilles nées sont marquées avec un point de peinture sur le thorax et réintroduites dans la ruche.
Annexe 7 : éthogramme hiérarchisé
Annexe 9 : développement des 3 castes de l’abeille Apis mellifera
a) chez la reine, b) chez les mâles, c) chez les ouvrières
A a)
b)
c)
Résumé
Le rôle de l’oléate d’éthyle (OE) comme phéromone a été mis en évidence chez l’abeille. L’OE agit notamment comme phéromone en modifiant l’âge auquel les abeilles nourrisses changent de tâche, le résultat est que l’activité de butinage d’une abeille est avancée ou non. L’OE a été mis en évidence dans la phéromone de couvain dans les larves et dans la phéromone de butineuse dans les butineuses.
Nous avons voulu préciser comment se fait le transfert de l’OE des butineuses aux nourrices. L’hypothèse privilégiée dans notre travail est que le transfert se fait par trophallaxie de la butineuse à la nourrice.
Nous avons donc mis au point une méthode permettant d’observer des trophallaxies puis mesuré les taux de l’OE dans le jabot des nourrisses.
Nos résultats montrent que l’OE est absent du jabot des nourrices et qu’il ne semble pas être transféré par trophallaxie des butineuses aux nourrices.
Mots clefs : Trophallaxie, OE, Oléate d’éthyle, Apis mellifera, nourrice, butineuse, abeille.
Abstract
Ethyl Oleate (EO) is a primer pheromon in honeybee Apis mellifera. This pheromone is regulating behavioural maturation of nurses. It modify first foraging age. It is present in brood pheromon and in forager pheromone.
We wanted to know how the EO is transferred from the foragers to the nurses. We think that the way is the trophallaxis.
So, we create a method to observe trophallaxis, then we mesure the amount of EO in nurses crop.
We show the absence of EO in nurses crop. The EO pheromone is apparently not transferred by trophallaxis between foragers to nurses.
![Figure 1 : Position systématique de l’abeille Apis [1]](https://thumb-eu.123doks.com/thumbv2/123doknet/12318175.325324/13.892.106.579.124.537/figure-position-systématique-l-abeille-apis.webp)
![Figure 5 : Les trois castes de l’abeille Apis mellifera [1]](https://thumb-eu.123doks.com/thumbv2/123doknet/12318175.325324/15.892.117.708.343.806/figure-castes-l-abeille-apis-mellifera.webp)
