Identification des TRPC exprimés dans les cellules glomérulées bovines et les cardiomyocytes de rat et localisation cellulaire de TRPC6

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

(9)

(10)

(11)

(12)

(13)

(14)

(15)

(16)

(17)

(18)

(19)

(20)

(21)

(22)

(23)

(24)

(25)

(26)

(27)

(28)

(29)

(30)

(31)

(32)

(33)

(34)

(35)

(36)

(37)

(38)

(39)

(40)

(41)

(42)

(43)

(44)

(45)

(46)

(47)

(48)

(49)

(50)

(51)

(52)

(53)

(54)

(55)

(56)

(57)

(58)

(59)

(60)

(61)

(62)

(63)

(64)

(65)

(66)

(67)

(68)

(69)

(70)

(71)

(72)

(73)

(74)

(75)

(76)

(77)

(78)

(79)

(80)

(81)

(82)

(83)

(84)

(85)

(86)

(87)

(88)

(89)

(90)

(91)

(92)

(93)

(94)

Figure 18 : Caractérisation de l'anticorps anti-TRPC6 pour des études d'immuuofluoresceuce. Les eellules COS transfeetées de façon transitoire avec peDNA3 seul (A) ou avec mTRPCô (B), les eellules HEK (QBI) transfeetées de façon stable avec ATIR (HEK (QBl) ATIR) (C) et les eellules HEK transfeetées de façon stable avec mTRPCô (HEK T6)(D) ont été ensemencées sur des lamelles 16 heures avant leur immunomarquage. Les cellules sont fixées, perméabilisées au MeOH et immunomarquées par ime première incubation avec l'anticorps anti-TRPCô 1/100 pendant 2h, suivie par une incubation avec l'anticorps anti-IgG couplé à l'Alexa fluor 488 (1/1000), d'ih. Le noyau des eellules a été marqué avec 2 pg/ml d'iodure de propidium pendant 30 minutes. Les images ont été acquises sur un microscope à épifluoreseenee avec im objectif lOOX à immersion à l'huile (A et B) et un objectif 63X à immersion à l'huile (C et D), ainsi qu'avec les filtres respectifs pour l'Alexa Fluor 488 et l'iodure de propidium.

(95)

(96)

72

Le noyau, qui fut marqué par 2 pg/ml d'iodure de propidium, n'a aucune immunofluorescence croisée avec l'anticorps anti-TRPC6. Ce marqueur d'ADN et d'ARN donne une coloration rouge au noyau. Une coloration croisée de l'iodure de propidium avec l'anti-TRPCô aurait donné une coloration jaune (vert + rouge) (figure 18). Ce marquage fut aussi utilisé afin d'écarter les cellules qui étaient endommagées avant leur fixation. Ce type de cellules montrait un noyau dont le contour était partiellement indéfini ou une tramée d'ARN et/ou d'ADN. Ainsi, les cellules qui ont été étudiées avaient un noyau défini et ne semblaient pas montrer d'anormalités.

La spécificité de l'anticorps anti-TRPC6 fut aussi analysée sur des cellules de type HEK 293 transfectées de façon stable avec mTRPCô (HEK T6) et, comme contrôle, des cellules transfectées de façon stable avec le récepteur de type 1 de l'angiotensine II (HEK (QBI) ATIR). Les cellules HEK (QBI) ATIR ne montrent pas de fluorescence verte (figure I8-C). Pour les cellules transfectées avec l'ADNc codant pour mXRPCô, le marquage par l'anticorps anti-TRPC6 est généralement diffus au niveau du cytosol (figures 18-D et flèche hachurée dans les figures 20-A et 21-A) et montre une

immunofluoreseence plus définie en périphérie cellulaire pour plusieurs cellules (flèche

blanche dans les figures 20-A et 2I-B).

L'immunofluorescence des cellules HEK T6 et des cellules COS transfectées avec

mTRPCô suggèrent la présence de TRPC6 à la membrane plasmique, puisqu'il y a un renforcement de l'immunomarquage en périphérie cellulaire (figures 18-B, 20-A et 21-B) par rapport au cytosol. Pour confirmer la présence de TRPC6 à la membrane

(97)

(98)

(99)

(100)

(101)

(102)

(103)

(104)

(105)

(106)

(107)

(108)

(109)

(110)

(111)

(112)

(113)

(114)

(115)

(116)

(117)

(118)

(119)

(120)

(121)

(122)

(123)

(124)

(125)

(126)

(127)

(128)

(129)

(130)

(131)

(132)

(133)

(134)

(135)

(136)

(137)

(138)

(139)

(140)

(141)

(142)

(143)

(144)

(145)

(146)

(147)

(148)

(149)

(150)

(151)

(152)

(153)

(154)

(155)

(156)

(157)

(158)

(159)

(160)

(161)

(162)