STIMULATION DE LA SYNTHÈSE DES COMPOSÉS
NUTRACEUTIQUES ET AROMATIQUES DANS LES FINES
HERBES ET LES LÉGUMES PAR LES CHAMPIGNONS
MYCORHIZIENS À ARBUSCULES
Mémoire
Frédéric Simard
Maîtrise en biologie végétale
Maître ès sciences (M. Sc.)
Québec, Canada
iii Résumé
Le principal objectif de ce projet de recherche était de déterminer si les champignons mycorhiziens à arbuscules pouvaient stimuler la synthèse des composés du métabolisme secondaire d’intérêt nutraceutique dans les végétaux. Deux plantes ont été utilisées au cours de ce projet de recherche, le basilic (Ocimum basilicum L.) et la carotte (Daucus carota L.). La mycorhize a favorisé la croissance des plants de basilic ayant reçu un ajout de superphosphate triple au cours de la deuxième expérience menée sur cette espèce. Elle a aussi favorisé à plusieurs reprises l’assimilation minérale de certains minéraux comme le potassium et le phosphore. Des teneurs plus élevées en caroténoïdes ont été observées dans les feuilles des plants de basilic ayant reçu une double dose d’inoculant. De plus, la capacité antioxydante liposoluble des extraits de plants de basilic inoculés avec la simple dose a été abaissée. Chez la carotte, la mycorhize a favorisé la croissance et l’assimilation minérale des plants dans les conditions sans ajout de superphosphate triple. La teneur en α-carotène a diminué chez les carottes mycorhizés au cours de la première expérience. L’association mycorhizienne a induit des effets à la fois indirects et directs sur la synthèse des composés nutraceutiques.
v Résumé long
Le principal objectif de ce projet de recherche était de déterminer si les champignons mycorhiziens à arbuscules pouvaient stimuler la synthèse des composés du métabolisme secondaire d’intérêt nutraceutique dans les végétaux. Les aliments sains, riches en composés nutritifs et antioxydants et produits de manière respectueuse envers l’environnement sont de plus en plus recherchés. L’usage critiqué des pesticides et des engrais chimiques mène les producteurs à revoir leurs méthodes culturales. C’est dans cette optique que les champignons mycorhiziens à arbuscules attirent de plus en plus l’attention des producteurs horticoles. Jusqu’à maintenant, plusieurs auteurs ont rapporté les effets favorables des champignons mycorhiziens à arbuscules sur la synthèse de certaines familles de molécules d’intérêt nutraceutique comme les composés phénoliques et les terpénoïdes. Plusieurs questions persistent concernant l’étendu de l’effet de la mycorhize, est-elle localisée au site de colonisation des racines ou peut-elle se manifester à distance jusque dans les feuilles de la plante? En revanche, d’autres auteurs n’ont pas observé d’effet direct des champignons endomycorhiziens et les effets observables semblent davantage être attribuables à la fertilisation ou à l’effet indirect d’une meilleure assimilation minérale conférée par la mycorhize.
C’est devant ces nombreuses questions fondamentales que les hypothèses de ce projet de recherche ont pris forme. Il a été émis que les champignons mycorhiziens à arbuscules auraient un effet inducteur sur le métabolisme secondaire des plantes et que cet effet mènerait à la synthèse d’une plus grande quantité de composés d’intérêt nutraceutique. Les fruits et les légumes produits selon cette régie de culture seraient ainsi biofortifiés. Les molécules produites lors de l’enclenchement des mécanismes de défense des plantes sont sensiblement les mêmes que celles qui confèrent les propriétés nutraceutiques, cosmétiques ou aromatiques. Donc, l’effet de l’association mycorhizienne serait direct et non pas indirect causé par une meilleure assimilation des nutriments de la solution nutritive du sol ou du substrat.
vi
Deux plantes ont été utilisées au cours de ce projet de maîtrise de deux ans, la carotte et le basilic. Deux expériences ont été réalisées pour chaque espèce. La carotte permettait de déterminer si les effets étaient localisés au niveau des racines de la plante et le basilic permettait de déterminer si les effets pouvaient être systémiques et activer des mécanismes moléculaires jusque dans les feuilles de la plante. Les deux plantes ont été inoculées à l’aide d’un inoculant commercial du Glomus irregulare. Pour atteindre nos différents objectifs, les plants ont été fertilisés à l’aide de deux types de solution fertilisante, une faiblement concentrée en azote au cours d’une première expérience et une autre plus concentrée au cours de la deuxième expérience. De plus, du superphosphate a été ajouté au substrat de culture dans certains traitements afin d’isoler l’impact direct de la mycorhize de l’impact indirect d’une meilleure assimilation minérale causée par cette dernière.
Les principales conclusions sont que l’association mycohizienne est indéniablement plus efficace lorsque les teneurs en minéraux dans la solution du sol sont faibles. Toutefois, la mycorhize a favorisé la croissance des plants de basilic lors d’un ajout de superphosphate triple au cours de la deuxième expérience menée sur cette espèce. Elle a aussi favorisé à plusieurs reprises l’assimilation de certains minéraux comme le potassium et le phosphore. L’association mycorhizienne n’a pas modifié de façon importante la biochimie du basilic. Outre une stimulation de la synthèse des caroténoïdes dans les feuilles des plants de basilic ayant reçu une double dose d’inoculant au départ, peu d’effets ont été observés au niveau des teneurs totales en composés phénoliques, en caroténoïdes et de la capacité antioxydante. Une diminution de la capacité antioxydante a aussi été observée dans les extraits liposolubles des feuilles des plants de basilic inoculés à partir de la simple dose. Chez la carotte, la mycorhize a favorisé la croissance et l’assimilation minérale des plants dans les conditions sans ajout de superphosphate triple. La mycorhize semble avoir perturbé la synthèse de l’α-carotène chez les carottes mycorhizées au cours de la première expérience. Il n’y a pas eu d’autre impact important de l’association mycorhizienne sur les
vii molécules du métabolisme secondaire étudiées au cours des expériences sur la carotte.
ix Table des matières
Résumé ... iii
Résumé long ... v
Liste des tableaux ... xiii
Remerciements ... xvii
Introduction général... 1
Chapitre 1 : Revue bibliographique sur les champignons mycorhiziens arbusculaires, hypothèses et objectifs de recherche ... 4
1.1 La découverte des champignons mycorhiziens arbusculaires ... 4
1.2 Effets sur la croissance des plantes et mécanisme de transfert carbone/éléments minéraux entre les symbiotes ... 6
1.3 Protection accrue contre les stress hydriques et salins et relation hydrique entre les mycorhizes à arbuscules et l’hôte végétal ... 8
1.4 Amélioration de la structure des sols ... 10
1.5 Protection accrue contre les différents stress biotiques ... 11
1.6 Impact sur la synthèse des métabolites primaires et secondaires de la plante hôte ... 12
1.6.1 Métabolisme primaire des acides aminés ... 12
1.6.2 Métabolisme des terpénoïdes ... 12
1.6.3 Métabolisme des phénylpropanoïdes ... 13
1.6.4 Autres modifications du métabolisme secondaire ... 14
1.7 Hypothèses et objectifs de recherche ... 14
Chapitre 2 : Influence du champignon mycorhizien arbusculaire Glomus irregulare sur la croissance, la nutrition minérale et la production de composés nutraceutiques chez le basilic (Ocimum basilicum L.)... 18
Résumé ... 18
2.1 Introduction ... 18
2.2 Matériel et méthodes ... 20
2.2.1 Biologie du basilic et champignon mycorhizien utilisé ... 20
2.2.2 Localisation, conditions de culture et dispositifs expérimentaux ... 21
2.2.3 Échantillonnage et paramètres mesurés ... 23
2.2.4 Coloration des racines et détermination du pourcentage de colonisation mycorhizienne 24 2.2.5 Détermination du contenu en éléments minéraux du substrat ... 25
2.2.6 Détermination de la teneur en éléments minéraux dans les feuilles de basilic ... 26
2.2.7 Détermination de la teneur en composés phénoliques totaux dans les poudres sèches des feuilles de basilic ... 26
2.2.8 Extraction et détermination des teneurs en caroténoïdes... 27
2.2.8.1 Extraction et détermination des teneurs en caroténoïdes totaux ... 27
2.2.8.2 Séparation et détermination de la teneur des différents caroténoïdes ... 29
2.2.9 Détermination de la capacité antioxydante des extraits de poudre de basilic ... 30
2.2.9.1 Extraction des composés liposolubles (L-ORAC) ... 30
2.2.9.2 Extraction des composés hydrosolubles (H-ORAC) ... 30
2.2.9.3 Mesure de la capacité antioxydante... 31
2.2.10 Analyse statistique ... 32
x
2.3.1 Taux de colonisation des racines des plants de basilic par le champignon Glomus
irregulare ... 32
2.3.2 Croissance des plants de basilic ... 33
2.3.3 Teneur en éléments minéraux des feuilles des plants de basilic ... 35
2.3.3.1 Première expérience ... 35
2.3.3.2 Deuxième expérience ... 38
2.3.4 Teneur en composés phénoliques totaux dans les feuilles de basilic ... 41
2.3.5 Teneur en caroténoïdes totaux dans les feuilles de basilic ... 42
2.3.6 Capacité antioxydante des extraits de feuilles des plants de basilic ... 45
2.4 Discussion et conclusion ... 47
2.4.1 Première expérience sur le basilic ... 47
2.4.1.1 Taux de colonisation, croissance et nutrition minérale ... 47
2.4.1.2 Effet sur les métabolites secondaires ... 48
2.4.2 Deuxième expérience sur le basilic ... 49
2.4.2.1 Taux de colonisation, croissance et nutrition minérale ... 49
2.4.2.2 Effet sur le métabolisme secondaire ... 50
2.4.3 Comparaison de l’étude avec la littérature ... 51
2.4.4 Conclusion ... 52
Chapitre 3 : Effet du champignon mycorhizien à arbuscules Glomus irregulare sur la croissance, la nutrition minérale et la stimulation de la synthèse de composés nutraceutiques chez la carotte (Daucus carota L.) ... 56
Résumé ... 56
3.1 Introduction ... 57
3.2 Matériels et méthodes ... 58
3.2.1 Biologie de la carotte et conditions de culture ... 58
3.2.2 Échantillonnage et paramètres mesurés ... 60
3.2.3 Détermination du taux de colonisation par le champignon mycorhizien à arbuscules Glomus irregulare des racines de carotte ... 61
3.2.4 Analyse minérale du substrat de culture des bioessais de carotte ... 62
3.2.5 Analyse minérale des tissus végétaux des racines de carotte ... 63
3.2.6 Contenu en composés phénoliques totaux dans les poudres sèches de carotte ... 64
3.2.7 Quantification du contenu en caroténoïdes totaux dans les poudres sèches de carotte . 65 3.2.8 Détermination de la capacité antioxydante des extraits de carotte ... 67
3.2.8.1 Extraction des composés liposolubles des poudres de carotte (L-ORAC) ... 67
3.2.8.2 Extraction des composés hydrosolubles des poudres de carotte (H-ORAC) ... 68
3.2.8.3 Mesure de la capacité antioxydante ... 68
3.2.9 Analyses statistiques ... 69
3.3 Résultats ... 69
3.3.1 Taux de colonisation des racines de carotte par le champignon endomycorhizien Glomus irregulare ... 69
3.3.2 Rendements en matière fraîche des racines tubérisées de carotte ... 70
3.3.3 Teneur en minéraux dans les tissus des racines tubérisées de carotte ... 71
3.3.3.1 Première expérience ... 71
3.3.3.2 Deuxième expérience ... 74
3.3.4 Contenu en composés phénoliques totaux dans les racines tubérisées de carotte ... 76
3.3.5 Contenu en caroténoïdes dans les racines tubérisées de carotte ... 77
3.3.6 Capacité antioxydante des extraits de carotte ... 80
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3.4.1 Première expérience sur la carotte ... 82
3.4.1.1 Taux de colonisation, croissance et nutrition minérale ... 82
3.4.1.2 Effet sur le métabolisme secondaire ... 82
3.4.2 Deuxième expérience sur la carotte... 83
3.4.2.1 Taux de colonisation, croissance et nutrition minérale ... 83
3.4.2.2 Effet sur le métabolisme secondaire ... 84
3.4.3 Comparaison avec les études antérieures ... 85
3.4.4 Conclusion ... 86
Conclusion générale... 89
Références bibliographiques ... 93
Annexe 1 ... 103
xiii Liste des tableaux
Chapitre 2
Tableau 2.1 Propriétés chimiques du terreau Agro Mix® avec ou sans ajout de superphosphate triple au moment de l’empotage des essais sur le basilic……….25 Tableau 2.2 Taux de colonisation des racines des plants de basilic par le champignon endomycorhizien à arbuscules Glomus irregulare en fonction de la dose d’inoculant mycorhizien et de superphosphate triple………...33 Tableau 2.3 Masses fraîches aériennes des plants de basilic en fonction de la dose d’inoculant mycorhizien et de l’ajout de superphosphate triple………35 Tableau 2.4 Teneur en éléments minéraux (base sèche) dans les feuilles des plants de basilic de la première expérience en fonction de la dose d’inoculant mycorhizien et de l’ajout de superphosphate triple………..……37 Tableau 2.5 Teneur en éléments minéraux (base sèche) dans les feuilles des plants de basilic de la deuxième expérience en fonction de la dose d’inoculant mycorhizien et de l’ajout de superphosphate triple………..……40 Tableau 2.6 Teneur en composés phénoliques totaux dans les feuilles de basilic en fonction de la dose d’inoculant mycorhizien et de l’ajout de superphosphate triple………...………42 Tableau 2.7 Teneur en caroténoïdes totaux, en lutéine et en β-carotène dans les feuilles des plants de basilic des deux expériences en fonction de la dose d’inoculant mycorhizien et de l’ajout de superphosphate triple………..44 Tableau 2.8 Capacité antioxydante des extraits hydrosolubles (Orac-H), liposolubles (Orac-L) et totaux (Orac-T) des feuilles de basilic des deux expériences en fonction de la dose d’inoculant mycorhizien et de l’ajout de superphosphate triple………...46
Chapitre 3
Tableau 3.1 Propriétés chimiques de la terre à jardin Premier horticulture utilisée pour les bioessais chez la carotte en fonction de l’ajout ou non de superphosphate triple……….63 Tableau 3.2 Taux de colonisation des racines de carotte par le champignon
endomycorhizien Glomus irregulare en fonction de l’ajout d’inoculant mycorhizien et de superphosphate triple………..70
xiv
Tableau 3.3 Rendement en matière fraîche des racines tubérisées de carotte en fonction de l’ajout d’inoculant mycorhizien et de superphosphate triple………...…71 Tableau 3.4 Teneurs en éléments minéraux (base sèche) des racines tubérisés de carotte de la première expérience en fonction de l’ajout ou d’inoculant mycorhizien et de superphosphate triple………...73 Tableau 3.5 Teneurs en éléments minéraux (base sèche) des racines tubérisés de carotte de la deuxième expérience en fonction de l’ajout d’inoculant mycorhizien et de superphosphate triple………...75 Tableau 3.6 Teneur en composés phénoliques totaux dans les racines tubérisées de carotte en fonction de l’ajout d’un inoculant mycorhizien et de superphosphate triple………...……..77 Tableau 3.7 Teneur en caroténoïdes totaux, en β-carotène et en α-carotène dans les racines tubérisées de carotte en fonction de l’ajout d’inoculant mycorhizien et de superphosphate triple………..……79 Tableau 3.8 Capacités antioxydantes hydrophiles (Orac-H), lipophiles (Orac-L) et totaux (Orac-T) des extraits de racines tubérisées de carotte en fonction de l’ajout d’inoculant mycorhizien et de superphosphate triple……….………81
xv « La joie de contempler et de comprendre, voilà le langage que me porte la nature. »
xvii Remerciements
Tout d’abord, je voudrais remercier mes directeurs de recherche, M. Jacques-André Rioux et M. Martin Trépanier, pour la confiance qu’ils m’ont témoignée en acceptant ma participation à ce projet de recherche. Je tiens à les remercier sincèrement pour l’ensemble des connaissances scientifiques qu’ils m’ont transmises et pour leurs dévoués enseignements.
Je ne peux oublier de remercier Éric Dugal, Marie-Pierre Lamy et Antoine St-Pierre, vous m’avez beaucoup aidé et supporté durant ces années d’études. Je considère avoir fait partie d’une équipe très solidaire envers ses membres.
Merci à Pascal Dubé et à Jean Martin, vous m’avez rendu de grands services pour les différentes analyses nécessaires à l’accomplissement de ce travail de recherche.
À vous, mes parents, vous êtes sans doute les auteurs les plus importants de cette réussite. Sans votre infaillible amour et votre éducation impeccable, je n’en serais certainement pas où j’en suis présentement. Vous êtes et avez été la clé de mes succès. Philippe, mon frère, tu seras toujours mon modèle sur qui je peux compter et me fier par tes conseils réfléchis. Ma chère Cathia, nous avons passé ensemble cette étape de notre vie commune. Certains moments ont été ardus lors de cette merveilleuse aventure, mais ta compassion et ton amour m’ont permis de traverser toutes ces épreuves la tête haute.
Merci Sylvie d’avoir mis ta délicate touche pour la correction de ce mémoire. Gilles et Lucie, merci de m’avoir hébergé au « petit chalet » du lac Trois-Saumons. C’est un endroit paradisiaque pour la rédaction.
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Finalement, merci à tous mes amis. Les relations et les aventures que nous avons vécues ensemble ont forgé ma personne et mon caractère. Vous avez toujours été là pour moi lors des moments difficiles, mais aussi lors des plus heureux.
1 Introduction général
Les champignons mycorhiziens à arbuscules représentent un groupe particulier de microorganismes présents dans les sols. Les premières espèces de champignons mycorhiziens à arbuscules seraient apparues il y a entre 460 à 350 millions d’années et auraient jouées un rôle crucial lors de l’établissement des premières populations de plantes terrestres vasculaires. Les 300 espèces de champignons mycorhiziens à arbuscules répertoriées à ce jour participent à l’association symbiotique obligatoire la plus commune formée avec environ 300 000 espèces végétales, ce qui représente près de 80 à 90 % des plantes terrestres connues à ce jour. Après près de 100 années d’études sur cette symbiose végétale, plusieurs rôles écologiques leurs ont été attribués. Parmi ceux-ci, les plus déterminants sont leurs effets bénéfiques sur l’écologie des écosystèmes et des agrosystèmes. Les études démontrent qu’un bon nombre de plantes mycorhizées présentent une stimulation de la croissance. La symbiose mycorhizienne permet une assimilation plus efficace de l’eau et des éléments nutritifs, particulièrement le phosphore. Elle diminue les effets néfastes d’un bon nombre d’agents pathogènes affectant les racines. Elle favorise une meilleure absorption de l’eau par temps sec et modifie le métabolisme primaire et secondaire des plantes.
Les études sur la modification du métabolisme des plantes sont encore à l’état de prélude. Bien qu’il y ait de nombreuses observations documentées à ce sujet, il reste encore beaucoup à faire afin de mieux comprendre certains phénomènes : par exemple, l’effet direct de la colonisation des racines opposé à l’effet indirect de la nutrition minérale octroyé par le champignon. De plus, les effets d’une espèce de champignon peuvent être très différents de ceux d’une autre sur une plante mycorhizée. Dans une optique d’agriculture en pleine transformation à la suite d’une demande par le consommateur d’aliments sains et produits de manière durable, l’utilisation des champignons mycorhiziens à arbuscules semble prendre tout son sens.
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Ce document présente une étude des effets du champignon mycorhizien à arbuscules Glomus irregulare sur la croissance, la nutrition minérale et la stimulation de la synthèse de composés à valeur nutraceutique d’une fine herbe, le basilic, et d’un légume racine, la carotte.
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Chapitre 1 : Revue bibliographique sur les champignons mycorhiziens arbusculaires, hypothèses et objectifs de recherche
1.1 La découverte des champignons mycorhiziens arbusculaires
Les recherches sur les associations mycorhiziennes retiennent l’attention depuis plus de 120 ans. C’est en 1885 que A.B. Frank donna le nom « mycorhize » à l’association entre les racines d’un arbre et d’un champignon ectomycorhizien (Frank, 1885). Il émit comme hypothèse que les champignons ectomycorhiziens et les plantes ligneuses étaient intimement liés par une relation mutualiste d’échange de nutriments. À l’origine, Frank postula que le champignon assimilait les éléments minéraux et les nutriments de l’humus du sol et que l’arbre en échange de minéraux nourrissait le champignon. Quelques années plus tard, il fit la distinction entre les champignons ectotrophiques et endotrophiques qu’il n’avait observés à l’époque que chez les éricacées et les orchidées. C’est en 1897 que Janse nomma la vésicule, l’une des structures caractéristiques de certains champignons à arbuscules, et c’est ensuite Gallaud (1905) qui nomma la structure de l’arbuscule, d’où l’appellation de champignon à arbuscules et à vésicules qui demeura longtemps. C’est à ce moment que plusieurs chercheurs se mirent à décrire et à tenter de classifier les différentes espèces de champignons mycorhiziens à arbuscules.
Préalablement, Link (1809) regroupa les champignons phycomycètes endomycorhiziens sous le genre Endogone. Par la suite, les frères Tulasne (Tulasne et Tulasne, 1844) ont été les premiers à décrire le genre Glomus, représentant l’ensemble des espèces à sporulation se produisant dans les sols, mais sans établir de relation avec les symbioses mycorhiziennes. Ils reconnaissaient cependant la proximité du genre Glomus avec le genre Endogone. Fries (1849) introduisait le terme Endogonacées et plaçait cette famille dans l’ordre des Tuberales. Les Endogonacées seront par la suite déplacées dans les
5 Mucorales par Bucholtz (1912). Dangeard (1896) fut le premier à décrire un champignon mycorhizien à arbuscules isolé des racines d’un peuplier (Dangeard, 1900). Il croyait alors que ce type de champignon était pathogène et lui donna le nom Rhizophagus populinus. En 1922, Thaxler révisa les Endogonacées et replaça le genre Glomus des frères Tulasne dans les Endogone (Thaxter, 1922). Butler (1939) revérifia l’identité des champignons mycorhiziens à arbuscules et les classifia comme des membres imparfaits des Endogonacées.
Face à ces nombreux événements contradictoires, les phytopathologistes Nicholson et Gerdemann (1968) décidèrent de dresser un système de classification classique à nom latin. Parallèlement, Mosse et Bowen (1968), pour leur part, décidèrent de dresser un système plus descriptif basé principalement sur la structure des parois cellulaires des spores, la couleur des spores et leurs contenus cytoplasmiques. Les deux systèmes de classification présentaient en partie des correspondances, notamment parce que les spores des champignons possèdent peu d’éléments permettant leur différenciation. C’est au début des années 1970 qu’il devint évident pour Gerdemann et Trappe (1974) que les
Endogone, contenant à ce moment plusieurs espèces variées, devaient être
révisés plus en profondeur. Il divisa l’ancien genre Endogone en sept nouveaux incluant trois genres non mycorhiziens, Endogone, Modicella, Glaziella, et quatre genres mycorhiziens, Glomus, Sclerocystis, Gigaspora et Acaulospora. L’ensemble de ces genres fut placé dans les Endogonacées, les Endogonales et les Zygomycètes.
En 2001, une réelle révolution dans le monde de la classification des champignons mycorhiziens arbusculaires se produisit. Schüβler et collaborateurs (2001) utilisèrent des données moléculaires pour établir les relations phylogénétiques entre les différents genres et espèces de champignons mycorhiziens à arbuscules. Le groupe des champignons mycorhiziens à arbuscules quitta le phylum des Zygomycètes pour constituer un nouveau phylum propre à ce type de champignon : les Glomeromycètes. Les études phylogénétiques permirent de
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regrouper les différentes espèces de champignons mycorhiziens à arbuscules selon quatre ordres : Paraglomerales, Archeosporales, Diversisporales et
Glomerales. Pendant longtemps, une des espèces modèles, le Glomus intraradices souche DAOM197198 et BEG 195, a porté à tort ce nom d’espèce.
Les analyses génétiques ont permis de relier ses données moléculaires à une espèce nouvellement décrite, le Glomus irregulare (Stockinger et coll., 2009).
1.2 Effets sur la croissance des plantes et mécanisme de transfert carbone/éléments minéraux entre les symbiotes
Durant plusieurs années, les chercheurs ne s’entendaient pas sur l’impact des champignons mycorhiziens à arbuscule sur la croissance des plantes. Plusieurs croyaient que la colonisation du tissu racinaire végétal par les champignons mycorhiziens arbusculaires était d’origine pathogène ou parasitique. Rayner (1927) postula que les champignons ectomycorhiziens devaient être possiblement bénéfiques pour leurs hôtes et que les champignons mycorhiziens arbusculaires l’étaient probablement aussi. L’idée de Rayner fit échos à travers la communauté scientifique et plusieurs travaux de recherches furent effectués pour déterminer le type de relation entre la plante et le champignon. On souleva ainsi l’importance de déterminer le terme le plus approprié pour définir cette relation, soit infection, colonisation ou mycorhization. Le terme colonisation semblerait être jusqu’à aujourd’hui le plus approprié.
Asai (1944) publia un article relatant l’effet de champignons mycorhiziens à arbuscules sur l’amélioration de la croissance des plants poussant dans un sol pasteurisé. Il observa ainsi l’impact de la microflore, en particulier l’impact des champignons mycorhiziens arbusculaires ainsi que celui des rhizobiums sur la croissance des légumineuses. Viennent par la suite de nombreux articles démontrant l’impact positif des mycorhizes à arbuscules sur la croissance de plusieurs plantes : notons le pommier (Mosse, 1957), le tabac (Peuss, 1958), le
7 peuplier (Clark, 1963), le maïs et l’avoine (Meloh, 1963). Cet effet bénéfique sur la croissance serait majoritairement dû à un rapport coût en carbone contre un bénéfice en éléments minéraux favorables pour la plante. Entre 4 et 20 % des photosynthétats sont transférés au champignon, majoritairement sous forme d’hexoses (Koch et Jonhson, 1984; Eissenstat et coll., 1993). Ces sucres, absorbés par les structures intraracinaires du champignon, sont rapidement transformés en tréhalose, en lipide et en glycogène afin d’être exportés vers les hyphes extraracinaires qui eux ne peuvent pas (ou très peu) prélever de carbone organique des sols par les processus saprotrophiques (Shachar-Hill et coll., 1995; Bago et coll., 2002a, 2002b). Ce carbone concédé pour maintenir son symbiote en place est vu comme un investissement plutôt qu’une dépense pour la plante, car la symbiose prédispose celle-ci à une plus grande efficacité dans l’acquisition des nutriments du sol quand les teneurs en sont faibles. Le champignon possède une meilleure capacité à prélever ces minéraux du sol et à les transférer à la plante par les racines. L’hôte végétal peut même parfois en accumuler pour une utilisation subséquente. Cependant, plusieurs chercheurs ont proposé d’éviter une généralisation excessive sur l’effet bénéfique des champignons mycorhiziens à arbuscules sur la croissance des plantes, rappelant qu’il peut y avoir une grande variation sur la nature de l’effet causé par les différentes espèces de champignons (Lohman, 1927; Janos, 1980; Johnson et coll., 1997).
Avant 1959, on ne connaissait pas la cause exacte des effets positifs engendrés par les champignons mycorhiziens à arbuscules sur la croissance des plantes. Baylis (1959) suggérait que l’effet positif sur la croissance est le résultat d’une meilleure assimilation du phosphore par la plante en relation avec les champignons mycorhiziens arbusculaires. Par la suite, plusieurs chercheurs confirmèrent les conclusions de Baylis entre autres Gerdemann (1964) et Holevas (1966). Après une deuxième série d’expériences, Baylis (1970, 1972a, 1972b) formula une nouvelle hypothèse à l’effet que les champignons mycorhiziens ou les poils racinaires devaient être responsables du prélèvement du phosphore dans les sols. Il observa aussi que l’effet sur la croissance était plus marqué dans les sols
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pauvres que dans les sols riches en phosphore. Outre le phosphore, plusieurs autres éléments comme le cuivre, le fer et le zinc sont prélevés du sol par le réseau extraracinaire fongique et transférés sensiblement de la même manière vers la plante (Kilham et Firestone, 1983).
L’ensemble de ces informations permet de conclure que les racines mycorhizées possèdent une plus grande capacité à explorer le sol à la recherche de minéraux et ainsi à les absorber. Le phosphore, souvent peu mobile dans les sols, serait l’élément le plus abondamment transféré vers les racines de la plante. Cette capacité est majoritairement attribuable au réseau fongique extraracinaire et à sa capacité supérieure à sécréter des phosphatases permettant de solubiliser et d’absorber les phosphates par des canaux transporteurs de phosphates propres aux champignons mycorhiziens (Joner et coll., 2000; Koide et Kabir, 2000). De récentes études ont démontré que des bactéries solubilisatrices de phosphore se développant en périphérie des hyphes sont à l’origine de la solubilisation des phosphates. Ces phosphates sont par la suite absorbés par les hyphes et transférés ultimement à l’hôte végétal démontrant ainsi de nouvelles preuves d’une symbiose tripartite (Villegas et Fortin, 2001, 2002).
1.3 Protection accrue contre les stress hydriques et salins et relation hydrique entre les mycorhizes à arbuscules et l’hôte végétal
Plusieurs études ont démontré la diminution du flétrissement des plantes en symbiose avec les champignons mycorhiziens à arbuscules comparativement à des plantes non mycorhizées démontrant ainsi l’impact bénéfique de la mycorhize dans l’approvisionnement en eau de la plante. Les effets du champignon mycorhizien sur le bilan hydrique de la plante seraient à la fois directs et indirects. L’influence des mycorhizes arbusculaires se traduit tout d’abord par une diminution de la résistance du transport de l’eau au niveau des racines. Ce phénomène a été observé chez le soya et serait notablement attribuable à une augmentation de la
9 surface de contact des hyphes extraracinaires et des racines avec les particules du sol (Safir et coll., 1972). Les différentes observations démontrant un effet direct des mycorhizes à arbuscules ont permis de noter un taux de transpiration plus élevé et une résistance stomatale réduite chez les plants mycorhizés en comparaison avec des plants non mycorhizés, et ce, autant durant les états de stress hydrique que durant les périodes de rétablissement. Ceci serait dû en partie à des variations hormonales affectant l’activité stomatale (Allen et coll., 1981). La diminution de la résistance au transport de l’eau au niveau des racines est perdue lorsqu’il y a ajout de nutriments au sol, démontrant ainsi un effet indirect de la mycorhize sur le bilan hydrique de la plante. Ce fait amènerait à la conclusion que dans les sols pauvres en nutriments, l’eau serait mieux absorbée par la plante, car le champignon permet à celle-ci de puiser une plus grande quantité de minéraux (en particulier le phosphore) engendrant ainsi un appel d’eau du sol plus important au niveau des racines (Augé, 2001, 2004). La relation hydrique serait donc attribuable à la relation minérale entre la plante et le champignon, mais aussi à des variations hormonales affectant la physiologie stomatale de la plante. Dernièrement, une aquaporine (GintAQ1) des hyphes extraracinaires du Glomus
irregulare a été caractérisée. Les travaux d’Arocado et collaborateurs (2009) ont
démontré qu’il y avait une expression concertée des gènes responsables de la synthèse des aquaporines au niveau des hyphes et des racines en réponse à un stress salin ou hydrique.
D’autres recherches ont démontré l’impact positif de la symbiose en réponse au stress salin. La majorité des plantes voient leur croissance et leur biomasse diminuer lorsqu’elles sont exposées à de hautes teneurs en sels minéraux comme le chlorure de sodium dans les sols. La raison de cette diminution est l’indisponibilité des minéraux séquestrés en raison de concentrations trop élevées en sels et de l’énergie dépensée pour contrebalancer les effets toxiques des sels en haute concentration. Dans plusieurs cas, la relation symbiotique mycorhizienne s’est avérée bénéfique aux plantes se développant dans ces conditions. Par exemple, Al-Karaki (2000) a observé une augmentation de la masse sèche
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aérienne et racinaire, du nombre et de la grosseur des fruits des plants de tomate inoculés comparativement à ceux qui ne l’étaient pas. Cette protection engendrée par le partenaire fongique est causée par une meilleure assimilation minérale, l’accumulation d’un régulateur osmotique (proline) en plus grande quantité (Jindal et coll., 1993), d’une augmentation du taux de photosynthèse ainsi que d’une utilisation plus efficace de l’eau disponible. La protection contre les stress salins des plantes en association avec les mycorhizes arbusculaires est donc une combinaison d’effets nutritionnels, biochimiques et physiologiques (Evelin et coll., 2009; Porcel et coll., 2012).
1.4 Amélioration de la structure des sols
La structure des sols est un élément fondamental dans le fonctionnement et la fertilité des écosystèmes et particulièrement pour les agroécosystèmes. L’agrégation des particules du sol facilite les différents mouvements de l’eau, des gaz et des nutriments qui sont essentiels pour le bon développement des plantes et des microorganismes dans les sols. Les microorganismes participent activement au processus d’agrégation des particules du sol, favorisant ainsi leur structure. Les travaux de Degens (1997) suggèrent que les hyphes fongiques des champignons, incluant ceux des champignons mycorhiziens à arbuscules, sont le facteur biotique le plus important dans la stabilisation des sols, tout en reconnaissant les impacts positifs des racines des plantes, des bactéries et de la faune du sol. Les champignons mycorhiziens à arbuscules seraient le facteur le plus important pour trois raisons : 1) les hyphes extraracinaires des champignons mycorhiziens à arbuscules sont souvent une composante dominante de la biomasse microbienne des sols; 2) de par leur symbiose avec les plantes, ils ne sont pas limités dans leur approvisionnement en carbone comparativement aux champignons saprophytes qui eux n’ont que le carbone disponible dans les sols pour se développer; 3) et finalement, les champignons mycorhiziens possèdent un temps de résidence plus long dans les sols que les autres types de microorganismes (Jastrow et coll., 1998). Depuis 1996, on sait que la glomaline, une glycoprotéine produite par les
11 mycorhizes à arbuscules, favorise l’agrégation des particules et la rétention en eau dans les sols. Des études démontrent que plus la concentration en glomaline est grande, plus le pourcentage en eau disponible dans les agrégats du sol est élevé (Rillig et coll., 2001).
1.5 Protection accrue contre les différents stress biotiques
Chez la plupart des plantes, la relation plante-pathogène induit une résistance systémique acquise qui se traduit par une expression plus rapide des mécanismes de résistance lors d’une subséquente rencontre avec un grand nombre de pathogènes. Les mécanismes de résistance s’accompagnent par la présence dans la plante de l’acide salicylique et d’un grand nombre de protéines spécifiques qui contribuent à la résistance de la plante (Durrant et Dong, 2004). Lors de l’établissement de la colonisation racinaire, les champignons endomycorhiziens sont perçus par la plante sensiblement de la même manière qu’un pathogène. Les mêmes voies métaboliques caractéristiques de l’induction de la résistance systémique sont déclenchées dans les deux cas. Les enzymes de la phénylalanine ammonia-lyase et de la chalcone isomérase, caractéristiques des mécanismes de résistance des plantes, ont été mesurés à près de 200 % par rapport au traitement témoin lors de la colonisation des racines de la luzerne (Volpin et coll., 1994). De plus, des superoxydes dismutases (Podzo et coll., 2002), des protéines de résistance de type 1 (Cordier et coll., 1998) et de hautes concentrations en composés phénoliques (Ceccarelli et coll., 2010) ont été retrouvés dans les plantes colonisées par les champignons endomycorhiziens.
Les mycorhizes, en plus de déclencher la mise en place des mécanismes de résistance, protègent indirectement les racines de la plante en favorisant le développement de microorganismes antagonistes des pathogènes dans la rhizosphère. Plusieurs cas de réduction du développement d’organismes pathogènes près ou dans la rhizosphère ont été décrits lorsque les plantes sont en association avec les mycorhizes ou en présence de champignons mycorhiziens
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sans même être colonisées. Par exemple, le Glomus irregulare a réduit les dommages causés par le Fusarium oxysporum dianthi selon les études de St-Arnaud et collaborateurs (1997) et le Glomus mosseae a réduit le nombre de foyers d’infection causés par le Phytophtora nicotinae au niveau des racines de tomate (Lioussanne et coll., 2009).
1.6 Impact sur la synthèse des métabolites primaires et secondaires de la plante hôte
1.6.1 Métabolisme primaire des acides aminés
Le métabolisme des acides aminés est affecté suite à l’établissement de la colonisation par les champignons endomycorhiziens. Une étude sur la tomate menée par Salvioli et collaborateurs (2012) a démontré des modifications des teneurs en acides aminés lors de la maturation des fruits de plants de tomate mycorhizés. La glutamine était présente en plus grande quantité lorsque le fruit était vert et la glutamine, la thréonine et la sérine étaient plus abondantes en cours de la maturation (rougissement) du fruit. Ces résultats démontrent ainsi un effet systémique de la mycorhize. Une étude in vitro récente a démontré la capacité des hyphes du champignon mycorhizien à arbuscules à absorber directement les acides aminés du milieu de culture et à les transférer à la racine de la plante (Whiteside et coll., 2012).
1.6.2 Métabolisme des terpénoïdes
Depuis longtemps, les mycorhiziologistes observent que les racines mycorhizées des plantes présentent des colorations jaunes à orangées visibles à l’œil nu. Il a été démontré que le métabolisme des terpénoïdes pouvait être stimulé en réponse à la mycorhization. Deux molécules, la mycoradicine et la bluménine, sont retrouvées dans les racines mycorhizées seulement et sont responsables de cette coloration particulière. Or, ces deux molécules dérivent directement de la voie
13 métabolique des terpènoïdes et sont produites uniquement à la suite de l’établissement de la symbiose mycorhizienne (Strack et Fester, 2006). Ces molécules proviennent du clivage oxydatif des caroténoïdes. Le rôle de ces molécules pour la symbiose demeure incertain, mais elles joueraient probablement divers rôles dans la signalisation entre les partenaires, le contrôle de la colonisation des racines, la protection contre les agents pathogènes du sol et assureraient aussi une protection contre les stress oxydatifs dans les cellules racinaires colonisées (Strack et Fester, 2006; Akiyama, 2007). Les teneurs en caroténoïdes sont aussi susceptibles d’être modifiées suite à l’établissement mycorhizien comme le démontre une expérience sur la tomate où les teneurs en lycopène et en β-carotène dans les fruits ont été augmentées (Ulrichs et coll., 2008). Quelques études récentes ont été effectuées sur des fines herbes. La teneur en huiles essentielles, molécules provenant aussi de la voie des terpénoïdes, a augmenté chez l’aneth, chez le carvi, ainsi que chez la coriande et l’origan (Kapoor et coll., 2002a, 2002b, 2004; Khaosaad et coll., 2006; Morone-Fortunato et Avato, 2008; Chaudhary et coll., 2008) en réponse aux mycorhizes arbusculaires.
1.6.3 Métabolisme des phénylpropanoïdes
La voie métabolique des phénylpropanoïdes est elle aussi affectée par la présence de champignons mycorhiziens dans les racines. La composition en flavonoïdes est fortement affectée lors des différentes étapes de la colonisation mycorhizienne. Les flavonoïdes, composés phénoliques à deux noyaux aromatiques, semblent jouer plusieurs rôles dans l’établissement de la mycorhize. Certains flavonoïdes racinaires comme le coumestrole, l’ononine et le daidzéine ont été caractérisés comme molécules signals servant à favoriser le développement des hyphes et les branchements entre le réseau racinaire et mycélien (Salzer et Boler, 2000; Vierheilig et Piché, 2002). La teneur plus abondante de médicarpine dans les racines a aussi été notée lors du positionnement des appressoriums des mycorhizes à arbuscules sur la racine du Medicago sativa. La médicarpine est
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souvent retrouvée comme phytoalexine dans les racines des plantes parasitées par des pathogènes, démontrant une certaine homologie du signal avec les champignons mycorhiziens à arbuscules (Dixon et coll., 1992). Les flavonoïdes joueraient donc plusieurs rôles durant la colonisation mycorhizienne et la composition en flavonoïdes serait elle aussi dépendante des différentes combinaisons plantes-champignons mycorhiziens (Larose et coll., 2002). De ce fait, une augmentation d’environ 30 % de la concentration des phénols totaux et de la capacité antioxydante des extraits a été observée chez l’artichaut (Ceccarelli et coll., 2010) et une synthèse plus élevée d’anthocyanes a été obtenue chez la fraise (Castellanos-Morales et coll., 2010).
1.6.4 Autres modifications du métabolisme secondaire
On a également observé une augmentation de la concentration de molécules conférant les saveurs piquantes (sulfoxides) chez la ciboule (Allium fistulosum L.) (Guo et coll., 2007). La symbiose mycorhizienne est un phénomène fondamental, mais la plante semble réagir à certains niveaux de la même façon que lorsqu’elle est en présence d’agents pathogènes. Cette réponse aux champignons endomycorhiziens pourrait se manifester par l’activation généralisée des voies du métabolisme secondaire menant à la production d’une panoplie de molécules de défense engendrant ainsi la résistance systémique acquise (Durrant et Dong, 2004). Bien qu’il y ait eu quelques recherches sur le sujet, il reste encore plusieurs questions ouvertes sur la modification du métabolisme des plantes en réponse à la mycorhization ainsi que l’élucidation des différents mécanismes en cause.
1.7 Hypothèses et objectifs de recherche
Au cours des dix dernières années, de plus en plus de gens se sont conscientisés à ce qui se trouve dans leur assiette. L’arrivée des aliments biologiques, ainsi que l’usage critiqué des pesticides et des engrais de synthèse ont poussé les producteurs à revoir leurs pratiques culturales. Plusieurs observations démontrent
15 que l’inoculation par les champignons endomycorhiziens peut à la fois faire augmenter les rendements des cultures et modifier considérablement les métabolismes primaire et secondaire des plantes tout en diminuant raisonnablement l’utilisation des engrais chimiques et des produits phytosanitaires nécessaires à leur production. La possibilité de produire des fruits, des légumes et des fines herbes biofortifiés préalablement inoculés par les champignons endomycorhiziens est aujourd’hui de plus en plus envisageable et souhaitable. Ces évidences ont mené à la naissance de ce projet de recherche et à la formulation des hypothèses et objectifs de recherche qui suivent.
Les hypothèses de travail étaient :
1) La plante mycorhizée présentera une modification de son métabolisme secondaire en réponse à la colonisation de ses racines par le champignon endomycorhizien Glomus irregulare;
2) Une concentration accrue en métabolites secondaires en réponse à la symbiose conférera à la plante un potentiel nutraceutique plus intéressant qu’une plante non mycorhizée;
3) Les effets sur les modifications du métabolisme secondaire ne sont pas l’effet indirect d’une meilleure assimilation minérale, mais l’effet direct de la colonisation mycorhizienne des racines.
Les plantes choisies ont été une fine herbe, le basilic doux (Ocimum basilicum L.) et un légume racinaire, la carotte (Daucus carota L.). Ces plantes sont couramment utilisées dans l’alimentation humaine et produites en grande quantité par les producteurs horticoles et maraîchers québécois. L’inoculum utilisé a été le Myke® Pro PS3 (Glomus irregulare) produit par la compagnie Premier Tech Biotechnologies (Rivière-du-Loup, Québec).
L’inoculation des plants a permis de vérifier les objectifs spécifiques de la présente recherche. Ces objectifs étaient de :
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1) Déterminer si une plante colonisée par les champignons endomycorhiziens présente une synthèse accrue de métabolites secondaires;
2) Déterminer si les modifications biochimiques de la plante mycorhizée confèrent à celle-ci un potentiel nutraceutique plus intéressant qu’une plante non mycorhizée;
3) Déterminer les voies du métabolisme secondaire qui peuvent être stimulées par les champignons endomycorhiziens;
4) Déterminer si les modifications du métabolisme secondaire de la plante sont systémiques ou localisées;
5) Déterminer de quelle nature sont les effets du champignon sur les teneurs en composés du métabolisme secondaire des plantes à l’étude. Est-ce l’effet indirect de la fertilisation minérale, l’effet du champignon sur l’assimilation minérale ou l’effet direct de la colonisation des racines par le champignon?
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Chapitre 2 : Influence du champignon mycorhizien arbusculaire Glomus irregulare sur la croissance, la nutrition minérale et la production de composés nutraceutiques chez le basilic (Ocimum basilicum L.)
Résumé
Deux expériences ont été menées sur le basilic visant à déterminer si les mycorhizes à arbuscules pouvaient favoriser la croissance, la nutrition minérale et augmenter les teneurs des composés nutraceutiques dans les feuilles de cette espèce. La première expérience a permis de mettre en évidence l’importance de l’association mycorhizienne lorsque la fertilisation azotée est faible (fertigation bihebdomadaire de 50 à 150 mg/l en azote). Une augmentation de la teneur en caroténoïdes dans les feuilles de basilic a été observée chez les plants mycorhizés. La mycorhize a aussi permis l’augmentation de la teneur de certains éléments minéraux dans les feuilles comme le phosphore, le potassium et le zinc, mais en a fait diminuer d’autres comme le calcium et le magnésium. L’ajout de superphosphate triple dans le substrat a généré une stimulation de la croissance des plants et une augmentation des teneurs en phosphore, en magnésium et en manganèse dans les feuilles. La présence de superphosphate triple a entraîné la diminution du taux de colonisation des racines par le champignon et de la teneur en zinc dans les feuilles du basilic. L’amendement en phosphore a fait significativement augmenter la teneur en composés phénoliques et la capacité antioxydante de l’extrait liposoluble des feuilles du basilic.
2.1 Introduction
La symbiose entre les plantes supérieures et les champignons mycorhiziens est dans la plupart des cas favorable à la croissance des plantes, surtout lorsque ces dernières sont exposées à des conditions difficiles comme un stress hydrique, une teneur en éléments minéraux plus faible dans la solution du sol ou en présence de
19 certains pathogènes. Une série d’expériences menées récemment par plusieurs chercheurs démontrent que cette symbiose peut également avoir un effet favorable sur la synthèse de plusieurs métabolites secondaires. Certains de ces métabolites présentent des propriétés alimentaires, nutraceutiques, aromatiques, cosmétiques et même pharmaceutiques. Le basilic possède plusieurs propriétés phytochimiques intéressantes pour l’alimentation humaine. Elles lui sont attribuables à un large éventail de composés phénoliques prédominants comprenant l’acide rosmarinique, l’acide caféique et l’eugénol, ainsi que des flavonoïdes comme le kaempférol, la lutéoline et la catéchine (Grayer et coll. 1996, 2002; Simon et coll., 1999; Lewinsohn et coll., 2000; Gang et coll., 2001; Jayasinghe et coll., 2003; Kivilompolo et Hyötyläinen, 2007). Sa saveur et ses arômes proviennent aussi de la qualité de son huile essentielle présente dans les glandes foliaires. Cette huile est composée majoritairement de linalool, d’eugénol, d’α-bergamotène et de 1,8-cinéol (Tada et coll., 1996; Ismail, 2006; Copetta et coll., 2006, 2007; Chalchat et Özcan, 2008; Carovic-Stanko et coll., 2009). Sa valeur en vitamine A est majoritairement attribuable à sa composition en caroténoïdes dont les plus importants sont la lutéine et le β-carotène (Kopsell et coll., 2005; Daly et coll., 2010). L’ensemble de ces composés lui confère donc de bonnes propriétés antioxydantes (Kim et coll., 2005; Gülçin et coll., 2007; Hakkim et coll. 2007; Politeo et coll., 2007).
Jusqu’à maintenant, les résultats rapportés sur le basilic dans la littérature concernent la combinaison du Glomus mossae et du Glomus caledonium ainsi que celle du Glomus irregulare sur le basilic. Les résultats restent contradictoires en certains points. Plusieurs études ont été réalisées sur la modification des teneurs en huiles essentielles des plants, mais peu de données ont été répertoriées par rapport à la teneur en composés phénoliques totaux, la capacité antioxydante des composés hydrosolubles et liposolubles, ainsi que la teneur en caroténoïdes dans les feuilles des plants colonisés par le Glomus irregulare. Les objectifs de la présente étude étaient de vérifier les effets du Glomus irregulare sur la croissance, la nutrition minérale et la synthèse de composés nutraceutiques du basilic cultivé
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en serre dans un terreau organique. Ces effets ont été déterminés par les mesures du taux de colonisation des racines, des rendements en matière fraîche de la partie aérienne du plant, de ses teneurs en éléments minéraux, en composés phénoliques totaux, en caroténoïdes, ainsi que sa capacité antioxydante.
2.2 Matériel et méthodes
2.2.1 Biologie du basilic et champignon mycorhizien utilisé
Le basilic doux (Ocimum) appartient à la famille des Lamiacées, anciennement appelées Labiées. Cette plante peut atteindre près de 75 cm de hauteur et est caractérisée par ses arômes et par sa floraison estivale (fleurs blanches ou violettes). On cultive différentes espèces un peu partout dans le monde, mais le basilic doux est le plus important commercialement. Les conditions de culture appropriées en température sont un minimum de 12 à 15 °C, la plage optimale étant entre 20 à 25 °C. Cette plante préférant être exposée en plein soleil demande un arrosage régulier et résiste mal aux périodes de sécheresse et de froid. Un sol bien aéré facilitera sa croissance. En plus, il faut que les apports d’azote soient fréquents. Originaire de la région de Gènes, la variété ‘Genovese’ a conquis le monde entier et est à l’origine d’une impressionnante lignée de variétés nouvelles. Sa popularité vient de sa haute teneur en huiles essentielles qui est convoitée par les domaines cosmétiques, pharmaceutiques et alimentaires (Bauwens, 2008).
Les graines de basilic (Ocimum basilicum L.) du cultivar ‘Sweet, Large Genovese Green’ vendues par la compagnie Norseco inc. (Laval, Qc) ont été utilisées. Ce cultivar a été sélectionné pour ses qualités gustatives. L’inoculant Mike® PRO PS3 (800 propagules du Glomus irregulare par gramme d’inoculant) produit par la compagnie Premier Tech Biotechnologies a été utilisé.
21 2.2.2 Localisation, conditions de culture et dispositifs expérimentaux
Deux expériences ont été menées dans les serres à haute performance de l’Université Laval (Québec). Les graines de basilic ont été semées dans le substrat à semis Pro-Mix PGX® (Premier Tech Horticulture, Rivière-du-Loup, Qc) dans des plateaux multicellulaires (P-200).
Un dispositif factoriel en blocs complets aléatoires a été adopté. Le premier facteur était composé de trois niveaux d’inoculant mycorhizien : soit sans inoculant (NM), avec une dose d’inoculant (M1X) et avec la double dose (M2X). Le deuxième facteur était composé de deux niveaux de phosphore, soit avec ajout de superphosphate triple (P+) ou sans ajout de superphosphate triple (P-). Le dispositif était donc composé de 6 traitements :
1) P-NM : Sans ajout d’inoculant mycorhizien et sans ajout de superphosphate triple;
2) P+NM : Sans ajout d’inoculant mycorhizien mais avec ajout de superphosphate triple;
3) P-M1X : Avec ajout de la simple dose d’inoculant mycorhizien et sans ajout de superphosphate triple;
4) P+M1X : Avec ajout de la simple dose d’inoculant mycorhizien et avec ajout de superphosphate triple;
5) P-M2X : Avec ajout de la double dose d’inoculant mycorhizien et sans ajout de superphosphate triple;
6) P+M2X : Avec ajout de la double dose d’inoculant mycorhizien et avec ajout de superphosphate triple.
Les traitements ont été préparés selon la méthodologie suivante. Lors du semis, 0,2 g/cellule (environ 160 propagules) d’inoculant mycorhizien ont été ajouté au substrat pour les traitements P-M1X et P+M1X et 0,4 g/cellule (environ 320 propagules) d’inoculant mycorhizien pour les traitements P-M2X et P+M2X. Les
22
traitements P-NM et P+NM ont reçu une dose de 0,4 g/cellule d’inoculant stérilisé afin de rendre la composition du substrat semblable à celui des autres traitements. Les plateaux de semis ont été placés selon un dispositif expérimental composé de 6 répétitions comprenant chacune 6 graines par traitement afin d’obtenir le nombre de plants nécessaires pour l’empotage et la mise en place définitive du dispositif.
Trois semaines après le semis, les plants de basilic ont été repiqués dans des pots azalés Kord® de 15 cm de diamètre (V = 1,5 L) remplis du substrat tourbeux commercial Agro Mix® (Fafard et Frères ltée, Saint-Bonaventure, Qc). Ce substrat a été préalablement pasteurisé à la vapeur pendant 2 heures afin d’éliminer tout agent contaminant. Les traitements P+NM, P+M1X et P+M2X ont reçu un supplément de 0,2 g/pot de superphosphate triple (0-46-0) mélangé au substrat. Afin d’assurer une bonne homogénéité, le superphosphate triple granulaire avait été réduit auparavant en poudre à l’aide d’un moulin à café. Au moment de l’empotage, les plants des traitements P+NM et P-NM ont reçu une nouvelle dose de 0,2 g d’inoculant mycorhizien stérilisé et ceux des traitements P-M1X, P-M2X, P+M1X et P+M2X, une nouvelle dose de 0,2 g d’inoculant viable. L’expérience a été répétée deux fois. Les dispositifs comportaient six répétitions et chacun des six traitements était constitué de deux plants pour un total de 72 plants pour chacune des deux expériences.
La serre a été maintenue à une température de 22 °C le jour et de 17 °C la nuit sous une photopériode de 14 heures. La première expérience s’est déroulée du 2 mai au 3 août 2010 pour une période de 85 jours de croissance. Une fertilisation bihebdomadaire a été appliquée à l’ensemble du dispositif. La solution fertilisante a été produite à partir d’un engrais hydrosoluble (20-2-20) de la compagnie PlantProducts®. Les plants ont reçu une dose croissante de fertilisant allant de 50 à 150 mg/l en azote selon le stade de développement des plants, soit 50 mg/l d’azote à raison de 100 ml par pot du 17 mai au 16 juin, 100 mg/l d’azote à raison de 100 ml par pot du 16 juin au 19 juillet et 150 mg/l d’azote à raison de 100 ml par pot du 19 juillet au 3 août. La deuxième expérience s’est déroulée du 23 juillet
23 2010 au 27 octobre 2010 pour un total de 92 jours de croissance (12 semaines), et ce, dans des conditions similaires de croissance. Pour cette expérience, les plants ont reçu une fertilisation bihebdomadaire apportant 150 mg/l en azote à raison de 100 ml par pot pendant toute la période de croissance.
2.2.3 Échantillonnage et paramètres mesurés
Un échantillon de substrat a été recueilli au moment de l’empotage des plants de chacune des expériences afin d’en connaître le contenu en éléments minéraux. À la fin de chacune des expériences, les 72 plants de basilic ont été récoltés séparément. La masse fraîche des parties aériennes des plants a été mesurée afin d’établir les rendements. Un échantillon des racines a été prélevé pour déterminer le taux de colonisation mycorhizienne. La teneur des divers composés du métabolisme secondaire a été déterminée sur l’un des deux plants que comprenait chacun des traitements. Les feuilles de la partie supérieure, possédant sensiblement les mêmes dimensions et ne présentant pas de symptômes de maladie ou de carence, ont été prélevées, mises dans une enveloppe de papier et immédiatement congelées. Une fois la congélation réalisée, elles ont été séchées à froid au lyophilisateur minimisant ainsi au maximum la dégradation des molécules d’intérêt nutraceutique. Les feuilles séchées ont ensuite été broyées au mortier. La poudre obtenue a été utilisée afin de déterminer la teneur en minéraux, le contenu en composés phénoliques totaux, le contenu en caroténoïdes totaux, la capacité antioxydante des fractions d’extractions polaires et apolaires et la composition moléculaire en caroténoïdes dans les feuilles. Les détails de ces analyses sont présentés ci-après.
24
2.2.4 Coloration des racines et détermination du pourcentage de colonisation mycorhizienne
Les racines ont été lavées à l’eau courante et placées dans des tubes Sarstedt® de 15 ml percés de multiples trous. Les tubes sont introduits dans des supports à tube pour faciliter les manipulations.
Les échantillons de racines sont soumis à une hydrolyse alcaline au KOH 10 % dans un autoclave à une température de 121 °C durant 45 minutes. Les tubes et leurs contenus sont ensuite rincés abondamment à l’eau froide et plongés dans un bain d’HCl 1 % à température de la pièce pendant 15 minutes. Les tubes sont rincés rapidement à l’eau chaude et immergés dans la solution colorante à base de bleu de trypan (0,05 %) à 50 °C pour une durée de 10 à 12 minutes. Enfin, les racines sont rincées à l’eau froide et le contenu des tubes est transféré dans des plats de Petri. L’ajout de glycérol 20 % aide à la conservation des racines.
Le taux de colonisation est déterminé selon une adaptation de la méthode d’intersection de Giovannetti et Mosse (1980). Cette méthode consiste à étaler les racines colorées dans un plat de Petri et à les observer sous loupe binoculaire afin d’en déterminer le taux de colonisation. Des lignes parallèles distancées d’environ 1 cm sont préalablement tracées sur le couvercle du Petri. Le couvercle est emboîté sous le plat de Petri afin que les racines croisent les lignes du couvercle. À chaque intersection rencontrée, l’observateur détermine la présence ou non d’hyphes, de vésicules ou d’arbuscules. Une fois le décompte fait sur l’ensemble des lignes, le taux de colonisation est déterminé en divisant les comptes « positifs » sur l’ensemble des comptes « positifs + négatifs » afin de déterminer le pourcentage. Un minimum de 100 observations doit être effectué afin que la valeur soit considérée comme représentative.
25 2.2.5 Détermination du contenu en éléments minéraux du substrat
La détermination du contenu en minéraux des substrats a été réalisée selon la méthode d’extraction des substrats saturés (SSE). Des échantillons de substrat de tous les traitements ont été prélevés avant et après l’expérimentation dans 3 des 6 répétitions du dispositif. Ils ont été mis dans des plats de plastique et saturés en eau distillée permettant la libération en solution des éléments minéraux présents dans le terreau. Après deux heures d’attente, l’eau des terreaux est prélevée par filtration sous vide. Une quantité de 14 ml d’eau a été recueillie, filtrée, centrifugée et transférée dans un tube de plastique de 15 ml. Ces tubes munis d’un bouchon peuvent être entreposés au réfrigérateur jusqu’à l’analyse des solutions.
La teneur en azote des échantillons de substrat a été déterminée par colorimétrie au spectrophotomètre (Nkonge et Ballance, 1982), de même que celle du phosphore (Murphy et Riley, 1962). Les teneurs en potassium, en calcium, en magnésium et en oligominéraux (Fe, Mn, Cu) ont été déterminées par absorption atomique. Celle du zinc a été déterminée par émission atomique. Ces teneurs apparaissent au tableau 2.1.
Tableau 2.1 Propriétés chimiques du terreau Agro Mix® avec ou sans ajout de superphosphate triple au moment de l’empotage des essais sur le basilic.
Conduct.
électrique pH NH4+ NO3- PO4- K Ca Mg Fe Cu Mn Zn (CE) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg)
P- 0,97 5,52 2 2 4 75 125 18 2 0,1 0,6 0,7
P+ 1,06 5,44 1 2 37 78 140 20 2 0,1 0,7 0,8
*P- représente le terreau utilisé pour les traitements sans ajout de superphosphate triple et P+ pour les traitements avec ajout de superphosphate triple
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2.2.6 Détermination de la teneur en éléments minéraux dans les feuilles de basilic
La teneur en azote dans les échantillons de basilic a été obtenue par colorimétrie à la suite de leur digestion (Isaac et Johson, 1976; Nkonge et balance, 1982). Les analyses du phosphore, du potassium et des autres éléments (Ca, Mg, Fe, Mn, Cu, Zn) ont été faites après la calcination des tissus végétaux. La teneur en phosphore a été quantifiée par colorimétrie au spectrophotomètre (Murphy et Riley, 1962), celle du potassium et des autres éléments (Ca, Mg, Fe, Mn, Cu, Zn) par absorption atomique et émission atomique.
2.2.7 Détermination de la teneur en composés phénoliques totaux dans les poudres sèches des feuilles de basilic
L’analyse du contenu en composés phénoliques totaux a été réalisée selon une adaptation de la méthode de Singleton et Rossi (1965). Une quantité de 0,25 ± 0,05 g de poudre lyophilisée est placée dans un tube à centrifuger (Sarstedt®) de 15 ml et 10 ml d’une solution de méthanol aqueux 80 % a été ajoutée. Le tube est par la suite placé au bain ultrasonique (Model 75D VWR) pour une durée de 15 minutes à 25 °C. Durant ces 15 minutes, le tube est brassé au vortex à deux reprises pendant 30 secondes. Après la sonification, le tube est centrifugé et le surnageant est transféré dans un tube à centrifuger (Sarstedt®) de 50 ml. L’extraction est réalisée à nouveau à deux reprises avec la même quantité de solvant sur le culot. Les 30 ml de surnageant combiné sont par la suite transférés dans un ballon et le solvant est évaporé à l’évaporateur rotatif à une température de 35 °C (Rotovapor R-200, Heating bath B-490, Büchi). Lorsque le volume dans le ballon atteint environ 3 ml, l’extrait est récupéré dans un cylindre gradué et complété à l’aide d’eau bidistillée à un volume total de 50 ml.
27 Par la suite, une aliquote de 100 µl d’échantillon est placée dans une cuvette en plastique servant à la spectrophotométrie. À cette même cuvette, on ajoute 2 ml d’eau bidistillée et 200 µl de la solution réactive Folin-Ciocalteu’s. La cuvette est agitée durant 2 minutes avant d’ajouter 900 µl d’une solution de carbonate de sodium (Na2CO3 – 200 g/L). Un temps d’incubation de deux heures est nécessaire
avant la prise de l’absorbance au spectrophotomètre (modèle 8453 HP) à une longueur d’onde de 765 nm. Préalablement, des standards de 50, 100, 250 et 500 mg/l d’acide gallique ont été préparés et ont servi de valeurs de référence pour tracer une courbe standard. Les valeurs du contenu en composés phénoliques totaux sont ainsi quantifiées en mg/100 g de matière fraîche d’équivalent acide gallique.
2.2.8 Extraction et détermination des teneurs en caroténoïdes
2.2.8.1 Extraction et détermination des teneurs en caroténoïdes totaux
La méthode utilisée est une adaptation de trois méthodes similaires (Biehler et coll., 2010). L’ensemble des manipulations doit se faire le plus possible à l’abri de la lumière et les échantillons doivent être conservés sur la glace. Une quantité de 0,080 ± 0,005 g de poudre lyophilisée de feuilles de basilic a été placée dans un tube (Sarstedt®) de 15 ml. À ce même tube, 4 ml de méthanol et 1 ml de KOH:méthanol (30 % w/v) sont ajoutés afin d’éliminer la chlorophylle par saponification. Le tube est brassé au vortex pendant 30 secondes et incubé 15 minutes sur la glace.
Après la saponisation, le tube est centrifugé à 3500 rpm pendant 7 minutes et le surnageant est transféré dans un tube à centrifuger (Sarsted®) de 50 ml. Au tube
