Développement d’approches innovantes pour la production d’anticorps monoclonaux humains : application au modèle de la dengue

Texte intégral

(1)Développement d’approches innovantes pour la production d’anticorps monoclonaux humains : application au modèle de la dengue Caroline Majenski. To cite this version: Caroline Majenski. Développement d’approches innovantes pour la production d’anticorps monoclonaux humains : application au modèle de la dengue. Biotechnologies. 2011. �dumas-01081521�. HAL Id: dumas-01081521 https://dumas.ccsd.cnrs.fr/dumas-01081521 Submitted on 8 Nov 2014. HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of scientific research documents, whether they are published or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers.. L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés.. Distributed under a Creative Commons Attribution - NonCommercial - NoDerivatives| 4.0 International License.

(2) Remerciements . Je remercie tous les membres du jury d’avoir accepté d’évaluer mon travail et d’être présents pour la soutenance de mon mémoire de fin d’études.. Je remercie Vincent Lotteau de m’avoir permis de réaliser ce travail pour le projet Hu’s MAP, au sein de son équipe qui est intégrée dans l’unité INSERM 851 intitulée « Immunité, Infection et Vaccination ». Je remercie tout le personnel du plateau de cytométrie de flux notamment Sébastien Dussurgey, ainsi qu’Olga Azocar pour son aide au microscope confocal, et Monique Flacher pour ses précieux conseils en culture cellulaire. Je pense également à Philippe Marianneau pour ses recommandations en matière de culture de dengue. Je remercie les deux chercheurs qui ont collaboré avec moi sur ce projet : tout d’abord Philippe Mangeot. qui. m’a. conseillé. dans. l’utilisation. de. la. technologie. qu’il. a. breveté,. et. tout. particulièrement Henri Gruffat pour la préparation du virus d’Epstein-Barr mais surtout pour son soutien tout au long de ce projet. Un grand merci au Dr Sylvie Bruneau travaillant à l’EFS de Fort-de-France et au Pr Raymond Césaire coordinateur adjoint du CIC des Antilles pour leur collaboration dans la sélection des patients et pour m’avoir aussi bien accueillie dans leurs laboratoires. Je pense aussi à toutes les personnes que j’ai côtoyées durant ma mission en Martinique, dont Jimmy Néret, pour leur gentillesse. Je remercie également Benoît De Chassey, Philippe Mangeot et Henri Gruffat, pour leurs corrections et conseils dans l’écriture de ce mémoire.. 1.

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(4) Je remercie toutes les personnes côtoyées au Centre d’Etudes et de Recherche en Virologie et Immunologie,. au. Centre. d’infectiologie,. ainsi qu’à. l’Ecole. Normale Supérieure qui m’ont. encouragée et aidée scientifiquement tout au long de cette étude. Je pense spécialement aux personnes du cinquième étage de la tour CERVI et notamment l’équipe de Chantal Rabourdin Combe et Mathias Faure, sans oublier le personnel du secrétariat bien sûr indispensable : Céline Messa, Anaïs Jacquin, Véronique Pelamatti, Christèle Marchand et Alexandra Fargeot.. Ce travail m’aura apporté de nouvelles compétences mais également de belles rencontres avec lesquelles j’ai partagé de très bons moments durant ces dernières années. Je pense notamment à Johann Pellet, Aurélie Guironnet Paquet, Thibault Chantier, Lionel Tafforeau, Marc Le Breton, Alexandre Deloire, Clémence Richetta, Claire Ciancia, Stéphane Joly, Pauline Radraud,. Philippe. Mangeot,. Caroline. Scholtes,. Emilie. Debien,. Erwan. Ventre,. Julien. Mafille, Agnès Doreau Bastide, Marine Hillaire, Caroline Rosset, Pauline Meneraud, Sandra Dollet et Guillemette Pontini.. Je remercie également tous les membres du CNAM qui m’ont apporté de nouvelles connaissances, et tout particulièrement Eléonore Gondeau pour sa gentillesse et son soutien.. Enfin je tiens sincèrement à remercier mes amis et surtout mes parents et ma sœur pour leur présence et leur soutien inconditionnel durant ce travail.. 3.

(5) 4.

(6) Caroline MAJENSKI ;$'$

(7) *! /?B99@ ,,"! 0D<<?@@B9B>??$%%%%$0 %8*!!1$. Expérience professionnelle p p e 2008 En cours. 2007 3 mois. INSERM Unité 851, CDD d'Ingénieur d'Etudes pour le projet "Hu's MAP". Responsable de la partie INSERM du projet ayant pour but la production d’anticorps monoclonaux humains à partir de lymphocytes B mémoires immunisés in vivo, puis immortalisés par des technologies innovantes. Application au virus de la dengue. Culture cellulaire : lymphocytes B, lignées et clonage ; Culture de virus en L3 : virus de la dengue et Immunologie : cytométrie de flux, ELISA, Western Blot, immuno-fluorescence et microscopie à fluorescence. Ecole Normale Supérieure, CDD d'Ingénieur d'Etudes pour le projet "Traces, Eléments et Santé".. 2004/ 2006 Centre Hospitalier Lyon Sud, CDD de Technicienne en cytogénétique et biologie 2 ans 9 mois moléculaire pour le projet STIC sur la Leucémie Lymphoïde Chronique. Culture cellulaire, congélation de cellules et tissus, manipulation azote ; Techniques de cytogénétique conventionnelle et d’hybridation in situ ; Caryotypes des pathologies hématologiques lymphoïdes et myéloïdes ; Cytométrie de flux et Participation à des projets de recherche. 2003 1 mois 1/2. 2003 6 mois. Hospices Civils de Lyon (Croix Rousse et Neuro), CDD de Technicienne en Anatomie Pathologie, puis Neurobiotech (banque de cellules et tissus). Groupe Immunité des Muqueuses et Agents Pathogènes, stagiaire (licence pro) en tant que Technicienne de recherche. Thème d'étude : "Synthèse de cytokines et régulation de la production de substance P par les cellules dendritiques/cellules de Langerhans humaines dans l'infection par le VIH." Culture cellulaire ; Biologie moléculaire : extraction d'ADN et ARN, RT-PCR, PCR et Immunologie : cytométrie de flux, ELISA.. 2002. MDS pharma service, CDD de Technicienne en Pathologie technique.. 2 mois. Formation 2011 2007 2003 2002 2000. Diplôme d’ingénieur en Génie Biologique (spécialité Sciences et techniques du vivant) avec mention Très Bien, EICNAM (Ecole d’Ingénieur du Conservatoire National des Arts et Métiers) Lyon. CPN35 : Responsable de production industrielle en Génie biologique niveau II avec mention Bien, CNAM Lyon. BIOTECH "Spécialisation en Biotechnologies" (idem licence professionnelle) avec mention Bien, Faculté des Sciences de l’Université Catholique de Lyon. BTSA ANABIOTEC (Analyses Biologiques et Biotechnologiques) avec mention Assez Bien, Lycée agroalimentaire de Saint-Genis-Laval (département 69). Baccalauréat STL (Sciences et Techniques de Laboratoire) série Biochimie Génie Biologique avec mention Assez Bien, Lycée agroalimentaire de Saint-Genis-Laval.. Informatique : Word, Excel, PowerPoint, Internet, ImageJ, logiciel de cytométrie : Diva. Langues : anglais (TOEIC niveau III), italien.. Centres d’intérêts S t pratiqués Sports ti é : danse, d plongée l é sous-marine, i randonnées. d é Loisirs : musique, cinéma, sorties, lecture, nature.. 5.

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(9) Table des matières REMERCIEMENTS. 1 . LISTE DES ABREVIATIONS. 9 . TABLE DES ILLUSTRATIONS. 11 . INTRODUCTION GENERALE. 17 . 1. INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE. 25 . 1.1. LYMPHOCYTES B 1.1.1. ORIGINE DES CELLULES 1.1.2. DIFFERENCIATION DES LYMPHOCYTES B ET MEMOIRE IMMUNITAIRE 1.1.3. LYMPHOCYTES B ET IMMUNOGLOBULINES 1.2. PRODUCTION D’ANTICORPS MONOCLONAUX HUMAINS 1.2.1. ORIGINE DES ANTICORPS MONOCLONAUX 1.2.2. ANTICORPS MONOCLONAUX CHIMERIQUES ET HUMANISES 1.2.3. ANTICORPS MONOCLONAUX HUMAINS 1.2.4. NOMENCLATURE 1.3. IMMUNOTHERAPIE 1.3.1. HISTORIQUE 1.3.2. PRINCIPE 1.3.3. APPLICATIONS DES ANTICORPS MONOCLONAUX EN IMMUNOTHERAPIE 1.4. VIRUS DE LA DENGUE 1.4.1. CARTE D’IDENTITE 1.4.2. EPIDEMIOLOGIE 1.4.3. MANIFESTATIONS CLINIQUES 1.4.4. VACCINS ET TRAITEMENTS CONTRE LA DENGUE EN COURS DE DEVELOPPEMENT. 25 25 27 29 43 43 45 47 59 61 61 61 65 73 73 77 81 86 . 2. MATERIEL ET METHODES. 100 . 2.1. MATERIEL BIOLOGIQUE 2.1.1. CELLULES PRIMAIRES : LYMPHOCYTES B 2.1.2. LIGNEES CELLULAIRES 2.1.3. ADN PLASMIDIQUES 2.1.4. BACTERIES 2.1.5. VIRUS 2.2. METHODES 2.2.1. PRODUCTION DE GESICULES 2.2.2. PRODUCTION D’ACM HUMAINS 2.2.3. AMPLIFICATION ET TITRAGE DES QUATRE SEROTYPES DE DENV 2.2.4. MARQUAGE DES CELLULES POUR LA CYTOMETRIE DE FLUX 2.2.5. MISE AU POINT D’UN ELISA SANDWICH IGG HUMAINES. 100 100 104 106 108 108 110 110 116 126 130 132 . 3. RESULTATS. 144 . 3.1. OPTIMISATION DE LA TECHNIQUE DE PRODUCTION D ‘ACM HUMAINS 3.1.1. AMELIORATION DE LA PURIFICATION DES LB HUMAINS 3.1.2. OPTIMISATION DE L’EFFICACITE DE L’IMMORTALISATION DES LB PAR EBV 3.2. INNOVATIONS TECHNOLOGIQUES POUR LA PRODUCTION D’ACM HUMAINS 3.2.1. TECHNOLOGIE DE TRANSFERT PROTEIQUE APPLIQUEE AUX LB 3.2.2. ESSAI D’ETABLISSEMENT D’UNE LIGNEE CELLULAIRE B STABLE SANS EBV 3.2.3. ESSAI DE TRANSACTIVATION D’EBV DANS DES LB AVEC LE TRANSFERT DE EBNA2. 144 144 146 156 156 158 164 . 7.

(10) 3.3. APPLICATION DE LA TECHNIQUE DE PRODUCTION D’ACM AU VIRUS DE LA DENGUE 3.3.1. REPONSE SEROLOGIQUE VIS-A-VIS DE DU DENV 3.3.2. ISOLATION D’ACM HUMAINS ANTI-DENV. 170 170 172 . 4. DISCUSSION. 176 . 4.1. OPTIMISATION DE LA TECHNIQUE DE PRODUCTION D’ACM HUMAINS 4.2. INNOVATIONS TECHNOLOGIQUES POUR LA PRODUCTION D’ACM HUMAINS 4.2.1. ESSAI D’ETABLISSEMENT D’UNE LIGNEE B STABLE AVEC BCL-6 ET BCL-XL 4.2.2. ESSAI DE TRANSACTIVATION D’EBV DANS LES LB PAR EBNA2 4.2.3. PRODUCTION D’ACM HUMAINS SPECIFIQUES DE LA DENGUE. 176 176 176 178 184 . 5. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES. 190 . ANNEXE 1 : NOTE D’INFORMATION ET CONSENTEMENT DONNEURS. 196. ANNEXE 2 : ACCORDS SIGNES ENTRE L'INSTITUT PASTEUR ET L'INSERM POUR LA CESSION DES QUATRE SEROTYPES DE DENGUE 197 ANNEXE 3 : PREPARATION DES MILIEUX. 206 . MILIEUX DE CULTURE COMPLETS MILIEU DE RECOUVREMENT POUR LA CULTURE DU DENV MILIEU DE CYTOMETRIE. 206 207 207 . ANNEXE 4 : MULTIPLICATION DES ADN PLASMIDIQUES DANS DES BACTERIES THERMOCOMPETENTES. 208 . ANNEXE 5 : PREPARATION D’UNE SOLUTION DE PARAFORMALDEHYDE (PAF) A 4% POUR LA FIXATION DES CELLULES 210 ANNEXE 6 : SIGNIFICATION DES CLASSES DE DIFFERENCIATION AUXQUELLES APPARTIENNENT LES AC UTILISES 212 ANNEXE 7 : REACTIFS UTILISES. 214 . 8.

(11) Liste des abréviations Ac : anticorps AcM : anticorps monoclonal/aux ADE : Antibody Dependent Enhancement ADEPT : antibody-directed enzyme prodrug therapy ADCC : cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps ADN : acide désoxyribonucléique ARN : acide ribonucléique Ag : antigène(s) AMM : autorisation de mise sur le marché BCR : B-cell antigen receptor C : capside CD : classe de différenciation CDC : cytotoxicité dépendante du complément CDR : complementary determining regions Cellules ES : embryonic stem cells Cellules NK : cellules natural killer CIC : centre d’investigation clinique CPA : cellule présentatrice d’antigènes CpG : cytosine phosphatidyl guanosine DCI : dénomination commune internationale DC-SIGN : Dentritic Cell-Specific Intercellular adhesion molécule-3-Grabbing Non-integrin DENV : dengue virus DF : dengue fever DHF : dengue hemorrhagic fever DMSO : diméthylsulfoxyde DSS : dengue choc syndrom E : enveloppe EBNA2 : Epstein-Barr virus-encoded nuclear antigen 2 EBV : Epstein-Barr virus EFS : Etablissement Français du Sang ELISA : enzyme linked immuno sorbent assay Fab : fragment antigen binding 9.

(12) Fc : fragment cristallizable FDA : Food and Drugs Administration GFP : green fluorescent protein HAMA : human anti-mouse antibodies HRP : horse radish peroxidase IC50 : concentration inhibitrice de 50% IFN : interféron Ig : immunoglobuline(s) IL : interleukine(s) LB : lymphocytes B LT : lymphocytes T LLME : L-leucine-L-leucine méthyl ester M : membrane Mab : monoclonal antibody MOI : multipicity of infection (MOI=1 équivaut à un virus pour une cellule) OMS : Organisation Mondiale de la Santé (ou WHO : World Health Organization) ORF : Open Reading Frame (ou cadre ouvert de lecture) PAF : paraformaldéhyde PBL : peripheral blood lymphocytes PBS : phosphate buffered saline PBMC : peripheral blood mononuclear cells PEG : polyethylene glycol RAG : recombination activating gene RE : réticulum endoplasmique RSS : recombination signal sequence scFv : single chain variable fragment SVF : sérum de veau fœtal TCR : T-cell antigen receptor TLR : toll like receptor TMB : 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine TNF : tumor necrosis factor VLP : virus-like particles VSV-G : glycoprotéine G du virus de la stomatite vésiculaire. 10.

(13) Table des illustrations Liste des figures Figure 1 : Schéma de l'hématopoïèse....................................................................................... 24 Figure 2 : Schéma d'un ganglion lymphatique......................................................................... 26 Figure 3 : Différentes formes d’immunoglobulines : BCR et Ac............................................ 28 Figure 4 : Structure des domaines Variables et Constants d'une molécule d'Ig ...................... 30 Figure 5 : Structure 3D d'une IgG............................................................................................ 30 Figure 6 : Schéma d'une molécule d'Ig .................................................................................... 30 Figure 7 : Clivage protéolytique d'une Ig ................................................................................ 32 Figure 8 : Organisation des loci sur les chaînes légères et lourdes d'une Ig humaine ............. 34 Figure 9 : Etapes de la recombinaison V(D)J .......................................................................... 34 Figure 10 : Mécanisme de recombinaison des gènes V et J sur la chaîne légère d’une Ig ...... 36 Figure 11 : Organisation structurale des cinq isotypes d'Ig humaines..................................... 38 Figure 12 : Recombinaison V(D)J et commutation de classe.................................................. 40 Figure 13 : Production d'AcM par fusion de cellules .............................................................. 42 Figure 14 : Création d'anticorps monoclonaux chimériques et humanisés.............................. 44 Figure 15 : Cycle « phage display » pour la production d’AcM ............................................. 48 Figure 16 : Techniques développées pour générer des souris transgéniques........................... 50 Figure 17 : Technique de production d'AcM murins avec des souris ES ................................ 52 Figure 18 : Technique de production d'AcM humains par le virus d'Epstein-Barr (EBV)...... 54 Figure 19 : Protocole d'immunisation in vitro par des antigènes solubles............................... 54 Figure 20 : Méthode améliorée pour l'immortalisation de cellules B mémoires par EBV ...... 56 Figure 21 : Historique de l'immunothérapie ............................................................................ 60 Figure 22 : Les fonctions effectrices des Ac : ADCC (cytotoxicité cellulaire dépendante des Ac) et CDC (cytotoxicité dépendante du complément)................................................... 66 Figure 23 : Ac thérapeutiques utilisés en cancérologie ........................................................... 68 Figure 24 : Structure du virus de la dengue (DENV) .............................................................. 72 Figure 25 : Génome du DENV ................................................................................................ 72 . 11.

(14) Figure 26 : Cycle de réplication du virus de la dengue............................................................ 74 Figure 27 : Répartition mondiale de la dengue en 2010 .......................................................... 76 Figure 28 : Moustique Aedes, vecteur de la dengue ................................................................ 78 Figure 29 : Transmission du virus de la dengue ...................................................................... 78 Figure 30 : Classification de la dengue selon l'OMS............................................................... 80 Figure 31 : Classification de la sévérité de dengue en quatre grades suivant l’OMS.............. 80 Figure 32 : Facilitation de l'infection de dengue dépendante des anticorps (ADE) ................ 82 Figure 33 : Réponse immunitaire lors d'une infection de dengue.......................................... 101 Figure 34 : Nombre hebdomadaire des cas biologiquement confirmé de dengue en Martinique, de Janvier 2005 à Novembre 2010............................................................. 103 Figure 35 : Séparation des PBMC du sang humain périphérique sur gradient de densité..... 115 Figure 36 : Schéma de marquage des cellules humaines par le complexe d'Ac tétramérique117 Figure 37 : Protocole d'utilisation du kit d'enrichissement des cellules B par déplétion négative .......................................................................................................................... 117 Figure 38 : Tri des LB mémoire : cellules CD22+ et IgA1/A2/D/M- ................................... 119 Figure 39 : ELISA indirect pour détecter des Ac anti-dengue............................................... 123 Figure 40 : ELISA sandwich pour détecter des IgG humaines.............................................. 131 Figure 41 : LB en amas ayant reçu une dose de 10µl de gésicules GFP pendant trois jours (microscope à fluorescence, objectif 20) ....................................................................... 155 Figure 42 : Observation 3D au confocal en fluorescence, de deux cellules B mises en présence de 10µg de gésicules GFP ou vides pendant trois jours................................................. 157 Figure 43 : Western Blot des gésicules Bcl-6 et Bcl-xL........................................................ 157 Figure 44 : Western Blot des gésicules EBNA2.................................................................... 163 Figure 45 : Schéma résumant les étapes nécessaires à la production d’AcM........................ 169 . 12.

(15) Liste des tableaux Tableau 1 : Guide international de nomenclature des AcM .................................................... 58 Tableau 2 : Liste des 25 AcM approuvés par la FDA et commercialisés pour un usage thérapeutique en 2010 ...................................................................................................... 70 Tableau 3 : Candidats vaccins sélectionnés pour la dengue .................................................... 85 Tableau 4 : Cibles potentielles de l'hôte anti-DENV et leurs inconvénients ........................... 89 Tableau 5 : Anticorps utilisés lors des Westerns Blots.......................................................... 113 Tableau 6 : Différences calculées entre les concentrations en IgG humaines théoriques et expérimentales suivant les deux conditions où l’Ac de capture est à 2,5 ou 5µg/ml avec l’Ac secondaire couplé HRP dilué au 1/500000ème........................................................ 137 Tableau 7 : Différences calculées entre les concentrations en IgG humaines théoriques et expérimentales suivant les deux conditions où l’Ac de capture est à 1 ou 2,5µg/ml avec l’Ac secondaire couplé HRP dilué au 1/500000ème ou au 1/700000ème ......................... 139 Tableau 8 : Nombre de puits GFP+ par plaque de pré-clonage suivant cinq sérums testés, et suivant la durée du temps de culture des cellules. ......................................................... 153 Tableau 9 : Nombre de puits GFP+ par plaque de pré-clonage suivant deux quantités de SVF dans le milieu de culture ................................................................................................ 153 Tableau 10 : Lecture des puits GFP+ après trois et six semaines de culture post) pré-clonage réalisé à J57 post-infection des LB par EBV ................................................................. 165 Tableau 11 : Date des résultats de NS1 ainsi que les valeurs sériques des IgG et IgM associées à leurs dates de contrôle, pour les cinq donneurs........................................................... 169 Tableau 12 : Nombre de LB décongelés et de LB mémoires triés pour chacun des cinq donneurs......................................................................................................................... 171 . Liste des graphiques Graphique 1 : Courbe où le logarithme de la concentration en IgG humaines est exprimé en fonction des valeurs d’absorbance obtenues à une longueur d’onde de 450nm, avec l’Ac de capture à 2,5µg/ml et l’Ac secondaire couplé HRP dilué au 1/200000ème ................ 135 Graphique 2 : Courbe où le logarithme de la concentration en IgG humaines est exprimé en fonction des valeurs d’absorbance obtenues à une longueur d’onde de 450nm, avec l’Ac de capture à 2,5 ou 5µg/ml et l’Ac secondaire couplé HRP dilué au 1/200000ème ou au 1/50000ème ...................................................................................................................... 135 Graphique 3 : Parties linéaires des courbes où le logarithme de la concentration en IgG humaines est exprimé en fonction des valeurs d’absorbance obtenues à une longueur 13.

(16) d’onde de 450nm, avec l’Ac de capture à 2,5 ou 5µg/ml et l’Ac secondaire couplé HRP dilué au 1/500000ème ...................................................................................................... 137 Graphique 4 : Parties linéaires des courbes où le logarithme de la concentration en IgG humaines est exprimé en fonction des valeurs d’absorbance obtenues à une longueur d’onde de 450nm, avec l’Ac de capture à 1 ou 2,5µg/ml et l’Ac secondaire couplé HRP dilué au 1/500000ème ou au 1/70000ème .......................................................................... 137 Graphique 5 : Pourcentage de cellules positives pour les marqueurs CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD19 et CD56 dans la population de LB ayant été purifiée en utilisant les billes magnétiques « Dynabeads » (Invitrogen) marquées avec des Ac (Beckman)............... 145 Graphique 6 : Pourcentage de cellules CD19 positives présent dans chacune des fractions purifiées par « Dynabeads » et « Easysep »................................................................... 145 Graphique 7 : Cinétique du taux d’infection des LB par EBV sur 21 jours mesuré par l’expression de la GFP, suivant trois conditions incluant des CD40L .......................... 147 Graphique 8 : Cinétique du taux de mortalité des LB infectés par EBV suivant l’expression du Troppo 3, par rapport à trois conditions incluant des CD40L ....................................... 147 Graphique 9 : Cinétique du taux de production d’IgG des LB infectés par EBV suivant l’expression de la PE, par rapport à trois conditions incluant des CD40L .................... 147 Graphique 10 : Cinétique du pourcentage d’infection des LB par EBV suivant cinq conditions de culture en présence ou non de CD40L et CpG 2006................................................. 149 Graphique 11 : Cinétique du taux de mortalité des LB infectés par EBV suivant cinq conditions de culture faisant varier la présence de CD40L et de CpG 2006 ................. 149 Graphique 12 : Cinétique du taux d’infection des LB par EBV pendant 10 jours en présence de CpG 2006, soit 24 heures avant infection, soit le jour de l’infection........................ 151 Graphique 13 : Cinétique du taux de mortalité des LB infectés par EBV pendant 10 jours en présence de CpG 2006, soit 24h avant l’infection, soit le jour de l’infection................ 151 Graphique 14 : Cinétique de la viabilité des LB infectés par EBV pendant 34 jours, suivant cinq SVF testés dans le milieu de culture ...................................................................... 153 Graphiques 15 : Taux de LB fluorescents verts (A) et vivants (B) après avoir en contact pendant trois jours avec différentes doses de gésicules GFP......................................... 155 Graphique 16 : Epression de CD38 par des LB mesurée après 7 jours de mise en contact avec soit Bcl-6, soit Bcl-xL, soit les deux protéines apportées par des gésicules.................. 159 Graphique 17 : Taux de LB vivants et infectés à 64 jours post-infection par EBV suivant trois doses de gésicules EBNA2 ............................................................................................ 165 Graphique 18 : Cinétique de la viabilité des LB ayant été infectés par EBV avec 15µl de gésicules EBNA2, suivant une stimulation des LB avec CpG et IL-2 .......................... 167 Graphique 19 : Taux de LB vivants et infectés à 64 jours post-infection par EBV avec 15µl de gésicules EBNA2, suivant une une stimulation des LB avec CpG et IL-2.................... 167 . 14.

(17) Graphique 20 : Représentation des concentrations en IgG humaines obtenues par différents clones de LB issus d’une infection par EBV en présence ou non de gésicules EBNA2 167 . 15.

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(19) Introduction générale Cette étude a été réalisée dans le cadre du projet Hu’s MAP dont le but est la production d’anticorps monoclonaux humains (AcM). Ce projet a été réalisé en partenariat avec deux entreprises privées dont chacune avait des objectifs précis : PX Therapeutics devait développer l’humanisation moléculaire d’anticorps (Ac) et Genoway avait en charge le développement de souris humanisées. Les objectifs de la partie INSERM dont je me suis occupée étaient la production d’AcM humains anti-infectieux à partir de lymphocytes B (LB) immortalisés, en proposant des innovations technologiques.. Jusqu’à présent, la plupart des traitements thérapeutiques étaient uniquement fondés sur des molécules chimiques, mimant des molécules naturelles. Depuis l’apparition des AcM, ceux-ci prennent une place de plus en plus importante en immunothérapie passive, thérapie qui vise à améliorer le système immunitaire par apport d’Ac spécifiques.. Le système immunitaire est un ensemble de mécanismes biologiques qui permet à l’organisme de faire la distinction entre le soi et le non soi. Il tolère le soi qui correspond aux éléments qui lui sont propres, et il rejette le non soi c'est-à-dire les éléments étrangers auxquels il est exposé : substances étrangères ou agents infectieux, mais également ses propres constituants altérés : cellules tumorales par exemple. L’immunité agit efficacement grâce à l’association de deux sous-systèmes : l’immunité innée et l’immunité adaptative. L’immunité innée est non spécifique, à action immédiate, tandis que l’immunité adaptative, modulée par l’immunité innée, est spécifique et met quelques jours à se développer. Sa particularité est de mémoriser tous les agents pathogènes déjà rencontrés, via les lymphocytes mémoires et les Ac, afin qu’il y ait une réponse immunitaire plus rapide lors d’une éventuelle nouvelle rencontre.. En thérapeutique, les AcM sont utilisés pour aider l’immunité adaptative car ils sont hyper spécifiques d’un antigène (Ag) donné. Ce sont des médicaments d’origine biologique et non chimique. Par rapport à des molécules chimiques, ils présentent deux avantages majeurs : pour la majorité il n’y a pas d’interférence avec le mécanisme des autres médicaments et ils. 17.

(20) 18.

(21) n’entraînent pas de modifications hépatiques ni rénales. Ces avantages sont importants pour les patients car les biothérapies sont très souvent associées à d’autres traitements. L'administration de cette nouvelle classe de médicament, en association à la chimiothérapie, a permis d'améliorer la réponse clinique et ainsi d'augmenter la survie des malades. Les AcM sont utilisés dans de nombreux domaines tels que la cancérologie, les pathologies cardiovasculaires, les maladies auto-immunes et inflammatoires, les rejets de greffe, les infections bactériennes, virales, etc. Du fait de leur très grande spécificité, les AcM ont permis de grandes avancées dans de nombreux domaines de la recherche, du diagnostic, de la prévention et de la thérapeutique.. Malgré le fait que les AcM aient des domaines d’application variés, aujourd’hui leur usage est essentiellement restreint à la cancérologie. Afin d’élargir ce répertoire nous nous sommes intéressés au domaine de l’infectiologie et notamment des virus. L’application au virus de la dengue (DENV) a alors été choisie car c’est un problème majeur de santé publique au niveau international. Ce flavivirus comporte quatre sérotypes qui n’ont pas d’immunité croisée entre eux. Ils provoquent entre 70 et 500 millions d’infections par an selon l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS). Les cas ont augmenté en nombre, en sévérité et en dispersion géographique car après avoir été identifié dans l’hémisphère Sud, surtout dans les zones tropicales, le DENV progresse maintenant vers le Nord.. Dans un premier temps, la partie bibliographique va permettre de mieux appréhender le sujet. Tout d’abord l’origine des LB et leurs rôles dans l’immunité, dont leur production en Ac, seront rappelés. Ensuite, la structure des AcM, leur mécanisme de fonctionnement ainsi que leurs différentes techniques de production vont être expliqués afin de comprendre comment leur technologie a pu évoluer. La part des AcM prenant de plus en plus d’ampleur dans les traitements d’immunothérapie, cette notion sera définie et ses différents modes de fonctionnement seront rappelés, pour finir avec leurs applications notamment en infectiologie. Notre étude portant sur des Ac contre la dengue, la structure de ce virus et ses manifestations cliniques seront décrites. Les différentes approches de lutte contre ce virus seront également abordées.. 19.

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(23) La deuxième partie de ce mémoire sera dédiée aux différents matériels biologiques et à toutes les méthodes utilisés lors de cette étude. Les résultats seront décrits dans la troisième partie puis ils seront discutés et leurs perspectives seront abordées dans la dernière partie.. 21.

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(25) . 23.

(26) Figure 1 : Schéma de l'hématopoïèse Une cellule souche pluripotente peut se différencier en deux grandes lignées : la lignée lymphoïde avec les lymphocytes T et B (se différenciant en plasmocytes) ainsi que les cellules NK ; ou la lignée myéloïde avec les érythrocytes (globules rouges), les mégacaryocytes (produisant les plaquettes), les monocytes (se différenciant en macrophages) et les granulocytes (globules blancs).. 24.

(27) 1. Introduction bibliographique 1.1.. Lymphocytes B . 1.1.1. Origine des cellules Toutes les populations de cellules du sang sont dérivées de cellules souches hématopoïétiques pluripotentes se situant dans la moelle osseuse. Ces cellules hématopoïétiques se différencient en progéniteurs à partir desquels se développent les cellules de deux grandes lignées : la lignée myéloïde et la lignée lymphoïde (Figure 1). La lignée myéloïde comprend les érythrocytes, les mégacaryocytes (précurseurs des plaquettes), les granulocytes (éosinophiles, basophiles et neutrophiles) et les monocytes/macrophages. Les cellules myéloïdes (à l’exception des érythrocytes) sont les actrices de l’immunité innée, qui est non spécifique, à action immédiate. La lignée lymphoïde intervient dans l’immunité adaptative (induite par l’immunité innée) qui est spécifique et met plusieurs jours à se mettre en place. Il existe trois catégories de cellules lymphoïdes, les cellules « natural killer » (NK) ainsi que les lymphocytes T et B.. Les lymphocytes réalisent leur maturation dans des organes lymphoïdes centraux (dits primaires) : la moelle osseuse pour les LB, et le thymus pour les lymphocytes T (LT). Les LB sont produits tout au long de la vie alors que les LT sont moins produits après la puberté (du fait de la diminution de la taille du thymus). Lorsque les lymphocytes sont matures, ils entrent dans la circulation sanguine à partir de laquelle ils migrent vers les organes lymphoïdes périphériques (dits secondaires) : les ganglions lymphatiques, la rate et les tissus lymphoïdes associés aux muqueuses (amygdales, plaques de Peyer, appendice). Ces organes sont les sites d’activation des lymphocytes par les Ag. Un Ag est le plus souvent une protéine ou un fragment de protéine reconnu par des Ac, ou des cellules présentatrices d’Ag (CPA) : cellules dendritiques, macrophages et LB. Les CPA internalisent l’Ag reconnu puis présentent à leur surface les fragments peptidiques sur des complexes appelés complexes majeurs d’histocompatibilité (CMH). Par l’intermédiaire de son TCR (T-cell antigen receptor), le LT va reconnaître des fragments antigéniques de pathogènes (virus, bactéries extracellulaires, etc.) présenté sous la forme d’un CMH-peptide.. 25.

(28) Figure 2 : Schéma d'un ganglion lymphatique Immunobiology (7th edition), Janeway C. A. et al., Garland Science; 2008. 26.

(29) Pour lutter contre un Ag, le LB a besoin de deux signaux d’activation. Suite à l’interaction entre le BCR et l’Ag (qui fournit le premier signal d'activation), l’Ag va être internalisé et présenté sur le CMH. Le LT, préalablement activé par une CPA, va alors reconnaître les complexes CMH-peptides présentés par le LB et va lui fournir des signaux de co-stimulation. Le LB ainsi activé se différenciera en plasmocyte sécréteur d’Ac spécifiques de l’Ag, ce qui caractérise une réponse immunitaire humorale. La partie de l'Ag reconnue par l'Ac s'appelle l'épitope. Un même Ag peut porter plusieurs épitopes différents. On distingue deux types d’épitopes : les épitopes conformationnels pour lesquels la structure tridimensionnelle est importante pour la reconnaissance par l'Ac, et les épitopes linéaires (ou séquentiels) où la partie reconnue par l'Ac est sa séquence en acides aminés. Les lymphocytes matures sont en perpétuelle circulation entre le sang et la lymphe, fluide extracellulaire passant à travers les tissus lymphoïdes périphériques. La lymphe circule dans des vaisseaux lymphatiques, lesquels sont connectés à de nombreux ganglions lymphatiques dont le rôle est de la filtrer afin de retenir les Ag. Dans les ganglions lymphatiques, les LB sont regroupés dans des follicules lymphoïdes (Figure 2). Lors d’une réponse immunitaire, certains follicules contiennent des zones centrales appelées centres germinatifs où se déroule une prolifération intensive des cellules B. Celles-ci portent des récepteurs spécifiques permettant de reconnaître les Ag rencontrés (« Immunobiology » 7th edition, Janeway et al., 2008, p. 1-108).. 1.1.2. Différenciation des lymphocytes B et mémoire immunitaire Chaque cellule souche lymphoïde engendre un grand nombre de lymphocytes, chacun portant un récepteur antigénique qui lui est propre. Ainsi chaque lymphocyte a une spécificité différente. L’ensemble de ces lymphocytes constitue le répertoire de récepteurs lymphocytaires d’un individu. Pendant la lymphopoïèse, les lymphocytes sont soumis à un mécanisme de sélection clonale négative. En effet, les lymphocytes ayant des récepteurs se liant aux Ag ubiquitaires du soi sont éliminés avant qu’ils ne deviennent complètement matures, afin de permettre une tolérance aux Ag du soi. Le LB qui quitte la moelle osseuse est mature mais naïf tant que son récepteur n’a pas interagit avec un Ag du non soi et des cytokines produites par les LT.. 27.

(30) Figure 3 : Différentes formes d’immunoglobulines : BCR et Ac. 28.

(31) Celui-ci est alors activé et commence à se différencier en un clone, c’est-à-dire que chaque lymphocyte porte à sa surface un seul type de récepteur avec une spécificité unique. Ces récepteurs sont générés par recombinaison aléatoire des segments de gènes du récepteur variable et de l’appariement des chaînes variables : les chaînes lourdes et légères pour les immunoglobulines (Ig). Les lymphocytes sont également soumis à un processus de sélection naturelle dirigée lors d’une réponse immunitaire humorale. Seuls les LB dont les récepteurs se lient avec un Ag étranger rencontré, s’activent pour se multiplier et se différencier en cellules effectrices appelées plasmocytes. Ainsi le répertoire lymphocytaire de chaque personne dépend de la diversité des Ag rencontrés, ce qui mène à l’immunité adaptative. Tout au long de la vie, la reconnaissance est maintenue du fait que ces cellules B prolifèrent et se différencient en cellules effectrices. Une fois qu’un Ag a été éliminé par ces cellules effectrices la réponse immunitaire se met en veille. En effet, une partie de ces plasmocytes, est gardée en mémoire pour une réponse immune plus rapide s’il devait y avoir un autre contact avec ce même Ag. Ces LB mémoires vont quitter les organes lymphoïdes secondaires et gagner la circulation sanguine pour détecter un maximum d’Ag. Ainsi quand des LB mémoires rencontrent à nouveau un Ag connu, ils vont être réactivés plus rapidement et plus spécifiquement et ainsi produire des Ac ayant une plus grande avidité pour cet Ag. Ceci est appelé la mémoire immunitaire (« Immunobiology » 7th edition, Janeway et al., 2008, p.111-123, p.259-273, p.381-399 et p.442-455). Cette notion est apparue en 430 avant J.-C. grâce à l’historien grec Thucydide qui avait observé en décrivant la peste, que « la même personne n’était jamais atteinte deux fois » (Sallusto, Lanzavecchia et al. 2010).. 1.1.3. Lymphocytes B et immunoglobulines Lorsque les LB sont activés par un Ag, ils se multiplient et se différencient en plasmocytes, cellules productrices d’Ac. Les Ac sont des protéines complexes produites pour détecter et neutraliser les Ag de manière spécifique. Chaque clone lymphocytaire B (plasmocyte) produit une immunoglobuline, dont la séquence et la spécificité sont uniques. Les Ig sont présentes sous deux formes (Figure 3) : une forme soluble dans le plasma et de nombreuses sécrétions,. 29.

(32) Figure 4 : Structure des domaines Variables et Constants d'une molécule d'Ig Immunobiology (7th edition), Janeway C. A. et al., Garland Science; 2008. Figure 5 : Structure 3D d'une IgG Immunobiology (7th edition), Janeway C. A. et al., Garland Science; 2008. Fv : Fragment variable. Fc : Fragment constant. Fab : Fragment de liaison à l’antigène Ponts disulfures. Chaîne légère. Chaîne lourde. Figure 6 : Schéma d'une molécule d'Ig. 30.

(33) qui correspond aux Ac, et une forme membranaire qui est le récepteur du LB à l'Ag appelé BCR (B-cell antigen receptor). Chaque LB n’exprime à sa membrane qu’un seul type de BCR en plusieurs exemplaires. Les BCR sont capables de stimuler la différenciation des LB en plasmocytes et d’augmenter la sécrétion d’Ac spécifiques, suite à la reconnaissance d’un Ag. Les Ac sont ainsi sécrétés en réponse à une stimulation par un Ag. Un Ac est capable d'interagir avec un Ag pour former un complexe Ag-Ac.. 1.1.3.1.. Caractéristiques structurales des Ig . Les Ac font partie de la superfamille des immunoglobulines (Ig) (Figure 4). Cette superfamille est caractérisée par la présence d'un domaine Ig qui est constitué par : •. 110 acides aminés repliés en feuillets β, reliés par des hélices α. •. un pont disulfure entre deux cystéines distantes de 60 acides aminés. •. des ponts disulfures inter-chaînes qui assurent la stabilité structurale.. Il y a cinq classes d’Ig comprenant les IgG (70 à 75% des Ig totales), les IgM (10%), les IgA (15 à 20%), les IgD (moins de 1%) et les IgE (moins de 1%). Les Ac les plus simples (monomères) et les plus utilisés dans l'industrie pharmaceutique sont les IgG (Figure 5). Chaque molécule d’Ig est constituée de quatre chaînes polypeptidiques : deux chaînes lourdes identiques d’environ 50 kDa et deux mêmes chaînes légères d’environ 25 kDa. Celles-ci sont reliées entre elles par des ponts disulfures qui assurent la flexibilité de la molécule (Figure 6). Chaque chaîne possède un domaine variable et des domaines constants. Pour les chaînes légères, le domaine variable est lui-même constitué de trois régions hypervariables, et pour les chaînes lourdes il y a plusieurs domaines constants dont le nombre est dépendant de l’isotype : trois pour les IgA, IgD et IgG, et quatre pour les IgE et IgM. L'association des domaines variables des chaînes lourdes et légères constitue le site de liaison à l'Ag, appelé le paratope. Chaque chaîne lourde et légère étant identiques entre elles, ainsi chaque Ig comporte deux paratopes identiques qui possèdent la même spécificité et reconnaissent de ce fait des épitopes identiques. Il existe deux types de chaînes légères chez les Ig, nommées kappa (κ) et lambda (λ). Une Ig est composée de chaînes κ ou λ, mais jamais des deux. Ces deux types de chaînes peuvent être. 31.

(34) Figure 7 : Clivage protéolytique d'une Ig Immunobiology (7th edition), Janeway C. A. et al., Garland Science; 2008 La papaïne clive la molécule d’Ig en trois fragment, deux Fab contenant la région variable et liant l’Ag, et un Fc cristallisable contenant la région constante. La pepsine clive la molécule d’Ig en un fragment F(ab’)2 (contenant les deux fragments Fab ainsi que les cystéines formant les ponts disulfures) et de nombreuses coupes du fragment Fc dont la plus grande est appelée pFc’. . . 32.

(35) retrouvés dans les cinq classes d’Ig et il n’existe pas de différence fonctionnelle pour les Ig suivant le type de chaînes. Le rapport moyen κ/λ des chaînes légères varie selon les espèces, par exemple il est de 2:1 chez les humains et 20:1 chez les souris. Un déséquilibre de ce ratio peut indiquer un nombre anormal de chaînes légères κ ou λ, ce qui pourrait être le signe d’une prolifération anormale d’un clone de cellules B et donc la présence d’une tumeur. La digestion enzymatique des Ac permet de singulariser des fragments responsables de fonctions précises (Figure 7). La papaïne clive la molécule d'Ig en trois fragments : . deux fragments Fab (antigen binding Fragment) qui permettent la fixation de. l'Ag. Ils comportent des domaines variables et constants. un fragment Fc (cristallizable Fragment) qui est la partie de l’Ac reconnue par les effecteurs de l’immunité. Cette région Fc assure les fonctions communes à tous les Ac comme l'activation du complément ou la fixation à des récepteurs spécifiques portés par certaines cellules du système immunitaire (FcR). Cette région assure également la fonction biologique spécifique aux différents isotypes, par exemple l’opsonisation (les Ac vont recouvrir un Ag afin de permettre son élimination par phagocytose) et l’activation du complément (la fixation du complément sur le complexe immun Ag-Ac va entraîner la formation de pores transmembranaires aboutissant à la lyse de la cellule porteuse du complexe immun). Le fragment Fc comporte uniquement des domaines constants. La pepsine clive la molécule d'Ig en deux fragments principaux: . un fragment F(ab')2 constitué des deux fragments Fab reliés par des ponts. disulfures. . 1.1.3.2.. un fragment pFc’.. Diversité des Ig . L’organisme a mis en place plusieurs mécanismes de recombinaisons afin de produire un très grand nombre d’Ig différentes dans le but de contrer un maximum d’Ag. La première étape se situe dans la moelle osseuse où a lieu la recombinaison V(D)J pour obtenir des Ig avec des sites de liaison à l’Ag fonctionnels. Après leur stimulation, les LB migrent dans les centres germinatifs des follicules (Figure 2), présents dans les organes. 33.

(36) Figure 8 : Organisation des loci sur les chaînes légères et lourdes d'une Ig humaine Immunobiology (7th edition), Janeway C. A. et al., Garland Science; 2008 Le locus de la chaîne légère λ a environ 30 segments de gène Vλ (variables) et quatre paires de segments de gènes fonctionnels Jλ (de jonction) et Cλ (constants). Le locus de la chaîne légère κ est organisé de le même façon avec environ 40 segments de gène Vκ accompagnés d’un groupe de cinq segments de gènes Jκ mais avec un seul gène Cκ. Le locus de la chaîne lourde a environ 65 segments de gènes fonctionnels VH ainsi qu’un groupement d’environ 25 gènes DH (de diversité), suivi de six segments de gènes JH et de plusieurs gènes CH décrits dans la Figure 9. Les segments de gènes V sont précédés de séquences leader (L).. Figure 9 : Etapes de la recombinaison V(D)J Immunobiology (7th edition), Janeway C. A. et al., Garland Science; 2008 La région Variable de la chaîne légère est construite à partir de deux segments de gènes : V et J qui sont précédés d’un peptide leader L (permettant l’adressage de l’Ig suivant la pathologie et étant clivé ensuite). La région Cconstante de la chaîne légère est jointe à la région Variable (L est alors éliminé ainsi que les introns entre L-V et V-C). Les régions V de la chaîne lourde sont construites à partir de trois gènes : tout d’abord les segments de gène de Diversité et de Jonction sont joints, ensuite ceux-ci sont joints au segment de gène V formant un complexe VH. Le gène de la région C est codé par plusieurs exons qui sont joints au complexe VH. La séquence leader est éliminée après traduction de la protéine et les ponts disulfures liants les chaînes polypeptidiques sont formés (violet).. 34.

(37) lymphoïdes secondaires, pour se multiplier. Ensuite, les deux mécanismes suivants impliqués dans cette diversité concernent les domaines variables pour permettre aux Ac de reconnaître les Ag. Il y a le mécanisme d’hypermutation somatique provoquant des mutations aléatoires ponctuelles, ceci dans le but d’augmenter l’affinité du BCR. Et le phénomène de commutation isotypique (ou changement de classe d’Ig) qui est induit par des cytokines. Il s’agit de réarrangements où la partie constante d’une IgM est remplacée par celle d’une autre Ig. Cette substitution permet de modifier la fonction de l’Ig, assurée par le fragment Fc, suivant la réponse immunitaire voulue. Seules les régions constantes diffèrent suivant les classes d’Ig. Ainsi tous les isotypes reconnaissent le même Ag. Si le changement d’isotype n’a pas lieu, les LB continuent à proliférer ou bien quittent le centre germinatif pour terminer leur différenciation en LB mémoires ou en plasmocytes (« Immunobiology » 7th edition, Janeway et al., 2008, p.143-176)..  Recombinaison V(D)J Un progéniteur lymphoïde doit tout d’abord effectuer des recombinaisons somatiques pour devenir une cellule B. Celles-ci ont lieu dans le but d’obtenir des domaines variables fonctionnels permettant de reconnaitre les Ag (Tonegawa 1983). La recombinaison est effectuée sur les deux chaînes d’Ig, les segments de gènes V-D-J pour la chaîne lourde, et les segments de gènes V-J pour la chaîne légère (Figure 8). Ainsi, chaque gène codant les domaines variables contient plusieurs fragments de gènes variables (V), de gènes de jonction (J) et un seul gène constant (C). Seules les chaînes lourdes contiennent des gènes de diversité (D). . Pour les chaînes légères cela dépend du type de chaîne. Les gènes de la chaîne κ codent pour 40 segments V et 5 segments J ce qui peut générer 200 recombinaisons. Et les gènes de la chaîne λ codent pour 30 segments V et 4 segments J, soit 120 recombinaisons possibles.. . Pour la chaîne lourde il y a 40 segments de gènes V, 25 à 27 segments de gènes D et 6 segments de gènes J, ce qui peut faire 6000 possibilités de recombinaisons (40x25x6).. Les recombinaisons commencent sur les chaînes lourdes où les fragments D et J sont recombinés en premier. Il y a jonction entre un des segments D avec un des six segments J par réarrangement, l’ADN (Acide DésoxyRibonucléique) se trouvant entre les deux segments est éliminé. Puis il y a jonction entre un des segments V avec le segment DJ recombiné (Figure 9). Après les recombinaisons des gènes des chaînes lourdes, celles des gènes des chaînes 35.

(38) Figure 10 : Mécanisme de recombinaison des gènes V et J sur la chaîne légère d’une Ig Chaque recombinaison de la région V est permise car les segments des gènes sont flanqués de signaux: les heptamères sont montrés en jaune et les nonamères en orange. La recombinaison se produit aux extrémités des séquences d’heptamères, le rapprochement des séquences RSS (Recombination Signal Sequence) et RAG (Recombination Activationg Gene) crée un signal commun, libérant ainsi l'ADN présent dans le cercle fermé. Pour faire simple, seule la recombinaison de la région V d’une chaîne légère est représentée ici, pour une chaîne lourde deux évènements de recombinaison sont nécessaires pour avoir une région V fonctionnelle.. . 36.

(39) légères sont réalisées par réarrangement entre les segments V et J. Il est important de noter que seuls les réarrangements productifs, générant un Ac fonctionnel, entraînent la formation des chaînes d’Ig. Le mécanisme de réarrangement est dirigé par les séquences RSS (Recombination Signal Sequence). Elles servent de signaux de recombinaison et entourent chaque gène V, D et J. Chaque séquence est constituée d’un heptamère (5’CACAGTG3’), suivi d’un espaceur de 12 ou 23 paires de bases, puis d’un nonamère (5’ACAAAAACC3’). La recombinaison suit toujours la règle 12/23, c’est-à-dire qu’un gène suivi d’un espaceur de 12 paires de bases se réarrange uniquement avec un gène ayant un espaceur de 23 paires de bases (et vice versa). Et la recombinaison se fait uniquement entre segments de gènes se trouvant sur un même chromosome, ceci pour éviter qu’il y ait réarrangement entre les gènes des chaînes lourdes et légères (« Immunobiology » 7th edition, Janeway et al., 2008, p.143176). La recombinaison V(D)J peut être résumée en quatre étapes : 1) Rapprochement des gènes cibles (Figure 10) grâce aux enzymes RAG1 et RAG2 (Recombination Activating Gene) qui reconnaissent les séquences RSS bordant les gènes cibles. La juxtaposition de ces séquences forme une structure d’ADN en épingle à cheveux. 2) Excision de l’ADN se trouvant entre les deux séquences RSS, ce qui permet la jonction entre les gènes cibles. 3) Addition ou délétion de bases d’ADN aux extrémités des gènes cibles. 4) Fusion des gènes cibles, ceci permettant la formation d’un locus codant et d’un joint signal (structure en épingle à cheveux dont les extrémités ont fusionné). Les modifications dues aux additions et délétions de nucléotides aux jonctions entre les gènes V, D et J sont responsables de la diversité jonctionnelle et donc de la diversité des Ig. La maturation des LB se fait au fur et à mesure des réarrangements V(D)J. Après les réarrangements des chaînes lourdes, le progéniteur lymphoïde passe alors au stade pro-B précoce puis au stade pro-B tardif. Lorsque ceux-ci sont fonctionnels, la maturation des LB se poursuit avec la recombinaison VJ sur les chaînes légères, passant au stade grande puis petite cellule pré-B pour finir en cellule B immature lorsque les recombinaisons V(D)J sont. 37.

(40) Figure 11 : Organisation structurale des cinq isotypes d'Ig humaines Immunobiology (7th edition), Janeway C. A. et al., Garland Science; 2008 Les IgM ainsi que les IgE n’ont pas de pont disulfure mais chacune comporte un domaine de chaînes lourdes constitué de trois régions contrairement aux autres Ig qui n’en ont que deux. Les IgG ont deux ponts disulfures alors les IgD et IgA n’en présentent qu’un seul. Les différentes isotypes d’Ig diffèrent également dans la localisation des groupements carbohydrates lies à l’azote, ils sont représentés par des ronds gris.. 38.

(41) terminées (productives). Une fois matures, les cellules B vont exprimer à leur surface différentes classes d’Ig (« Immunobiology » 7th edition, Janeway et al., 2008, p.259-273).  Commutation de classe d’Ig La classe d’une Ig est définie par la structure du domaine constant de ses chaînes lourdes. Son activité fonctionnelle dépend de la classe à laquelle elle appartient. Au cours de sa maturation puis de son activation, le LB produit des Ig de classes différentes. Il y cinq classes principales ou isotypes d’Ig qui apparaissent dans l’ordre suivant (par rapport à l’ordre des exons) (Figure 11) : •. Classe µ : immunoglobulines M (IgM) qui sont présentes à la surface des LB matures naïfs. Lorsqu’elles sont sécrétées, du fait de leur structure pentamérique elles jouent un rôle efficace dans l’agglutination des Ag et dans l’activation du complément (ne pouvant traverser la barrière placentaire).. •. Classe δ : immunoglobulines D (IgD) qui sont co-exprimées avec les IgM à la surface des LB matures naïfs. Leur fonction n’est pas encore bien connue, cependant il a été démontré que le changement de classe d’IgM à IgD influait sur l’immunité mais aussi sur l’inflammation (Chen, Xu et al. 2009).. •. Classe γ : immunoglobulines G (IgG) qui sont divisées en quatre sous-classes (IgG1 à IgG4). Elles sont classées suivant leur abondance dans le sérum (les IgG1 sont les plus abondantes). Les IgG constituent 75-80% des Ig circulantes et peuvent traverser la barrière placentaire. Elles jouent un rôle dans l’activation du complément et dans la réponse immunitaire mémoire.. •. Classe ε : immunoglobulines E (IgE) sont les seules Ig thermolabiles. Lorsqu’il y a contact avec un allergène, les IgE se fixent aux mastocytes et aux basophiles ce qui entraîne une réaction inflammatoire. Ainsi une forte allergie peut provoquer un choc anaphylactique.. •. Classe α : immunoglobulines A (IgA) qui sont divisées en deux sous-classes : IgA1 et IgA2. Elles sont présentes sous forme de dimères dans toutes les muqueuses (respiratoires, digestives, génito-urinaires, etc.) et sous forme de monomères dans le sérum (90% IgA1) et les sécrétions, incluant la salive et le lait maternel.. La commutation isotypique est également appelée « isotype switching » ou « class switch recombination ». Elle est réalisée par un processus de recombinaison somatique. Elle sert au. 39.

(42) Figure 12 : Recombinaison V(D)J et commutation de classe (Diaz and Daly 2009) a, Recombinaison des segments de gènes d’Ig variables (V), de diversité (D) et de jonction (J) permettant de produire des récepteurs de LB (BCR) fonctionnels durant le développement des LB dans la moelle osseuse. Si pendant le développement, un BCR reconnaît un Ag du soi, la cellule B va subir une recombinaison supplémentaire afin de générer une Ig non auto-réactive. b, La commutation de classe a lieu après activation des cellules B matures dans les tissus lymphoïdes périphériques (rate et ganglions lymphatiques). Lors de la commutation de classe, les exons µ sont échangés avec les exons situés en aval pour générer une classe d'Ac différents. Les LB activés subissent également une hypermutation somatique (SHM), car ils se transforment en cellules B mémoires. Considérant que les protéines RAG engagent la recombinaison V (D) J (a), la commutation de classe et l'hypermutation somatique sont déclenchées par l'enzyme AID (b). Tous les processus sont initiés par/ou impliquent des cassures d'ADN double brin.. 40.

(43) changement d’un isotype d’Ig par un autre, suivant la réponse immunitaire voulue (« Immunobiology » 7th edition, Janeway et al., 2008, p.143-166). Par exemple, pour les IgA, après recombinaison V(D)J, une IgM apparaît à la membrane des LB immatures. Puis après activation des LB dans les tissus lymphoïdes périphériques par un Ag présent dans le sérum, il y a excision de l’ADN pour remplacer le locus Cµ par le locus Cα. Cette recombinaison de classe a lieu afin d’obtenir une réponse immunitaire appropriée (Macpherson, McCoy et al. 2008)..  Hypermutation somatique Le mécanisme d’hypermutation somatique sert à augmenter l’affinité du BCR pour l’Ag qui l’a activé. Ce mécanisme ajoute des mutations ponctuelles dans les régions variables des chaînes lourdes et légères réarrangées du BCR. Il est déclenché par les LT CD4 helpers présents lors de la deuxième activation du LB par l’Ag. Le mécanisme d’hypermutation somatique a lieu lors du développement des cellules effectrices en cellules mémoires. En effet, lors d’une nouvelle rencontre avec un Ag connu, les cellules mémoires seront encore plus spécifiques. Ces mutations se faisant au hasard, elles peuvent être de quatre types : -. silencieuses et neutres : l’affinité du BCR pour son Ag reste inchangée. -. délétères : l’affinité du BCR pour son Ag diminue, cela abouti à la mort des cellules B par sélection négative. -. positives : l’affinité du BCR pour son Ag augmente. Alors les LB, encore plus spécifiques, poursuivent leur différenciation (« Immunobiology » 7th edition, Janeway et al., 2008, p.167-176).. En résumé, la diversité des Ig est due à la diversité combinatoire associée à la commutation de classe puis à l’hypermutation somatique (Figure 12) (Diaz and Daly 2009).. 41.

(44) Figure 13 : Production d'AcM par fusion de cellules (Alkan 2004) HGPRT : hypoxanthine-guanine phospho ribosyltransférase. 42.

(45) 1.2.. Production d’anticorps monoclonaux humains . 1.2.1. Origine des anticorps monoclonaux Les AcM produits in vitro sont apparus il y a une trentaine d’années, et depuis ont subi une évolution technologique remarquable. Les AcM doivent leur découverte à Georges Kölher et César Milstein en 1975 (Kohler and Milstein 1975). Ils ont développé une technique de production d’hybridomes qui sécrètent des molécules d'Ig monoclonales. Cette technique leur a valut le prix Nobel de Médecine en 1984. Les hybridomes sont formés par fusion entre une cellule immortalisée (myélome) et une cellule B murine qui produit des Ac. La fusion a tout d’abord été réalisée grâce au virus de Sendai inactivé, puis par du polyéthylène glycol (PEG : agent de fusion des membranes plasmiques des cellules eucaryotes), celui-ci ayant plus d’avantages comme l’efficacité, la stabilité et le coût (Pontecorvo 1975). Ces hybridomes héritent de deux propriétés : ils se multiplient indéfiniment, grâce aux propriétés immortalisantes conférées par les cellules de myélomes, donnant naissance à des cellules identiques entre elles, et ils produisent des Ac grâce au matériel génétique apporté par les LB. Chaque clone de cellules produit le même Ac qui est dit monoclonal (Figure 13). Les cellules hybrides sont ensuite sélectionnées grâce à un milieu spécifique, le milieu HAT qui contient de l'hypoxanthine, de l'aminoptérine et de la thymidine. En effet, pour se développer et se diviser à l’état physiologique, les cellules synthétisent des nucléotides en utilisant la voie endogène de synthèse de novo. Il existe des molécules capables de bloquer cette voie comme l'aminoptérine. Les cellules peuvent alors utiliser une voie de sauvetage grâce aux substrats contenus dans le milieu : la thymidine via l’enzyme TK (thymidine kinase) pour les pyrimidines, et l’hypoxanthine via l'enzyme HGPRT (hypoxanthine-guanine phospho ribosyltransférase) pour les purines. Ainsi sur le milieu spécifique HAT, seules les cellules possédant les enzymes TK et HGPRT peuvent survivre. Ce milieu HAT est donc le milieu de sélection positive des hybridomes. Les cellules de myélomes utilisées pour la fusion sont préalablement sélectionnées pour être déficientes en l'enzyme HGPRT. Après la fusion, sur le milieu de sélection HAT, seules les cellules d'hybridomes HGPRT- fusionnées avec les cellules de souris (produisant les Ac) HGPRT+ survivent. Au fil de la culture, les LB murins non fusionnés s'éliminent car ils sont incapables de se répliquer in vitro, et les cellules d'hybridomes non fusionnées meurent également du fait de leur déficience en HGPRT et de la présence d'aminoptérine dans le milieu HAT.. 43.

(46) Figure 14 : Création d'anticorps monoclonaux chimériques et humanisés http://www.fusionantibodies.com Un Ac murin est uniquement constitué d’ADN murin (Bleu). Un Ac chimérique possède des chaînes lourdes constantes (CH) et des chaînes légères constantes (CL) d’origine humaine (Vert), ainsi que des chaînes lourdes variables (VH) et des chaînes légères variables (VL) d’origine murine. Un Ac humanisé est constitué uniquement d’ADN humain, sauf ses régions complémentaires déterminantes (CDR) qui sont d’origine murine.. 44.

(47) La mise au point d’une technique de production d’AcM a permis de grandes avancées dans le domaine de la recherche et celui du diagnostic, c'est pourquoi très vite de nouveaux espoirs thérapeutiques sont nés. Cependant l'utilisation d'AcM murins chez l'Homme a fait surgir d'importants problèmes d'immunogénicité. En effet, pour la majorité des patients, cette utilisation se traduisait par l'apparition d'Ac humains anti-Ac de souris appelés HAMA (human anti-mouse antibodies), provoquant une diminution d'efficacité et surtout des effets secondaires indésirables dus à la formation de complexes immuns.. 1.2.2. Anticorps monoclonaux chimériques et humanisés 1.2.2.1.. AcM chimériques : 70% humains . Afin de réduire l’immunogénicité des AcM murins, des techniques ont été mises en place pour ajouter des régions humaines dans le but de minimiser la partie murine. La première technique mise au point s’appelle la chimérisation. Celle-ci consiste à remplacer les régions constantes murines par des régions constantes humaines. Les séquences des gènes codants la région variable d’un Ac murin, sont fusionnées avec les séquences géniques codant la région constante d'une Ig humaine (Morrison, Johnson et al. 1984) (Boulianne, Hozumi et al. 1984) (Figure 14). Les gènes codant ces régions sont intégrés dans le génome de myélomes murins, et produisent alors des Ac chimériques souris-humains. Les AcM chimériques peuvent cependant conserver un pouvoir immunogène chez certains patients. En effet, des réactions HAMA ont été détectées chez des patients ayant reçu des AcM chimériques. D'autres techniques ont ainsi été développées pour humaniser une partie des régions variables.. 1.2.2.2.. AcM humanisés : 90-‐95% humains . La deuxième étape d'amélioration des AcM murins a été la création d'Ac humanisés à partir d'Ac chimériques (Figure 14). La plus simple des stratégies d'humanisation implique le transfert des régions complémentaires déterminantes (CDR) codantes du paratope (boucles de liaison à l'Ag) d'un AcM murin vers une IgG humaine (Jones, Dear et al. 1986; Riechmann, Clark et al. 1988; Verhoeyen, Milstein et al. 1988). En résumé, seules les régions 45.

(48) 46.