Métabolisme nucléolaire en absence de synthèse de protéines

pevr.

ANVRE ROYAL

Vépcvr.;temen:t de Blolog�e Celluf.a,Uz.e

de la 6aculté de médec.-lne

de l' wu.vu/2ilé de SheJtbnoob.e

en yue de l'ob:te.ntlon d'un

gita.de de Ph. V.

She.Jz.bnoob.e, Québec, Canada

Sep:tembne

1977

SOMMAIRE

Le métabolisme de l'ARN ribosomique en absence de synthèse des protéines a été étudié avec un mutant des cellules CHO. Ce mu-tant, tsHl, possède une enzyme thermosensible, leucyl-t-RNA synthé-tase, dont l'inactivation par la chaleur résulte en l'inhibition de la synthèse des protéines.

Dans un premier temps, la· localisation des RNP et des ARN préribosomiques dans le nucléole a été déterminée par comparaison des cinétiques de marquage des éléments morphologiques et

macr~mo-léculaires du nucléole. Les résultats présentés suggèrent que l'ARN 458 sous la forme d'un RNP 808 est localisé dans la zone

fi-.

brillaire et que les ARN 368 et 328 sous la forme de RNP 558 sont localisés dans la zone granulaire.

Cette information a été utilisée dans l'interprétation de l'étude morphologique et autoradiographique de tsHl. Nos résultats indiquent que l'augmentation de la température provoque dans le nucléole une inhibition du passage de la radioactivité de la zone fibrillaire vers la zone granulaire et de celle-ci vers le cyto-plasme, impliquant que la maturation de l'ARN préribosomique est

inhibée. L'incorporation d'uridine - 3H n'est pas affectée, tou-tefois l'ensemble des observations suggère que la synthèse est inhibée.

Ces résultats sont corroborés par l'étude biochimique du métabolisme nucléolaire: la synthèse et la maturation de l'ARN

pré-ribosomique sont rapidement inhibées

à

39.S0

c.

A cet effet intranucléolaire, s'ajoute une instabilité des ARN nouvellement synthétisés dans le cytoplasme. L'examen des RNP nucléolaires mon-tre que leur densité de f,lottaison diminue en absence de synthèse des protéines. Enfin, nous avons noté des changements importants dans les proportions des différentes protéines nucléolaires.

L'ensemble de nos résultats suggère que la synthèse-et la maturation des ARN ribosorniques sont dépendantes d'une synthèse con-comitante des protéines. Il semble exister une réserve cytoplasmi-que de protéines suffisante pour soutenir,

à

un taux réduit, le métabolisme nucléolaire pendant une heure ou deux, au maximum.

Enfin, ce système, n'impliquant que l'augmentation de la température du milieu de croissance des cellules, apparait comme idéal pour l'étude des mécanismes moléculaires de contrôle de la synthèse et de l'assemblage des ribosomes.

REMERCIEMENTS

Je désire exprimer toute ma gratitude au docteur René

Simard pour m'avoir proposé ce projet de recherche et pour son soutien actif et la chaleureuse attention qu'il m'a témoignés pendant toute la durée de mon séjour dans son laboratoire.

Je remercie très sincèrement les docteurs P. Bourgaux,

J. Hugon, R. Simard et C.P. Stanners d'avoir bien voulu juger mon travail. Je tiens

à

remercier tout particulièrement le professeur

Jean-Pierre Zalta pour l'intérêt qu'il a manifesté pour ma formation scientifique.

Qu~ soient remerciés également les docteurs J.-P. Bachellerie,

C. Brailovsky,

c.

Kédinger, A. Kessous et M. Suh ainsi que mes

collègues étudiants, Ginette Lacoste, Nicole Maestracci, Yves Langelier et Louis Giguère qui m'ont fait bénéficier de leur collaboration et de leurs conseils tout au long de mon travail.

Je tiens

à

exprimer ma reconnaissance

à

tous ceux qui

m'ont aidé dans la réalisation de ce projet: Mlles Nicole Authier et Nicole Robitaille pour la culture des cellules, Mmes Françoise Sakr et Françoise Zanderman, Mlles Michèle Mitchell et Elizabeth Beaumont ainsi que M. Alex Trétiak pour leur aide technique et M. Bernard Szirth pour la photographie. Mlle Lise Allaire s'est chargée de la dactylographie de cette thèse, je lui en suis vivement reconnaissant.

de l'Institut du Cancer de Montréal pour leur collaboration.

Enfin, je remercie le docteur C.P. Stanners qui nous a procuré le mutant CHO-tsHl sans lequel ce travail n'aurait pu être accompli.

TABLE DES MATIERES

SOMMAIRE

...

_iv REMERCIEMENTS. . . • . • . • . • . . . . • . . . • . . • . . . • . • . • • . . • . . • • . • • • • • . . vi TABLE DES MATIERES ...•.••••..•.•....••.••••...•••...••..•..•. viii LISTE DES FIGURES • • . • • • • . • • • . . . . • . . • . . . • • • . • . . . • . . . xi v LISTE DES TABLEAUX ...•••..•...•.••...•.••....•..•..•..•.•....••• xviii LISTE DES ABREVIATIONS

I. INTRODUCTION

...

xix l.Le nucléole est le site de synthèse des ribosomes •••...••••. 2 2.Le nucléole,site de transcrisption, contient de l'ADN et de

l 'ARN sous forme de DNP et de RNP . . • . . . • . • • . . . • . • • . 2 3.Les ARN ribosomiques 28S et 18S sont synthétisés sous la

forme d'un précurseur lourd ayant une constante de

sédimen-tation de 45S. . • • . • • • . • • . • • . . . . • • • • . • • . . . • . • • . • . . . • • • • • • . 3 4.La maturation de l'ARN 45S implique des intermédiaires

entre cet ARN et les ARN 28S et 18S. . . • • . . . . • • . • . . • . • . • • . . • • 4 5.L'ARN ribosomique est méthylé •...••...•••..•....•.•...••• 4 6.Les ARN ribosomiques existent associés

à

des protéines •..••.• 5 7.Contrôle de la synthèse des ARN ribosomiques ..••.•.••.•.•..•. 6 a.coordination entre la production des ribosomes et la

syn-thèse des protéines. • • • . • • . . • • • • . . . • . . • . . . • . . • • • • • • • . • • . . . • . 8 9. TsHl comme modèle pour l'étude de la coordination entre

la synthèse des ARN ribosomiques et la synthèse des

II. MATERIEL ET METHODES

! .Matériel .. ... ~ 12

2.Culture cellulaire

2.1.Milieux de culture et solutions ••••••••••.••••••••••..•• 12 2.2.Entretien des souches .••••••••••••••••••.•••••••••...•.• 13 2. 3 .Conservation des souches. . • • • • • • • • • • • • • • • . • • . • • • • • • • • . • • 14

2.4.Courbes de croissance... 14

2. 5 .Détection des mycoplasme.s: essai de 1' uridine phos-

_-

.

phorylase . . • . • • • • • • • . • • • • • • • • • . . • • • • • • . • • • . • • • • • • • • . . • • • 1 7 2. 6 .Cultures en suspens ion. • • • • • • • • • • • • • • • . • • • . • • • • • . . • • • • • • 18 2. 7 .Manipulation des cultures. • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 21

..

3.Fractionnement cellulaire

3 .1 • Tairl,POns • ••••••• -. • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 22

3.2.Préparation des noyaux... 25 3.3.Préparation des nucléoles

3.3.1.par ultrasons ••••••.••••.•••••••.••••••.••••••••••. 26 3.3.2.par traitement

à

la DNAase dans un tampon

à

haute force ionique.. . . • • • • • • • • • • • • • • • . • • . . • . • • • . . • 27 3.4.Préparation des RNP nucléolaires •.•••••••.•••••••••••.•• 27 3.5.Préparation des polysomes ••••.••••••••••••••••.••••••••• 28 3.6.Préparation des ribosomes ••••••.••.••••.•••.•••••••••••• 28 4.Détermination des densités de flottaison des RNP dans

des gradients de CsCl

4 .1 • Solutions. • • • • • • • • • • • • • • • • • . . . • • • • . • • • • • . • . • • . • • • • • • • • • • 2 9 4.2.Fixation des RNP, préparation des gradients et

5.:."Microscopie électronique et autoradiographie

5.1.Solutions ... ... 29

5.2.Préparation des échantillons

5.2.1.préparation des blocs •.•••••.••••••..••••.••••••••• 3o 5.2.2.coupe et coloration ••••.••••.••••••••.••••••••••••• 31 5.3.Autoradiographie

5.3.1.déposition de l'émulsion •••••.••••••••••••.•••••••• 32 5. 3 .2 .exposition •••••••••.• ~... 33

5 • 3 • 3 • développement. • • . . • • • • • • • • • • • • • • • . • • • . • • . • • • . . • . . . • 3 3 5.4.Interprétation et quantification des autoradiogrammes ••• 33 6.Extraction de !'ARN et séparation

6.1.Solutions. .. . . 34

•

6.2.Extraction de l'ARN cytopiasmique et ribosomique

6.2.1..extraction par le SDS •.•.•.••••.••.••.•••.•••••••• 35 6.2.2.extraction par le SDS, le phénol et le chloroforme •• 35 6.2.3.extraction d'un culot de ribosomes •.••••••••••.•••• 35 6.3.Extraction de l'ARN nucléolaire, nucléaire ou cellulaire 35 6.4.Séparation de !'ARN par centrifugation en gradient

de sucrose • • . • • • • • • • • • • • • • • . • • • • • • • • • • • • . • • • • • • • . • • • • • • . 36 6.5.Séparation de !'ARN par électrophorèse sur gels

d'a-garose et d'acrylamide

6.5.1.préparation de l'acrylamide et du bisacrylamide •••• 37 6.5.2.préparation des gels 2.1% ••••••••••.••.•••••.••.••• 37 6. 5. 3. électrophorèse.. • • • • • • . • • • • • • • • • . . • . • • • • • • • • • • • • • • • 38 6.5.4.fractionnement des gels et dosage de la

7.Séparation des protéines

7.1.Solutions ••••.•••..•...••.•••....•..•...•.•.•..•...••... 39 7.2.Préparation des échantillons et électrophorèse .•••..•.•. 40 7. 3 .Fluorographie . • . . . • . • . • • • • . • • • . • • • • • . . . • • • . . . • • • . . • . • . . • 40 8.Dosages

8.1.Préparation des échantillons ...••...•.•.••••.•..••.••• 41 8.2.Dosages chimiques

8. 2 .1. dosage de l 'ADN.. • • . • • . . • • . • . • . • • . • . • . . • • • . . • • • . • . • 41 8.2.2.dosage de l'ARN ..•.•.•..•.•.•.•••...••...•.•.•.•••. 42 8.3.3.dosage des protéines ...•••.•..•••.•••...•••..•••. 42 8.3.Dosage de la radioactivité

8.3.1.dosage de l'incorporation dans l'ARN cellulaire .•.• 42 8.3.2.dosage de l'incorporation dans les protéines

cel-lulaires... 43 8.3.3.dosage par précipitation sur des filtres de

fibre de verre. . . . • • • . • • • . • • • • . . • • • • • • • • . • . • . • . . . • • 4 3 III. RESULTATS

l.Etude morphologique et autoradiographique du métabolisme nucléolaire chez tsHl.

1.1.Correspondances entre les éléments morphologiques et

macromoléculaires du nucléole ••...•.••••••••.•.•.•.•••.• 45 1.1.1.cinétiques de marquage des compartiments

nu-cléolaires •..•••••••.•••...•..•.•••...•.... 45 1.1.2.cinétiques de marquage des ARN nucléolaires de

poids moléculaires élevés. . . • . • • . . . • . • . . • • • • . • 5 0 1.1.3.cinétiques de marquage des RNP nucléolaires •••..••. 52

1.1.4.comparaison des cinétiques de marquage ••••.•••••••• 57 1.2.Etude morphologique de tsHl .•••.••••.•.•.•••••••••.•.••. 62 1. 3 .Etude autoradiographique du métabolisme de 1·1 ARN

chez tsHl. • • • • • • • . . . . • • . • • • • . • • . . • • • • • • • . . . . • • . • • • • • • • • . 70 1.3.1.incorporation d'uridine-3 H .••..••••••••••••••••••• 70 1.3.2.démarquage par traitement

à

l'AMD •••••••••.••••...• 70 2. Etude biochimique du métabolisme nucléolaire chez tsHl

2.1.Effet de la température sur la synthèse des protéines .•• 74 2.2.Synthèse d'ARN en absence de synthèse des protéines

2.2.1.effet de la température sur l'incorporation

d' uridine-3 H. • • • • • • . • • • • • • • . • • • • • . . • . • . • • • . . • • . • • • 8 3 2.2.2.effet de la température sur la synthèse de l'ARN

riboso_mique. . . 86

2.3.Effet de la température sur la maturation de l'ARN

ribosomique. . . 95

2.4.Méthylation de l'ARN nucléolaire ..••...•••••••••.•••• 109 2.5.Assemblage des RNP nucléolaires •.•••••••••.••••..••••••• 113 2.6.Protéines nucléolaires ••••••••••••.•••••.•...••••.•••.•. 123 2.7.Effet d'une inhibition de la synthèse résiduelle des

protéines par la cycloheximide •.•••.••.••.•.••.••••••••• 128 IV. DISCUSSION

l.Localisation des RNP ••••••••••••.••••••••.•••.••••••••••••••• 140 2.Inhibition de la synthèse des protéines .•••••••...••••••••••• 142 3.Métabolisme de l'ARN pré-ribosomique

3.1.Inhibition de la maturation de l'ARN •••.••••••••••.•.••• 143 3.2.Synthèse de l'ARN 45S ••.•.•••••••••••.••...•.•••.••••••• 146

4. Protéines nucléolaires et assemblage des RNP

4.1.Densité de flottaison des RNP .•.•••..•.••...•..•••.••••.• 149 4. 2. Protéines nucléolaires • . • • . • . . • • . • . • . • . • • • . • . • . . . • . . . . • . • 15 0

0

4.3.Effet de la cycloheximide

à

39.5 C .••.•••••••••.••••.•.•• 151 5. Effet de l'inhibition de la synthèse des protéines sur le

métabolisme de l'ARN pré-ribosomique 152

V. CONCLUSION • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 156 VI. BIBLIOGRAPHIE • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 158

LISTE DES FIGURES

1. Courbes de croissance des cellules CHO-S et tsHl

' 0 ' 340 . 16

a 37 C et a C respectivement .•.•...••••....•...•...••...

2. Détection des mycoplasmes ..••••.••...••.•..••.•••.••..•....••. 20

3 ' 0 ' 3. Incorporation de valine- H par tsHl a 34 C et a 39.5°c

...

24

5. Incorporation d'uridine- 3H par 'CHO: marquage de 2.5 mn

...

47

6. Incorpora tian d'uridine- 3H par CHO: marquage de 2.5 mn

...

49

7. Incorpora tian d'uridine-3 H par CHO: marquage de 5 mn

...

49

B. Incorpora tian d'uridine-3H par CHO: marquage de 15 mn

...

49

9. Incorpora tian d'uridine-3H par CHO: marquaqe de 30 mn

...

49

10. Incorporation d'uridine-3H par CHO: marquage de 45 mn

...

49

11. Incorpora tian d'uridine-3H par CHO: marquage de 60 ..mn •• · •••••••• 49 12. Incorporation d'uridine- 3H dans l'ARN nucléolaire de CHO ...••••...•..•••.•...••...•..•..•..•....••....•.•••.•.. 54

13. Incorpora tian d'uridine-3 dans les H RNP nucléolaires de CHO . . • . . . • . • . • • . . . • . • . . . • • . . . . • • . . • . • • . • . . . • • . . • . . . • . . . 56

14. Préparation de RNP nucléolaires pour l'extraction de leur ARN . • . • . . • • • • • • • • . . . • • • . • • • • • • • . • . . . • . . . • . . • • . . • • 59

15. Analyse de l 'ARN des RNP nucléolaires . . . • . . . • . . . 61

16. Cinétique de l'incorporation d'uridine- 3H par les composants nucléolaires . • . • . • • . • . . . . • . • . . . • . • • . . • . . • • . . . • • . . . • 64

17. Incorporation d'uridine-3H par tsHl

à

_{34 c . . . 66} 0 18. Incorporation d'uridine-3H par tdHl

à

39.5°c ... 66

" ' ' 40 '

19. Demarquage a l'AMD de 60 mn a 3 C apres une

incor-. d 1 • d. 3 ' 34° 69

20. Démarquage

à

l'AMD de 120 rnn

à

34°c après une

incor-pora tion d' uridine- 3H à 34° C . . . . • • . . • . • . • . • . . . . • . • • . . . • . • • . 69

21. Démarquage

à

l'AMD de 60 rnn

à

39.5°c àpres une

incor-. d 1 • d . 3 ' 34°

pora tion uri ine- H a C • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 6 9

22 . Dernarquage a ,,. ' 1 1 AMD e d 120 rnn a ' 39 5° . C apres une in-' .

. d 1 • d. 3 ' 34° . 6 9

corporation uri ine- H a C .•••....•...••..•..•••..•.••...

23. Démarquage à l'AMD de 60 rnn à 39.5°c après une

incor-. d' 'd' 3 ' 39 5°

poration uri ine- H a . C • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 7 3

24. Démarquage

à

l'AMD de 120 rnn à 39.5°c après une

in-. d' . di 3 ' 39 5° 73

corporation uri ne- H a . C ••.•..•..••..•..•..••.•.•..••

25 • Dernarquage a ,,. ' 11 AMD e d 60 rnn a ' 34° C apres une incor-' .

. d' . d. 3 ' 39 5°

poration uri ine- H a . C • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 7 3

2 6 • Dernarquage a ,,. ' 1 1 AMD e d 12 0 mn a ' 34° C apres une in-' .

\

ti dl 'd' 3 ' 39 5° 73

corpora on uri ine- H a . C ••.•...••••••...••••...•.•.••

' 0 ' 0

27. Polysornes des cellules tsHl a 34 Cet a 39.5 C ...••...•.•.• 78

' 0

28. Effet de la CHX sur les polysornes de tsHl a 39.5 C 80

' ,,. ' 0 ' 0

29. Synthese de proteines a 34 Cet a 39.5 C chez tsHl .•••••..••.• 82 30. Effet de la température sur l'incorporation d'uridine

3 H par tsHl • • . . . • • . • • . . . • • • . • • • • . • . • • . . • • . . • • . . . . • • . • • . • . . 85 31. Effet de la température sur l'incorporation d'uridine

3H en absence de synthèse de protéine chez tsHl et

CHO . • . • • . . . • • • • . . • • • . • • . . . . . • • . . • . • . . • • . . . • • • . . . • • • . . . • • . . . . 8 8

32. Effet de la température sur l'accumulation d'uridine

14 C par tsHl . • . . • • . • . . . • . . • . • . • . . • • • . • . . . • • . . • • . • . . . • . • • . . • • 90 33. Effet de la température sur l'incorporation d'uridine

34. Effet de la temoérature sur l'incorporation d'uridine 3

H dans l 'ARN 45S de CHO ••••••••. • • • • • • • • • • • · • • • • • • • • • • • • • • • • • 94 35. Effet de la température sur l'incorporation n'uridine

3H dans l'ARN 45S nucléolaire de tsHl •••••••••••••··•••••••••• 97 36. Effet de la température sur le profil de 11ARN nucléolaire

de tsHl .•••.•••..•••..•.••.. • • • • · • • • • · • · • • · • · · • • • • • · · • • • • • • • • • 99 37. Effet de la température sur la maturation de l'ARN

nucléolaire de tsHl: marquage de 60 mn

...

101 38. Effet de la température sur la maturation de l'ARN

45S de tsHl: démarquage

à

1 'AMD •.••• • • • • •• • • • • • • • • • • • • · · · · • • · • • 104 39. Effet de la température sur la maturation de l'ARN

45S de tsHl: démarquage

à

l'uridine

...

-

... .

106 40. Effet de la température sur la sortie des ARN

ri.l:xJso-miques dans le cytoplasme de tsHl .• • . • •.•••• • · • • • • · · • • • • • · • • • • · 111 41. Effet de la température sur la méthylation de l'ARN

45S nucléolaire de tsHl •. · · • · · · • • • · • • · • • • • • • • • • • · · · · • • · • · · • • · • 115 42. Effet de la température sur l'incorporation

d'uri-dine-3H dans les RNP nucléolaires de tsHl ···••··•••····•·•••• 117 43. Densité de flottaison des RNP SOS et 30S

cytoplas-miques de tsHl

...

120 44. Densité de flottaison des RNP nucléolaires de tsHl ·•••••···•••• 122 45. Protéines des RNP nucléolaires de tsHl •·••••·•·••··•·•··•••••·• 125 46. Protéines nucléolaires de tdHl: effet de la

ternpé-rature •••.•••••••...•.••..• · · · . · · · • · · · • • • • · · · · • • • · • • · · · 127 47. Effet de la CHX sur la synthèse des protéines de

tsHl à 39.5°c

...

131 48. Effet de la CHX sur l'incorporation d'uridine- 3H

' 0

dans l 'ARN 45S chez tsHl a 39.5 C .••.•.••.••.•.•.••.•••..•.••. 133 49. Effet de la CHX sur l'incorf>Oration d'uridine- 3H

dans les RNP nucléolaires de tsHl

à

39.5°c 135

50. Densité de flottaison des RNP nucléolaires de

LISTE DES TABLEAUX

I. Incorporation d'uridine- 3H dans les régions

morpho-logiques et les éléments biochimiques du nucléole 51

II. Résumé des résultats de l'etude autoradiographique

de tsHl . . • • • . • . • • . • • • . . • • . . • . • . . • • • . • • . . . • . . . • . • . • . • • . • . • • 75 III. Proportions des différentes espèces d'ARN

nucléo-laire après un. traitement

à

39.5°c

...

108

IV. Proportion d'ARN ribosomique après un traitement

0 .

à

39. 5 c . . . . • . . . . • . • • • . . . . • . . . • . . • . • . . . • . • . . . • . • • . • • • • • . . 112

V. Incorporation d'acides aminés par tsHl

à

34°c et

à

39.5°c

...

₁₂₉

152-a-LISTE DES ABREVIATIONS

A absorbance

angstram, 10-10 mètre

ADN acide déoxyribonucléique

AMD actinomycine D

ARN acide ribonucléique

BHK "baby hamster kidney"

c

cytosine

oc

_{degré Celsius}

CHO "chinese hamster ovary"

CHX cycloheximide

cc centimètre cube

Ci curie, 2.2 x 10-8 désintéorations par minute

cm centimètre

cpm coups par minute

d.i. diamètre interne

d.e. diamètre externe

DNP déoxyribonucléoprotéine

dpm désintégrations par minute

fig. figure

g gramme

g gravite, 9.8 metre s ,. ' / 2

G ouanosine

hr heure

KHz kilohertz, 1000 cycles par seconde

mn minute min. minimum max. maximum mA milliampère M molaire mM millimolaire mg milligramme ml millilitre mm millimètre µCi microcurie µg microgramme µl microlitre µm micromètre N normal nm _nanomètre

pH logarithme de 1' inverse de la concentra tian d'ions H-+-dans une solution.

%p/p concentration en qramme de soluté par lOOq de solution

rpm

révolutions par minute

RNP ribonucléoprotéine

s seconde

s

uni

. " s

te ve erg, db l0-13 s

SDS dodécyl sulfate de sodium

SVF sérum de veau foetal

t-RNA ARN de transfert

V

vol.

volt volume

1. Le nucléole est le site de synthèse des ribosomes.

La reconnaissance du nucléole comme site de synthèse de l'ARN ribo-somique est basée sur plusieurs types d'évidences. Les premiers travaux

à

suggérer l'implication du nucléole dans le métabolisme de l'ARN cyto-plasmique sont ceux de Perry et Errera (1960) qui montrent que des cellu-les, dont on a inactivé l'ACN nucléolaire à l'aide d'un microrayon

ul-traviolet, ne synthétisent plus d'ARN cytoplasmique et suggèrent une relation précurseur produit entre l'ARN nucléolaire et cytoplasmique. Des expériences su?séquentes de ces chercheurs avec l'AMD confirmèrent la relation entre l'ARN nucléolaire et l'ARN ribosomique (Perry, 1964).

Entretemps des travaux d'Edstrom (1960) et d'Edstromet al. (1961), sur la composition en bases de l'ARN des différents compartiments cellulaires d'oocytes, avaient suggéré une origine nucléolaire pour l'ARN ribosomique. Enfin les travaux de Brown et Gurdon (1964) sur le mutant anucléolé deX •.

Laevis

confirmèrent le rôle du nucléole dans la synthèse de l'ARN ribosomique.

2. Le nucléole, site de transcription, contient de l'ADN et de l'ARN sous forme de DNP et de RNP.

L'observation des nucléoles au microscope électronique permit de reconnaître deux types de composants ultrastructuraux: des granules de 150 à 200

Î

et des fibrilles d'une épaisseur de 50 à 100

Î

(Borysko et Bang 1951, Bernhard et al. 1952, Bernhard et al. 1955). Par digestion enzymatique de coupes ultrafines, il a été établi que les fibrilles et les granules sont composées d'ARN et de protéines (Marinozzi 1964) et qu'il y a de la chromatine autour et à l'intérieur du nucléole (Bernhard

et Granboulan 1963, .Marinozzi 1964).

La localisation de l'ARN et de l'ADN a ensuite été confirmée par autoradiographie après incorporation de thymidine- 3H ou d'uridine- 3H

(Revel et Hay 1961, Granboulan et Granboulan 1964, 1965). Enfin

l'auto-d ' h' d llul " ' l' ' di 3H t " 1 f'

ra iograp ie es ce es rnarquees a uri ne- a mon re que es 1-brilles se marquent avant les granules et suggéré un rapport précurseur produit entre les deux (Granboulan et Granboulan 1965, Karasaki 1965, Geuskens et Bernhard 1966) .

3. Les ARN ribosomiques 288 et 188 sont synthétisés sous la forme d'un précurseur lourd ayant une constante de sédimentation de 458.

Des travaux biochimiques sur la synthèse de l'ARN ont montré la •

présence dans le noyau d'un ARN de haut poids moléculaire ayant une cons-tante de sédimentation d'environ 458 (Perry 1962, 8cherrer et al. 1963). L'ARN 458 a été identifié comme précurseur de l'ARN ribosomique 1°) par le passage de la radioactivité qui lui est associée dans l'ARN ribo-somique après un court marquage suivi d'un traitement

à

l'AMD (Perry 1962, 8cherrer et al. 1963, Georgiev et al. 1963, Rak.e et Graham 1964). 2°) par l'observation que la synthèse de l'ARN 458 et celle de l'ARN ribosomique sont réduites de façon concomitante au début de l'embryogé-nèse (Nemer 1963). 3°) par l'observation que le mutant anucléolé de

X. Laevis

ne synthétise pas d'ARN 458 et pas d'ARN ribosomique

(Brown et Gurdon 1964). 4°) par hybridation compétitive qui montre que l'ARN 458 contient des séquences identiques aux ARN 288 et 18S (Perry et al. 1964). 5°) par ana yse e a composi ion en ases e ces l' 1 d 1 't' b d An• .('-.~

qui révèle qu'ils sont riches en GC alors que l'ADN et les autres ARN ne le sont pas (Amaldi et Attardi 1968, Jeanteur et al. 1968, Willems et al.

1968) •

4. La maturation de l'ARN 45S implique des intermédiaires entre cet ARN et les ARN 28S et 18S.

Des travaux s'appuyant surtout sur l'utilisation de l'AMD montrèrent que la radioactivité incorporée dans l'ARN 45S passait par un ARN 35S avant d'apparaître dans l'ARN 28S (Gall 1966, Penman et al. 1966, Busch et al. 1966). Ces travaux Il'Ontrèrent en outre que les ARN 45S et 35S sont nucléolaires alors que l'ARN 28S est nucléoplasmique €t cytoplasmi-que et l'ARN 18S exclusivement cytoplasmicytoplasmi-que. La mise au point de

techniques de fractionnement cellulaire (Penman et al. 1966) et de

séparation de l'ARN par électrophorèse (Loening 1967, Peacock et Dingman 1968) permit ensuite la mise en évidence d'espèces intermédiaires moins

importantes (41S, 36S, 208) et d'établir la séquence des événements entre la synthèse de l'ARN 45S et l'apparition des ARN 28S et 18S dans le

cytoplasme (Weinberg et al. 1967). Ces résultats subséquemment confirmés par l'étude de la structure des molécules au microscope électronique

(Wellauer et Dawid 1973) indiquent que la maturation de l'ARN 45S procède de la façon suivante:

a)

458

~41S -=o:::=}32S 28S

~24S ~20S ----~ 18S

b) 458___,,,41s --===:::=l36s - - -... 32s ----.2ss _{---..,.248 ~18S}

5. L'ARN ribosomique est méthylé.

HeLa (W,ellauer et Dawid 1973) L (Wellauer et al. 1974)

Après la démonstration que l'ARN ribosomique est méthylé (Brown et Attardi 1965, Burdon 1966), l'ARN 45S nucléolaire a été identifié comme

berg et Penman 1966, Zimmerman et Holler 1967). Des résultats identiques ont été obtenus chez le rat (Muramatsu- et Fujisawa 1968). L'examen de la méthylation des nucléotides et des dinucléotides obtenus par hydrolyse alcaline des ARN méthylés a montré,par la suite~que l'ARN 45S contient

les séquences de l'ARN 28S et 18S alors que l'ARN 35S ne contient que la séquence de !'ARN 28S (Wagner et al. 1967). De plus ces études établis-saient que seules les séquences conservées (i.e. 28S et 18S) sont méthy-lées. Des travaux plus poussés montrèrent ensuite que certains résidus méthyl sont ajoutés pendant la maturation des ARN 18S et 28S (Zimmerman 1968, Maden et al.1972, Maden et Salim 1974). Finalement Liau et Hurl-bert (1975) ont montré la méthylation de !'ARN 45S dans des nucléoles isolés.

L'absenca de méthionine (Vaughan et al. 1967) ou son remplace-ment par l'éthionine (Wolf et Schlessinger 1977) dans le milieu de culture des cellules semble causer une inhibition plus importante de la synthèse et de la maturation de !'ARN ribosomique qu'une carence en un autre acide aminé. L'utilisation de la cycloleucine, un inhibiteur de la formation de la s-adénosyl-méthionine, a montré la sensibilité de la maturation de l'ARN ribosomique

à

l'inhibition de la méthylation (Caboche et Bachellerie, 1977) . Enfin chez un mutant des cellules BHK, la matu-ration thermosensible de l'ARN 32S (Toniolo et al. 1973) implique la méthylation de l'ARN préribosomique (Ouellette et al. 1976).

6. Les ARN ribosomiques existent associés

à

des protéines.

(RNP). Cette observation faite d'abord par microscopie électronique (Marinozzi 1964) fut ensuite confirmée par Tamaoki et Mueller (1965) et Tamaoki (1966). Ces RNP furent ensuite isolés du noyau des cellules

(Yoshikawa-Fukada 1967, Rogers 196S) et du nucléole par Warner et Soeiro (1967) qui montrèrent l'existence d'un RNP S08 contenant l'ARN 45S et d'un RNP 55S contenant l'ARN 328. Liau et Perry (1969) montrèrent que la maturation des RNP (S08 ~~> 55S ~~> 50S) est accompagnée d'une

diminution de la proportion de protéines associées

à

l'ARN. On montra ensuite l'existence d'un RNP intermédiaire entre les RNP SOS et 55S

(Mirault et al. 1971) puis l'existence de RNP légers, précurseurs du RNP SOS (Bachellerie et al. 1971, 1975).

L'étape suivante est la sortie du nucléole et l'apparition dans le nucléoplasme sous la forme de RNP 50S contenan~ l'ARN 2S8 (Vaughan

et al. 1967). Dans le cytoplasme, les nouveaux RNP se joignent d'abord aux RNP 45S (ARN lSS) et aux RNP 60S (ARN 2SS) (Girard et al. 1965, Jok-. lik et Becker 1965, Perry 1965) dont ils se distinguent par une plus grande proportion de protéines (Perry et Kelley 1966 a, b) . Ces RNP sont ensuite associés aux polysomes avant d'apparaître dans les monoso-mes (Girard et al. 1965).

7. Contrôle de la synthèse des ARN ribosomiques.

La synthèse de l'ARN ribosomique est contrôlée en m:)difiant la

quan-tité de gènes (Perry 1973, Reeder 1974) ou en modifiant les taux de transcription et de maturation (Perry 1973) . Des lymphocytes au repos ont des taux de transcription et de maturation réduits (Rubin 1968, Cooper 1970) . De même, des cellules en phase stationnaire ou en méta-phase se comportent de la même manière (Emerson 1971, Fan et Penman 1971).

D'autre part, plusieurs travaux ont montré que les ARN ribosomiques syn-thétisés dans des cellules en phase stationnaire étaient dégradés rapide-ment (Rubin 1968, Cooper 1970) et que les ribosomes étaient instables

(Becker et al.1971). La stabilité des ribosomes semble directement proportionnelle au taux de croissance des cellules (Weber 1972, Kolodny 1975). Ces travaux montrent que la production d'ARN ribosomique est contrôlée. Des sites de contrôle possibles ont été cherchés et identi-fiés.

Ainsi on a montré que l'incorporation d'analogues des précur-seurs de l'ARN ribosomique provoquait une inhibition de la maturation de cet ARN (Tavitian et al. 1968, Wilkinson et Pitot 1973, Reichman et

al. 1973, Weiss et Pitot 1974 a, b, 1975). L'observation que des agents intercalants ont le même effet (Snyder et al. 1971) a montré que c'est la structure des ARN qui est affectée par aes traitements. D'autre part, les agents qui affectent la méthylation affectent aussi la maturation

(Caboche et Bachellerie 1977) suggérant que la méthylation modifie aussi la structure des ARN et que cette structure est importante pour la matu-ration de l'ARN.

Enfin on a montré d'abord par microscopie électronique (Simard et Bernhard 1967, Simard et al. 1969) et ensuite biochimiquement (Amalric et al. 1969, Warocquier et Scherrer 1969) que les températures supranor-males affectaient la synthèse et la maturation de l'ARN préribosomique.

La maturation est inhibée

à

42°c (Warocquier et Scherrer 1969) alors que la synthèse est inhibée

à

44.5°c (Simard et al. 1969, Amalric et al. 1969). 'Ibutefois en ce qui concerne ces travaux, il faut souligner que la syn-thèse des protéines est partiellement inhibée

à

42°c (McCormick et

\

Penman 1969, Schochetman et Perry 1972) impliquant/à long terme/des effets secondaires sur la synthèse et la maturation de l'ARN prériboso-mique comme on le verra plus loin.

8. Coordination entre la production des ribosomes et la synthèse des protéines.

L'effet de l'inhibition de la synthèse des protéines sur le métabo-lisme nucléolaire a fait l'objet de nombreux travaux (Warner 1974). D'une part l'utilisation d'inhibiteurs a montré que la synthèse et la maturation de l'ARN préribosomique sont inhibées en absence de synthèse de protéines (Tamaoki et Mueller 1963, Holland 1963, Warner et al. 1966, Ennis 1966, Higashi et al. 1968, Soeiro et al. 1968, Willems et al. 1969, Rizzo et Webb 1969, Muramatsu et al. 1970, Craig et Perry 1971, Fakan 1971, Cooper et Gibson 1971, Franze-Fernandez et Fontanive-Sanguesa 1975, Penman et al. 1976) et que l'inhibition de la synthèse est plus ou moins importante selon la dose d'inhibiteur utilisée (Soeiro et al. 1968, comparer aussi Warner et al. 1966 et Willems et al. 1969, ainsi que

Rizzo et Webb 1969 et Muramatsu et al. 1970). Il faut noter que l'on a déterminé que la RNA polymérase A isolée n'est pas inhibée par ces dro-gues (Benecke et al. 1973).

D'autre part, pendant une carence en acides aminés on a montré l'inhibition de l'incorporation d'uridine ( Shields et Kerner 1969,

Sk8ld et Zetterberg 1969, Smulson et Thomas 1969, B8lcsf8ldi et al. 1971) ainsi que l'inhibition de la synthèse et de la maturation de l'ARN 458

(Maden et al. 1969, Tiollais et al. 1971, Vaughan 1972) quoique pas de façon aussi importante que dans les études utilisant des inhibiteurs.

Vaughan et Hansen (1973) ont par la suite montré que les carences en acides aminés provoquaient une augmentation de la concentration des t-RNA non chargés et que ceux-ci inhibaient l'initiation de la synthèse des protéines.

L'effet de la carence en acides aminés a été confirmé par des mesures de l'activité RNA polymérasique dans des nucléoles isolés

(Franze~Fernandez et Pogo 1971) et assigné récemment

à

un taux

d'initia-tion de la synthèse d'ARN plus bas (Grurnrnt et al. 1976).

A tous ces faits vient s'ajouter l'observation que chez des cellules placées en milieu hypertonique, dans des conditions où la syn-thèse des protéines est inhibée (Pestka, 1977), la synsyn-thèse de !'ARN 458 n'est pas inhibée (Pederson et Kurnar 1971) et ensuite que l'incorporation d' uridine-14

c

n'est pas inhibée chez CHO-tsHl '\ un mutant dont l'enzyme leucyl-t-RNA synthétase est thermosensible, causant une inhibition

à

99% de la synthèse des protéines ('Ihompson et al. 1973).

En résumé, l'inhibition de la synthèse des protéines provoque une inhibition de la synthèse et de la maturation de l' ARN 458.

Toute-fois, l'importance de l'inhibition (de la synthèse en particulier) n'est pas toujours la même et quelquefois sans égard

à

l'importance de l'in-hibition de la synthèse des protéines.

9. TsHl comme modèle pour l'étude de la coordination entre la synthèse des ARN ribosomiques et la synthèse des protéines.

Parmi tous les modèles utilisés pour étudier les interactions entre la transcription et la traduction, tsHl se présente comme le modèle idéal parce que le traitement utilisé pour provoquer l'inhibition de la

tra-duction n'implique qu'un changement de température. Le fait que les cellules de type sauvage ne soient pas affectées par la température

(Thompson et al. 1973) et que même tsHl puisse pousser

à

des températures non permissives lorsque la concentration de leucine du milieu est suffi-samment augmentée ('Ihompson et al. 1975, Farber et Deutscher 1976)

indique que seule l'enzyme leucyl-t-RNA synthétase est sensible

à

la température chez tsHl.

Dans notre travail nous avons utilisé une approche combinant des techniques de microscopie électronique, dont l'autoradiographie

à

haute résolution, et des techniques biochimiques. Nous avons voulu au départ déterminer les correspondances entre les composants ultrastructu-ramc et biochimiques du nucléole, i.e. déterminer

à

quels RNP correspon-dent les zones fibrillaires et granulaires du nucléole pour ensuite uti-liser cette information dans l'étude du métabolisme de l'ARN nucléolaire par autoradiographie après incorporation d'uridine-3H chez tsHl.

Notre travail se divise en trois parties principales:

1- La détermination des correspondances entre les éléments ultrastructu-ramc et biochimiques du nucléole;

2- l'étude du métaboli~me de l'ARN préribosomique chez tsHl en absence

de traduction;

3- l'identification des mécanismes responsables soit du maintien soit de l'inhibition de la transcription et de la maturation des ARN ribosomiques en absence de traduction.

l. Matériel

L'acrylamide et le N,N'-méthylène bisacrylamide proviennent d'Eastman Kodak Co.; le (NH4)2

s

2

o

8 , le N,N,N' ,N'-tétraméthyl-1, 2-diaminoéthane et l'agarose de Biorad; le sucrase (sans RNAase) de Schwartz/Mann; le dithiothréitol de Calbiochem; l'Aquasol de New

England Nuclear; le sérum de veau foetal (sans mycoplasmes), le sulfate de kanamycine et le milieu a (en poudre, sans NaHco3) de Flow Lab.; les acides aminés, les vitamines et.le dextrose utilisés dans la préparation du milieu a de Gibco; l'ADN de thymus de veau, la collagénase et la DNAase (purifiée par électrophorèse) de Worthington; le cémulsol NPT 10

et le célanol 251, de Melle-Bezons.

L'uridine-5-3H (25 Ci/mM), l'uridine-2-14c (55 Ci/M), la

L-leucine-14 3

· 1- C (57 Ci/M), la L-valine-2, 3- H (12.5 Ci/mM), la L-méthionine-méthyl-3H (200 Ci/M), la L-méthionine-méthyl-14c (50 Ci/M) et la

14 . , ,

formaldehyde- C (10 Ci/M) ont ete obtenues de New England Nuclear.

2. Culture cellulaire

2.1. Milieux de culture et solutions

Milieu de culture: Les cellules sont cultivées dans le milieu a (Stanners et al. 1971) sans ribonucléosides ni déoxyribonucléosides. Il est composé de L-alanine, 25 mg/l, L-arginine-Hcl, 127 mg/l, L-asparagine, 56.7 mg/l, acide L-aspartique, 30 mg/l, L-cystéine-HC1-H2o, 100 mg/l, L-cystine, 24 mg/l, acide L-glutarnique, 75 mg/l, L-glutamine, 292 mg/l, glycine, 50 mg/l, L-histidine-HCl, 38 mg/l, L-isoleucine, 52.4 mg/l, L-leucine, 52.4 mg/l, L-lysine, 73.1 mg/l, L-méthionine, 15 mg/l;

L-phénylalanine, 33 mg/l, L-proline, 40 mg/l, L-sérine, 25 mg/l,

L-thréonine, 47.6 mg/l, L-tryptophan, 10.2 mg/l, L-tyrosine, 36.2 mg/l, L-valine, 46.8 mg/l, acide L-ascorbique, 50 mg/l, D-biotine, 0.1 mg/l, vitamine B12, 1.36 mg/l, panthoténate de calcium, 10 mg/l, choline, 1 mg/ 1, acide folique, 1 mg/l, inositol, 2 mg/l, acide lipoïque, 0.2 mg/l, niacinamide, 1 mg/l, pyridoxal-HCl, 1 mg/l, pyruvate de sodium, 110 mg/ 1, riboflavine, 0.1 mg/l, thiamine-Hel, 1 mg/l, NaCl, 6,800 mg/l, KCl,

NaHco3, 1870 mg/l, glucose, 1000 mg/let "phenol red", 17 mg/l. Trypsine-citrate: trypsine 0.25%, "phenol red" 0.001% et citrate trisodique 10 mM pH 7.4.

Tampons utilisés dans la détection des mycoplasmes:

Tampon Triton-phosphate: phosphate de sodium, 50 mM, pH 8.1, uracil, 1 mM, Triton X-100, 0.5% v/v.

Solvant: acide borique 4% - NH40H 30%-n-butanol, 70:1:430. 2.2. Entretien des souches

Deux souches de cellules CHO (Chinese Hamster Ovary) ont été utilisées: les CHO-S (Thompson et al. 1975), de type sauvage et les CHO-tsHl (Thompson et al. 1973), dont l'enzyme leucyl-t-RNA synthétase est thermosensible. Les premières sont cultivées à 37°c et les secondes

' 0 ,,.

a 34 (Thompson et al. 1973). Les cellules sont cultivees en couche monocellulaire dans des boîtes de plastique dans du milieu a enrichi par 10% v/v de sérum de veau foetal (SVF) .

2

Des boîtes de 75 cm confluentes sont lavées avec 3 ml de trypsine-citrate puis trypsinisées avec 1.5 ml de la même solution. Les CHO-S sont, en général, trypsinisées à 37°c et les tsHl à la température de la

pièce. Les cellules sont ensuite diluées 1:20 et ensemencées dans 15 ml de milieu par boîte. Elles sont confluentes en 4 jours; donc chaque passage représente 5 générations. Après 10 passages, de nouvelles cultures sont initiées

à

partir de cellules congelées.

2.3. Conservation des souches

Pour congeler, des cultures confluentes sont trypsinisées, lavées avec du milieu a enrichi de 10% v/v de SVF et resuspendues

à

une concentration de 107/ml dans du milieu a contenant 10% v/v de SVF et 10% v/v de glycérol. Les cellules, dans des bouteilles de verre de deux

,,. ' 0 4 . ' 80°

ml, sont placees a 4 C pour heures puis a -

c.

Quelques bouteilles sont conservées dans l'azote liquide parce que la survie des cellules

à

-so

0_{c est faible après six mois d'entreposage. La décongélation}

s'effec-tue par immersion des bouteilles

à

37°c ou

à

34°c. Les cellules sont ensemencées dans une boîte de 150 cm2 avec 30 ml de milieu a enrichi de 10% v/v de SVF et sont confluentes en deux jours.

2.4. Courbes de croissance

Les cultures sont ensemencées dans les conditions habituelles puis le nombre de celLules déterminé

à

intervalles réguliers. Les cellules sont comptées

à

l'aide d'unhémacytomètre en présence de

"trypan blue" 0.1%. La fig. 1 montre les courbes de croissance des

0 ' 0

CHO-S à 37 c et des tsHl a 34

c.

La partie linéaire de la courbe est ensuite utilisée pour déterminer la durée d'une génération

à

l'aide de l'équation (1).

N (t)

=

NoEat (1)

où N₀ est le nombre initial de cellules, a

=

_{0.693/t0 et t 0 est la durée} d'une génération. En exprimant l'équation (1) sous la forme de l'équation

,, .... 2 ,,

Une serie de boites de 25 cm sont ensemencees avec une

quanti-,, quanti-,, 5 ... )

te egale de cellules (3-5 x 10 / boite • En temps voulu, les boîtes sont trypsinisées et les cellules sont comptées avec un appareil Coulter. Chaque point représente la moyenne de cinq déterminations.

u

106 w Cl w n:: c.Cl ~

0

z

"

24

48

72

HEURES

( 2)

ln N(t)

=

ln N₀

+

_{(0.693/t0) t} (2)

il est possible d'obtenir t 0 graphiquement ou de manière plus précise, en résolvant pour t 0 les équations normales (3) et (4)

Eln N(t)

=

m (lnNO) t (0.693/tD) Et (3)

E (ln N(t))t

=

(lnN₀)Et + _{(0.693/t0) Et}2 (4)

où m représente le nombre de points utilisés pour la détermination. La solution pour tD est

0.693 2 (Et) 2)

tD = (mEt - (5)

(mE (lnN (t)) t)

-

( (LlnN (t)) (Et))

Nous avons ainsi déterminé que les CHO-S doublaient en 13 heures et les tsHl en 20 heures •

•

2.s.

Détection des mycoplasmes: essai de l'uridine phosphorylase L'uridine phosphorylase catalyse la réaction suivante:

uridine - P04 ...--~~ uracil

+

ribose-1-phosphate.

L'usage de cet essai pour la détection des mycoplasmes est basé d'abord sur le fait que cette activité y est plus importante que chez les cellu-les de mammifères et ensuite sur la possibilité de distinguer, par leur sensibilité

à

la température, les deux activités (Levine, 1972).

Le milieu d'une culture de deux jours est décanté et remplacé par du

7

tampon triton-phosphate

à

raison de 3 ml par 2 x 10 cellules. Le

lysat est décanté et séparé en deux parties dont l'une est incubée 10 mn dans un bain d'eau bouillante. Après addition de 1 µCi d'uridine-14c, les deux échantillons sont incubés dans un bain à 37°c. Des aliquots sont prélevés après 30 mn et après 180 mn. La réaction est arrêtée

' 0 ,. "' ,.

' 200 . 1'

a - C JUsqu a la chromatographie. Après le dégel, l'activité enzymatique est nulle. L'uridine et l'uracil sont ensuite séparées par chromatogra-phie. Des aliquots (1-5 µl) sont déposés

à

5 cm de l'extrémité d'une languette de papier Whatman #41 (18 mm x 160 mm) • Cette extrémité est attachée

à

l'aide d'un trombone

à

un morceau de papier #41 (environ

40 mm x 200 mm) enroulé sur lui-même et devant servir de support. L'autre extrémité est fixée,

à

l'aide d'un trombone,

à

un bouchon de silicone ou de liège. Environ 15 ml de solvant

(à

37°c) sont versés dans un tube de 25 x 200 mm, le montage y est introduit.et l'ensemble fermé herméti-quement. La chromatographie est faite

à

l'horizontale et dure entre 20

et 30 ron. Le chromatogramme est alors séché et découpé en tranches de 2 mm qui sont comptées après addition de 10 ml d'Aquasol.

•

La fig. 2 montre les résultats de la séparation. L'importance de l'infection est déterminée par le pourcentage d'uridine convertie en uracil entre 30 et 180 mn. Nos essais indiquent que ni les CHO-S, ni les tsHl ne sont capables de transformer !'uridine en uracil. L'essai a été fait

à

intervalles réguliers afin de s'assurer de l'absence des mycoplasmes.

2.6. Cultures en suspension

Pour obtenir des cultures en suspension, un minimum de trois boîtes de 150 cm2 confluentes sont trypsinisées de la manière habituelle.

La trypsinisation est arrêtée par l'addition,

à

chaque boîte, de 10 ml de milieu contenant 10% v/v de SVF. Les cellules sont centrifugées 3-5 mn

à

600 g et mises en suspension dans un "spinner" avec 150 ml de milieu enrichi par 10% v/v de SVF et 1% v/v de sulfate de kanamycine. On laisse les cellules récupérer pendant 6-24 heures puis elles sont comptées et

B chromatographie de l'uraci1-2-14

c.

C lysat de cellules tsHl bouilli, incubé 30 mn avec

l'uridi-14 ne- C.

D lysat cellulaire bouilli, incubé 180 mn avec l'uridine-14

c.

E lysat cellulaire, incubé 30 rnn.

F lysat cellulaire, incubé 180 rnn.

f \

...

C'2 •o

-)(

...

u

..,

...

~ A. u

c

5

E

5

10

D

F

20

TRANCHES

10

20

5

diluées

à

3 x 10 /ml toutes les 24 heures. La suspension est examinée régulièrement au microscope

à

contraste de phase pour détecter toute contamination par des microorganismes. Dans nos conditions de culture, la durée de génération passait de 18-20 heures

à

25-26 heures après une semaine en spinner. Nous n'avons pas cherché la cause exacte de cette diminution. Elle pourrait être liée

à

des changements dans le milieu de culture, notamment dans le pH qui devient pl us acide. Pour contourner cette difficulté nous avons toujours utilisé les cellules dans les premiers cinq jours de culture en prenant soin de vérifier que les cellules poussaient normalement.

2. 7. Manipulation des cultures

Les cellules tsHl sont soumises

à

des traitements impliquant des changements dans la composition et la température du milieu pour obtenir l'inhibition de lâ synthèse des protéines. Thompson et al.

(1975) et Farber et Deutscher (1976) ont montré que la leucyl-t-RNA syn-thétase de tsHl était sensible

à

la température et

à

la concentration de leucine du milieu. Donc pour obtenir une inhibition plus rapide de la synthèse des protéines, les cellules sont chauffées

à

42°c en absence de leucine. De plus, à cette température, l'initiation de la synthèse des protéines est inhibée (McCormick et Penman, 1969).

Lorsque les cellules croissent dans des boîtes de plastique

à

34°c, le milieu de culture est remplacé par du milieu a déficient en leucine

à

42°c, les boîtes sont refermées et immergées dans un bain

à

42°c pour 5 mn. Les boîtes sont ensuite retirées du bain, le milieu est remplacé par du milieu a enrichi de SVF

à

39.S0c et les boîtes sont immergées dans un bain

à

39.S0c. Les bains contiennent 0.1% méthyl-4-hydroxyben-zoate pour inhiber la croissance des microorganismes.

Lorsque les cellules sont en croissance dans un "spinner", la suspension est centrifugée

à

600 g

à

température ambiante 3

à

10 mn et resuspendue par agitation dans 10% du volume initial dans du milieu a déficient en leucine

à

42°c. La suspension est incubée

à

cette tempéra-ture pendant 5 mn puis diluée dans suffisamment de milieu a enrichi de SVF et de kanamycine,

à

39.5°c, pour restaurer la concentration cellulaire originale.

Pour estimer l'efficacité de cette technique, l'incorporation de valine-3H a été mesurée, tel que décrit en 8.3.2.,

à

partir du début de l'incubation

à

39.5°c. La fig. 3 montre les résultats de cette expérience. Les pentes des courbes indiquent que l'incorporation est inhibée

à

95%

' 0

a 39.5 c. La fig. 3 indique aussi que cette inhibition atteint son

maximum moins de 5 mn après le début de l'incubation

à

39.5°c.

L'incorporation résiduelle représente la synthèse d'une petite

quan-~ité de protéines. Ce problème a été examiné un peu plus en profondeur

à

la section 2.1. des Résultats. Les expériences qui y sont décrites indiquent que la méthode que nous avons utilisée permet d'inhiber très rapidement la synthèse de toutes les protéines. Celles qui sont tout de même synthétisées appartiennent

à

toutes les catégories de poids molécu-!aires quoique les petites protéines aient plus de facilité que les gros-ses

à

être complétées.

3. Fractionnement cellulaire

3 .1. Tampons

Tampon phosphate: Tampon PBS (Dulbecco, 1954) déficient en calcium et en magnésium: NaCl, 8 g/l; KCl, 0.2 _{g/l, Na2HP04,} 1.15 g/l;

ordonnée DPM X 10 -6 par mg d'ADN

Une culture en suspension en croissance exponentielle

à

34°c est divisée en deux parties dont l'une est incubée

à

34°c et

' 0 / 3

l'autre a 39.5 C en presence de valine- H (10 uci/ml). En ternos voulu, un échantillon est prélevé et immergé dans 4 volumes de tampon phosphate pour arrêter l'incorporation. La radioactivité incorporée est ensuite déterminée tel que décrit dans Matériel et Méthodes.

3

2

_ r . - - - 0 - - - - 0 - - - 0 - - - 1 1 1

3 9.5°c

KH2Po4, 0.2 g/l; pH 7.4.

Milieu noyaux: Tris-HCl, 10 mM, pH 7.4; sucrase, 0.25 M; MgC12, 2.5 mM; _{Cacl2, 0.1} mM et polyvinylsulfate, 25 µg/ml.

Milieu A: Tris-Hel, 10 mM, _{-pH 7.4; ficoll, 2.1%; Mgel2,}

5.5 mM; mercaptoéthanol, 0.25 mM et polyvinylsulfate, 10 µg/ml. Milieu B: Identique au milieu A sauf Mgel2, 0.5 mM.

Milieu C: Identique au milieu A sauf Mgel 2, 3 mM.

RSB ("Reticulocyte standard buffer"): Tris-Hel, 10 mM, pH 7.4; NaCl, 10 mM; _{Mgel2, 1.5} mM.

HSB ("High salt buffer"): Tris-Hel, 10 mM, pH 7.4; Nael, 0.5 M; Mgel2, 50 mM.

NEB ("Nael-EDTA-buffer"): Tris-Hel, 10 mM, pH 7.4; Nael, 10 mM; EDTA, 10 mM.

PA (polysome A) : Tris-Hel, 10 mM, pH 7.4; Nael, 0.15 M; Mgel2, 1. 5 mM.

PB (polysome B) : Tris-Hel, 20 mM, pH 7.4; Nael, 50 mM;

Mgel2, 1.5 mM.

3.2. Préparation des noyaux

Les noyaux sont préparés par la méthode de Zalta et al. (1962). Un culot de cellules, lavé avec 10 ml de tampon phosphate, est resuspendu dans 10 vol. de tampon noyaux auquel on ajoute 100-200 µg de collagénase et deux détergents: du NPT 10 (0.4% v/v) et du 251 (0.1% v/v).

La collagénase est préparée le jour même dans du tampon noyaux (1 mg/ml) et la solution est clarifiée par filtration (Millipore, HAWP 0.22 µm). La suspension cellulaire est homogénéisée 15-30 s à 600 rpm à l'Ultra-Turrax (Janke et Kunkel). On laisse ensuite l'enzyme et les détergents agir pendant 1 mn puis la suspension est de nouveau homogénéisée 15-30 s.

L'opération est répétée jusqu'à ce que les noyaux apparaissent complète-ment libérés du cytoplasme par observation au microscope

à

contraste de phase. Les noyaux sont centrifugés 3-5 mn à 1000 g et lavés une fois avec 10 vol. de tampon noyaux. Les volumes de tampon sont toujours donnés en fonction du volume du culot de cellules.

3.3. Préparation des nucléoles

3.3.1. Par ultrasons (Zalta et al. 1971)

Des noyaux obtenus tel que décrit en 3.2. sont resus-pendus dans 5 vol. de tampon A et désintégrés par 15-30 s

d'ultrasonica-tion dans un appareil MSE Mk2 équipé d'une sonde de 9.5 mm à une fré-quence de 20 KHz et une amplitude de 7 µm. Pour éviter l'échauffement de la suspension pendant le traitement, de courtes périodes d'ultrasoni-cation sont entrecoupées de périodes plus ou moins longues de repos: pour des volumes de 2-4 ml, 5 s d'ultrasonication et 25 s de repos, pour 5-10 ml, 5 s et 10 s et enfin pour plus de 10 ml, 10 s et 5 s. Le traitement est fait dans un tube conique de 10 ml de type "Sorvall" ou dans un tube de 30 ml de type "Corex". Dans ces conditions la températu-re ne dépasse jamais

4°c

si le tube est enfoncé jusqu'au niveau du tam-pon dans un mélange eau-glace. Il est en outre nécessaire d'observer les précautions suivantes: a) la pointe de la sonde doit être enfoncée jusqu'à 13 mm sous la surface du tampon et

à

plus de 13 mm du fond du tube pour permettre une bonne efficacité de transmission des ultrasons. b) la sonde ne doit pas toucher le verre au risque de provoquer la désintégration de la surface du tube. On obtient alors, après centrifu-gation, un culot de nucléoles grisâtre. Après 10

à

15 s d'ultrasonica-tion, la suspension est examinée au microscope

à

contraste de phase. Lorsque les noyaux ont tous été ouverts on ajoute un volume égal de

tampon B et on continue l'ultrasonication (15-30 s) jusqu'à ce que les nucléoles soient débarrassés de tout fragment de chromatine.

Les nucléoles sont obtenus par 10 rnn de centrifugation à 3000 g. Le culot est resuspendu dans 5 vol. de tampon C et centrifugé. Ce lavage est destiné à enlever la chromatine qui a été entraînée avec les nucléo-les pendant la centrifugation précédente.

3.3.2. Par traitement

à

la DNAase dans un tampon à haute

force ionique (Penman et al. (1966) et Warner et Soeiro (1967))

Les noyaux obtenus en 3.2. sont resuspendus dans 10

vol. de tampon RSB et centrifugés 3 mn

à

1600 g. Les noyaux sont resuspendus dans 10 vol.de RSB auquel on ajoute du déoxycholate de sodium (0.5%) et du tween 40 (1% v/v), mélangés 30 s au vortex et centrifugés 3-5 rnn à 1600 g. Le culot est lavé avec du RSB. Le culot est resuspendu dans 10 vol. de tampon HSl3 contenant 50-100 µg/rnl de DNAase I et homogénéisé jusqu'à ce que les nucléoles soient libérés et que la chromatine soit solubilisée. Les nucléoles ne doivent pas

rester trop longtemps dans ce tampon, aussi sont-ils homogénéisés dans un appareil de type dounce. Après 10 courses, le traitement est terminé à la pipette pasteur. Le tout prend 10 rnn. Les nucléoles sont obtenus par 10 rnn de centrifugation

à

4000 g.

3.4. Préparation des RNP nucléolaires (Warner et Soeiro, (1967))

Un culot de nucléoles, obtenus tel que décrit en 3.3.2., est rincé avec du tampon NEB, resuspendu dans 5 vol. de NEB contenant 10 mM

dithiothréitol et 0.1% Brij 35 et homogénéisé pendant 10 rnn dans un bain

à 25°c. La suspension est ensuite clarifiée par centrifugation 10 rnn

à

\

gradients 15-30% p/p sont centrifugés 1.08 x 106 g max. heures (rotors SW 25,27,41 et SB283) ou 90 min

à

48000 rpm (rotor SW 50) et les

gradients 5-20%, 6.8 x 105 g max. heures. Après la centrifugation une aiguille est plongée dans le gradient qui est alors aspiré par le fond avec une pompe péristaltique. L'absorbance

à

254 nm·est mesurée en même temps par passage

à

travers une cuvette de spectrophotomètre Pharmacia 200. Des fractions sont recueillies

à

la sortie lorsque désiré.

3.5. Préparation des polysomes (Schochetman et Perry (1972), Penman et al. (1976))

Un culot de cellules est resuspendu dans 10

à

20 vol. de tampon PA et homogénéisé au dounce, équipé d'un piston ajusté (type B), en

présence de 0.05% v/v de Nonidet P-40. L'homogénat est centrifugé 10 rnn

à

12000 g et 0.6 ml de surnageant est déposé sur un gradient de sucrase 0.5 M - 1.5 M dans le tampon PB et centrifugé 75 rnn

à

41000 rpm dans le rotor SW41.

3.6. Préparation des ribosomes (Rich, 1967)

Un culot de cellules est resuspendu dans 10 vol. de tampon 0.33 RSB et laissé dans la glace 10 rnn pour faire gonfler les cellules. Elles sont ensuite ouvertes par 15

à

30 courses d'homogénéisateur

dounce puis centrifugées 5 rnn

à

1600 g. Le surnageant 1600 g est

clarifié par une centrifugation de 15 rnn

à

20000 g et, après addition de déoxycholate de sodium jusqu'à 0.3%, centrifugé 75 mn

à

100,000 g. Le culot est resuspendu dans du tampon 0.33 RSB et centrifugé 75 rnn

à

100,000 g. Le culot translucide contient les ribosomes.

4. Détermination des densités de flottaison des RNP dans des gradients de CsCl (Baltimore et Huang, (1968))

4.1. Solutions

Gluteraldehyde: Solution 25% neutralisée (pH 7.4) par addition de NaHC03 M.

CsCl: Les solutions sont préparées dans le tampon RSB et additionnées de 0.1% Brij 35.

4.2. Fixation des RNP, préparation des gradients et centrifugation Les fractions de gradients contenant les RNP sont rassemblées et additionnées de gluteraldehyde jusqu'à 6% v/v. · Des gradients de CsCl 35-55% p/p sont construits à l'aide d'un appareil Beckman à partir de solution 12% et 108%. Des gradients de 5 ml sont préparés en chambre froide dans des tubes de 12 ml juste avant d'être utilisés.

Des échantillons d'environ 1 ml sont déposés sur les gradients puis les tubes sont remplis d'huile minérale et centrifugés 5 heures à

\

175000 g (au milieu du gradient). La centrifugation est arrêtée avec le

frein et les gradients sont fractionnés tel que décrit en 3.4. 25

fractions d'environ 0.2 ml sont recueillies et la radioactivité déterminée au compteur à scintillation après addition de 0.5 ml d'eau et 10 ml

d'Aquasol. A intervalle régulier, la pompe est arrêtée et l'indice de réfraction de la dernière goutte mesuré à l'aide d'un réfractomètre.

5. Microscopie électronique et autoradiographie

5.1. Solutions

Tampon Sorensen: Na_{2HPo4 , 0.08 M;} NaH_2Po4, 0.02 M; pH 7.2.

Tampon Cacodylate: cacodylate de sodium, 0.1 M, ajusté à pH 7.2 avec HCl.

Epon: A: Epon 812, "Dodecenyl succinic anhydride", 31:50. B: Epon 812, "Nadic methyl anhydride", 43:38.

1 volume de A, 1 volume de B et 0.015 volume de Benzyldiméthylamine. Conservé

à

-8o0c.

Formvar: 0.6% dans 1,2-dichloroéthane.

Thiosulfate d'or: HAuc14, 0.004%; KSCN, 0.0005% et KBr

0.0006%. Le chlorure d'or est préparé

à

0.02% dans l'eau et neutralisé avec NaOH.

Révélateur: Métal, 0.45 g/l; acide ascorbique, 3 g/l;

Na2B4

o

7 .10 H2

o,

5 g/l; KBr, 1 g/l; pH 8.0. Préparé 1 heure avant son utilisation.

5.2. Préparation des échantillons 5.2.1. Préparation des blocs

Les cultures cellulaires, en boîtes de plastique ou de

2

verre de 25-75 cm sont lavées 3 fois avec du tampon phosphate (3.1.) froid pour bien enlever le SVF puis fixées in situ pendant 30 mn avec 5-15 ml de gluteraldehyde 2.5% v/v préparée dans le tampon Sorensen ou cacodylate. Cette opération est effectuée en chambre froide. Après la fixation, on lave deux fois avec du tampon, on détache les cellules par grattage dans 10 ml de tampon et on les centrifuge 10 mn

à

1000 g. Le surnageant est décanté et on ajoute au culot environ 0.5 ml d'une solution tamponnée d'acide osmique (2%) et on fixe 30 mn,

à

4°c, après avoir brisé le culot de cellules avec une fine tige de verre. L'acide osmique est ensuite enlevé avec une pipette pasteur et les morceaux sont lavés trois fois avec 2 ml de tampon puis une fois avec 2 ml d'éthanol 70% v/v et finalement laissés pour la nuit dans cette solution à 4°c.