Régulation de l’expression du récepteur P2Y2 dans les m aladies inflammatoires intestinales
par les facteurs de transcription NF-kB et C/EBPP et son implication dans le processus de réparation de l’épithélium intestinal.
Par
Émilie Degagné
Département d ’anatomie et biologie cellulaire
Thèse présentée à la Faculté de médecine et des sciences de la santé
en vue de l’obtention du grade de philosophiae doctor (Ph.D.) en biologie cellulaire
Sherbrooke, Québec Mai, 2012
M embres du jury d ’évaluation
Pr Femand-Pierre Gendron, Départem ent d ’anatom ie et de biologie cellulaire Pr François Boudreau, Département d ’anatomie et de biologie cellulaire
Pr Abdelaziz Amrani, Départem ent de pédiatrie
Pr Jean-François Côté, IRCM, Département de m édecine, Université de M ontréal
1+1
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RÉSUM É
Régulation de l’expression du récepteur P2Y2 dans les maladies inflam m atoires intestinales par les facteurs de transcription NF-kB et C/EBPp et son im plication dans
le processus de réparation de l’épithélium intestinal.
Par
Émilie Degagné
Département d ’anatomie et biologie cellulaire
Thèse présentée à la Faculté de m édecine et des sciences de la santé en vue de l’obtention du diplôme de philosophiae doctor (Ph.D.) en biologie cellulaire, Faculté de m édecine et des sciences de la santé, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J 1H 5N4.
Les maladies inflammatoires intestinales (M il) sont caractérisées par des périodes d ’inflammation chronique entrecoupées de périodes de rémission. Elles m obilisent l’action de plusieurs molécules pour favoriser le retour à l’homéostasie. Il a été dém ontré que l’expression du récepteur P2Y2 (P2Y2) est augmentée chez les patients atteints de M il et dans un modèle murin de colite chimique. Cette thèse s ’intéresse aux m écanism es de régulation transcriptionnelle du gène de P2Y2 et à son rôle dans les MIL Prem ièrem ent, la disponibilité de la chromatine au prom oteur de P2Y2 a été caractérisée par le statut d ’acétylation des histones H3 et H4 par immunoprécipitation de la chrom atine (ChIP). Le site d ’initiation de la transcription du gène de P2Y2 a été identifié par 5 ’ RLM -RACE. NF-
kB et C/EBPp sont des candidats idéals pour réguler l’expression de P2Y2 puisqu’ils sont impliqués dans la régulation de gènes liés à l’inflamm ation. En utilisant le logiciel TRANSFAC, les sites de liaison potentielle (SLP) de N F -kB et C/EBPp ont été identifiés sur le promoteur du récepteur P2Y2. Ensuite, des essais luciférase ont dém ontré que N F -kB et C/EBPP transactivent le prom oteur de P2Y2 dans les cellules épithéliales intestinales (CEI) en condition inflammatoire ou non. Lorsque ces deux facteurs de transcription sont co-exprimés dans les CEI, on observe une synergie de la transactivation du prom oteur de P2Y2. Par des essais luciférase avec des constructions du prom oteur mutées pour les SLP des facteurs de transcription à l’étude ainsi que par des gels de retardement et des essais de ChIP, nous avons montré que C/EBPp se lie en position -229 à -220pb du prom oteur et que N F -kB se lie en position -181 à -172pb. Finalement, la stim ulation du récepteur P2Y2 active
la voie de signalisation PI-3K/Akt qui inactive GSK-3P favorisant la stabilisation des microtubules permettant à la cellule de m igrer pour réparer une monocouche de CEI blessées. De plus, dans les CEI, l’expression de COX-2 et PG E2 qui sont des molécules importantes pour la réparation tissulaire, est augm entée par la stimulation de P2Y2. In vivo, la stimulation du récepteur favorise la rémission de souris atteintes de colite chimique. Cette thèse démontre donc que l’expression du récepteur P2Y2 dans les M il est régulée par
N F -kB et C/EBPP et que ce récepteur joue un rôle im portant dans les M il en favorisant la phase de rémission.
Mots clés : facteurs de transcription, récepteur P2Y2, inflammation, restitution, migration cellulaire, maladies inflammatoires intestinales
A m a fille Lily, m on m ari Gabriel et m es parents Réjeanne et Alain
Dans vingt ans vous serez plus déçus par les choses que vous n ’avez pas fa ite s que par celles que vous avez faites. Alors sortez des sentiers battus. Mettez les voiles. Explorez.
Rêvez. Découvrez. M ark Twain
TABLE DES M ATIÈRES
RÉSUMÉ...II TABLE DES MA TIÈRES...V LISTE DES TABLEAUX... VII LISTE DES FIGURES... VIII LISTE DES ABBRÉVIA TIONS, SIGLES E T SYMBOLES... X
INTRODUCTION...1
1. L ’i n t e s t i n...l 1. I S tru c tu re et fo n c tio n s de l ’ép ith éliu m in te stin a l... / 2. L ’IMMUNITÉ DE LA MUQUEUSE INTESTINALE...4
2.1 L 'im m u n ité in n é e ... 4
2 .2 L 'im m unité a d a p ta tiv e ... 6
3. Le sm a l a d i e si n f l a m m a t o ir e s i n t e s t i n a l e s... 9
3. / L a m a la d ie de C r o h n ...9
3.2 L a co lite u lc é r e u s e ...11
3.3 La ré p a ra tio n d e la m u q u eu se in te s tin a le ... 12
3.3.1 Première étape de la réparation de blessures : la restitution...12
3.3.2 La deuxième étape de la réparation de blessures : la prolifération... 14
3.3.3 La dernière étape de la réparation de blessures : la maturation... 15
3.3.4 Molécules favorisant la réparation de blessures... 16
4. Le sn u c l é o t i d e s e x t r a c e l l u l a ir e s...17
4 . 1 S o u rc e de n u cléo tid es ex tra c ellu la ire s d ans l'in te s tin ... 17
4.2 C o n c en tra tio n de n u cléo tid es d ans le m ilie u extra c ellu la ire d e l'in te s tin ...19
4.3 M éta b o lism e des n u c lé o tid e s ... 19
4.4 O rig in e de la sig n a lisa tio n p u r in e r g iq u e ... 2 1 5. L e s r é c e p t e u r s p u r i n e r g i q u e s P 2 ...21
5.1 L es ré ce p teu rs m é ta b o tro p iq u e s P 2 Y ...22
5.2 L e ré c e p te u r P 2 Ï 2 ... 23
5.2.1 Localisation génique et polym orphism es g é n é tiq u e s...23
5.2.2 Structure de la p ro téin e...24
5.2.3 Signalisation a ss o c ié e ... 26
5.2.4 D istribution et rôle dans l'o rg an ism e...28
5.2.4 Régulation transcriptionnelle... 30
6. Le FACTEUR d et r a n s c r ip t io n Rf.lA /p6 5 ... 31
6. / S tru c tu re p r o té iq u e ... 31
6.2 R ég u la tio n de l ’activa tio n d e N F -kB p a r la v o ie c a n o n iq u e...32
6.3 R ég u la tio n de l'a c tiv a tio n d e N F -kB p a r les voies a lte rn a tiv e s... 33
6.4 R ég u la tio n de l ’activité d e R elA /p 6 5 p a r d es m o d ific a tio n s p o s t tra d u c tio n n e lle s et l'in te ra c tio n a vec des p ro té in e s ré g u la tric e s... 33
6.5 R ôles et fo n c tio n s d e N F -kB da n s l'in te s tin ... 34
7. LE FACTEUR DE TRANSCRIPTION C /E B P B ... 35
7.1 S tru c tu re p r o té iq u e ... 36
1.2 R ég u la tio n de l'a c tiv ité de C /E B P p ... 36
7.3 R ôles et fo n c tio n s de C /E B P p d a n s l'é p ith é liu m in te stin a l... 37
8. Hy p o t h è s e, o b j e c t i f se tm é t h o d e s... 37
P2Y2 RECEPTOR TRANSCRIPTION IS INCREASED B Y NF-kB AN D STIMULA TES
COX-2 EXPRESSION AND PGE2 RELEASED B Y INTESTINAL EPITHELIAL
CELLS.... 39 Au t e u r s d e l’a r t i c l e...3 9 St a t u t d el’a r t i c l e...39 Av a n t-p r o p o s...3 9 9. Ré s u m é d e l’a r t i c l e...4 0 10. Ab s t r a c t... 42 11. In t r o d u c t i o n... 42 12. Ma t e r ia l s a n d Me t h o d s... 4 4 13. Re s u l t s... 4 9 14. Di s c u s s i o n...58 15. Su p p l e m e n t a ld a t a... 63 16. Ac k n o w l e d g e m e n t s...67 17. Re f e r e n c e s...:... 68 CHAPITRE 2 ...73
P2Y2 RECEPTOR PROMOTES INTESTINAL EPITHELIAL CELL MIGRATION THROUGH A GO PROTEIN AND INTEGRIN a v PATHW AY ALLOWING MICROTUBULE STABILIZATION AND MUCOSAL RE-EPITHELIZATION IN EXPERIMENTAL COLITIS...73 Au t e u r s d e l’a r t i c l e...73 St a t u td e l’a r t i c l e ... 73 Av a n t-p r o p o s... 73 18. RÉSUMÉ DE L’ARTICLE...74 19. Ab s t r a c t... 76 2 0 . In t r o d u c t i o n... 77 2 1 . Ma t e r ia l s a n dm e t h o d s... 80 2 2 . Re s u l t s... 84 2 3 . Di s c u s s i o n... 97 2 4 . Su p p l e m e n t a ld a t a... 101 2 5 . Ac k n o w l e d g m e n t s... 102 2 6 . Re f e r e n c e s... 103 CHAPITRE 3... 107
P2Y2 RECEPTOR EXPRESSION IS REGULATED BY C/EBPB DURING INFLAMMATION IN INTESTINAL EPITHELIAL CELLS...107
Au t e u r sd e l’a r t i c l e...107 St a t u td e l’a r t i c l e... 107 Av a n t-p r o p o s... 107 2 7 . RÉSUMÉ DE L’ARTICLE... 108 2 8 . Su m m a r y... 110 2 9 . In t r o d u c t i o n... 111 3 0 . Re s u l t s... 112 3 1 . Di s c u s s i o n... 118 3 2 . Ma t e r ia l sa n d m e t h o d s...120 3 3 . Ac k n o w l e d g e m e n t s...126 3 4. Re f e r e n c e s... 127 3 5. Su p p l e m e n t a l d a t a... 130 DISCUSSION...131 CONCLUSION...142
VII
REMERCIEMENTS...145
LISTES DES PUBLICA TIONS... 146
ANNEXES...163 A n n e x e 1 : Ar t i c l e sp u b l i é s e nt a n tq u e d e u x i è m ea u t e u r...163 An n e x e 2: DAI e t t r a n s l o q u a t i o n b a c t é r i e n n e d a n s l a r a i e d e s o u r i s P2Y," a t t e i n t e s d'u n e C O U T E CHIM IQ UE... 165 A n n e x e 3 : T r a n s a c t i v a t i o n d u p r o m o t e u r d u r é c e p t e u r P 2 Y 2 d a n s l e s c e l l u l e s C a c o - 2 p a r l e s FACTEURS DE TRANSCRIPTION C /E B P A ET C /E B P a ... 167
Ta b l e a u 1. Ca r a c t é r i s t i q u e s d e s r é c e p t e u r s P2Y ...
LISTE DES FIGURES Fi g u r e 1. Ar c h i t e c t u r e d e l'é p i t h é l i u m d u c ô l o n e t d e l'i n t e s t i n g r ê l e... 3 Fi g u r e 2 . Le s y s t è m e i m m u n i t a i r e i n t e s t i n a l e n c o n d i t i o n p h y s i o l o g i q u e e t P A T H O L O G IQ U E ... 8 F i g u r e 3 . R é g u l a t i o n d e l a m i g r a t i o n c e l l u l a i r e p a r l e c y t o s q u e l e t t e d ’a c t i n e e t LES M I C R O T U B U L E S ... 1 5 Fi g u r e 4 . Re p r é s e n t a t i o n s c h é m a t i q u e d e s e c t o-n u c l é o t i d a s e s... 2 0 Fi g u r e 5 . Re p r é s e n t a t i o n d e l a s t r u c t u r e e n d e u x d i m e n s i o n s d u r é c e p t e u r P 2 Y 2 h u m a i n... 2 6 Fi g u r e 6 . Sc h é m a r e p r é s e n t a n t l e s v o i e s d e s i g n a l i s a t i o n a c t i v é e s p a r l e RÉCEPTEUR P 2 Y 2 ... 2 7 Fi g u r e 7 . Vo i e s d’a c t i v a t i o n d u f a c t e u r d e t r a n s c r i p t i o n N F-kB... 3 2
ADN : Acide désoxyribonucléique ADP: Adénosine diphosphate AMP: Adénosine monophosphate ARF : ADP-ribosylation factor ARN: Acide ribonucléique
ARP2/3: A ctin-related protein 2/3
ATG16L1: Autophagy related 16- like 1 ATP: Adénosine triphosphate
Bcl-XL: B-cell lym phoma-extra large BCR: B cell recetor
BMP: Bone m orphogenetic protein BrdU: 5-bromo-2'-deoxyuridine BRE: B recognition element bZIP: Basic leucine zipper domain
C/EBPp : CCAAT-enhancer binding protein beta
CARD 15: Caspase recruitment dom ain-containing protein 15 CBP: CREB-binding protein
Cdc42: Cell division control protein 42 homolog CEI: Cellule épithéliale intestinale
ChIP: Chromatin immunoprécipitation CK2: Casein Kinase II
CMH: Complexe m ajeur d ’histocompatibilité COX-2: Cyclooxygénase 2
DAG: Diacylglycérol
DPE: Downstream promoter element DSS: Dextran sodium sulfate
EGF: Epidermal growth factor
EGFR: Epidermal growth factor receptor ENaC: Epithelial sodium channel
ERK: Extracellular signal-regulated kinases FAK: Focal adhesion kinase
GDP: Guanoside diphosphate GPCR: G protein-coupled receptor GSK-3P: Glycogen synthase 3 beta GTP: guanosine triphosphate HDAC: Histone déacétylase
HEK-293T: Human embryonic kidney-293T H esl : Hairy and enhancer o f split 1
HGF: Hepatocyte growth factor HLA: Human leukocyte antigen IEC: Intestinal epithelial cell IEL: Intraepithélial lymphocyte IFN-y: Interféron gamma IGF: Insulin growth factor IKK: IkB kinase
IL: Interleukine
ILK: Integrin-linked kinase INR: Initiator element
IP3: Inositol 1,4,5-triphosphate
IP3R: Inositol 1,4,5-triphosphate receptor KGF: Keratinocyte growth factor
LAP: Liver-enriched activator protein
Lgr5: Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5 LIP: Liver-enriched inhibitory protein
LPS: Lipopolysacharide
MAPK: M itogen-activated protein kinase MCP-1 : M onocyte chemotactic protein-1 MEK: M APK kinase
miARN: Micro acide ribonucléique MIL M aladies inflammatoires intestinales MLC-2; M yosin light chain II
NKT: Natural killer T cell
NOD: Nucleotide Oligomerization domain PDLIM4: PDZ and LIM domain protein 4 PGE2: Prostaglandine E2
PI-3K: Phosphoinositide 3-kinase PKC: Protein kinase C
PLC: Phospholipase C
PPAR-y: Peroxysome proliferator-activated receptor gamma PPi: Pyrophosphate
Pyk2: Protein tyrosine kinase 2
Rac: Ras-related C3 botulinum toxin substrate
RANTES: Regulated upon activation, normal T-cell expressed and secreted RCPG: Récepteur couplé aux protéines G
ReglIIy: Regenerating islet-derived protein 3 gam ma
RelA: v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A RGD: Arginine/Glycine/Aspartic acid
RGE: Arginine/Glycine/Glutamic acid RhoA: Ras homolog gene family m em ber A ROCK: Rho-associated protein kinase SH3: SRC homology 3 domain
shRNA: Short-hairpin ribonucleic acid SLP: Site de liaison potentiel
Spl : Specific protein 1
STAT3: Signal transducer and activator o f transcription 3 SW I/SNF: SW Itch/Sucrose Non Fermentable
TBP: TATA-binding protein TCR: T-cell receptor
TFIID: Transcription factor II D TFIIFI: Transcription factor II H
TGF-a: Transform ing growth factor alpha TGF-(3: Transform ing growth factor beta
T»: T helper cell
TLR: Toll-like receptor
TN F-a: Tum or necrosis factor alpha
TRAF: Tum or necrosis factor-associated factor Treg: Regulatory T cell
Trem2: Triggering receptor expressed on m yeloid cells 2 UDP: Uridine diphosphate
UMP: Uridine monophosphate UTP: Uridine triphosphate
1. L ’intestin
Selon Taxe rostro-caudal, l’intestin se subdivise en deux entités intim em ent liées, soit l’intestin grêle et le côlon (Tortora et Grabowski, 2001). L ’intestin grêle est divisé en trois sections distinctes et com plémentaires soit le duodénum , le jéjunum et l’iléon. Le côlon est subdivisé en quatre parties soit le côlon ascendant, transverse, descendant et sigmoïde.
1.1 Structure et fonctions de (’épithélium intestinal
L’axe crypte-villosité est l’unité fonctionnelle qui caractérise l’architecture de l’épithélium de l’intestin grêle (voir Figure 1). La crypte est l’endroit où sont localisées les cellules souches qui donneront naissance aux cellules différenciées. La localisation exacte de ces cellules dans la crypte est encore source de discussion. Des études antérieures ont démontré que les cellules souches étaient localisées à la base de la crypte (Bjerknes et Cheng, 1981; Potten et al., 1997). Le récepteur Lgr5 qui est un récepteur orphelin couplé aux protéines G est un marqueur spécifique des cellules souches adultes qui a récem m ent perm is de confirmer la présence de cellules souches à la base de la crypte (Li et Clevers, 2010; May et al., 2009; Sato et al., 2009; Scoville et al., 2008). Toutefois, en utilisant des m arqueurs de prolifération comme la thymidine triciée ou le BrdU qui s’incorporent à l’ADN des cellules en division, d ’autres équipes ont plutôt localisé les cellules souches à la position +4 à partir de la base de la crypte (Batlle, 2008; Potten et al., 2002). Selon certaines études, les cellules en position +4 seraient des cellules souches quiescentes responsables de la réparation suivant une blessure alors que les cellules souches Lgr5+ du fond de la crypte serait responsables du renouvellem ent physiologique des cellules de l’axe crypte-villosité (Li et Clevers, 2010; M ay et al., 2009; Scoville et al., 2008).
Dans la niche des cellules souches, on retrouve des cellules m ésenchym ateuses qui sécrètent des facteurs essentiels pour le m aintien de la fonction des cellules souches. Elles sécréteront ainsi les ligands de la voie Wnt qui favorise la survie et la prolifération des cellules souches ainsi que des antagonistes des BM Ps qui permettent aux cellules souches de rester indifférenciées. Ainsi dans l’intestin, on retrouvera un gradient d ’expression de
2
Wnt décroissant vers la villosité et un gradient d ’expression des BMPs décroissant vers la crypte (G regorieff et al., 2005). Lorsque les cellules souches se divisent, elles donneront naissance aux cellules progénitrices qui en migrant le long de la crypte seront exposées à des concentrations croissantes de BMPs favorisant leurs différenciations (Haramis et al., 2004). Bien que les BMPs soit essentiels pour la différentiation des cellules progénitrices, c ’est la voie de signalisation Notch qui permettra d ’effectuer la différentiation terminale. Les cellules progénitrices dans lesquelles la voie Notch sera activée perm ettront la transcription du facteur de transcription H esl qui est un répresseur de la transcription du facteur de transcription M athl (Tam ura et al., 1995; Yang et al., 2001). Ces cellules progénitrices dépourvues de l’expression de M athl deviendront des cellules absorbantes (Yang et al., 2001). Dans les cellules progénitrices dans lesquelles la voie de signalisation Notch n ’est pas activée, il y aura expression du facteur de transcription M athl perm ettant la différenciation terminale des cellules en cellules de la lignée sécrétrice (M ilano et al., 2004). Les cellules seront donc pleinement différenciées à l ’atteinte de la jonction crypte- villosité et elles auront une survie d’environ trois jours puisque le renouvellem ent constant de l’épithélium intestinal les pousse à migrer vers la pointe de la villosité où elles seront exfoliées par anoïkose (Hall et al., 1994).
Les cellules différenciées composant l’intestin grêle sont les cellules absorbantes nom m ées entérocytes et les cellules de la lignée sécrétrice soit les cellules caliciformes, les cellules de Paneth et les cellules entéroendocrines. Les entérocytes représentent plus de 80% des cellules de la muqueuse (Karam, 1999). Ils sont responsables de la digestion, de l ’absorption et du transport des nutriments contenus dans le bol alimentaire. Les cellules caliciformes représentent 4% à 16% des cellules de la muqueuse (Karam, 1999). Elles sécrètent des mucines et des facteurs en trèfles qui ont pour rôle de protéger l’épithélium contre les assauts des bactéries et des molécules délétères pour le maintien de l ’hom éostasie intestinale (Tortora et Grabowski, 2001). Les cellules entéroendocrines représentent environ 1% des cellules de la muqueuse (Schonhoff et al., 2004). On compte une quinzaine de sous-types de cellules entéroendocrines qui sont responsables de la sécrétion de différentes hormones (Schonhoff et al., 2004). Les cellules de Paneth constituent le dernier type cellulaire différencié qui compose l’axe crypte-villosité. Contrairem ent aux autres types cellulaires différenciés présentés, les cellules de Paneth entreprennent une migration
4
L’épithélium du côlon présente une architecture similaire à celui de l ’intestin grêle à l’exception de la présence de villosités dont il est dépourvu (voir Figure 1). Les cellules souches se retrouvent au fond des cryptes et en se divisant donnent naissance aux cellules progénitrices qui vont migrer vers le haut de la crypte vers l’épithélium de surface. La voie de signalisation Wnt joue ici aussi un rôle de m aintient de la survie et de la prolifération des cellules souches (Kuhnert et al., 2004). Les cellules m ésenchym ateuses péricryptales exprim eront plusieurs antagonistes de la voie des BM P soit la grem lin-1 et la gremlin-2 ainsi que la chordin-1 afin de garder l’environnem ent de la niche des cellules souches propices à la prolifération (Kosinski et al., 2007). Afin de permettre la différentiation des cellules progénitrices, la présence d ’un gradient d ’expression décroissant des BM P de l’épithélium de surface vers le fond de la crypte sera observée (Hardwick et al., 2004). Une autre molécule importante pour la différentiation des cellules progénitrices est Indian Hedgehog. Cette protéine est exprimée par les côlonocytes et entraîne l ’augm entation de l’activation de la voie des BMPs et limite l’expression de W nt à l’épithélium de surface (van den Brink et al., 2004; van Dop et al., 2009). Dans le côlon, on retrouvera trois types de cellules épithéliales différenciées soit les cellules entéroendocrines, les cellules caliciformes et finalement les côlonocytes. Les colonocytes tout comme les entérocytes de l’intestin grêle ont des propriétés d ’absorption. Cependant, les colonocytes sont spécialisés dans l’absorption de l’eau et des électrolytes contenus dans la lumière intestinales (Karam,
1999; Tortora et Grabowski, 2001)
L ’épithélium intestinal n ’a pas seulement que des fonctions de digestions et d ’absorption, il permet aussi le maintien de l ’homéostasie intestinale en participant à l’im m unité innée.
2. L ’imm unité de la muqueuse intestinale 2.1 L ’immunité innée
La barrière épithéliale représente la première ligne de défense de l’intestin contre l’environnement extérieur. Elle perm et l’absorption des nutriments, de l’eau et des électrolytes en plus de maintenir une défense efficace contre les toxines de la lumière intestinale, des antigènes et la microflore. L ’épithélium maintient sa fonction de barrière
par la formation de différents types de jonctions cellulaires qui permettent de lier entre elles les cellules adjacentes et de sceller l’espace intercellulaire (Groschwitz et Hogan, 2009). Les différents types de cellules différenciées qui composent l ’épithélium intestinal ont des rôles complémentaires et distincts à jo u e r dans l’immunité innée. Les cellules caliciformes sécrètent différentes mucines permettant la formation d ’une couche de m ucus qui protège la barrière épithéliale en limitant le contact des bactéries pathogènes et celles de la microflore sans em pêcher la diffusion des nutriments, de l’eau et des électrolytes (G arrett et al., 2010). Les cellules de Paneth produisent et stockent dans des granules de sécrétions de multiples molécules antimicrobiennes comme les défensines, les lysozymes et les cathélicidines (Garrett et al., 2010; Ito et al., 2012). Les cellules entéroendocrines sont positionnées stratégiquement le long de l’épithélium intestinal. Ces cellules expriment, par ailleurs, des récepteurs de type Toll et suivant des stimuli microbiens ou alimentaires (par exem ple la présence de glucose) sécréteront différentes chimiokines, hormones et défensines (Garrett et al., 2010; Selleri et al., 2008). Finalem ent les entérocytes et les côlonocytes expriment différents récepteurs PAMP (pathogen-associated m olecular patterns) com me certains récepteurs de type Toll et des récepteurs de reconnaissance de pathogène intracellulaire (NOD) qui suivant leurs activations produisent des défensines, des cytokines et des chimiokines (Garrett et al., 2010; M uller et al., 2005).
Finalement les cellules du système immunitaire résidentes de l’intestin soit les macrophages, les cellules dendritiques et les lymphocytes intraépithéliaux (IEL) participent aussi à l’immunité innée. Les m acrophages résidents de l’intestin sont un type de cellules spécialisées de la lamina propria participant à l’immunité innée. Les m acrophages résidents sont anergiques et ils se caractérisent par une forte activité phagocytaire, mais par une faible capacité à produire et à sécréter des cytokines (Smythies et al., 2005). De plus, il n ’est pas encore établi si les macrophages résidents peuvent faire la présentation d ’antigènes et ainsi participer à l’immunité adaptative (Smith et al., 2011).
On compte deux sous-types d ’IEL, soit les a(3 IEL et les yô IEL (Sheridan et Lefrancois, 2010). Les IEL participent à l’immunité innée en produisant des facteurs antim icrobiens tel que Regllly permettant de contrôler l ’invasion de la microflore intestinale (Ismail et al., 2011). De plus, lors de la présence d ’une brèche dans l’épithélium intestinal du côlon, les
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IEL vont sécréter le facteur de croissance KGF qui entraînera la m igration et la prolifération des cellules de l’épithélium favorisant ainsi l ’intégrité de la barrière épithéliale (Chen et al., 2002b). Dernièrement, il a été démontré que les cellules dendritiques participaient aussi à l’imm unité innée puisqu’en présence de flagelline, elles sont responsables de la production d ’IL-23 qui à son tour augm ente l’expression de la molécule antimicrobienne Regllly (Kinnebrew et al., 2012).
2.2 L ’im m unité adaptative
L’immunité adaptative fait appel à la réponse hum orale via la production d ’anticorps par les lym phocytes B et à la réponse à médiation cellulaire via l’activation des lym phocytes T. Les différentes populations de lymphocytes B et T possèdent un récepteur nommé respectivem ent BCR et TCR qui reconnaissent les complexes majeurs d ’histocom patibilité (CM H) présentant les antigènes à la surface de toutes les cellules (Parham, 2003). Les CMH comportent deux sous-types : le CMH de classe I qui est exprim é par toutes les cellules et le CMH de classe II qui est exprimé par les cellules présentatrices d ’antigènes telles que les cellules dendritiques et les cellules M qui sont présentes dans l’intestin (Parham, 2003).
L’intestin comprend des structures spécialisées appelées tissus lymphoïdes associés aux muqueuses dénommées plaques de Peyer dans l ’intestin grêle qui renferm ent des populations de lymphocytes B et T (Abraham et Cho, 2009; Parham, 2003). Les lymphocytes T auxiliaire qui se subdivisent en plusieurs sous-types se lient aux CM H de classe II des cellules présentatrices d ’antigène (Parham, 2003). L’activation de ces lymphocytes est maximale suivant la liaison de leur corécepteur avec la cellule présentatrice d ’antigène (Parham, 2003). C ’est en présence de différentes cytokines et chimiokines que les lymphocytes T auxiliaires pourront se différencier en différents sous- types. La présence d ’IFN-y et d ’IL-12 favorisera la différentiation en lym phocytes T u l qui sécréteront de l’IFN-y (Abraham et Cho, 2009). La présence d ’IL-4 favorisera la différentiation en lymphocytes Th2 qui sécréteront de l’IL-4, de l’IL-5 et de l’IL-13 et participeront à l’activation et à la prolifération des lymphocytes B qui produiront les anticorps (Abraham et Cho, 2009). La présence de TGF-P, d ’IL-1 et d ’IL-6 perm ettra la
différentiation en lymphocytes Th17 qui produiront des cytokines telles l’IL 17, l ’IL-21, l’IL-22 et l’IL-2 et perm ettra de limiter les infections bactériennes et stim ulera le recrutem ent des neutrophiles aux sites d ’inflam m ation (Abraham et Cho, 2009; W eaver et al., 2007). Finalement, la présence de TGF-P perm ettra la différentiation en lymphocytes Treg qui sécrètent des molécules anti-inflam m atoires telles l’IL-10 et le TGF-P et perm ettra de dim inuer la réponse inflammatoire (Abraham et Cho, 2009; Sakaguchi et Sakaguchi, 2005).
La régulation fine de la réaction immunitaire de l’intestin, par exemple contre les bactéries de la microflore, est essentielle pour le m aintien de l’homéostasie de cet organe. Un déséquilibre de la réponse immunitaire peut entraîner le développem ent de m aladies inflammatoires intestinales comme illustré à la Figure 2.
contexte, l’épithélium forme une barrière recouverte de mucus qui favorisera en collaboration avec les cellules de la lamina propria, l’hom éostasie de l’intestin. B) L’inflammation peut être causée par des brèches dans l’épithélium, une couche de mucus absente ou réduite, une perméabilité accrue, une augm entation de l’adhérence des bactéries à l’épithélium favorisant ainsi l’activation de la réponse immunitaire afin de favoriser un retour rapide à l’homéostasie intestinale. Chez les patients atteints de maladies inflammatoires intestinales, une susceptibilité génétique résultera en une suractivation du système imm unitaire envers la présence de bactéries et d ’antigènes. Cette suractivation aura pour effets d ’augmenter la sécrétion de cytokines pro-inflam matoires, d ’augm enter la perméabilité de la barrière épithéliale et de dim inuer la tolérance en favorisant la génération de cellules T h l7 . Tiré et adapté de (Abraham et Cho, 2009).
3. Les maladies inflam m atoires intestinales
La maladie de Crohn et la colite ulcéreuse sont des m aladies du tube digestif regroupées sous le terme général de maladies inflam m atoires intestinales. Ces m aladies résulteraient d ’une réponse inflammatoire inappropriée aux bactéries de la microflore intestinale chez un individu susceptible génétiquement (Abraham et Cho, 2009). Entre 1998 et 2000, la prévalence de la maladie de Crohn s’élevait à 223,7 cas par 100 000 habitants alors que l’incidence était estimée à 13,4 nouveaux cas par 100 000 habitants faisant du Canada le pays avec la plus haute prévalence et incidence jam ais rapporté (Bernstein et al., 2006). Au Canada, durant ces mêmes années, la prévalence de la colite ulcéreuse était de 193,7 cas par 100 000 habitants alors que l’incidence était estimée à 11,8 nouveaux cas par 100 000 habitants (Bernstein et al., 2006).
3.1 La m aladie de Crohn
La maladie de Crohn peut affecter tout le tube digestif de la bouche à l’anus mais affecte principalement la jonction iléo-caecal (M acdonald et M onteleone, 2005). Les lésions inflammatoires sont transmurales c ’est-à-dire q u ’elles peuvent affecter toutes les couches tissulaires formant l’intestin. Les lésions inflammatoires se présenteront sous forme discontinue le long du tube digestif (M acdonald et Monteleone, 2005). L ’inflam m ation retrouvée consiste principalement en la présence de lymphocytes T et de m acrophages (M acdonald et M onteleone, 2005). Le patient présentera des signes cliniques caractérisés
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par des douleurs abdom inales, des diarrhées chroniques et par une perte de poids importante (Yamada, 2009).
Les patients atteints de cette maladie présentent des prédispositions génétiques complexes pouvant conduire à un dérèglement du système immunitaire face à la m icroflore intestinale (M acdonald et M onteleone, 2005). Plusieurs patients vont présenter des polym orphism es dans un ou plusieurs gènes de susceptibilité pouvant être regroupés en différentes catégories (Tsianos et al., 2011). La prem ière catégorie représente les gènes associés aux récepteurs de reconnaissance de patrons m oléculaires tels les gènes NOD2 (C A R D 15) et TLR. Par exemple, dans les cellules de Paneth des m utations dans NOD2 ont été associées avec une diminution de l’expression de peptides antimicrobiens comme l’a-défensines (W ehkamp et al., 2004). La deuxième catégorie com prend les gènes situés sur le locus nommé IBD5 et qui seraient impliqués dans l’homéostasie de la barrière épithéliale. Par exemple, une mutation dans le gène PDLIM 4 pourrait promouvoir la contraction des filaments d ’actine dans les cellules épithéliales et du coup augmenter la perm éabilité paracellulaire (Reinhard et Rioux, 2006).
La troisième catégorie regroupe les gènes liés à la réponse immunitaire adaptive et à l’apoptose soit CMH et HLA. Des mutations dans le gène de HLADRB1 sont associées à la maladie de Crohn et à la colite ulcéreuse et pourraient occasionner une réponse imm unitaire inappropriée (Annese et al., 2005). La quatrièm e catégorie rassemble les gènes impliqués dans la différentiation lymphocytaire tels IL23R et STAT3. Il a été dém ontré q u ’un polymorphisme dans le gène d ’IL23R favorise une augmentation de la concentration de la cytokine pro-inflammatoire IL-22 dans le sérum de patients atteints de la maladie de Crohn (Seiderer et al., 2008).
La dernière catégorie comprend le gène relié à l ’autophagie ATG16L1. L ’autophagie permet la dégradation de composants du cytoplasm e en période où il y a un m anque de nutriments. Durant les infections, l’autophagie est employée pour dégrader les pathogènes qui ont pénétré à l’intérieur de la cellule (N aser et al., 2012). Rioux et collaborateurs ont démontré le rôle essentiel d ’A TG 16Ll dans l’autophagie de bactéries en utilisant des cellules HEK-293T dont le gène d ’A TG 16L l a été invalidé. Ils ont dém ontré que dans ces
cellules, il n ’y avait plus d ’autophagie dirigée envers les bactéries pathogènes (Rioux et al., 2007).
3.2 La colite ulcéreuse
La colite ulcéreuse est caractérisée par la présence d ’inflammation qui n ’affectera que la muqueuse intestinale de façon continue débutant au rectum et pouvant atteindre tout le côlon suivant la progression de la maladie (M acdonald et M onteleone, 2005). Les patients atteints de colite ulcéreuse vont présenter les signes cliniques suivant : diarrhées sanglantes avec présence de mucus ou non, douleurs abdominales, perte de poids et fièvre (Danese et Fiocchi, 2011).
Un modèle proposé pour expliquer la pathogenèse de la colite ulcéreuse im plique tout d ’abord des glycolipides qui proviennent soit des côlonocytes et/ou des bactéries et qui entraînent l’augm entation de l’expression du récepteur de l’IL-13 des cellules N K T (natural killer T) (Danese et Fiocchi, 2011). Les cellules NK T reconnaissent les glycolipides et, en absence de ceux-ci, peuvent répondre aux cytokines sécrétées par les cellules dendritiques (Tupin et al., 2007). Les cellules N K T produisent de l’IL-13 qui agissant de manière autocrine permet l’expansion du nombre de ces cellules dans la m uqueuse du côlon créant des dommages important à celle-ci (Danese et Fiocchi, 2011). Lorsque la m uqueuse est endommagée, il y aura entrée dans l’organisme de bactéries et d ’antigènes présents dans la lumière du côlon qui favoriseront l’activation des cellules présentatrices d ’antigènes telles les cellules dendritiques qui pourront à leur tour activer les lym phocytes T et les macrophages résultant en la production et la sécrétion d ’un cocktail de cytokines pro inflammatoires (Danese et Fiocchi, 2011). Les côlonocytes activées par la présence d ’IL- ip sécréteront de l’IL-8, un puissant chim io-attractant pour le recrutem ent des neutrophiles au site d ’inflammation. Les côlonocytes produiront aussi des chimiokines telles MCP-1 et RANTES qui attireront et activeront respectivem ent les macrophages et les cellules T auxiliaires (Danese et Fiocchi, 2011). Les cellules T auxiliaires de type 2 produiront de l ’IL-13 et de l’IL-5 contribuant respectivement à la dégradation de la muqueuse et au recrutement et à l’activation des éosinophiles (Danese et Fiocchi, 2011). De plus, des variantes génétiques associées à la colite ulcéreuse entraînent une réduction de la sécrétion
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de PPAR-y par les côlonocytes, des anom alies dans la production et la sécrétion de mucus et dans la présence et l’activation de lymphocytes T auxilliaires de type régulateur (Treg) (Danese et Fiocchi, 2011).
3.3 La réparation de la m uqueuse intestinale
Le maintien de l’intégrité de la barrière épithéliale intestinale est essentiel afin de prévenir l’entrée dans l’organisme d ’antigènes, de microorganismes et de virus (Laukoetter et al., 2006; W atson et al., 2005). Suivant, une blessure qui pourrait être causée par une réponse immunitaire incontrôlée telle qu ’observée chez les patients atteints de maladies inflammatoires intestinales, des m écanism es de réparation doivent s ’enclencher afin de retrouver le plus rapidement possible l’intégrité de la barrière épithéliale. Le processus de réparation épithéliale peut être divisé en trois étapes distinctes qui sont interdépendantes et qui se superposent dans le temps. Ces trois étapes sont : la restitution, la prolifération et finalement la maturation.
3.3.1 Première étape de la réparation de blessures : la restitution
L ’étape de restitution survient dans les minutes suivant la blessure. Cette étape implique la migration des cellules adjacentes à la blessure de façon à refermer le plus rapidement possible la brèche. Ces cellules subiront un changement de forme et de phénotype grâce à l’adoption d ’une transition épithéliale-m ésenchyme causée entre autres par une réorganisation du cytosquelette d ’actine qui entraînera la formation de lam ellipodes au front de migration. Ces lamellipodes sont obtenus suivant le désassem blage des m icrovillosités de la bordure en brosse (Albers et al., 1995). Brièvem ent et comme illustrée sur la Figure 3, au front cellulaire, il y aura activation de la petite protéine G Rac qui stimule la formation de ïam ellipode par la réorganisation du cytosquelette d ’actine. Tout d ’abord, il y aura formation d ’embranchement d ’actine produit à la m em brane plasm ique par l’activation des molécules W ASP-Arp2/3 (Le Clainche et Carlier, 2008). Ces embranchements seront m aintenus par l’addition constante de m olécule d ’actine sous l’action de la profiline. Les lamellipodes seront ancrés à la matrice extracellulaire par des complexes focaux. Alors que la cellule migre vers l’avant, les complexes focaux vont se retrouver sur les côtés latéraux de la cellule et devenir plus dense en intégrines (W
ehrle-Haller et Imhof, 2003). Ces complexes focaux seront liés au cytosquelette d ’actine par les fibres de stress qui sont créées suivant l’activation de RhoA. Finalement, les com plexes focaux qui se sont densifiés se localiseront à l ’arrière de la cellule où ils porteront le nom de contacts focaux (W ehrle-Haller et Imhof, 2003). Les m icrotubules s’attacheront à ses contacts focaux et exerceront une force de traction vers l’intérieur de la cellule permettant ainsi le détachement des contacts focaux de la matrice extracellulaire et l’avancem ent de la cellule (W ehrle-Haller et Imhof, 2003).
Le rôle du cytosquelette d ’actine dans la m igration cellulaire est am plem ent étudié. Récemment, des études ont démontré que les m icrotubules jouent aussi un rôle essentiel dans la prom otion de la migration cellulaire (W atanabe et al., 2005; W ehrle-Haller et Imhof, 2003). Les microtubules sont en état d ’instabilité dynamique, c ’est-à-dire que l’extrémité positive du microtubule est sujette à la polym érisation/dépolym érisation. Ceci permet aux microtubules d ’explorer l’espace intracellulaire (Kirschner et M itchison, 1986). Durant la migration cellulaire, il y aura une stabilisation des extrém ités positives des microtubules leur perm ettant de se polariser vers le front de m igration. Plusieurs modifications post-traductionnelles de la tubuline perm ettent d’augm enter sa stabilité. Parmi celle-ci la détyrosination et l’acétylation de l’a-tubuline. La détyrosination est catalysée par la carboxypeptidase qui est une détyrosinase cytosolique, (H am m ond et al., 2008) alors que l’acétylation est catalysée par le com plexe d ’histone acétyltransférase Elongator (Creppe et al., 2009).
La première étude à décrire qu ’il y avait une polarisation et une stabilisation des m icrotubules vers le front de m igration a été réalisée par Gundersen et collaborateurs. Ils ont démontré que dans les vingt m inutes suivant une blessure d ’une monocouche de fibroblastes murins, que les m icrotubules s’orientaient vers le front de m igration et q u ’il y avait une augm entation de la détyrosination de ces microtubules. (Gundersen et Bulinski, 1988). Des études subséquentes ont démontré que cette stabilisation des microtubules de la cellule en migration était régulé par la protéine Rho et son effecteur m D ia (Cook et al.,
1998; Palazzo et al., 2001).
Le rôle de l’acétylation de l’a-tubuline dans la stabilisation et la prom otion de la migration cellulaire est relativement récent. U ne étude réalisée par Creppe et collaborateurs a
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identifié que le complexe d ’histone acétyltransférase Elongator étaient responsables de l’acétylation de fa -tu b u lin e (Creppe et al., 2009). De plus, ils ont dém ontré que l’utilisation d ’un mutant non-acétylable de l’a-tubuline empêchait la m igration cellulaire de neurones corticaux de rat. Le rôle de l’acétylation dans la promotion de la migration cellulaire pourrait être de favoriser le transport de cargo contenant des élém ents du cytosquelette ou des protéines requises pour la m igration (Creppe et al., 2009).
Les études présentées dans cette section dém ontrent que c ’est par l’action coordonnée du cytosquelette d’actine et des microtubules que s’effectue la migration cellulaire nécessaire à l’étape de restitution.
3.3.2 La deuxième étape de la réparation de blessures : la prolifération
L ’étape de prolifération survient dans les heures ou les jo u rs suivant la blessure. Les cellules souches de l’intestin vont générer un grand nombre de cellules progénitrices qui perm ettra de remplacer le pool de cellules endom m agées suivant la blessure (D ignass et Podolsky, 1993). L’apparition d ’une brèche dans l’épithélium intestinal perm et un recrutement important de macrophages afin de contrôler l’invasion des bactéries de la flore intestinale (Pull et al., 2005). Cependant, des études récentes suggèrent que ce ne serait pas là le seul rôle des macrophages lors de réparation de blessures. Il existe deux types de macrophages : M l et M2. Les macrophages M l sont obtenus suivant la stim ulation avec des cytokines pro-inflam matoires comme l’IL -ip , le LPS ou encore le T N F -a (Ricardo et al., 2008). Les macrophages^Ml seront responsables de la sécrétion de plusieurs cytokines dont le TN F-a, l’IL-6 et l’IL-12 ainsi que de la production d ’oxyde nitrique (Ricardo et al., 2008). Les m acrophages M2 sont principalem ent obtenus suivant la stim ulation par les cytokines IL-4 et IL-13 (Lolmede et al., 2009; Ricardo et al., 2008). Les m acrophages M2 sont associés à la réparation tissulaire entre autres parce q u ’ils produisent et sécrètent du VEGF et des M MP9 associés au remodellage de la membrane basale (Lolmede et al., 2009). Une étude réalisée par Pull et collaborateurs a démontré que des m acrophages vont se localiser à proxim ité des cellules souches et exprim er différentes m olécules (facteurs de croissance, métalloprotéases, etc.) qui vont favoriser la prolifération de ces cellules (Pull et al., 2005). Une autre étude réalisée en 2008 par Seno et collaborateurs a aussi dém ontré le rôle des macrophages dans la promotion de la prolifération cellulaire. En effet, les
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seront responsables de la rétraction des contacts focaux à l’arrière de la cellule perm ettant à celle-ci d ’avancer alors q u ’au devant de la cellule les microtubules seront responsables de la livraison de cargo vers les complexes focaux et les lamellipodes. Tiré, adapté et modifié de (W ehrle-Haller et Imhof, 2003).
3.3.4 Molécules favorisant la réparation de blessures
La régulation de chacune des étapes du processus de réparation épithéliale est favorisée par différents signaux extracellulaires. Plusieurs facteurs de croissance, cytokines et chimiokines tels le TGF-a, le TGF-p, l’EGF, l’HGF, le KGF, l’IGF-I, l’IGF-II, l ’IL -lp , l’IL-2 et les peptides en trèfle ont été impliqués dans les étapes de restitution et de prolifération (Ciacci et al., 1993; Dignass et al., 1994a; Dignass et al., 1994b; Dignass et Podolsky, 1993; 1996; Dignass et al., 1994c; Housley et al., 1994; O hneda et al., 1997; Park et al., 1992). Le TGF-P jo u e un rôle central dans la restitution bien q u ’il inhibe la prolifération des cellules épithéliales intestinales (Dignass et Podolsky, 1993). Plusieurs des facteurs de croissance et cytokines m entionnés ci-haut favorisent la restitution en augmentant la production de TGF-P bioactif résultant en l’activation de sa voie de signalisation (Dignass et al., 1994b; Dignass et Podolsky, 1993; 1996; Dignass et al., 1994c). Le TGF-P permet suivant sa liaison avec son récepteur de type sérine/thréonine kinase l’activation des effecteurs SMAD. Les effecteurs SM AD transloquent au noyau de la cellule et se lient à leurs promoteurs cibles permettant la transcription de gènes qui favorisent le remodelage de la matrice extracellulaire ainsi que l’expression d ’intégrines nécessaire à la migration des cellules épithéliales (Ciacci et al., 1993; Faler et al., 2006; Schiller et al., 2004).
Il a été dém ontré dans les cellules épithéliales intestinales q u ’u n des gènes cibles du TGF-p est COX-2 (Shao et al., 1999). COX-2 est une enzyme responsable de la production des prostaglandines. Cette enzyme est exprimée très faiblem ent dans l ’intestin en conditions normales (Singer et al., 1998). Cependant, elle est rapidement exprim ée suivant des dommages à la muqueuse com me observés chez les patients atteints de m aladies inflammatoires intestinales (Singer et al., 1998). COX-2 catalysera la production de prostaglandines E2 qui en condition normale régulent plusieurs processus nécessaire au maintien de l’homéostasie intestinale (Chinen et al., 2011; Hawkey et Ram pton, 1965). Les
prostaglandines E2 jouent aussi un rôle dans la protection et la réparation de blessures de l’épithélium intestinal. Deux études utilisant le modèle de souris traitées au DSS afin d ’induire une colite chimique ont dém ontré que la prostaglandine E2 était le m édiateur de
l’effet protecteur suivant l’activation du récepteur de type Toll 4 (Brow n et al., 2007; Fukata et al., 2006). En effet, il a été dém ontré dans un m odèle de souris traitées au DSS que l’effet protecteur du PGE2 était dû à l’activation de son récepteur de type 4 (EP4) (Kabashima et al., 2002). Ainsi, des souris dans lesquelles l’expression du récepteur EP4 a été invalidée, ont montré une susceptibilité beaucoup plus sévère à la colite induit par le DSS (Kabashima et al., 2002). Ces souris dém ontraient une perte de la fonction de la barrière épithéliale, des dommages importants des cryptes et une agrégation de neutrophiles et de lymphocytes dans le côlon significativem ent plus importants que les souris de type sauvage (Kabashima et a}., 2002).
Le processus de réparation épithéliale est astucieusem ent contrôlé afin de prom ouvoir le plus rapidement possible le retour à l’homéostasie. Plusieurs m olécules extracellulaires joueront un rôle essentiel dans ce processus en perm ettant l’activation de voies de signalisation qui entraîneront le remodelage du cytosquelette ou encore la production de différentes molécules identifiées précédem m ent. Parmis ces molécules, les nucléotides extracellulaires comme l’ADP et l’A TP augm entent significativem ent la réparation d ’une monocouche de cellules épithéliales intestinales de 42% et 57% respectivem ent comparativement au contrôle (Dignass et al., 1998). Cette étude dém ontrait que les nucléotides extracellulaires jouent un rôle im portant dans la réparation de blessure de l’épithélium intestinal. Cependant les m écanism es et les récepteurs im pliqués dans le rôle de ces nucléotides demeuraient ju sq u ’à ce jo u r inconnu.
4. Les nucléotides extracellulaires
4.1 Source de nucléotides extracellulaires dans l’intestin
La principale source physiologique d ’ATP dans la lumière intestinale provient des bactéries. L ’utilisation de souris C57BL/6 SPF (specific-pathogen free) qui sont obtenues en inoculant des souris axéniques avec un cocktail de huit souches retrouvées norm alem ent dans la micro flore de la souris a perm is de dém ontrer que la concentration d ’ATP dans les
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fèces de ces souris était de 102 pmole/g (Atarashi et al., 2008). Atarashi et collaborateurs ont traité ces mêmes souris avec deux antibiotiques soit la vancomycine et le m étronidazole et la concentration d ’ATP dans les fèces chutait sous la limite de détection de la technique utilisée démontrant que la majorité de l’A TP extracellulaire retrouvée dans l ’intestin provient des bactéries. Une autre étude réalisée par Iwase et collaborateur a m ontré que la souche bactérienne Enterococcus gallinarium sécrète la majorité de l’A TP chez ces souris C57BL/6 SPF (Iwase et al., 2010). De plus, des études in vitro réalisées sur ces bactéries isolées de fèces humaines ont permis de constater que E. gallinarium sécrète de l ’ATP (Iwase et al., 2010).
Les cellules de la muqueuse contribuent elles aussi à la relâche de nucléotides extracellulaires. Les travaux de Patel et collaborateur, ont démontré que la muqueuse épithéliale du côlon et de l’iléon relâchait de l ’ATP dans le milieu extracellulaire en condition physiologique (Patel et al., 2011). Cette relâche semble être associée à l’hémi- canal pannexine-1 puisque l’activation de ce canal est associée à la relâche d ’A TP dans le m ilieu extracellulaire de cellules épithéliales pulmonaires suivant T activation de Rho (Seminario-Vidal et al., 2011). De plus, en utilisant les cellules épithéliales ciliées bovines, Li et collaborateurs ont montré que la relâche d ’ATP dans le milieu extracellulaire par les cellules épithéliales implique une sécrétion vésiculaire. L ’utilisation de bafilom ycine, un inhibiteur de la relâche de vésicules a réduit de 25% la relâche d ’ATP dans le milieu extracellulaire suivant un stress hypotonique (Li et al., 2010).
En condition pathologique où on retrouve de l’inflammation et/ou une blessure, les plaquettes sanguines ainsi activées sont une source de nucléotides extracellulaires importante (M arcus et al., 2003). En effet, les granules des plaquettes sont riches en ATP et en ADP. Leurs dégranulations perm ettent d ’élever la concentration de nucléotide extracellulaire pour une variété de fonctions physiologiques et pathologiques. Les neutrophiles recrutés au site d ’inflammation relâchent aussi de l’ATP par la connexine 43, un hémi-canal (Eltzschig et al., 2006). En conditions pro-inflammatoires, les cellules épithéliales intestinales vont aussi participer à augmenter la concentration de nucléotides extracellulaires. Suivant la stimulation de cellules Caco-2/15 avec de TIFN-y et du TN F-a, il y a une augmentation de la relâche d ’UDP d ’environ 110 nM à 125 nM dans le m ilieu extracellulaire (Grbic et al., 2008). Finalement, les dommages cellulaires peuvent entraîner
la lyse des cellules et le relâchement d ’une grande quantité de nucléotides extracellulaires (Hart et al., 2008).
4.2 Concentration de nucléotides dans le m ilieu extracellulaire de l’intestin
La concentration exacte de nucléotides extracellulaires dans l’intestin est inconnue autant en condition physiologique que pathologique. Cependant, une étude récente utilisant un nouveau biom arqueur de l’ATP a rapporté in vitro que la muqueuse du côlon en condition physiologique relâchait une concentration d ’A TP de l’ordre de 0,8 à 1,0 pM (Patel et al., 2011). Il est proposé que l’ATP et l ’UTP soient relâchés de façon sim ilaire puisque la relâche d ’UTP par les cellules de types non-sécrétrices, comme les côlonocytes, suit le même patron de relâche que celui de l’ATP (Lazarowski et Boucher, 2001). De plus, en condition physiologique, la muqueuse du côlon est exposée à un stress mécanique lors du passage des fèces. Ce stress mécanique pourrait stim uler la relâche d ’A TP et d ’UTP par un facteur de 10 à 20 fois à ce qu ’on retrouve en condition basale (Lazarowski et Boucher, 2001; Lazarowski et al., 2003; Lazarowski et Harden, 1999; Lazarowski et al., 1997). Comme mentionné précédemment, les nucléotides extracellulaires peuvent aussi provenir des bactéries de la flore intestinale, des cellules apoptotiques et des cellules du système immunitaire. En effet, T activation des leucocytes et des plaquettes sanguines ainsi que les microenvironnements acide et hypoxique retrouvée lors d’une inflammation vont favoriser la relâche de nucléotides extracellulaires (Di Virgilio et al., 2001; Gordon, 1986; Luttikhuizen et al., 2004).
4.3 M étabolism e des nucléotides
Dans le m ilieu extracellulaire, on retrouve des ecto-nuclétotidases solubles ou liées à la membrane plasm ique qui ont la capacité d ’hydrolyser ou de synthétiser les nucléotides (voir Figure 4). Ces enzymes permettent une régulation de l’activation ou de la term inaison de la signalisation cellulaire associées aux récepteurs purinergiques qui sera abordée plus en détail à la section 5 de cette introduction.
quatrième famille est composée d ’un seul membre nommé nucléoside diphosphokinase ou NPDK qui a la capacité de catalyser réversiblem ent le transfert d ’un groupem ent phosphate entre un nucléoside di et triphosphate com m e par exemple : ATP + UDP <-> A D P + UTP (Boissan et al., 2009).
L ’avant-dernière famille est appelée alcaline phosphatase. Ces enzym es ancrées à la membrane ont la capacité d ’hydrolyser un nucléoside triphosphate ju sq u ’à sa forme la plus simple soit sous forme de nucléoside et phosphate inorganique (Zimm ermann, 2001). La dernière fam ille d ’ecto-nucléotidases com prend sept mem bres nom m és ecto-adénylate kinase ou ecto-AK. Ces enzymes m em branaires catalysent la conversion de deux molécules d ’ADP en ATP et AM P et ce de façon réversible (D zeja et Terzic, 2009; Yegutkin, 2008).
4.4 Origine de la signalisation purinergique
Les premières preuves que les nucléotides retrouvés dans le m ilieu extracellulaire pouvaient avoir un rôle physiologique furent dém ontrées par Drury et Szent-G yorgyi en 1929 (Drury et Szent-Gyorgyi, 1929). Il aura fallu attendre plus de 40 ans avant que le rôle important de médiateur autocrine et paracrine des nucléotides extracellulaires soit rem is de l’avant (Sattin et Rail, 1970). Finalement en 1976, les travaux du Pr B um stock ont permis d ’établir les premières bases d ’un système de classification des récepteurs purinergiques (Bumstock, 1976).
5. Les récepteurs purinergiques P2
Les récepteurs P2 sont divisés en deux familles soit les récepteurs ionotropiques P2X et les récepteurs métabotropiques P2Y. La famille de récepteurs P2X compte sept m em bres chez l’humain soit P2X1 à P2X7. Contrairem ent aux récepteurs P2Y, les récepteurs P2X ne possèdent q u ’un seul agoniste naturel: l’ATP.
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5.1 Les récepteurs m étabotropiques P2Y
Les récepteurs métabotropiques P2Y sont, com m e leurs nom s l’indiquent, des récepteurs couplés aux protéines G. À ce jour, on com pte huit récepteurs de la famille P2Y chez l’humain soit P2Y,, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y n , P 2Y i2, P 2 Y I3 et P2Y ,4 (Abbracchio et al., 2006) Les agonistes endogènes des récepteurs P2Y sont l’ATP, l’UTP, l’AD P, l’UDP, l’UDP-glucose et l’U DP-galactose (Abbracchio et al., 2006). Le tableau 1 indique les agonistes endogènes ainsi que les protéines G auxquels chacun des récepteurs de la famille P2Y se couplent.
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le gène du récepteur P2Y2. La prem ière étude a rapporté un changement en position 334 d ’une arginine pour une cystéine dans la protéine de P2Y2 (Janssens et al., 1999). Pour déterminer l’effet de ce variant sur la fonction du récepteur P2Y2, les auteurs ont utilisé les cellules humaines astrocytaires 1321N1 qui n ’exprim ent aucun récepteur P2. L’expression du variant exprimant une cystéine en position 334 du récepteur P2Y2 dém ontre une diminution de l’accumulation d ’IP3 suivant l ’activation du récepteur avec ces agonistes
suggérant que ce variant permet une activation m oindre de ses voies de signalisation associées (Janssens et al., 1999). Une autre étude a dém ontré que chez les patients atteints de fibrose kystique, il y a une augmentation significative d ’un polymorphisme dans le gène du récepteur P2Y2 (Buscher et al., 2006). En effet, le changem ent en position 312 d ’une arginine pour une sérine était plus fréquent dans la population de patients atteints de fibrose kystique comparativement à la population contrôle. L ’expression de ce variant dans les cellules 1321N1 a révélé que suivant la stimulation avec l’A T P7 il y avait une augm entation de la concentration de calcium intracellulaire plus importante que celle observée avec le variant non-associé à la fibrose kystique (Buscher et al., 2006). La stim ulation du récepteur P2Y2 augmente la concentration de calcium intracellulaire et l’activation des CaCCs (calcium-activated chloride channels) qui régulent la sécrétion d ’ions chlore chez les patients atteints de fibrose kystique (Buscher et al., 2006). Ainsi, l’expression de ce variant (Ser312) chez les patients atteints de fibrose kystique pourrait m odifier la sécrétion de chlore et être pris en compte dans les thérapies utilisant les agonistes du récepteur P2Y2 (Buscher et al., 2006). Finalement, trois études publiées par Wang et collaborateur ont démontré une incidence significative de différents variants du gène du récepteur P2Y2 chez la population nipponne qui prédispose à l’hypertension, aux infarctus du myocarde et aux infarctus cérébraux sans toutefois investiguer l’effet de ces variants sur la structure et la fonction du récepteur P2Y2 (W ang et al., 2010; W ang et al., 2009a; W ang et al., 2009b).
5.2.2 Structure de la protéine
La protéine encodée par l’A RNm du récepteur P2Y2 est composée de 377 acides aminés (voir Figure 5). Le site de liaison des agonistes est situé entre les boucles extracellulaires des domaines transmembranaires six et sept. Ainsi, il a été démontré par mutagenèse
dirigée que le rem placem ent de l’histidine en position 262 et des arginines en position 265 et 292 par des leucines qui sont des acides aminés neutres résultaient en une diminution d ’environ 100 à 850 fois la capacité de l’ATP et de l’UTP d ’induire une réponse calcique norm ale (Erb et al., 1995).
Dans la première boucle extracellulaire du récepteur P2Y2, on retrouve un m o tif arginine- glycine-asparagine (RGD) qui permet la colocalisation du récepteur P2Y2 avec les intégrines a v(V P5 (Erb et al., 2001). Ce m otif est essentiel pour l’interaction avec les intégrines dyf^/Ps puisque le rem placem ent du m o tif RGD par une séquence RGE abolie cet interaction (Erb et al., 2001).
Le dom aine intracellulaire en C-terminal de la protéine contient un site de phosphorylation pour les kinases de récepteurs couplés aux protéines G (G PCR kinases) qui perm et la désensibilisation et la séquestration du récepteur suivant sa stimulation. En effet, des form es tronquées pour différentes portions du domaine C-terminal ont perm is de dém ontrer que la délétion des dix-huit derniers acides aminés entraînait une dim inution de la désensibilisation du récepteur P2Y2 d ’environ 30% suivant la stimulation avec les agonistes
(Garrad et al., 1998). La séquestration du récepteur après trois heures de stim ulation était diminuée d ’autant plus que la partie en C-terminale était tronquée (Garrad et al., 1998). Ces résultats démontrent que la portion en C-term inale de la protéine est importante pour réguler la désensibilisation et la séquestration du récepteur P2Y2.
En plus de son rôle important dans la désenbilisation du récepteur, la région C-terminal de P2Y2 est impliquée dans le recrutem ent et l’activation de Src (Liu et al., 2004). Le recrutement de Src se fait grâce à la présence de deux domaines de liaison SH3 retrouvés dans le domaine carboxi-term inal de P2Y2 (Liu et al., 2004). Src ainsi activé peut transactiver les récepteurs de facteur de croissance comme l’EG FR (les voies de signalisation activées par le récepteur P2Y2 seront discutées plus en détails à la section 5.2.3) (Liu et al., 2004).
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signalisation telles que M EK/ERK (Albert et al., 1997). De plus, l’augm entation de calcium intracellulaire perm ettra l’activation des calm odulines et la m odulation de différents canaux ioniques comme les canaux potassiques et sodiques sensibles au calcium retrouvés sur les cellules épithéliales intestinales (Lee et al., 2003; M atos et al., 2005; M atos et al., 2007).
Les protéines G sont composés de trois sous-unités soit a, P et y. On retrouve plusieurs sous-types de sous-unités a qui seront classés selon les effecteurs activés. Suivant la liaison de GTP sur la sous-unité a, il y aura dissociation des sous-unités P et y. La sous- unité a peut ensuite activer différents effecteurs ju s q u ’à ce que la m olécule de G TP à laquelle elle est liée soit hydrolysée. Les sous-unités Py peuvent ensem ble activer différents effecteurs. Ainsi, suivant la stim ulation du récepteur P2Y2, les sous-unités Py de la protéine Gq entraîne le recrutement et l’activation de la protéine Src qui phosphoryle et active Pyk2 permettant de transactiver les récepteurs de facteurs de croissance (Liu et al., 2004).
S.2.3.2 Signalisations associées au recrutem ent de G 0 et G12
L’interaction avec les intégrines c ^ / P s perm et le recrutem ent de la protéine G0 et G12 qui entraîneront respectivem ent l’activation de Rac et RhoA activant des voies de signalisation favorisant le remodelage du cytosquelette d ’actine et la migration cellulaire (Bagchi et al., 2005; Erb et al., 2001). Par exemple, l’activation de RhoA entraîne l’activation de RO CK et de la M LC-2 perm ettant la formation de fibres de stress favorisant la chim iotaxie de cellules astrocytaires 132IN 1 (Liao et al., 2007; M ediero et al., 2008).
5.2.4 Distribution et rôle dans l’organism e
Le récepteur P2Y2 est exprimé de façon ubiquitaire dans l’organisme et ses fonctions sont étroitement associées aux tissus dans lequel il est exprimé. Le tableau 2 résum e la distribution et le rôle du récepteur P2Y2 dans l’organisme.
