Optimisation des réacteurs microfluidiques
microbiens en contrôlant la croissance et
l'homogénéité du biofilm
Mémoire
Farnaz Asayesh
Maîtrise en chimie
Maître ès sciences (M.Sc.)
Québec, Canada
© Farnaz Asayesh, 2018
Optimisation des réacteurs microfluidiques
microbiens en contrôlant la croissance et
l’homogénéité du biofilm
Mémoire
Farnaz Asayesh
Sous la direction de:
iii
RÉSUMÉ
Les biofilms microbiens soit des communautés multicellulaires formées de bactéries, adhérant à une surface, entourés d’une couche de polymère extracellulaire (EPS). Parce qu’ils sont naturels, les biofilms bactériens sont de plus en plus étudiés et utilisés pour des applications en biocatalyse, en autoréparation et en tant que systèmes pouvant fonctionner efficacement dans des conditions ambiantes. La structure du biofilm est également importante, car elle peut protéger les bactéries sous les contraintes physiques, chimiques et biologiques rencontrées lors de l’opération du bioréacteur. Parmi les principaux facteurs entrant dans la régulation du développement du biofilm et de ses propriétés à maturité, on trouve les conditions hydrodynamiques et les concentrations d’éléments nutritifs appliquées. La microfluidique connait une popularité croissante parmi la communauté de recherche sur les biofilms en raison de sa capacité à mieux contrôler ces paramètres en fonction de d’autres propriétés physicochimiques importantes et même le taux de croissance. Dans ce travail, nous nous appuyons sur les travaux antérieurs de notre groupe pour résoudre deux principales limites. Tout d’abord, la tendance des biofilms à contaminer les canaux et les tubes en amont peut éroder les spécifications précises des conditions expérimentales dans les positions en aval d’où des mesures analytiques sont réalisées. La premiere partie ce travail, nous présentons un dispositif microfluidique qui varie la vitesse d’écoulement en amont pour arrêter la croissance vers l’arrière et la contamination de l’entrée pour les expériences de longue durée. Le deuxième point d’intérêt est lié à des facteurs qui provoquent une hétérogénéité dans les modèles de croissance du biofilm. On a noté que les bulles formées pendant et après l’inoculation augmentaient la croissance locale du biofilm et réduisaient l’uniformité et l’homogénéité globale. Ce mémoire étudie également les effets des bulles sur le taux de croissance et le développement secondaire du biofilm.
iv
Table des Matières
RÉSUMÉ ... iii
Table des Matières ... iv
Liste des Figures ... viii
Liste desTableaux ... x
Liste desÉquations ... xi
Liste desAbréviations ... xii
Remerciement ... xiii
Avant-propos ... xiv
Chaptire 1: Introduction ... 1
1.1. Motivation : transformation biologique par les biofilms ... 1
1.2. Structure et composition des biofilm et la substance polymère extracellulaire ... 2
1.2.1. Le cycle de vie du biofilm ... 3
1.3 Les dispositifs microfluidiques ... 5
1.4. Avantages de la microfluidique pour l’étude des biofilms ... 5
1.4.1. Conditions hydrodynamiques précises ... 6
1.4.1.1. Ratios de surface par rapport au volume élevé ... 6
1.4.1.2. Écoulement laminaire ... 7
1.4.1.3. Les forces de cisaillement appliquées dans les microscanaux ... 9
1.5. Études antérieures utilisant la microfluidique pour la croissance des biofilms ... 10
1.6. Utilisation de la microfluidique pour l’étude des bioflms Identification de nouveaux défis et solutions proposées ... 11
1.6.1. Croissance incontrôlée près des parois des microcanaux ... 11
1.6.2. Contamination en amont ... 13
v
1.8. Effet des microbulles attachées en surface sur la croissance du biofilm ... 15
Chapitre 2: Matériel et méthodes ... 17
2.1. Matériel et méthodes ... 17
2.1.1. Conception et fabrication de moules ... 17
2.1.1.1. Méthode 1 ... 18
2.1.1.2. Méthode 2 ... 19
2.1.2. Matériaux du dispositif microfluidique ... 19
2.1.3. Contrôle des fluides ... 20
2.2. Installation expérimentale et mesures... 20
2.3. Protocole biologique ... 21
2.3.1. Stérilisation... 21
2.3.2. Pré-culture bactérienne et nutriments ... 22
2.4. Techniques de mesure et autres protocoles ... 22
Chapitre 3 : Article ... 23
3.1. Résumé ... 24
3.2. Abstract ... 24
3.3. Introduction ... 25
3.4. Materials and methods ... 26
3.4.1. Inoculant preparation ... 26
3.4.2. Microfabrication ... 26
3.4.3. Microchannel design and properties ... 27
3.4.4. Fluidic control ... 30
3.4.5. Sterilization ... 30
3.4.6. Localized inoculation and introduction of bubbles ... 30
vi
3.5.1. Bubbles formed and released on a clean surface in the absence of planktonic
bacteria did not affect biofilm formation ... 31
3.5.2. Bubbles formed on a pre-inoculated surface led to enhanced biofilm growth and homogeneity ... 32
3.5.3. Bubbles formed on clean surfaces then exposed to planktonic bacteria led to biofilm “ring patterns” ... 38
3.6. Conclusion ... 42 3.7. Supplementary material ... 43 3.8. Acknowledgements ... 43 3.9. References ... 44 3.10. Supplementary Materials ... 24 3.10.1. Notation ... 47
3.11. Equipment and experimental methodology ... 47
3.11.1. Transmission microscopy ... 47
3.11.2. Confocal microscopy ... 49
3.11.3. Attenuated Total Reflectance-Fourier Transform Infrared spectroscopy (ATR-FTIR) ... 49
3.11.4. Profilometry ... 50
3.12. Experimental design and flow cell characterization ... 50
3.12.1. Flow cells design ... 50
3.12.2. Effect of channel hydrophobicity on bubble trapping ... 52
3.12.3. Channel characterization ... 52
3.12.3.1. Characterization of surface chemistry by ATR-FTIR ... 53
3.12.3.2. Characterization of surface roughness by scanning profilometry ... 53
3.12.3.3. Bubble attachment is a stochastic process ... 53
vii 3.13.1. Bubble formation... 54 3.13.2. Bubble properties ... 55 3.14. Bacterial Inoculation ... 56 3.14.1. Downstream inoculation ... 56 3.14.2. Upstream inoculation ... 57
3.15. Supplemental image gallery ... 57
3.15.1. Biofilms at bubble interface from bubbles formed on sterile surfaces ... 58
3.15.2. Bubbles formed on pre-inoculated surfaces ... 61
3.16. Supplementary Materials References ... 67
Chapitre 4: Résultats et Conclusion ... 68
4.1. Étude de la croissance vers l’arrière du biofilm dans un microcanal pour atteindre la source de nutriments ... 68
4.1.1. Vitesse et contrainte de cisaillement ... 69
4.2. Résultats ... 72
4.3. Mesure de la densité optique lors de la croissance du biofilm ... 73
4.4. Conclusion ... 74
viii
Liste des Figures
Figure 1.1 Illustration des cinq étapes de développement du biofilm bactérien expliqué dans
le texte principal. ... 4
Figure 1.2 Caractéristique de la taille des dispositifs microfluidiques ... 5
Figure 1.3 Microcanal à section rectangulaire ... 6
Figure 1.4 Des flux laminaire et turbulent à l’intérieur des micro cannaux ... 7
Figure 1.5 Deux solutions coïncident côte à côte le long du microcanal en régime laminaire. ... 8
Figure 1.6 Schéma du dispositif micro-fluidique à deux niveaux ... 12
Figure 1.7 Schéma du microcanal avec système de micro-écoulement à 3 entrées ... 14
Figure 2.1. Schéma représentant l’approche de photolithographie ... 17
Figure 2.2. Équipement pour la fabrication de moules ... 18
Figure 2.3 Laminateur de photorésine ... 19
Figure 2.4 Image montrant la conception micro-fluidique ... 21
Figure 3.1 Configuration expérimentale avec les pompes, les seringues ... 29
Figure 3.2 Channel characterization ... 31
Figure 3.3 A bubble in microchannel ... 33
Figure 3.4 Bubbles in nutrient solution ... 35
Figure 3.5 Top view of a volume rendered z-stack from CLSM showing bacteria surrounding a bubble ... 37
Figure 3.6 Superimposed images from CLSM ... 39
Figure 3.7 Top view of a volume rendered z-stack from CLSM showing bacteria surrounding a bubble ... 41
Figure 3.8 Schematic demonstrating the regions Rbubble, Rinterface and Rliquid ... 47
ix
Figure 3.10 Stitched images from the same microfluidic channel showing trapped bubbles
... 54
Figure 3.11 Cross-section schematic of the PDMS device ... 54
Figure 3.12 Calculated bubble area ... 56
Figure 3.13 Stitched images of microchannel ... 57
Figure 3.14 Bubble (dark) at a wall ... 59
Figure 3.15 Bubble on a sterile surface ... 59
Figure 3.16 Bubble playing a secondary role on biofilm formation... 60
Figure 3.17 CLSM image showing showing GFP bacteria trapped ... 61
Figure 3.18 Bubbles ... 62
Figure 3.19 A bubble in pure nutrient solution on a pre-inoculated ... 63
Figure 3.20 Superimposed images from CLSM ... 64
Figure 3.21 Expanding bubbles on a pre-inoculated surface ... 66
Figure 4.1 Schéma du dispositif microfluidique utilisé ... 69
Figure 4.2 Images cousues de canal ... 73
x
Liste des Tableaux
Tableau 1. Gamme de composition en SPE ... 3
Tableau 2. Phase de croissance ... 70
Tableau 3. Débit volumétrique pour les expériences 1-4 ... 70
Tableau 4. Vitesses calculées pendant la phase de croissance en amont. ... 71
Tableau 5. Taux de la contrainte de cisaillement calculée pendant la phase de croissance en amont. ... 71
xi
Liste des Équations
Équation 1. Ratios de surface par rapport au volume élevé ... 6
Équation 2.Nombre de Reynolds ... 7
Équation 3.Vitesse de débit ... 8
Équation 4. Le degré de diffusion dans le temps selon ... 8
Équation 5. La contrainte de cisaillement (a,b) ... 9
Équation 6. Les densités optiques ... 48
Équation 7. Croissance exponentielle ... 48
Équation 8. Temps de doublement de DO de biofilm ... 48
xii
Liste des Abréviations
SPE Substance polymérique extracellulaire
PDMS Polydiméthylsiloxane
GFP Green fluorescent protein
RBubble Région de la boule
RLiquid Région du liquide
Rinterface Région d’interface air-liquide
CLSM Microscopie confocale à balayage laser (confocal laser scanning microscopy)
rpm Révolutions par minute
AB Agrobacterium growth media
LB Lysogeny broth
OD Densité optique
xiii
Remerciements
J’aimerais remercier tous ceux et celles qui m’ont aidé à réaliser ce mémoire.
Mes plus sincères remerciements s’adressent au professeur Jesse Greener, mon superviseur, pour m’avoir donné l’occasion de travailler avec son groupe, de m’inviter à relever les défis des sciences microfluidiques modernes, de ses précieux conseils et de son assistance. Je suis incroyablement reconnaissante envers sa gentillesse, sa patience et sa compréhension incessante.
J’ai de la gratitude envers tous les membres du comité du jury : le Prof. Dominic Larivière et le Prof. Amine Miled pour examiner ce mémoire et d’y fournir des commentaires positifs et bénéfiques.
J’aimerais exprimer ma sincère reconnaissance à ma famille qui a été une source d’encouragement et d’inspiration dans ma vie entière.
Un immense merci à tous mes amis et collègues (François Paquet-Mercier, Mohammad Pousti, Mirpouyan Zarabadi, Mehran Abbaszadeh et Erica Rosella), pour leur aide dans ce projet et pour leur amitié et leur soutien qui feront de ma maitrise un beau souvenir.
xiv
Avant-propos
Le travail présenté ici est le fruit de mon travail au sein du groupe Greener au département de chimie de l’Université Laval. Les chapitres un et deux ont été rédigés selon les propos dits dans la littérature, des objectifs du projet et des techniques expérimentales spécifiquement employées lors de ma thèse. Cette partie comprend des données non publiées de l’ancien élève Nahid Babaei Aznaveh. Le chapitre trois est une publication acceptée au journal
Biomicrofluidics discutant de l’effet des bulles d’air sur la croissance et la structure des
biofilms bactériens à l’aide de la technologie microfluidique. Dans cet article, j’ai aidé à concevoir les expériences, à faire de la microfabrication et à mener des expériences dans le document principal (avec le soutien de mon collègue Mir Pouyan Zarabadi, qui m’a aidée à effectuer des mesures confocales de microscopie à balayage laser). Mon superviseur, Jesse Greener, a écrit la plupart des parties du manuscrit final et a effectué certaines mesures à l’’aide de la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier à réflexion totale atténuée. D’ailleurs, mon superviseur et moi-même remercions plusieurs personnes pour leur soutien informel et quelques professionnels de recherche pour leur aide avec certains aspects expérimentaux du travail dans la section de remerciements. Le chapitre comprend également une importante section de matériaux de soutien comportant des données ainsi que quelques précisions expérimentales faisant référence à l’article publié. Afin d’éviter les répétitions, le chapitre deux fait référence à ces détails expérimentaux provenant du chapitre trois. Le chapitre quatre, quant à lui, est basé sur un document en cours de préparation qui met l’accent sur un nouveau concept de prévention de la contamination vers l’arrière d’un bioréacteur à base de microflux. De cette façon, une stratégie de microfabrication est développée pour modifier les conditions hydrodynamiques sur la puce, de sorte que nous puissions éviter le problème de la contamination en amont des éléments de distribution de liquide et des réservoirs de source nutritive. Dans ce chapitre, j’ai fait toute la conception assistée par ordinateur, la microfabrication, les mesures et l’analyse de données. J’ai écrit le chapitre en suivant les commentaires et les modifications de mon superviseur.
Les étudiants diplômés, François Paquet-Mercier, Mir Pouyan Zarabadi et Mohammad Pousti, ont contribué à la discussion, à l’analyse, à l’optimisation et à la maintenance des
xv
instruments. François Paquet-Mercier et Valérie Pineau Noël ont apporté leur soutien à la traduction de ce mémoire.
1
Chapitre 1 : Introduction
1.1 Motivation : transformation biologique par les biofilms
Les biofilms bactériens sont connus pour être les plus anciens organismes multicellulaires sur Terre. Non seulement ils ont une capacité impressionnante de survie et d’auto-régénération, leur organisation spatiale et métabolique les protègent contre une multitude de risques environnementaux. Les bactéries vivant sur une surface sont phénotypiquement et physiologiquement différentes de leurs homologues planctoniques, mais la plupart d’entre elles peuvent exister sous forme sessile. L’une des propriétés typiques de la bactérie sessile est sa capacité à former une substance polymérique extracellulaire (SPE), une matrice solide composée de macromolécules biologiques qui, parmi ses autres rôles, offre une résistance accrue aux agents antimicrobiens.1 Les biofilms virulents sont donc très difficiles à traiter par des agents antimicrobiens, ce qui en fait un sujet important pour une étude plus approfondie du point de vue de la science médicale.2 La formation de biofilms peut également avoir des effets néfastes sur les systèmes industriels. Par exemple, l’encrassement biologique des systèmes mécaniques, des systèmes de refroidissement et des systèmes navals peut réduire considérablement leur performance.3 Aussi, la formation de biofilms dans les réservoirs d’eau potable et les systèmes de distribution est problématique, car ceux-ci entravent le bon fonctionnement de ces systèmes tout en étant dangereux pour la santé humaine. En effet, la formation de biofilms se traduit par une augmentation du niveau bactérien, une diminution de l’’oxygène dissout ainsi qu’un changement de gout, de l’odeur et de la couleur.4
En plus, il existe plusieurs applications utilisant des biofilms microbiens tels que le traitement des eaux usées5, la filtration biologique6, la remédiation biologique environnementale7 et la synthèse chimique. Par exemple, leur robustesse et leur résistance à la toxicité en font des catalyseurs vivants attrayants pour la synthèse biochimique ; ils peuvent être exploités pour des applications de synthèse chimique. Les biocatalyseurs sont des enzymes isolées ou des cellules vivantes entières. L’utilisation de cellules entières comme catalyseurs biologiques, qui, dans notre cas, est un biofilm, est industriellement bien établie et est souvent préférée
2
par rapport aux enzymes isolées. Une raison importante derrière l’utilisation de la cellule entière est d’obtenir une stabilité du catalyseur et une autogénération des cellules. De plus, la purification enzymatique s’ajoute souvent d’une manière significative aux couts de production globaux, ce qui motive fortement l’utilisation de catalyseurs cellulaires entiers au lieu d’enzymes. Aussi, les biofilms ont le potentiel d’effectuer des réactions chimiques par biocatalyse avec l’avantage d’être des matériaux naturels et biodégradables qui peuvent fonctionner à pression et température ambiants.8 Pour se faire, une variété de réacteurs à biofilms faits sur mesure ont récemment été développés pour différentes applications, telles que la production chimique et enzymatique, les carburants biologiques, et plus encore. Les réacteurs à biofilm peuvent fonctionner en flux continu en raison de biocatalyseurs immobilisés sur des supports solides pouvant être des particules ou des surfaces de membranes. En effet, les réacteurs à écoulement continu sont souvent préférés par rapport aux réacteurs à écoulement discontinu compte tenu du temps réduit pour la préparation du réacteur, la croissance cellulaire et le nettoyage. Les conditions de réaction peuvent aussi être contrôlées en modifiant le débit des réactifs, offrant ainsi un moyen simple d’étudier la réaction cinétique.
1.2. Structure et composition des biofilms et la substance polymérique
extracellulaire
Lorsqu’ils sont entièrement hydratés, 97% du poids total les films biologiques bactériens est constitué d’eau. Tous les matériaux non aqueux se composent de bactéries et de macromolécules biologiques. Comme on le voit dans le tableau 1, ceux-ci sont constitués de protéines, d’acides nucléiques et de polysaccharides.9,10 Le ratio relatif de chacun de ces éléments contenus dans un biofilm est déterminé par un certain nombre de facteurs, y compris le type de nutriment, les conditions hydrodynamiques et la température.11,12 En plus de participer à l’adhésion des bactéries à une surface, les flagelles, les pili et les fimbriae ont un rôle important dans la stabilisation de l’SPE.
3
Tableau 1. Composants d’une SPE 13
Composants % composant la matrice
Eau Jusqu’à 97%
Cellules microbiennes 2-5% (de nombreuses espèces)
Polysaccharides 1-2% (neutres et polyanioniques)
Protéines <1-2% (plusieurs, y compris les enzymes)
ADN et ARN <1-2% (provenant de cellules lysées)
Ions Traces (complexés et libres)
1.2.1. Le cycle de vie du biofilm
La formation de biofilm comprend cinq étapes séquentielles, telles qu’illustrées à la figure
1.10,11 Au cours de la première étape, les bactéries planctoniques circulent dans un liquide
près d’une surface apte à la colonisation. À la deuxième étape, les bactéries produisent des molécules de conditionnement, telles que des protéines et des polysaccarides, qui sont absorbées par la surface ; ces molécules forment une couche de conditionnement préparant la fixation des cellules bactériennes. La troisième étape montre l’adhésion réversible des bactéries par fixation non spécifique via les forces de van der Waals et les interactions électrostatiques ou hydrophobes avec la couche de conditionnement. La quatrième étape implique l’adhésion irréversible, conduisant l’accumulation cellulaire et la croissance secondaire permettant la formation d’un biofilm mature. À la dernière étape, certaines bactéries se détachent du biofilm par diffusion ou en raison de l’érosion du biofilm, ce qui leur permet de commencer un nouveau cycle de vie de biofilm.11, 9,14
Il est important de noter que ce modèle plutôt simpliste a été mis au défi par notre groupe. En effet, on observe qu’indépendamment du débit ou de l’âge du biofilm, le nombre de cellules planctoniques éjectées d’un biofilm est à peu près constant lorsqu’il est normalisé
4
par le débit volumique imposé contre lui.11 De prime abord, la formation de biofilm commence par la fixation de bactéries planctoniques à une surface. Les bactéries colonisatrices s’attachent ensuite à la surface principalement par des forces van der Waals, qui sont faibles et réversibles. Les pili et les flagelles bactériens sont utilisés pour attacher physiquement les bactéries à la surface pour les fixer de façon permanente. Puis, la SPE est formée pour maintenir les colonies bactériennes ensemble qui, du même coup, confère divers avantages physiques, chimiques et biologiques.15,16,17 Par exemple, la communication entre bactéries, connue sous le nom de détection de quorum, est renforcée par la présence de SPE en raison du piégeage de molécules de signalisation biochimiques émises par les bactéries.18 La SPE est également un matériau viscoélastique qui peut empêcher le détachement en raison de sa capacité à subir un processus de relaxation élastique après une exposition prolongée à un débit élevé. Ce processus se produit après un temps étonnamment similaire (environ 20 min) pour une grande variété de biofilm bactérien différent.19 En addition, la densité optique fournie par la matrice extracellulaire du biofilm assure la protection contre les rayons ultraviolets.11,12,13 Les formes de bactéries dans les biofilms sont aussi environ 500 fois plus résistantes aux antimicrobiens que leurs homologues planctoniques, permettant ainsi la reproduction cellulaire dans les conditions chimiques et hydrodynamiques les plus sévères.12,18
Figure 1.1.Illustration des cinq étapes de développement du biofilm bactérien. 1
2
4 3
5
1.3 Les dispositifs microfluidiques
La technologie microfluidique permet de manipuler et de traiter le flux et les échantillons biologiques en quantités restreintes, ce qui conduit à une analyse plus précise, plus rapide et moins coûteuse.20 Un autre avantage majeur est la réduction des volumes des milieux de culture. Cela permet de faire des études à long terme même sous des vitesses de fluide élevées sans nécessiter de remplissage fréquent de sources de nutriments.21
Figure 1.2. Comparaison des dispositifs microfluidiques avec d’autres composantes.11
1.4 Avantages de la microfluidique pour l’étude des biofilms
L’utilisation de dispositifs microfluidiques pour étudier les matériaux fonctionnels et les systèmes vivants, tels que les biofilms bactériens, gagne rapidement en intérêt.22,23,24,25 Typiquement, les dispositifs microfluidiques se caractérisent par des faibles débits (µL à mL par heure). Ceci, combiné avec le rapport surface/volume élevé, conduit à de faibles valeurs de nombre de Reynolds et à des flux hautement laminaires.26 Ainsi, ces dispositifs rendent le développement des biofilms possible dans des conditions contrôlées, tandis que la petite taille de l’appareil permet l’analyse microscopique du biofilm à la résolution d’une seule cellule. Comme la plupart des dispositifs microfluidiques sont transparents, ils sont compatibles avec les microscopes optiques standards. Le démarrage rapide, marqué par un décalage réduit
6
entre l’inoculation et la phase de croissance rapide, est également un avantage. Il ne faut pas oublier que la faible consommation de solution réactive (milieu nutritif) permet des expériences de longue durée, même à fortes vitesses d’écoulement, avec une diminution du risque de contamination lors du remplissage ou du remplacement des sources liquides. Pour se faire, du point de vue des réacteurs (bio)chimiques, la microfluidique offre un contrôle précis des conditions de réaction, telles que les concentrations de réactif, le temps de réaction et la contrainte de cisaillement.27,21
1.4.1 Conditions hydrodynamiques précises
1.4.1.1 Ratios de surface par rapport au volume élevé
Les conditions hydrodynamiques affectent directement la formation et le métabolisme des colonies en raison de leur position dans le microcanal.28 De cette manière, selon les dimensions des microcanaux, il est possible d’effectuer des calculs précis des conditions hydrodynamiques. Le calcul le plus fondamental est le rapport surface (SA)/volume (V), donné par l’équation 1 :
SA V = 2L(W + H) WHL = 2(W + H) WH⁄ ⁄ ⁄ (1)
Figure 1.3. Microcanal à section rectangulaire avec largeur (W), hauteur (H) est longueur (L).
W
L H
7
1.4.1.2 Écoulement laminaire
L’écoulement laminaire est défini comme le rapport entre la force inertielle et la force visqueuse. Il est aussi caractérisé par le nombre de Reynold (Re).
Re = ρ v DH/µ (2)
Où ρ (kg/m3) est la densité du fluide, v (m/s) est la vitesse moyenne du fluide, D
H (m) est le diamètre hydraulique du microcanal et μ (kg/ms) est la viscosité dynamique du fluide.29, 30
Les écoulements caractérisés par des nombres de Reynold ayant une valeur supérieure à 2300 sont turbulents, tandis que les nombres de Reynold ayant une valeur inférieure à 2300 sont laminaires (figure 4). Dans les canaux microfluidiques, les fluides sont strictement laminaires avec des valeurs typiques de Re<1.31
Figure 1.4. Des flux turbulents et laminaires à l’intérieur des microcanaux.32
Dans des conditions de flux laminaire, les molécules sont transportées par diffusion et convection dans des directions parallèles au canal, alors qu’elles ne sont transportées que par diffusion dans des directions perpendiculaires au canal (figure 4). En fait, le phénomène de convection permet à la vectrice vitesse résultant, v (m/s), d’être parallèle au canal. La vitesse
Turbulent
8
de débit est donnée dans l’équation 3 qui relie le débit volumétrique, Q (m3/s) et la section transversale du canal, A = W × H (m2).
v=Q/A (3)
Dans un microcanal, il est possible de calculer la distance à laquelle la diffusion peut transporter des espèces moléculaires ou microscopiques perpendiculairement à la direction de l’écoulement. Cette distance est fonction du temps de diffusion (t) et du coefficient de diffusion (D). La diffusion est un processus passif. Cela se produit naturellement en déplaçant les molécules du milieu le plus concentré vers le milieu le moins concentré.33 Le degré de diffusion dans le temps est déterminé selon l’équation 2.34
x2 =2Dt ou x=(2Dt)0.5 (4)
Où, x est la distance qu’une particule parcoure dans le temps (t). Le coefficient de diffusion (D) est inversement proportionnel au rayon hydrodynamique moléculaire. Ainsi, les petites molécules ont un D plus grand que les grosses molécules.30
x y Solution
1
Solution 2 L W H (a) (b)9
Figure 1. 5. (a) Deux solutions s’écoulent côte à côte le long du microcanal en régime laminaire. Les changements de la distance de diffusion sont affichés en aval. (b) La section transversale du microcanal avec la hauteur (H) et la largeur (W). Le gradient chimique en (a) n’est pas montré en (b).
1.4.1.3 Les forces de cisaillement appliquées dans les microcanaux
Les propriétés du biofilm, telles que sa morphologie, sa structure, sa densité et son métabolisme, sont étroitement liées aux conditions hydrodynamiques qui y sont imposées. Pour se faire, la contrainte de cisaillement (τw) est particulièrement importante dans la détermination de ces propriétés au cours des premières étapes de croissance du biofilm. Une valeur très élevée de la contrainte de cisaillement indique que les conditions hydrodynamiques pourraient éliminer le biofilm de sa surface, affecter sa croissance15 et modifier son cycle de vie.15 La contrainte de cisaillement, lors d’application en microfluidique, est déterminée par:
τw=6µ×Ǫ/H2W (5a)
τw=6µ×v/H (5b)
Où
τ
w (Pa) est la contrainte de cisaillement aux murs. En raison de la flexibilité de lamatrice SPE, la forme du biofilm peut changer en raison des forces qui lui sont appliquées. Le seuil de cisaillement peut également affecter le processus d’adhérence et de détachement du biofilm. Par conséquent, une contrainte de cisaillement ayant une valeur plus élevée pousse les biofilms à adopter une forme plus mince et plus dense. Inversement, sous une contrainte de cisaillement ayant une valeur plus faible, les biofilms ont une adhérence plus forte et un SPE intense.16
10
1.5 Études antérieures utilisant la microfluidique pour la croissance des
biofilms
Des études ont été effectuées sur l’utilisation de la microfluidique pour étudier les biofilms. Les auteurs ont essayé de contrôler les conditions hydrodynamiques dans des environnements où le nombre de Reynolds est bas. Par conséquent, ils ont pu observer l’effet sur la formation de biofilms, ainsi qu’analyser leur morphologie et leurs propriétés mécaniques. Ils ont aussi examiné l’influence de ces conditions sur la fixation, le détachement et la reproduction des biofilms. Par exemple, notre groupe a imposé des contraintes de cisaillement bien contrôlées sur les biofilms pour déterminer l’effet des conditions hydrodynamiques sur la libération de cellules planctoniques.
De plus, une étude sur les facteurs favorisant la fixation, l’adhérence et le détachement des bactéries planctoniques a été faite tout en observant le cycle de vie des biofilms. Plus précisément, les auteurs ont travaillé sur l’influence de la fixation bactérienne aux surfaces par rapport à la vitesse d’écoulement. Ils ont préféré utiliser des méthodes microfluidiques au lieu des méthodes classiques, car elles permettent de faire des expériences de longue durée consommant une faible quantité de réactifs. Il est donc plus intéressant d’utiliser la microfluidique considérant que les anciennes méthodes nécessitent de grands volumes de réactifs et ne permettent pas de contrôler la formation spatiale et temporelle des biofilms précisément.17
Par conséquent, la microfluidique a été utilisée pour étudier les effets de la contrainte de cisaillement, de la détection du quorum, de la température et de la concentration des nutriments comme facteur affectant la croissance du biofilm de manière quantitative. Des études en microfluidique sur les effets des conditions hydrodynamiques sur les biofilms de
Pseudomonas aeruginosa ont révélé que les facteurs chimiques et biologiques influent sur
les taux de croissance des biofilms. De plus, le biofilm peut affecter les conditions d’écoulement en réduisant le volume du canal.14 Ces résultats posent un modèle de base pour des études futures, ce permettrait d’acquérir une meilleure compréhension de la relation qu’il y a entre ces facteurs, soit la contrainte de cisaillement, les besoins en nutriments, l’interaction des bactéries à l’intérieur de la matrice SPE, etc. et la formation du biofilm dans des canaux microfluidiques. Le groupe du professeur Jesse Greener a contribué à l’obtention
11
de stratégies analytiques autorisant la pose d’actions en temps réel, dans les mesures in situ de la croissance de biofilms et de la production de leurs sous-produits. Ces travaux font l’objet de nouvelles cellules électrochimiques de microécoulement pour (i) l’imagerie électrochimique, qui peut être appliquée aux biofilms électroactifs19, (ii) l’étude des effets de l’environnement hydrodynamique sur les biofilms en utilisant la spectroscopie d’impédance électrochimique et la voltamétrie cyclique.35 Aussi, l’utilisation de l’imagerie vidéo permet un laps de temps entre les prises d’images combinées à la modélisation mathématique pour des études sur (i) la viscosité du biofilm avec des mesures continues sous différentes forces ioniques et concentrations en éléments nutritifs11,13 et (ii) le transfert des molécules et l’observation de la dynamique du biofilm dans les microcanaux.36 Également, l’utilisation d’un dispositif microfluidique hybride avec une fluorescence renforcée par le métal, pour l’imagerie du pH, appliquée à la recherche sur la simulation chimique et hydrodynamique des biofilm intacts est employée.22 Pour terminer, une nouvelle approche du balayage linéaire ATR-FTIR pour la cartographie linéaire et les études de biofilm à haut débit est étudiée.23
Dans ce travail, notre motivation est d’exploiter la microfluidique pour étudier les biofilms catalytiques. Du même coup, une nouvelle méthodologie et de meilleures pratiques pour surmonter les problèmes communs décrits dans les sections suivantes lors de la culture de bioflms dans des conditions de microécoulement seront développées.
1.6 Utilisation de la microfluidique pour l’étude des bioflms-identification
de nouveaux défis et solutions proposées
1.6.1 Croissance incontrôlée près des parois des microcanaux
Malgré les avantages cités ci-dessus, il faut résoudre certains problèmes fondamentaux pour étudier les biofilms en microfluidique. Par exemple, l’approche courante pour la croissance des biofilms dans les canaux microfluidiques consiste à injecter l’ensemble du microcanal, exposant ainsi les bactéries à toutes les surfaces murales et aux tubes conjonctifs en amont. Cela peut conduire à une prolifération de biofilm et à une formation de streamers, ce qui peut réduire le volume libre dans les microcanaux et augmenter la vitesse d’écoulement de la
12
solution. Ce phénomène peut également appliquer une contrainte de cisaillement de manière incontrôlée, ce qui nuit à l’un des principaux avantages des dispositifs microfluidiques.38 Ce problème a été résolu par l’utilisation d’une nouvelle conception microfluidique qui était capable de modeler des formations linéaires de biofilms, ce qui évite la croissance près des parois latérales, en utilisant un gabarit d’écoulement.31 Le design comportait deux parties étagées, ce qui a généré une croissance contre un mur et sur les trois autres côtés à cause du flux de confinement. Ayant fait ses preuves, ce système a été utilisé pour étudier à long terme la cinétique de croissance du biofilm dans des conditions hydrodynamiques bien définies. Plus précisément, cette approche a été utilisée pour étudier les différences entre la croissance aux parois et la croissance au centre de canal.11,13
Figure 1.6. (a) Schéma du dispositif micro-fluidique à deux niveaux. Le niveau 2 (bleu) est un nutriment de biofilm avec un débit de QT. La couleur d’entrée 1 (rouge) apporte la solution de confinement avec un débit de QC. (b) Section transversale de la partie du microcanal entourée de (a). L’orientation se trouve dans le plan y-x, la largeur du canal étant wM = 2000 μm. (c) Image qui a été collectée par microscope inversé à partir d’un microcanal au même endroit que (b).31 La barre d’échelle est 2 mm.
(a)
(b) (c)
Niveau 1 Niveau
13
1.6.2. Contamination en amont
Le premier problème que ce mémoire abordera est la contamination des appareils en amont du système. En effet, le remplacement de l’inoculum par une solution de réactif (nutriment) cause une croissance du biofilm le long des parties en amont de l’appareil, y compris les tubes le connectant. Les biofilms en amont transformeront donc les réactifs en produits, par exemple en consommant des éléments nutritifs, avant d’entrer dans la partie d’observation du microcanal. Ainsi, la valeur de la concentration de réactifs de départ est biaisée. Des travaux (non publiés) du groupe Greener ont permis de résoudre ce problème en ajoutant une troisième entrée (figure 7), ce qui sépare le fluide d’inoculation du fluide de réactifs. Comme le montre la figure 7, des simulations et expériences préliminaires ont prédit que les régions inoculées dans la partie en aval du canal pourraient être lavées avec une solution nutritive distincte. Les observations préliminaires ont montré qu’un biofilm isolé à des parties précédemment inoculées du canal n’a aucune contamination comparativement aux portions du biofilm en amont (figure 7d, e). Cependant, il a été intéressant d’observer que le biofilm a ensuite proliféré vers l’arrière, soit en direction de la source nutritive, et a entré dans le tube en amont (figure 7e). Il n’est pas étonnant d’observer un mouvement du biofilm, puisque les bactéries utilisées dans cette étude ont des mécanismes de mouvement actif.27 Par contre, le fait que les bactéries se déplacent ne permet pas de connaitre avec précision la concentration de réactifs du départ. Dans le pire des cas, les bactéries peuvent même atteindre la seringue et contaminer le liquide source, provoquant des changements dans les concentrations de solutions nutritives, la formation des biofilms indésirables et un flux contenant des bactéries planctoniques provenant de biofilms en amont. Les tentatives visant à résoudre ce problème de contamination en amont sont discutées dans la Section 1.7.
14
Figure 1.7. (a) Schéma du microcanal avec système de micro-écoulement à 3 entrées. La première entrée (niveau 1) avec la couleur rouge apporte le modèle de solution de confinement avec un débit de QTI= 0.5 mL·h-1. Le niveau 2 en bleu apporte le flux de la matrice de solution nutritive pour le biofilm avec débit QT = 0.3 mL·h-1. La troisième entrée apporte l’inoculation avec un débit QI. (b) Image du microcanal avec fluide de couleur pour montrer le flux laminaire à l’intérieur du canal avec des flux multiples. (c) Simulation du microcanal à trois niveaux avec écoulement laminaire. (d) Image du microcanal avec croissance du biofilm en aval avec introduction d’éléments nutritifs en amont. (e) Image fluorescente de microcanal avec une croissance vers l’arrière du biofilm à travers la source de nutriments et contaminant en amont du microcanal. La bactérie mobile Gram négative, en forme de tige Pseudomonas sp. CTO7 a été sélectionnée pour la préculture utilisée. La largeur du canal est de 2000 μm et la hauteur est de 305 μm.
(a)
(b)
(c)
Croissance en amont Q TI (Inoculée) Q TN (Nutriment) Croissance en aval(d)
(e)
15
1.7. Solution proposée pour éviter la contamination des sources nutritives
Le premier objectif, éviter une contamination en amont, pourrait être accompli en modifiant la conception du bioréacteur illustré à la figure 6 en incluant un col qui entraînerait une augmentation localisée de la vitesse d’écoulement et de la contrainte de cisaillement entre les entrées de gabarit nutritif et de gabarit d’inoculation. Ce micro-bioréacteur conduit à un développement limité du biofilm en aval du canal en provoquant un flux de confinement au début du tube. De ce fait, il serait possible d’éviter une croissance à la fin du microcanal en augmentant la vitesseet la contrainte de cisaillement des nutriments en amont dans la zone de restriction. Par conséquent, le biofilm serait formé selon un patron bien précis à une localisation prédéterminée en aval du microcanal. Le modèle d’écoulement de micro-bioréacteur que nous proposons ici est alors une conception adaptée à l’étude des biofilms avec une restriction en amont du canal.1.8. Effet des microbulles attachées en surface du biofilm en croissance
Un autre problème qui n’est pas abordé dans la littérature est l’effet des bulles adhérant à la surface du biofilm. Il est bien connu que les bulles peuvent se déplacer librement sous la force d’écoulement du liquide. Elles peuvent aussi être statiques en raison de leur adhérence à la paroi. Par contre, la présence de bulles mobiles à l’intérieur du canal peut changer les conditions d’écoulement. Effectivement, leur présence peut changer l’environnement chimique de la phase liquide et ainsi causer différents problèmes.21,28 Elles provoquent des changements de pression et de résistance à l’écoulement, ainsi que de fortes contraintes de cisaillement à la paroi qui peuvent nuire à la formation de biofilms biologique ou même les éliminer complètement du canal.8 Aussi, elles peuvent modifier les propriétés des parois et des diagrammes d’écoulement locaux et nuire au contact entre le liquide et le mur.29,31 Dans ce travail, des variations du taux de croissance du biofilm et de sa structure causées par la présence de bulles adhérentes à la surface sont présentées. Il est intéressant d’observer qu’il y a des variations même si les bulles d’air sont libérées de la surface plusieurs heures avant le début de la phase de croissance rapide.16
Toutes les mesures quantitatives ont été effectuées en utilisant un microscope à champ clair et un microscope confocale à balayage laser. Les mesures ont été validées par une simulation numérique. Dans cette étude, nous avons analysé la densité optique, la vitesse et le cisaillement du flux-modèle pour déterminer et explorer de manière approfondie les caractéristiques et les fonctionnalités de la conception des bioréacteurs et l’efficacité de l’examen des paramètres. Nous avons utilisé le bioréacteur pour des études du taux de croissance du biofilm à différentes vitesses et contraintes de cisaillement. Ce travail présente les bienfaits de faire croitre un biofilm en conditions aqueuses pour étudier précisément la qualité et la quantité de croissance dans différentes conditions hydrodynamiques. En outre, le bioréacteur conduit à une mesure optimisée des propriétés du biofilm et fournit des conditions appropriées pour d’autres études de bulles d’air statiques sur la croissance et le développement d’un biofilm.
17
Chapitre 2: Matériel et méthodes
2.1 Matériel et méthodes
2.1.1 Conception et fabrication de moules
Les moules ont été fabriqués par photolithographie. Notre méthode est différente de la plupart des approches dans la mesure où nous utilisons une photorésine de type stratifié sec, tandis que l’approche standard consiste à centrifuger la photorésine liquide sur un substrat suivi d’une cuisson douce avant l’exposition à la lumière UV. L’équipement et les matériaux de la méthode utilisée dans cette étude sont peu couteux et ne nécessitent pas l’utilisation d’une salle blanche. Par contre, nous avons un contrôle limité sur la hauteur du moule. Dans les deux méthodes, suite à la superposition de la photorésine et du masque ayant la forme du canal désiré sur la lamelle de verre, une exposition du montage à l’UV est effectuée (figure 8). Puis, le tout est immergé dans un développeur pendant 10-15 minutes. Dans ce processus, les sections qui n’ont pas été exposées à la lumière UV vont se dissoudre dans la solution de développement. Finalement, le dispositif sera prêt à être rincé avec de l’eau pour éliminer toute trace de solution de développement.
Figure 2.1. Schéma représentant l’approche de photolithographie en utilisant un film de photorésine laminé sur une lame de verre et exposé à une lampe UV à travers un masque.
Lame de verre
Photorésine
Lampe UV
18
2.1.1.1 Méthode 1
Les moules ont également été fabriqués en utilisant une résine photosensible (F4000, film Photopolymer, Mungolux, Allemagne) et la lumière UV (E214409, USA). Une couche de photorésine a été laminée sur la lame en verre. Ensuite, le masque est ajouté par-dessus et le tout est placé sous la lumière UV pendant 10-12 minutes. Finalement, la lame de verre est trempée dans une solution de développement (0,1 M Na2CO3) (R1200, Mungolux, Entwickler, Allemagne).
Nous avons constaté que cette méthode entraine un développement imprécis des parois, car des expositions trop longues à l’UV (˃1 min) conduisent souvent à l’obtention de parois irrégulières. Ainsi, cela changera les dimensions du microcanal, ce qui pourrait avoir un impact négatif sur les résultats des expériences.
Figure 2.2. Équipement pour la fabrication de moules. Lampe UV
Photorésine négatif Lame de verre
19
2.1.1.2 Méthode 2
La conception des moules a été réalisée à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (DraftSightTM, Dassault systèmes, France). Le moule a été fabriqué en adhérant une photorésine stratifiée (film SY300, Fortex, Royaume-Uni) sur une lame de verre de 75 mm x 50 mm x 1 mm (12550C, Fisher Scientific, Canada) à l’aide d’un laminateur de film sec thermique (FL-0304- 01, Fortex, Royaume-Uni). La photorésine adhérente avec une épaisseur de 50 μm a été exposée à une lumière UV d’une longueur d’onde de 360-365 nm à travers un masque dans une unité d’exposition sous vide (AY-315, Fortex, Royaume-Uni). La photorésine non exposée à l’UV a été éliminée en utilisant des solutions de développement et de rinçage (SY300 Developer / Rinse, Fortex, Royaume-Uni). Avec cette méthode, le temps d’exposition est réduit et les contours du moule deviennent plus droits, plus affutés et plus soulignés. La diminution du temps de développement permet d’obtenir un moule de meilleure qualité.
Figure 2.3. (a) Laminateur de photorésine (film SY 300, Fortex, Royaume-Uni). (B) unité d’exposition sous vide de lumière UV (AY-315, Fortex, Royaume-Uni).
2.1.2 Matériaux du dispositif microfluidique
Les dispositifs microfluidiques (Sylgard184, Dow corning, Canada) ont été fabriqués en versant du polydiméthylsiloxane (PDMS) et une solution de réticulation (rapport 10:1) sur le moule. Le PDMS était durci à 70oC pendant la nuit. Ensuite, le dispositif de PDMS a été
20
découpé et décollé du moule. Les deux entrées ont été perforées aux positions en amont et une sortie à la position descendante la plus en aval (figure 11). Le dispositif de PDMS a été scellé sur une lame de verre de 75 mm x 50 mm x 200 mm (12550C, Fisher Scientific, Canada).
Le tout a ensuite été introduit dans un nettoyeur à plasma (PDC-001, Harrick plasma, USA)37 afin de lier de façon irréversible le PDMS à la lame de verre. Par la suite, le dispositif a été placé vers le bas sur un microscope inversé pour l’imagerie en mode transmission et CLSM (fluorescence) afin de prendre des images de haute qualité des dimensions du dispositif.
2.1.3 Contrôle des fluides
Les liquides ont été délivrés au système microfluidique via deux tubes en perfluoro-alcoxy (diamètre extérieur 1,6 mm) (U-1148, IDEX, WA, USA) chacun connectés à I1 et I2 (figure 11). Le côté en amont du tube avait un assemblage de connecteur fileté (P-200x, P-658, IDEX, WA, USA) assemblé avec une seringue Luer Lock de 60 mL (BD Scientific, NJ, USA), le tout monté sur des pompes (PHD 2000, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA). Toutes les solutions ont été préparées à l’aide d’eau ultra pure ayant une résistivité de 18.1 MΩ·cm.
2.2 Installation expérimentale et mesures
L’installation est la même pour les deux projets, que ce soit pour le microscope à champ lumineux ou le microscope confocale (figure 12). Tout l’équipement est stérilisé avant chaque expérience.
21
Figure 2.4. Installation expérimentale avec les pompes, les seringues, les connecteurs et les tubes entourant un microscope inversé avec un étage automatique et une unité de contrôle de positionnement.
2.3. Protocole biologique
2.3.1 Stérilisation
Le tube de téflon a d’abord été rempli d’éthanol pur, a été placé dans un bain ultrason puis exposé à un flux d’éthanol 70:30 eau pendant 2 heures à 2 mL·h-1. La tubulure a ensuite été connectée au dispositif et la stérilisation des microcanaux s’est poursuivie en rinçant le dispositif à travers I1 et I2 avec une solution d’éthanol:eau de 70:30 pendant 30 minutes à Q1 = Q2 = 1 mL·h-1. La solution résiduelle d’éthanol a été éliminée du système avec de l’eau stérile pendant 2 heures supplémentaires à Q = 1 mL·h-1. Pour ces expériences, la connexion des tubes aux entrées et aux sorties a été réalisée en utilisant des capillaires métallique en forme de coude qui s’adaptent étroitement aux entrées sans besoin d’époxy. Tous les liquides appliqués à l’appareil ont été dégazés sous vide avant de commencer l’expérience, pour minimiser la formation de bulles d’air dans le microcanal, dans les expériences qui ne se sont pas concentrées sur les bulles.
22
2.3.2 Pré-culture bactérienne et nutriments
Dans cette étude, nous avons utilisé Pseudomonas fluorescens CT07 (mobile, gram négatif, en forme de tige) marqué avec une protéine fluorescente verte intégrée (GFP). Dans la littérature, cette bactérie est déclarée comme Pseudomonas sp. souche CT07. Toutes les souches ont été maintenues sous forme de stocks de glycérol à -80°C. Une pré-culture de
Pseudomonas sp planctonique. A été utilisé comme inoculum, qui a été obtenue en secouant
les cultures de bactéries planctoniques dans 3 mL des milieux de croissance AB 5 mM à 300 tr/min pendant 18 h à 30°C. Les milieux de croissance utilisés pour la culture dans la cellule d’écoulement micro-fluidique étaient soit des AB modifiés ou du type LB (Sigma Aldrich, Canada). Le milieu AB comprenait 1,51 mM (NH4) 2SO4, 3,37 mM de Na2HPO4, 2,20 mM de KH2PO4, 179 mM de NaCl, 0,1 mM de MgCl2 • 6H2O, 0,01 mM de CaCl2 • 2H2O et 0,001 mM de FeCl3 avec 10 mM de citrate de Na • 6H2O en tant que seule source de carbone. Le courant de croissance LB modifié consistait en contenait 0,1% en poids de triptonne et 0,05% en poids d’extrait de levure et des concentrations de NaCl de 0,1% en poids (17 mM).
2.4 Techniques de mesure et autres protocoles
Pour plus d’informations concernant les travaux spécifiques aux effets des interfaces air-liquide sur les biofilms, le lecteur est invité à consulter les matériaux de support du chapitre 3, d’un papier publié dans le journal academique, Biomicrofluidics.37 Cette section contient des informations sur (i) la notation utilisée, (ii) l’équipement et la méthodologie expérimentale (incluant des calculs pour densité optique, coefficient de variance, temps de doublement bactérien (iii) la conception expérimentale et la caractérisation des cellules d’écoulement, (iv) les détails sur le contrôle de la taille, de la position et de la forme des bulles, et (v) l’inoculation bactérienne.
23
Chapter 3: Article
A new look at bubbles during biofilm inoculation reveals
pronounced effects on growth and patterning
Farnaz Asayesh1, Mir Pouyan Zarabadi1 and Jesse Greener1,2*
1 Département de Chimie, Faculté des sciences et de génie, Université Laval, Québec City,
QC, Canada.
2 Centre de recherche du CHU de Québec, 10 rue de l’Espinay, Québec City, QC, Canada.
24
3.1 Résumé
Des cellules de bioflux microfluidiques ont été spécialement conçues pour piéger temporairement des microbulles d’air au cours de différentes étapes d’inoculation de
Pseudomonas sp. biofilms. En plus d’être éliminé plusieurs heures avant l’apparition du
biofilm, l’utilisation de ces cellules permet la croissance microbienne selon un patron précis aux anciennes positions des bulles. La croissance à l’aide de bulles est en forme continue ou en cycles, selon le stade d’inoculation où les bulles ont été introduites. Les biofilms sur matrice ont été fortement améliorés en termes de leur cinétique de croissance et leur homogénéité structurelle. L’imagerie confocale à haute résolution a montré deux modes distincts de piégeage bactérien induits par les bulles qui étaient responsables du développement altéré du biofilm. En conclusion, les bulles statiques peuvent être exploitées pour améliorer fondamentalement la performance du bioréacteur ainsi que pour ouvrir de nouvelles possibilités à l’étudie les bactéries isolées et les petites colonies.
3.2 Abstract
Specially designed microfluidic bioflow cells were used to temporarily trap microbubbles during different inoculation stages of Pseudomonas sp. biofilms. Despite being eliminated many hours before biofilm appearance, templated growth could occur at former bubble positions. Bubble-templated growth was either continuous or in ring patterns, depending on the stage of inoculation when the bubbles were introduced. Templated biofilms were strongly enhanced in terms of their growth kinetics and structural homogeneity. High resolution confocal imaging showed two separate bubble-induced bacterial trapping modes which were responsible for the altered biofilm development. It is concluded that static bubbles can be exploited for fundamental improvements to bioreactor performance as well as to open new avenues to study isolated bacteria and small colonies.
25
3.3 Introduction
Research using microfluidics to study bacterial biofilms is accelerating due to unique advantages including the ability to implement diverse channel geometries and the ability to apply inherently laminar flow fields. These properties enable strong reduction in experimental footprints and the application of highly controlled shear forces at relevant time and size scales, which can enhance accuracy of experiments and numerical models, as well as enable parallel studies.1-6 In addition, well-controlled conditions can provide insight into bioreactor startup, biofilm growth kinetics and homogeneity.7-9 One typical problem involves moving bubbles, which are recognized as a major nuisance for biological studies in flow cells.10,11 They can increase time to reach equilibrium flow conditions, change the chemistry of surrounding liquid phase and cause pressure drops and resistance to flow.12,13,14 Of particular concern is the enhanced wall shear stress generated as bubbles flow by surfaces, which can disrupt or modify surface-attached microorganisms and biofilms.10,11,15,16 On the other hand, stationary bubbles and their effects on biological systems in flow cells are less studied, probably because they are difficult to control and observe predictably.17 Nevertheless, they may be at least as important in terms of their effects on biofilm growth. For example, they can modify wall properties and local flow patterns as well as and block bulk liquid from contacting the walls.18,19 In microchannels, stationary bubbles are amplified in terms of their probability of formation and their effects due to typically hydrophobic walls and high surface area to volume ratios.20,21 While static bubbles can undermine advantages of microfluidic systems to study biofilms, simultaneous control over their formation and fate opens the door to a better understanding of these effects.5,11,22,23
Here, trapped bubbles in low aspect ratio microchannels were studied in terms of their effect on the formation of biofilms from Pseudomonas sp. bacteria. Contrary to intuition, surfaces which were temporarily blocked by bubbles could drastically enhance biofilm growth rate. Moreover, the affected biofilms were patterned in shapes that matched the bubbles before they detached from the wall. With the use of optical quality microfluidic devices and high resolution confocal laser scanning microscopy (CLSM) the nature of initial interactions between the bacteria and the bubbles was revealed. The resulting changes to structural heterogeneity and local growth kinetics can have important implications for the performance
26
of continuous flow bioreactors.24-26 The findings can also open new avenues to study isolated bacteria and early biofilm formations.
3.4 Materials and methods
3.4.1 Inoculant preparation
In this study we used Pseudomonas fluorescens CT07 (motile, gram negative, rod-shaped) tagged with a chromosomally integrated green fluorescent protein (GFP). In the literature, this bacteria is reported as Pseudomonas sp. strain CT07.27 A pre-culture of planktonic
Pseudomonas sp. was used as inoculum, which was obtained by shaking the cultures of
planktonic bacteria in 3 mL of 5 mM AB growth media at 300 rpm for 18 h at 30°C. Growth media used for cultivation in the microfluidic flow cell were either modified AB or LB type (Sigma Aldrich, Canada). AB medium consisted of 1.51 mM (NH4)2SO4, 3.37 mM Na2HPO4, 2.20 mM KH2PO4, 179 mM NaCl, 0.1 mM MgCl2·6H2O, 0.01 mM CaCl2·2H2O and 0.001 mM FeCl3 with 10 mM Na-citrate·6H2O as the sole carbon source. The modified LB growth stream consisted of contained 0.1 wt% tryptone and 0.05 wt% yeast extract and NaCl concentrations 0.1 wt% (17 mM).
3.4.2 Microfabrication
Mold design was done by computer aided design software (DraftSightTM, Dassault systèmes, France). The mold was fabricated by adhering a laminate photoresist (SY300 film, Fortex, UK), on a 75×50×1 mm glass slide (12-550C, Fisher Scientific, Canada) using a thermal benchtop dry film laminator (FL-0304-01, Fortex, UK). The adhered photoresist was exposed to UV light through a mask using a vacuum exposure unit (AY-315, Fortex, UK) and excess photoresist was removed using developer and rinse solutions (SY300 Developer/Rinse, Fortex, UK). Figure 3.8 shows the mold at the bottom of a Petri dish.
Microfluidic devices were made by pouring polydimethyl siloxane (PDMS) (Sylgard184, Dow corning, Canada) and cross linker solution (10:1 ratio) against the mold and curing at
27
70°C overnight. After curing, the cross-linked PDMS device was cut and peeled from the mold. Two inlets were punched at the upstream positions and one outlet at the furthest downstream position. The PDMS device was sealed by a 75×50×170 µm glass coverslip (12-548C, Fisher Scientific, Canada), which enabled high quality optical surface for microscope-based observation. The device was placed cover slip down on an inverted microscope for imaging in transmission and CLSM (fluorescence) modes.
3.4.3 Microchannel design and properties
Figure 3.1a shows the channel design used in this study. It included two different inlets, I1 and I2, in order to apply different solutions to study the effect of bubbles during different stages of inoculation. All liquid flowed off-chip through a single outlet, O. The channel included a “head” and “body” with widths of 2 mm, which were each separated by a “ neck” with width 250 µm. The channel height was 50 µm throughout the device. The reduction in channel width in the neck resulted in calculated increases to flow velocities by nearly 8 times. Bubble trapping was encouraged in the head and body portion due to a low aspect ratio (h/w=0.025) and relatively slow flow velocities, compared to the neck. Figure 3.1a insets (i and ii) show channel cross-sections in the body and neck regions. We estimated enhancement of bubble trapping by 6-10 times versus taller channels typically used in our work (h≥150 µm). As well, bubble entrapment was enhanced by assuring the full recovery of hydrophobic wall properties after sealing with plasma gas. This was confirmed by monitoring the air/liquid contact angle at the wall in time. Full hydrophobic recovery was noted after 48 hours. Figure 3.1a (insets iii and iv) shows results for hydrophobic and hydrophilic walls. To ensure the transition to hydrophobic surface properties were complete and uniform throughout the channel, devices were dried with a continuous stream of filtered air for 30 mins and then exposed to low heating (40oC) during a three day recovery period. The effect of hydrophobicity on bubble trapping was crucial. Almost no bubbles could be trapped for longer than a few minutes under flow conditions used in this study if devices were used less than 5 hours after plasma bonding. More information on the effect of channel hydrophobicity on bubble trapping is given in the Supplementary Material (Section 3).
28
Finally, the device was operated with the PDMS surface up and the glass sealing coverslip down to enhance interaction between buoyant bubbles and they hydrophobic surface.
Uniformity in channel properties were verified to ensure that localized variations in biofilm growth were due to randomly trapped bubbles and not from localized chemical or topographical anomalies at the channel surface. To verify that chemical properties were uniform throughout the channel, ATR-FTIR was conducted at intervals of 1 mm, along the length of the channel. Details of the experiment and band assignments are given in Supplementary Material. Figure 3.1b shows the position-dependent vibrational absorbance bands (relative to an air background) from different positions along the channel. Characteristic PDMS bands were observed at 790, 1014, 1070, 1260 and 2960 cm-1. Differences between in-channel spectra and a separate PDMS sample reference were generated to more easily identify any position-dependent variations. Random differences at wavenumbers < 1000 cm-1 were due to noise where system sensitivity was low. The main observable differences were due to CO2 absorption (2350 cm-1), which was due to slight fluctuations in purge gas conditions. Lastly, surface roughness was measured at the bottom of the microchannel. The data presented shows RMS roughness of 265 nm and peak to peak roughness of 1.6 µm in a 1×2 mm area. These values were approximately 0.5% and 3% of the total channel height, respectively, and were representative of results throughout the entire channel.
29
Figure 3.1. (a) Schematic of the microchannel. Flow was left to right with liquid being introduced into the device through inlets I1 and I2 with volumetric flow rates Q1 and Q2, respectively. Liquid left the channel through outlet, O, at a flow rate of QT=Q1+Q2. Channel width was wa=2000 µm to wb=250 µm. Inset images (i) and (ii) show cross-sections of the channel (highlighted in red) with the glass cover slip and PDMS channel at the lower and upper surfaces, respectively. Inset scale bars 250 µm. Device length was L=6 cm. Recovery of the wall hydrophobicity is shown in inset immediately after (iii) and 48 hours after (iv) plasma bonding. Scale bars are 2 mm. (b) FTIR spectra using an air background acquired along the length of the microchannel in two regions upstream (*) and downstream (**) of the neck region. Spectra were normalized to 1 based on the 790 cm-1 peak of approximately 0.55 absorbance units. Inset shows recalculated spectra using a PDMS background. (c) Representative image showing surface morphology of a 1×2 mm segment within the microchannel. Color bar indicated heights for both images.
30
3.4.4 Fluidic control
Liquids were delivered to the microfluidic device via perfluoroalkoxy connective tubing (outer diameter 1.6 mm) (U-1148, IDEX, WA, USA) connected to I1 and I2. The upstream side of the tubing had a threaded connector assembly (P-200x, P-658, IDEX, WA, USA) that interfaced with a 60 mL lure lock syringe (BD Scientific, NJ, USA), which were driven by pumps (PHD 2000, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA).
3.4.5 Sterilization
Teflon tubing was first filled with pure ethanol, sonicated and then exposed to flow of 70:30% v/v ethanol: water, for 2 hours at 2 mL·h-1. Tubing was then connected to the device and sterilization ensued by flushing the device through I1 and I2 with a 70:30% v/v ethanol: water solution for 30 mins hours at Q1=Q2=1 mL·h-1. Residual ethanol solution was washed out of the system with sterile water for an additional 2 hours at Q1=Q2=1 mL·h-1. All solutions were made using ultrapure water with resistivity of 18.1 MΩ·cm.
3.4.6 Localized inoculation and introduction of bubbles
Biofilms were grown from Pseudomonans sp. bacteria in a temperature-controlled room at 22 ± 1oC. Direct inoculation was confined to the downstream region (between I1 and O) using an inoculum applied to I1 and a nutrient-depleted stream applied to I2. At later times, upstream biofilm growth (between I2 and I1) was achieved by blocking I1 and flowing a nutrient solution into I2. This enabled so-called upstream inoculation whereby planktonic bacteria emitted from the downstream biofilm could swim upstream toward the nutrient source (Figure 3.1c). See Supplementary Material (Section 5) for more details. Using upstream valves attached to tubing at either inlet, bubbles could be introduced into the pre-inoculated (downstream) region between I1 and O at any time following inoculation, or into the initially non-inoculated (upstream) region between I2 and I1. See Supplementary Material (Section 4) for more details about bubble formation and the use of flow rates to control over bubble properties.
31
3.5 Results and discussion
Figure 3.2 shows the three classes of experiments that were conducted in this work: (1) bubbles were admitted and released before introduction of planktonic bacteria, (2) bubbles were formed on a pre-inoculated surface and (3) bubbles were formed on a clean surface followed by exposure to planktonic bacteria. In all cases bubbles were trapped randomly throughout the channel. It was noted that once a bubble became adhered to a wall, the bubble net velocity was zero. During the time in which the bubbles were stopped in the channel, all bubble edges receded slowly (ca. 20 to 400 µm·h-1), due to gas molecule dissolution into the liquid phase and likely through the PDMS.28 Finally, under the constant shear force of the liquid, the bubbles were eventually released. This was an instantaneous procedure, with some exceptions.
Figure 3.2. (a) Planktonic bacteria (green circles) introduced to a region where a bubble was previously attached to a sterile surface (see Section III.1). (b) Bubble formed on a pre-inoculated surface (Section III.2). (c) Bubble formed on a sterile surface, followed by introduction of nutrient solution into I2 and subsequent inoculation by motile planktonic bacteria from downstream biofilms (Section III.3). In all cases flow was from left to right.
3.5.1 Bubbles formed and released on a clean surface in the absence of planktonic bacteria did not affect biofilm formation
As a control experiment, we adhered and released bubbles from a clean the microchannel wall before planktonic bacteria were admitted to the channel. Inoculation and exposure to a nutrient solution followed. Biofilm formation typically occurred after a 20-40 h lag phase and no local effects from former bubbles were detected.
