Régulation de la production d'antibiotiques dithiolopyrrolones chez saccharothrix algeriensis NRRL B-24137

INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE

ÉCOLE NATIONALE SUPÉRIEURE AGRONOMIQUE DE TOULOUSE

LABORATOIRE DE GÉNIE CHIMIQUE

UMR 5503

(CNRS/INPTIUPS)

DEPARTEMENT GÉNIE DES PROCÉDÉS ET SYSTÈMES MICROBIENS

THÈSE

Présentée

à

l'INP

par

Noureddine BOURAS

En vue d'obtenir le grade de

DOCTEUR DE L'INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE

École doctorale: SCIENCES DES PROCÉDÉS

Spécialité: SCIENCES DES PROCÉDÉS ET DE L'ENVIRONNEMENT

RÉGULATION DE LA PRODUCTION D'ANTIBIOTIQUES

DITHIOLOPYRROLONES CHEZSACC�ROTHR1XALGERIENSIS

NRRL B-24137

Soutenue le 25 Novembre 2005, devant le Jury composé de:

M. J-L. PERN ODET (D.R.U. Orsay, Paris XI)

M. A. LEBRIHI (Pr. ENSAT-INPT)

M. N. SABAOU (Pr. ENS de Kouba, Alger) M. C. BRANDAM (M.C. ENSIACET-INPT) Président de Jury Rapporteur Directeur de thèse Rapporteur Examinateur

JI.

mes très cners parents,

qui m'ont tant offert sans jamais se fasser,

qui m'ont transmis fe aésir

_tf'

apprenare et m'ont toujours accompagné tout au

Cong ae mes étuaes avec feur amour, feur soutien, feur comprénension et feurs

encouragements, et m'ont permis ae aevenir ce que je suis,

avec tout mon amour et ma reconnaissance.

JI.

ma sœur Jl.icna et

_à

mes frères Jfatfjaaoutf, CJljaa et '1(p.meC-eacfine, avec une

profonae tenaresse.

JI.

ma fiancée Cnacna, avec toute mon affection et mon amour.

JI.

toute fa famiffe, aans fe sens farge au terme, pour feur soutien qui m'a été fort

précieW(,

JI.

tous mes amis, mes ensei{Jnants et camaraaes ae cfasses au co{fège, fycée,

{'

écofe P'{4Jja6iria,

{'P,:NS tf'

Jl.Cger et ae

{'P,:NSJI. rr

ae %uCouse.

Je aéaie affectueusement cette tnèse

et J'aaresse

à

tous un grana merci pour tout

AVANT-PROPOS

Ce travail a été réalisé au laboratoire de Génie Chimique (UMR 5503, CNRS-INPT-UPS) au sein du département «Bioprocédés et Systèmes Microbiens)} sous la direction de Monsieur le Professeur Ahmed LEBRIID à l'Ecole Nationale Supérieure Agronomique de Toulouse (ENSAT-INP).

Il m'est particulièrement agréable d'adresser mes remerciements à:

Monsieur le Professeur Ahmed LEBRIID, pour m'avoir proposé ce sujet, pour m'avoir accueilli au sein de son laboratoire, pour m'avoir guidé et conseillé, pour l'intérêt qu'il porte à ce sujet et sès précieux conseils qui m'ont été tout le temps fructueux. Je lui exprime ma profonde gratitude et toute ma reconnaissance.

Monsieur le Professeur Nasserdine SABAOU, Professeur à l'ENS de Vieux-Kouba (Alger), pour m'avoir conseillé et pour avoir bien voulu juger ma thèse. Je lui exprime mes sincères remerciements et toute ma reconnaissance.

Que soit vivement remercié Monsieur le Professeur Jean-Luc PERN ODET (Directeur de Recherche CNRS d'Orsay, Paris XI) qui m'a fait l'honneur d'accepter de juger mon travail.

J'adresse mes remerciements à Monsieur Cédric BRANDAM, Maître de Conférences à l'INP­ ENSIACET qui a accepté d'examiner et de juger mon travail.

Madame Florence MATIDEU, Maître de Conférences et Chercheur dans notre laboratoire, pour la codirection de ma thèse. Je tiens à lui exprimer ma profonde gratitude pour ses bons et précieux conseils pratiques.

Je souhaiterais également remercier tous les membres du laboratoire pour leurs aides et leurs encouragements, en particulier Ali ATOUI, Hadjira BOUDJELLA, Abdelghani ZITOUNI, Gamal A W AD, Boubakeur BADJI, Huy Phong DAO et Hend BEJAOUI. Un merci à tous les membres de passage dans notre laboratoire qui m'ont accompagné pour l'ambiance amicale qu'ils ont su créer durant ces trois dernières années: Mohamed LARBI, Muriel AP A Y A, Sandra GARCIA, Ikram EL­ GANNABE, Emilie DEL ROSSO, Raflk ERRAKID, Abdelouahed HAJJAJI, Fatma Zahra KARMACH, Noura EL MOURABITE, Irène KOUADIO, Awanwee PETCHKONGKAEW, ... Un grand merci à tous les membres du laboratoire des Produits Bioactifs et la Valorisation de la Biomasse

(LPBVB) de l'ENS d'Alger: Amar RlBA, Rabiâa MERROUCHE, Lynda LAMARl, Tahar DOB, Farida BOUDJELAL, Atika MEKLAT. Une pensée particulière à tous mes professeurs de l'ENS, en particulier Leïla SAÂDI, Malika NEBBALI, Abdelkarim KAMELI, Nasser BOUZEKRIA, Messaoud BOUDJENIBA, Mohamed TOUMI, Zohra BOUNOUARA, . . .

Je souhaite exprimer mes remerciements à Monsieur le Professeur Pierre STREHAIANO, notre chef du département BioSyM pour être à l'écoute de chacun des thésards, ainsi qu'à Cédric BRANDAM pour ses bons et précieux conseils pratiques et sa collaboration lors des expériences en fermenteurs, Claudia CASTRO-MARTINEZ, Huberson AKIN, Maria-Helena HERNANDEZ-ROJAS, Audrey SPITZ­ SERRA, Patricia TAILLANDIER, Marie-Line DELIA, Jean-Pierre MONNA, pour leur aide précieuse et leur disponibilité, avec une pensée particulière à Felipé RAMON-PORTUGAL, pour son aide, ses conseils, et son amitié.

Je remercie le ministère de l'enseignement supérieur et de la recherche scientifique de l'Algérie pour le soutien financier dans le cadre d'une bourse intergouvernementale. J'aimerais exprimer ma profonde gratitude à Madame POUEYMIRO du CROUS de TOULOUSE pour sa gentillesse, et son aide.

A Monsieur le Professeur Yves TARDY, Monsieur Mustapha BARAKATE et au Directeur du centre de viticulture Monsieur Marc GARCIA, pour leur gentillesse, leurs encouragements et leur sympathie. Un grand merci à Monsieur Henri AVRlL, Professeur de l'anglais à l'ENSAT et à Monsieur le Professeur Arnold. L DEMAIN (DREW University, Madison, USA), pour leurs encouragements et pour la correction des publications.

A Messieurs Yannick COPPEL (Laboratoire de Chimie de Coordination, CNRS, Toulouse) et Frédéric PONT (Service de spectrométrie de masse de l'IFR 30, INSERM, Hôpital de PURP AN) pour la réalisation des spectres de RMN et de masse, respectivement, ainsi que pour les interprétations.

A tous les techniciens et le personnel de notre laboratoire: Gérard VIGNAU, Patricia NOUVET, Josiane TRlLLES, Josiane DESP AX, sans oublier la Formidable Paule T ABARELLI, . ..

Au personnel de la bibliothèque de l'ENSAT, et un grand merci également à Gérard SURAN de l'accueil de l'ENSAT, pour leur gentillesse, leur sympathie et leur disponibilité.

Je souhaite aussi adresser ma reconnaissance à Monsieur Bernard LACROUX, et son épouse Liliane, pour m'avoir accueilli à Toulouse et avoir accepté d'accueillir ma famille en Juillet-Août de l'année

Un grand merci au Docteur Abdellah DOUDOU pour son amitié et ses encouragements.

Mes remerciements vont également à: la famille TIZOUGGAGHINE, en particulier Daddi Salah ! et la famille DADDI-HAMMOU, en particulier M. Yahya, Moussa et Mohammed. Un grand merci pour leur accueil chaleureux et leur grande gentillesse.

Il m'est particulièrement agréable d'adresser un remerciement très chaleureux et très particulier à mon ami Faouzi ATTIA pour son aide morale et ses encouragements, vraiment Faouz! Tu es Magnifico. Un merci également à tous mes amis de Toulouse: Faouzi Mohamed KASERAOUI, Sami EL-OMARI, Charef BEDDANI, Abed MALT!, Houari KHENNOUS, Didier FORT, Jessica TABARELLI pour n'avoir épargné aucun effort pour m'aider. Un grand merci également à tous mes amis de Béni-Isguèn, en particulier: Zoheir KERBA, Abdelwahab FARTAS, Djaber HADJ-SAÏD, RafIk MOKNINE, Banouh NOUH-MEFNOUN, Mustapha DAOUD, Nacer BOURAS, Bakir METIAZ, Hamada ABDERRAHMANE, Mustapha BENNACER, Mohammed BAKELLI, Mohamed HADJ-MES SAOUD FEKHAR, merci une autre fois pour votre amitié, nos débats, nos souvenirs, . . . !!!

J'adresse une pensée particulière à tous ceux que j'ai eu le plaisir de rencontrer à Toulouse, en particulier Ahmed MOGAHED, Jamal IDRIS, Didier FORT, Majid SADI, Idriss BOUKHEFFA, Nisrine BOUCHEFAA, Nawroz TAHIR ABDERREZZAK, CHIZUKO ODA, Pierre GNONHOSSOU, Claire-Marie DAVID, Sylviane BOURGAULT-CÔTE, Marie-Christine FORTIN, Katrin DE CLERCQ, Abdoulaye DIA W ARA, Wassim CHEIKH-ARABE, . . .

J'adresse également mes remerciements à toutes les personnes qui, de diverses façons et à différents moments m'ont apporté leur aide et leur soutien, plus particulièrement aux gens du laboratoire présents et de passage qui m'ont accompagné, supporté et soutenu pendant ces trois armées.

EnfIn, il me tenait à cœur de remercier les tous ceux qui me sont, et qui me seront toujours chers. Ils sauront se reconnaître. Mes remerciements vont également à tous ceux qui m'ont soutenu tour au long de ce travail, ils savent bien la place que je leur réserve au fond de mon cœur.

SOMMAIRE Avant-propos INTRODUCTION GENERALE. . . ... . . .. .. . . .... . . ... . . 1 CHAPITRE I. REVUE BIBLIOGRAPHIQUE 1.-LE GENRE SACCHAROTHRIX . . . ... . . .. . . .... . . .... 5

1 .- Caractéristiques et position taxonomique du genre Saccharothrix . . . .... . . 5

2.- Espèces appartenant au genre Saccharothrix . . . ... . . ... . . . 7

3.- Métabolites secondaires sécrétés par Saccharothrix . . . ... . . ... . . 8

4.- Caractéristique et position taxonomique de Sa. algeriensis NRRL B-24137 .. . . .... . . 9

5.- Spectre d'action et antibiotiques sécrétés par Sa. algeriensis NRRL B-2413 7 . . . .1 1 5.1.- Spectre d'action de Sa. algeriensis NRRL B-24137 . . . .. . . .. . . ... . . . 1 1 5.2:- Antibiotiques sécrétés par Sa. algeriensis NRRL B-24137 .. . .. . . .. . . .1 1 II.- DONNEES SUR LES DITmOLOPYRROLONES . . . .... . . 12

1 .- Caractéristiques chimiques des dithiolopyrrolones . . . 12

1 . 1 .- Propriétés physico-chimiques . . . .. . . .. . . .. . . ... . . . 12

1 .2.- Propriétés spectroscopique . . . .... . . .. . . .. . . .. . . .. . . .. . . ... 13

1 .- Microorganismes producteurs de dithiolopyrrolones . . . . .. . . . .. . . .. . . ... 16 3.- Spectre d'action des dithiolopyrrolones . . . .. . . .. . . .... . . .... . . . .. 17

4.- Mode d'action des dithiolopyrrolones . . .. . . .... . . ... . . . ... . . . 1 9 5.- Biosynthèse et synthèse chimique des dithiolopyrrolones . . . ... . . . .... . . 1 9 5.1.- Biosynthèse des dithiolopyrrolones . . . .... . . 1 9 5.2.- Synthèse chimique des dithiolopyrrolones . . . .... . . .. . . ... . . . ... . ... 22

6.-Domaines d'utilisation des dithiolopyrrolones . . . .... . . .. . . .. 22

6.L-Utilisation dans l'agriculture . . . .. . . ... .... .22

6.1 .- Utilisation dans d'autres domaines . . . .. . . .. . . 23

7.- Toxicité des dithiolopyrrolones . . . .. . . .... . . .. . . ... . .... . . ... 24

8.-Résistance aux dithiolopyrrolones . . . .... . . .... . . ... 24

III.- REGULATION DE LA BIOSYNTHESE DES ANTIBIOTIQUES . . . .... . . . .. . . ... 25

1.- Facteurs physico-chimiques . . . .... . . .. .. . . .. 25

2.- Inoculum . . . ... . . 25

3.- Facteurs nutritionnels . . . .. . . .... . . .. . . . ... 26 3.1.- La source de carbone . . .. . . .. . . .... . . 27

3.1.1- Régulation par les substrats glucidiques . . . .. . . .. . . 27

3.1 .2- Régulation par les acides gras . . . .... . . .. 28

3.2.- La source d'azote ... . . .... . . ... . . .. . . .... . . . .. . . . 29

3.2.1 .- Régulation par les ions ammonium . . . .... . . 29

3.3.- La source de phosphate . . . ... . . . .. . . . 33

3.4.- Les sels minéraux et les oligoéléments . . . ... . . ... . . .... . . ... .34

4.-Taux de croissance . . . .... . . ... 35

5.- Régulation de la production des précurseurs des antibiotiques . . . .. . . 35

5.I.-Cas des acides aminés et métabolisme de soufre . . . .... . . 35

5.1.1.- Biosynthèse et rôle de la cystéine . . . .. . . .. . . ... ... 35

5.2.- Cas des acides organiques . . . ... . . .. . . .. .37

5.2. 1 .- Origine des acides gras à courtes chaînes . . . 37

5.2. 1.1- �-Oxydation des acides gras à longues chaînes . . . .... . . .. . . ... . . . 39

5.2. 1 .2- Catabolisme des acides aminés et glycolyse . . . .... . . 39

5.2.1 .3- Activation des acides acétique et propionique . . . ... .... . . .41 6.- Signaux régulateurs . . . ... .42

6.1 .- Facteurs d'induction . . . : . . . .. .42

6.2.- Messagers nucléotides phosphorylés . . . .. . . .... . .43

6.2. 1- AMPc . . . .... . . ... . . . .... .43 6.2.1- ppGpp et pppGpp . . . ... . . . .. . . ... . . . .... . . ... .44

CHAPITRE II. MATERIEL ET METHODES 1.-MICROORGANISME . . . .. . . .45 II.- APPAREILS ET PRODUITS CHIMIQUES . . . ... . . . .45 1 .- Appareillage . . . .. . . .45 2.- Produits chimiques . . . ... . . . ... . . . ... . . . ... . . . ... . . . . .. . . .47

III.- MILIEUX DE CULTURE ET STERILISATION ... . . . ... . . . .. . . .47

1 .- Milieu de conservation et de sporulation . . . . .. . . ... . . . ... .47

2.- Méthode de conservation dans du glycérol . . . ' " ... . . . ... .47

3.- Milieu de pré-culture et de culture . . . .. . . .48

4 .-Stérilisation des milieux de culture . . . .. . . ... . . . ... . . . ... . . . ... .49

IV.- CONDITIONS DE FERMENTATION .... . . ... . . . ... . . . ... . . . .49

1.-Pré-cultures . . . .... . . .... . . ... . . .... . . .. . . ... . . . ... . .. . . .•. . . . .49

2.- Cultures en Erlenmeyers . . . ... . . . ... . .. . . ... . . . ... . . ... . . . .... . . ... .49

3.- Cultures en fermenteur . . . ... . . . ... 50

V.- METHODES ANALyTIQUES . . . ... . . . ... . . ... . . . ... . . . ... . . . .. . . 50

1 .- Mesure du poids sec . . . 50

2.- Mesure du pH .. . . ... . . . 51

3.- Extraction des dithiolopyrrolones . . . ... . . . ... ... 51

4 .-Dosage des dithiolopyrrolones par HPLC . . . .. . . 51

5.- Dosage du glucose et des acides organiques par HPLC ... '" . . . ... . . . ... 53

6.- Dosage du glucose par la méthode enzymatique YSI.. . . .. . . ... 55

7 .-Dosage de l'azote ammoniacal. . . .. 55

7.1.- Principe . . . . ... . . .. . . .. . . .. . . ... . . .. . . ... . . 56

7 .2 .-Protocole . . . ... ... . . ... . . ... . ... . . . 56

7 .3.-Expression des résultats . . . .. . . ... . . 57

8.-Dosage de l'azote total ... 59

8.1.-Principe ... .... ... ... ... ... ... 59

8.2.-Protocole ... ... ... 59

9.-Détermination des spectres UV-visible . . . ... . . ... . . . .. . . 60

10.-Spectrométrie de masse par impact électronique direct des dithiolopyrrolones .. . . 60

VI- DETERMINATION DES PARAMETRES CINETIQUES MICROBIENS ET DES RENDEMENTS DES FERMENTATIONS . . . . .. . . ... . . 60

1 .-Fermentations en fioles Erlenmeyer. . . .. . . .. . . ... . . , . . .... . . 60

2 .-Fermentations en réacteur . . . ... . . ... . . , . . . .. . . 61

2 .1 .-Calcul des vitesses globales . . . ... . . , . . . .. . . 61

2 .2.-Calcul des vitesses spécifiques . .. . . .. . . ... . . ... . . ... . ... . . .. . . 61

CHAPITRE III. REGULATION DE LA PRODUCTION DES DlTHIOLOPYRROLONES CHEZ SACCHAROTHRIX ALGERIENSIS NRRL B-24137 PAR LES ACIDES AMINES ET LES ACIDES ORGANIQUES INTRODUCTION . . . ... . ... . ... . . .. . . . 62

RESULTATS . . . .. . . .. . . 62

1.-Mise au point d'un milieu de culture semi-syntbétique . . . ... . . 62

2.-Cinétique de croissance et de production des ditbiolopyrrolones chez Sa. algeriensis NRRL B-24137 dans le milieu MSS . . . ... . ... .. . . ... . . 63

3 .-Effet de ]' addition des acides aminés soufrés à différents temps d'addition sur la croissance et la production des ditbiolopyrrolones chez Sa. algeriensis . . . .. . . .. . . ... 64

4 .-Effet de différentes concentrations de la cystéine et de la cystine sur la production des dithiolopyrrolones chez Sa. algeriensis . . . .. . . ... . . . .. . . ... . . 64

5.-Effet de la nature et de la concentration de différents acides aminés et de l'acide humique sur la croissance et la production des dithiolopyrrolones chez Sa. algeriensis . . . 65

5.1.-Effet de différents acides aminés et de l'acide humique sur la croissance et la production des dithiolopyrrolones chez Sa. algeriensis .. . . ... . . ... . . ... 65

5.2.-Effet de différentes concentrations de L-métbionine, DL-éthionine, L-proline et d'acide humique sur la croissance et la production des dithiolopyrrolones chez Sa . . algeriensis .. . . 66

6 .-Effet de la nature et de la concentration de différents acides organiques sur la croissance et la production des ditbiolopyrrolones chez Sa. algeriensis . . . .. . . 67

6.1.-Effet des acides organiques à une concentration de 5 mM sur la croissance et la production des dithiolopyrrolones chez Sa. algeriensis . . . ... . . . 67

6.2 .- Effet de différentes concentrations des acides acétique, butyrique, pimélique, tiglique, méthacrylique, pamoïque et férulique sur la croissance et la production des dithiolopyrrolones chez Sa. algeriensis . . . ... . . ... . . ... . . ... . . .. . . 6 8

DISCUSSION . . . ... . . .. . .. . . .... . . ... . . ... . . 69

ARTICLE 1 Effect of amino acids containing sulfur on dithiolopyrrolone antibiotic productions by Saccharothrix algeriensis NRRL B-24137 ABSTARCT . . . ... . . . .. .. . . ... . . ... . . .. . . 74

1- INTRODUCTION . . . ... . . ... . . . . ... . . ... . . . .... . . 75

2-MATERIALS AND METHODS . . . ... . . ... . ... . . ... . . ... . .. . . 76

2 .1.- Microorganism . . . ... . . . ... . . . . ... . . .. .. . . ... . 76

2 .2 .- Culture medium . . . .... . . 77

2.3 .- Culture conditions . . .. . . ... . . 77

2 .4 .- Measurement of DCW and pH . . . ... .. .. . . ... . . ... . . . .... . . 77

2 .5.- High performance liquid chromatography (HPLC) analysis . ... . . .. . . 78

2 .6.- Statistical analysis . . . ... . . ... . . 78

3- RESULTS . . . .. . . .. 79

3 .1.- Kinetics of growth and dithiolopyrrolone productions in Sa. algeriensis . . . ... . . 79

3.2.- Effect of amino acids containing sulfur at different times of addition on growth and dithiolopyrrolone productions in Sa. algeriensis . ... . . ... . . .... 79

·3.3.- Effect of different concentrations of cysteine and cystine on dithiolopyrrolone productions by Sa. algeriensis . . . . ... . . ... . . .. .... . . ... . . ... . . ... . . . ... . . 80

4- DISCUSSION . . . ... . ... . . ... . . ... . . . ... . ... . . ... . . ... . . ... . . 81

5- REFERENCES . . . ... . . ... . .. .. . . ... . . .. .. 84

PROJET ARTICLE 2 Regulation of dithiolopyrrolone antibiotic productions by amino acids and humic acid in Saccharothrix algeriensis NRRL B-24137 Abstract.. ... . . . ... . . ... 93

1- Introduction . . . ... ... ... . . .... . . ... . . ... . . ... 94

2-Materials and Methods . . . ... . . . .. .. . . ... . . ... . . ... . . ... . 95

2 .1- Producing strain . . . ... . . .. . .... . . .. .. . . ... . . . ... 95

2 .2 - Culture medium . .. .. . . . .. . . ... ... . . ... . . ... . . ... . . 96

2.3- Culture conditions . .... . .. .. . . . ... . . . .. . .... . . ... . . .. .. . . .. . .. . . .. 96

2 .4- Measurement of DCW and pH . .. .. . . ... . . ... . . . . ... . .... . . 96

2 .5- Dithiolopyrrolone extractions and high performance liquid chromatography analysis ... 97

3.1-Effect of different amino acids and humic acid on growth and dithiolopyrrolone specifie

productions . . . 98

3.2- Effect of L-proline, L-methionine and DL-ethionine concentrations on growth and dithiolopyrrolone specifie productions . . . .. . . 99

3.3- Effect of humic acid concentrations on growth and dithiolopyrrolone specifie productions ... 1 00 4- Discussion . . . ... . . ... . . l 00 5- References . ... . . ... . . ... . . . ... . . ... . . l 03 PROJET ARTICLE 3 Control of dithiolopyrrolone antibiotic productions by organic acids in Saccharothrix algeriensis NRRL B- 24137 Abstract.. ... . . . .... . . .... 113

1.- Introduction ... . .. .. . . ... . . ... . . .. . . . ... . . ... . . . .114

2.-Materials and Methods . . . ... . . ... . ... . . . ... . . , . . . 114

2.1- Producing strain . . . , . . . , . . . , . . . , . . . ... . . .114

2.2- Culture medium . . . , . . . .. . . 115

2 .3- Culture conditions . . . 115

2.4- Measurement of DCW and pH . . . ... . . .115

2.5- High performance liquid chromatography (HPLC) analysis . . . .... . . . 116

3- Results . . . ... . . ... . . ... . . ... . . .117

3.1- Effect of different organic acids on growth and dithiolopyrrolone specifie productions . . . , . . . .. . . , . . . .117

3.2- Effect of organic acids concentrations on growth and dithiolopyrrolone specifie productions . . . .. .. . . 118

4- Discussion . . . ... . . ... . . ... . . 119

5- References . . . .... . . ... . . 123

CHAPITRE IV. REGULATION DE LA PRODUCTION DES NOUVELLES DITHIOLOPYRROLONES CHEZ SACCHAROTHRIX ALGERIEN SIS B-24137 PAR LES ACIDES ORGANIQUES ET LES ACIDES AMINES 1-INTRODUCTION . . . .. .. . . ... . . , . . . , . . . 134

11-RESULTATS . . . ... . . ... . . ... . . ... . . ... . . .135

1.- Induction de nouvelles dithioJopyrroJones par J'addition de certains acides organiques et acides aminés . . . ... . . ... . . ... . . ... . . 135

1.1.- Acides organiques cycliques induisant la production de nouvelles dithiolopyrrolones . . . .137

1.1.1.- Acides organiques cycliques induisant la formation de AJ 1 et/ou PR 16,64 . . . .. . . .. 138

1.1.2.- Acides organiques cycliques induisant la fonnation de diverses autres

dithiolopyrrolones . . . .. . . , . . . .. . . 144

1.2.- Acides organiques aliphatiques induisant la production de nouvelles dithiolopyrrolones . . . ... . . .. . . 146

1.3.- Acides aminés induisant la production de nouvelles dithiolopyrrolones . . . ... 151

2.-Effet de différentes concentrations de quelques acides organiques et acides aminés sélectionnés sur la production de nouvelles dithiolopyrrolones par Sa. algeriensis ... . . .. . . 156

2 .1.- Effet des acides benzoïque, sorbique, cinnamique et 4-bromobenzoïque sur la biomasse et la production spécifique de quelques nouvelles dithiolopyrrolones par Sa. algeriensis . . . .. .. . . , . . . , . . . 156

2.1.1.- Effet sur la production de biomasse maximale . . . ... . . .. 157

2.1.2.- Effet sur les productions spécifiques de quelques nouvelles dithiolopyrrolones . . . .... . . ... . . ... 157

2 .2 .- Effet de différentes concentrations des acides propionique et valérique sur la biomasse et la production spécifique de la nouvelle dithiolopyrrolone PR3 . . .... . ... . ... . . .... . . 160

2 .2.1.- Effet sur la production de la biomasse maximale . . . ... . . ... . . 160

2.2.2.- Effet sur la production spécifique de la nouvelle dithiolopyrrolone PR 3 . . . 161

2.3.- Effet de différentes concentrations de cystéine et de cystine sur la biomasse et la production spécifique de quelques nouvelles dithiolopyrrolones . . . 162

3.- Analyses spectrométriques de masse par impact électronique direct de quelques dithiolopyrrolones nouvellement apparues . . . 163

111-DISCUSSION . . . .. . . 166

CHAPITRE v. ETUDE CINETIQUE DE LA CROISSANCE DE SACCHAROTHRIX ALGERIENSIS ET DE LA PRODUCTION DES DITHIOLOPYRROLONES EN FERMENTEUR BATCH SUR UN MILIEU SEMI-SYNTHETIQUE I- INTRODUCTION . . . ... . . . .. . . .... . . .. . . 180

11-RESULTATS . . . ... . . . 180

1.- Effet sur la croissance de Sa. algeriensis . . . ... . . 180

2.-Effet sur le pH et le P(02) . . . 182

3.- Effet sur la consommation des substrats . . . .... . . 183

4.- Effet sur la production des dithiolopyrrolones . . . .... . . 188

4 .1 .- Effet sur la production de la thiolutine . . . ... 188

4 .2 .- Effet sur la production de la SEP et de la TIP . . . ... . . ... . . . .190

4 .3.- Effet sur la production de l'ISP et de la BUP . . . .... . . 192

4 .4 .- Effet sur la production de nouvelles dithiolopyrrolones . . . 194

VI- DISCUSSION . . . .. . . 195

DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALES . . . ... . . . 197

REFERANCES BIBLIOGRAPHIQUES . . . ... 202

A: ADP: ADN: AMP: AMPc: ARNr: ATP: B.: CoA: D.O: E. coli: h: HPLC: ISP2: Il: Ilmax: mm.: mM: NAD+: NADH: NADP+: NADPH: nm: OA: PM: PS: PSmax: q: qant: q.s.p.: rpm: S: s.: s: Sa.: spp.: TR: vvm:

[]:

LISTE DES ABREVIATIONS

Absorbance

Adénosine Diphosphate acide désoxyribonucléique Adénosine Monophosphate

Adénosine Monophosphate Cyclique Acide Ribonucléique Ribosomique Adénosine Triphosphate Bacillus coenzyme-A Densité Optique Escherichia coli heure

Chromatographie Liquide à Haute Performance

International Streptomyces Project 2

Vitesse spécifique de croissance (ou taux spécifique de croissance) Taux spécifique maximal de croissance

Minutes

millimoles, millimolaires

Nicotine Adénine Dinucléotide Oxydé / nicotine adénine = nicotinamide oxydée).

Nicotine Adénine Dinucléotide Réduit

Nicotine Adénine Dinucléotide phosphate Oxydé Nicotine Adénine Dinucléotide phosphate Réduit nanomètre

oxalo-acétate poids moléculaire

poids sec de la biomasse sèche poids sec maximum

quotient métabolique

taux de production de l'antibiotique glucose (ou vitesse spécifique de production de l ' antibiotique)

quantité suffisante pour rotations par minute substrat Streptomyces seconde Saccharothrix espèce temps de rétention

volume à volume par minute

INTRODUCTION GENERALE

Les actinomycètes forment un grand groupe de microorganismes procaryotes appartenant à l'Ordre des Actinomycetales. Cet ordre regroupe des bactéries à Gram positif ayant un pourcentage en "guanine + cytosine" relativement élevé dans leur ADN (G + C > 55 mol %) et dont la majorité tendent à former un véritable mycélium ramifié (Manuel de Bergey, 1994). Les actinomycètes sont des eubactéries chimio-organotrophes hétérotrophes, aérobies strictes ou microaérophiles, dont plusieurs produisent des spores non mobiles ou parfois mobiles. Ces microorganismes présentent un cycle de développement cellulaire asexué similaire à celui des champignons imparfaits (Locci et Sharples, 1984).

Les actinomycètes sont universellement répandus. Ils constituent en général 10 à 20% du total de la microflore tellurique (Dommergues et Mangenot, 1970; Ishizawa et Araragi, 1976). Ils sont rencontrés sur une grande variété de substrats naturels: sols, air, fumier, composts, foin, débris végétaux, résidus fibreux de cannes à sucre, pollen des plantes, sédiments marins, lacs, rivières, mers et océans, etc. (Lacey, 1973; Cross, 1981; Goodfellow et Williams, 1983; Lacey, 1997). Ils sont retrouvés également dans les environnements extrêmes tels que les sols glaciaires de l'Arctique, les déserts chauds et secs de divers continents, les sols pollués par du pétrole ou des métaux lourds, les lacs extrêmement alcalins et dans certains milieux très salés (Lechevalier, 1981).

Les actinomycètes sont généralement saprophytes, mais quelques-uns sont pathogènes pour les plantes tel Streptomyces scabies, responsable de la gale de la pomme de terre (Loria, 1986) ou encore, pathogènes pour l'homme, telles les infections causées par certaines espèces de Nocardia, de Nocardiopsis, d'Actinomyces ou de Streptomyces (Lacey, 1997; Peltola et al., 2001).

Les actinomycètes constituent l'un des plus grands groupes de la population microbienne du sol. Ils sont aptes à dégrader les composés organiques non biodégradables par les champignons et les bactéries non mycéliennes et contribuent ainsi à la fertilisation des sols (Lechevalier, 1981; Goodfellow et Williams, 1983). Grâce à leurs propriétés antagonistes, les actinomycètes sont utilisés dans la lutte biologique pour la réduction des maladies fongiques de certaines plantes et quelques succès ont été enregistrés dans ce domaine (Dommergues et Mangenot, 1970; Goodfellow et Williams, 1983). Certains antifongiques non polyéniques sécrétés par les actinomycètes, comme la blasticine S, la kasugamycine et les polyoxines B et D, sont utilisés à grande échelle et depuis longtemps dans l'agriculture japonaise, contre certaines maladies du riz (Misato, 1982). La tylosine produite par Streptomyces fradiae est utilisée comme additif alimentaire pour le bétail (Hamill et al., 1961).

Les actinomycètes jouent un rôle très important dans le domaine industriel. Ils produisent de nombreuses enzymes dont certaines sont déjà utilisées dans les domaines agro-alimentaire et médical, comme la glucose isomérase, la glucoamylase, les protéases, les cellulases, les ligninases et les cholestérol oxydases (Pokorny et al. , 1979; Young et al., 1980). Ils produisent également de nombreux composés à haute valeur ajoutée comme les vitamines (Piret et Demain, 1988) importants aussi bien dans le domaine médical, que dans le domaine vétérinaire, comme additif nutritionnel pour l'élevage par exemple (Oestergaard et al., 2001). Ils interviennent également dans la bioconversion des stéroïdes (Sallam et al., 1995). Par ailleurs, les protéases alcalines des actinomycètes sont utilisées dans les détergents pour lessive (Lin et al., 1994; Matsuo et al., 1994; Kim et al., 1995; Moreira, 2002).

Les actinomycètes peuvent aussi produire des vasodilatateurs, des inhibiteurs enzymatiques, des hormones, des analgésiques, des activateurs immunitaires, des immunosuppresseurs, des hypoglycémiants, des substances anti-cholestérolémiques, etc. (Asselineau et Zalta, 1973; Deshpande et al., 1988; Ohmori et al., 1988; Umezawa, 1988; Papp et al., 1992; Tsuboya et al., 1996; Kim et al., 1998; Murakata et al., 1998; Eder et al., 2002).

La grande diversité métabolique des actinomycètes leur confère parfois certaines propriétés inhabituelles (Brown, 1995; Davidson, 1995). Par exemple, quelques espèces sont capables de dégrader ou de transformer certaines toxines produites par des champignons toxinogènes (mycotoxines) et réduire ainsi leur teneur dans les produits alimentaire (Holzapfel et al., 2002). Plusieurs espèces appartenant aux genres Streptomyces, Nocardiopsis, etc., produisent la géosmine qui donne à la terre une odeur de moisi (terreux) et à l'eau des réservoirs un goût et une odeur désagréable (Lechevalier, 1981; GoodfeUow et Williams, 1983). Certaines substances produites par les actinomycètes sont utilisées pour le traitement des emballages (ex.: pimaricine) et d'autres, pour la protection de certains fromages (Block, 1983; Vandanune, 1985). Les autres centres

d'intérêt des actinomycètes concernent la dégradation des résines polylactates (Tokiwa et al., 2001), des hydrocarbures (Dixit et al., 2000) et du phénol dans les déchets des industries textiles et de teinture (Bhathena et al., 2002).

Cependant, les actinomycètes sont surtout réputés pour leur grande capacité à produire des antibiotiques: environ 70% des molécules actives d'origine microbienne (Okami et Hotta, 1988) dont plusieurs sont utilisés dans les domaine thérapeutique, vétérinaire et agronomique (antibactériens, antifongiques). Ils peuvent avoir une activité antibactérienne (chloramphénicol, tétracycline, kanamycine, etc.), antifongique (nystatine, pimaricine, etc.), antibactérienne et antifongique (Berdy et al., 1987; Bycroft, 1988) ou herbicides, pesticides, régulateurs de croissance, etc. (Burg, 1982; Miller et al., 1983; Cuiter, 1988).

Les actinomycètes peuvent produire également des composés qui ont des activités intéressantes et sont utilisées en chimiothérapie, telles que les substances antitumorales (carcinostatine, adriainycine, daunomycine, etc.), antimitotiques (ansarnitocine, etc.), antidermatophytes (dermostatine, etc.), acaricides (altémicidine, etc.), herbicides, antiparasites (distamycine), anticoccidiens, insecticides (avermictine, polyoxines, etc.) et antivirales (mutactimycines) (Takiguchi et al., 1 980; Kase et al., 1 986; Kusakabe et al., 1987 et 1988; Perry et al., 1990; Xuguang et al., 1993; Lombardi et Crisanti, 1 997; Raty et al., 2002).

Dans l'espoir d'augmenter la probabilité de découverte de nouveaux antibiotiques, les chercheurs ont commencé à s'intéresser ces dernières années à des genres rares (autres que Streptomyces, genre étudié beaucoup plus) provenant de milieux extrêmes (Sabaou et al., 1998; Lazzarini et al., 2000; Naidenova et Vladimirova, 2001; Barakate et al. , 2002; Donadio et al. , 2002; Moncheva et al. , 2002). Ainsi, à partir d'un sol saharien d'Algérie, une souche d'actinomycète, identifiée au genre Saccharothrix, a été isolée. Cette souche s'est avérée être une nouvelle espèce et a été nommée Saccharothrix algeriensis (Zitouni et al., 2004c). Des travaux antérieurs ont permis de constater que cette souche produisait des antibiotiques à large spectre, assez puissants et ayant à la fois une activité antifongique et antibactérienne (Lamari et al., 2002a). Ces molécules appartiennent au groupe des dithiolopyrrolones, antibiotiques hétérocycliques contenant deux atomes de soufre et un autre d'azote (Lamari et al., 2002b). Selon Büchi et Lukas (1 964), le noyau dithiolopyrrolone peut être obtenu chimiquement par la condensation de deux cystéines ou à partir d'une molécule de cystine. Ces antibiotiques diffèrent très souvent entre eux uniquement par la chaîne latérale composée par un acide organique relié au cycle par une liaison amide. Les voies de biosynthèse de ce groupe d'antibiotique n'ont jamais fait l'objet de travaux, à ]' exception d'une étude préliminaire réalisée par Furumai et al. (1982) chez Streptomyces kasugaensis.

En tenant compte des informations ci-dessus, en raison du spectre d'action très intéressant de ces molécules et au vu de l'intérêt que leur accordent les chercheurs (matérialisé par le dépôt d'un nombre important de brevets), nous avons approfondi, dans la présente étude, les travaux sur la souche de Saccharothrix algeriensis, en essayant de voir l'influence de certains composés sur la production de dithiolopyrrolones, aussi bien de point de vue qualitatif que quantitatif.

Ainsi,

- dans une première partie, nous avons étudié l'influence des acides aminés soufrés sur la production des dithiolopyrrolones. Plusieurs acides aminés non soufrés ont été également utilisés, car ils pourraient éventuellement intervenir dans une étape précoce de la biosynthèse, par exemple, en étant transformés en précurseurs des dithiolopyrrolones.

- dans une deuxième partie, nous avons étudié l'influence de nombreux acides organiques sur la production des dithiolopyrrolones. Ces acides organiques se transformeraient en acyl-CoA avant d'être incorporés au noyau pyrrothine.

- dans une troisième partie, nous avons réalisé une étude sur la cinétique de production des dithiolopyrrolones en fermenteur (fermentations contrôlées) après addition de certains acides organiques préalablement sélectionnés.

Dans ces trois parties, l'influence des acides aminés et organiques a été étudiée aussi bien sur les dithiolopyrrolones connues pour être synthétisées par Sa. algeriensis, que sur celles pouvant être nouvellement induites par l'addition des composés sus-cités.

1.-LE GENRE SACCHAROTHRIX

Le genre Saccharothrix reste minoritaire parmi les actinomycètes. Il est isolé en très petit nombre à partir de divers substrats et écosystèmes: gisements de minéraux, eaux usées, sédiments océaniques, sols des régions désertiques, sols salés et alcalins, etc. (Kinoshita et al., 1 999; Chun et al., 2000; Evtushenko et al., 2000; Peltola et al., 2001; Al-Zarban et al., 2002; Kampfer et al., 2002; Schippers et al., 2002; Li et al., 2003; Hozzein et al., 2004; Zitouni et al., 2005). Le pourcentage des isolats de Saccharothrix par rapport au total des actinomycètes oscille entre 0 et 0,5% (Athalye et al., 1985). Dans plusieurs échantillons de sols sahariens, ce pourcentage varie entre 8 et 15% (Sabaou et al., 1 998). Saccharothrix, comme la grande majorité des actinomycètes, est saprophyte, chimio-organotrophe hétérotrophe et aérobie stricte.

1.- Caractéristiques et position taxonomique du genre Saccharothrix

Le genre Saccharothrix fut crée en 1984 par Labeda et al. , avec comme espèce-type Saccharothrix australiensis. Celle-ci fut incluse dans un premier temps dans la famille des Pseudonocardiaceae (Embley et al., 1988), puis par la suite, sur la base des parentés phylogénétiques, dans la famille des Actinosynnemataceae (Labeda et Kroppenstedt, 2000). Saccharothrix est caractérisé par sa morphologie et son chimiotype.

Les colonies portent en général un mycélium aérien, lequel peut être abondant ou très peu produit sèlon les espèces et les souches. Les filaments du mycélium aérien se fragmentent de manière anarchique, souvent en "zig-zag", en éléments de plus en plus courts aboutissant à la fonnation de longues chaînes de spores ovoïdes ou en bâtonnets (1 à 2 flm x 0,7 à 1 flm) et non mobiles. Il n'y a pas de production de sporophores comme chez les Streptomyces. Le mycélium du substrat se fragmente souvent en éléments coccoïdes ou allongés, cette fragmentation pouvant être excessive ou, au contraire, assez réduite. Une comparaison de la micromorphologie du genre Saccharothrix avec celle du genre Streptomyces, est illustrée dans la figure 1. En plus de la micromorphologie, l'un des critères les plus importants pour l'identification des genres d'actinomycètes est leur composition cellulaire en acides aminés, en sucres et en lipides (Manuel de Bergey, 1 994). Sur cette base, des chimiotypes furent ainsi définis.

MA type S MA MA type RA

Streptomyces

MA MS =�� 0, �

Saccharothrix

C.sp tYPe RF

Figure 1. Une comparaison de la micromorphologie du genre Saccharothrix avec celle du genre d'actinomycète le plus abondant dans la nature, Streptomyces (ln: Bergy, 1989).

MA, mycélium aérien; MS, mycélium du substrat; RF, Rectus Flexibilis (chaînes de spores droites à flexueuse); RA, Retinaculum Apertum (chaînes en crochets ou en boucles fermées); S, Spira (chaînes spiralées); s, sporophore; c. sp., chaînes de spores.

Chimiquement, Saccharothrix est caractérisé par une paroi cellulaire de type III E (Labeda, 1 987; Labeda et Kroppenstedt, 2000; Labeda et al., 2001), c'est-à-dire, présence de l'isomère DL (méso) de l'acide diaminopimélique et absence de glycine (au niveau de la paroi), présence de sucres caractéristiques qui sont le rhamnose, le galactose et le mannose (dans les cellules entières) et absence d'acides mycoliques pariétaux. Les phospholipides membranaires sont, selon la classification de Lechevalier et al. (1977), du type P II (présence de phosphatidyléthanolamine =

PE et d'hydroxy-PE) ou du type P IV (PE + hydroxy-PE + phospholipides contenant de la glucosamine). Les ménaquinones (lipides membranaires) sont de type MK-9 (H4) ou MK-1O (H4), constitués d'un noyau quinone méthylé et d'une chaîne carbonée aliphatique contenant neuf ou dix unités isoprènes dont quatre sont hydrogénées (4 sites d'hydrogénation).

Quelques années après la création de ce genre, plusieurs espèces de Saccharothrix furent découvertes (Labeda et Lechevalier, 1989; Labeda et Lyons, 1 989). Quelques isolats appartenant au genre Nocardiopsis et à d'autres genres, furent reclassés parmi les Saccharothrix (Grund et Kroppenstedt, 1 990). Dans la majorité des cas, les espèces nouvelles ont été mises en évidence grâce, tout d'abord, à l'utilisation de la taxonomie numérique (Labeda et al., 1 986; Labeda 1 986 et 1 988; Grund et Kroppenstedt, 1 989 et 1 990), puis aux critères moléculaires, notanunent le

séquençage de l'ADNr 1 68 et l'hybridation ADN-ADN (Kinoshita et al., 1 999; Hu et al., 2004; Zitouni et al. , 2004c).

2.-Espèces appartenant au genre Saccharothrix

Récemment, et sur la base des parentés phylogénétiques, le genre Saccharothrix a été marqué par quelques remaniements. Ainsi, Sa. waywayendensis et Sa. aerocolonigenes ont été rattachées à Lentzea, genre crée par Yassin et al. (1995) et Sa. flava a été incluse dans Lechevalieria, crée par Labeda et al. (2001 ). Le genre comporte actuellement dix espèces décrites (tableau 1).

Tableau 1. Liste des espèces de Saccharothrix.

EsJlèces N° d'accès Références

Sa. auslraliensis

ATCC 3 1497 Labeda

el al.,

1984

Sa. lexasensis

ATCC 5 1 593 Labeda et Lyons, 1989

Sa. espanaensis

ATCC 5 1 144 Labeda et Lechevalier, 1989

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.. _ ---_.----_.-._---ATCC 3 1520 .

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Sa. mulabilis

subsp.

capreolus

ATCC 23892 Grund et Kroppenstedt, 1 990

Sa. coeruleofusca

ATCC 35 1 08 Grund et Kroppenstedt, 1990

Sa. longϧpora

ATCC 35 1 09 Grund et Kroppenstedt, 1990

Sa. syrinf<ae

ATCC 5 1 364 Grund et KrOjJpenstedt, 1990

Sa. lanf<erinus

ATCC BAA-48 1 Kinoshita

el al.,

1999

Sa. alf<eriensis

NRRL _{B-24137 Zitouni}

_{el al.,}

_2004c

'-Sa. xinjianf<ensis

AS 4. 1 731 Hu

el al.,

2004

3.- Métabolites secondaires sécrétés par Saccharothrix

Le genre Saccharothrix sécrète plusieurs antibiotiques de nature chimique assez diversifiée (tableau 2), dont environ la majorité a été découverte durant les dix dernières années. Le nombre de molécules actives (en comptant les complexes et isomères) dépasse actuellement la cinquantaine. Parmi les premiers antibiotiques décrits, nous citerons la nocamycine, sécrétée par une souche de Sa. syringae (Brazhnikova et al., 1977; Horvath et al., 1979). On peut ainsi trouver des polyamines ou des aminoglycosides (Takahashi et al., 1986), des benzoquinones (Takahashi et al., 1986; Isshiki et al., 1989), des alcaloïdes (Suzuki et al., 1991), des glycopeptides (Takeuchi et al., 1992), des nucléosides carbocycliques (Bush et al., 1993), des composés phosphorés acides et hydrophiles (Takahashi et al., 1995), des hétérocycles azotés et soufrés (Tsurumi et al., 1995; Lamari et al., 2002a,b), des heptadecaglycosides qui appartiennent à une nouvelle classe d'antibiotique (Singh et al., 2000), des anthracyclines (Zitouni et al., 2004a,b) et des macrolides (Zitouni, 2004).

Certains antibiotiques sont doués d'une activité antibactérienne (Gram positif et plus rarement Gram négatif), comme les galacardines, ou antifongique comme le thiazolylpyridine, ou encore antibactérienne et antifongique à la fois, comme les dithiolopyrrolones, la dopsisamine et la formamycine. D'autres composés sécrétés présentent des activités antitumorales (ex.: ammocidine, pluraflavines), antivirales (fluvirucines), herbicides (phosphonothrixine et coformycine =

nucléosides carbocycliques), ou inhibitrices de métalloprotéases ou d'autres enzymes (molécules WS75624). Le tableau 2 donne les principales substances bioactives synthétisées par le genre Saccharothrix.

Il est à signaler que plusieurs souches de Saccharothrix productrices des molécules bioactives ont fait l'objet de plus de 60 dépôt de brevets (Tresner et al., 1 980; Jain et al., 1982; Kirby et al.,

1 987) dont 34 entre 2000 et 2005 (www.uspto.gov/patfi[).

4.- Caractéristique et position taxonomique de Sa. algeriensis NRRL B-24137

L'espèce Sa. algeriensis a été isolée en 1 992 à partir d'un échantillon de sol prélevé de la palmeraie d'Adrar (oasis du Sud-Ouest algérien). Initialement rattachée au genre Nocardiopsis (Boudjella, 1 994) et reclassée par la suite dans le genre Saccharothrix (Zitouni, 1 995). La micromorphologie de la souche est typiquement celle du genre. Le mycélium aérien est abondant et de couleur jaune-orange. Le mycélium du substrat est jaune vif. Des pigments solubles de même couleur sont abondamment sécrétés. L'analyse des constituants cellulaires a montré que la souche possède le chimiotype III E et des phospholipides de type P IV. La glycine et les acides mycoliques sont absents. Une taxonomie numérique, incluant 77 tests physiologiques, ainsi qu'une analyse phylogénétique (séquençage de l'ADNr 1 6S, hybridation ADN-ADN) ont montré que la souche diffère nettement des espèces connues et a été nommée Sa. algeriensis. Celle-ci a été déposée dans deux collections mondiales: NRRL et DSM sous le numéro d'accession B-24 1 37 et 445 8 1 , respectivement (Zitouni et al. , 2004c).

Tableau 2. Principales substances ayant une activité biologique et synthétisées par les souches appartenant au genre

Saccharothrix.

Substances Propriétés Orie;ines Références

Nocamycine Antibactérienne, antitumorale

Sa. syringae

Brazhnikova

et al.,

1977; Horvath

et

al.,

1 979.

Polymitoxine Antibiotique

Sa. mutabilis

Jain

et al.,

1982.

Dopsisamine Antibactérienne, antifongique

Sa. mutabilis

Takahashi

et al.,

1986.

LL-C19004 Antibiotique

Sa. espanaensis

Kirby

et al.,

1987.

Kinamycines (1 et 2) Antibactériennes, antitumoraIes

Saccharothrix

sp. Isshiki

et al.,

1989. Ménaquinones (1, II et III) Antiparasitaires

Saccharothrix

sp. Perry

et al.,

1990.

Sekothrixide AntitumoraIe

Saccharothrix

sp. Kim

et aI.,

1991;Seto

et al.

, 1992. Tetrazomine Antibactérienne, antitumorale

Sa. mutabilis

subsp. Suzuki

et al.,

1991.

chichijimaensis

Fluvirucines (Al , A2, BI, Antivirales

Sa. mutabilis

subsp. Tomita

et al.,

1991.

B2, B3, B4 et B5)

Schiiijamaensis

Galacardines (A et B) Antibactériennes

Saccharothrix

sp. Takeuchi

et al.,

1992.

Coformycine Herbicide

Saccharothrix

sp. Bush

et al.,

1993; Dancer

et al.,

1 997. WS75624 A et B Inhibiteur d'enzyme

Saccharothrix

sp. Tsurumi

et al.,

1995; Yoshimura

et al.,

convertissant l' endotheline 1995.

Substance P analgésique

Saccharothrix

sIJ. Tsuboya

et al.,

1996.

Formamycine Antibactérienne, antifongique

Sa. tangerinus

Igarashi

et al.,

1 997a,b; Kinoshita

et al.,

1999.

Phosphonothrixine Herbicide

Saccharothrix

sp. Kimura

et al.,

1995; Takahashi

et al.,

1995; Nakamura

et al.,

1999. ThiazoIiIpyridine Antifongique

Saccharothrix

sp. Sugawara

et al.,

1999. TMC 96 Inhibiteur de protéasome

Saccharothrix

sp. Koguchi

et al.,

1999. Ammocidine Antitumorale

Saccharothrix

sp. Murakami

et al.,

2001a,b. Pluraflavines (A, B et E) Antitumorales

Saccharothrix

sp. Vértesy

et al.,

200 1 .

Saccharomicines (A et B) Antibactériennes

Sa. espanaensis

Sinll:h

et al.,

2000. Wan�

et al.,

2001 . Dithiolopyrrolones (AJ, Antibactériennes, antifongiques

Sa. algeriensis

Lamari

et al.,

2002a,b.

Ct; C2, A et B)

Pravastatine Anti-cholestérolémique

Sa. mutabilis

Matsuo

et al.,

2003 .

(GBC33-0) Antiparasite, insecticide

Saccharothrix

sp. UK. Pat., 1990, 2 232 668, CA, 1 15, 1 12815u.

(FZ032-W) Antiparasite, insecticide

Saccharothrix

sp. U.K. Pat., 1990, 2 232 668, CA, 1 15, 1 12815u.

(GBC32-N) Antiparasite, insecticide

Saccharothrix

sp. U.K. Pat., 1990, 2 232 668, CA, 1 1 5, 1 12815u.

Kinamycine G Antibactérienne, antitumorale

Saccharothrix

sp. Ito

et al.,

1970.

RUG l3A Analgésique

Saccharothrix

sp. Abe

et al.,

1969; Yamatodani

et al.,

1970.

RUG l 3B Analgésique

Saccharothrix

sp. Abe

et al.,

1969; Yamatodani

et al.,

1970.

(GYZ60-K) Antibiotique

Saccharothrix

sp. Isono, 1988.

(GYZ61-L) Antibiotique

Saccharothrix

sj). Isono, 1988.

Swalpamycin B Antibactérienne

Saccharothrix

sp. Zitouni 2004a. Al

dg

amycin G Antibactérienne

Saccharothrix

sp. Zitouni 2004a. mutactimvcin C Antibactérienne

Saccharothrix

sp. Li

et al.

1992.

mutactimycin PR Antibactérienne

Saccharothrix

sp. Zitouni

et al.,

2004a,b.

5.- Spectre d'action et antibiotiques sécrétés par Sa. algeriensis NRRL B-24137

5.1.- Spectre d'action de Sa. algeriensis NRRL B-24137

Sa. algeriensis NRRL B-24137 présente un spectre d'action très large, qui touche aussi bien les

bactéries à Gram positif (Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus et Bacillus subtilis) et à Gram négatif (Escherichia coli, Proteus mirabilis, Alcaligenes faecalis, Pseudomonas fluorescens et Serratia marcescens), que les levures (Saccharomyces cerevisiae et Candida albicans) et les champignons filamenteux. L'action est particulièrement importante contre les bactéries à Gram positif et les champignons, moyenne contre les levures et moyenne à faible contre les bactéries à Gram négatif (Zitouni, 1995). Il est intéressant de noter que les champignons phytopathogènes tels que Fusarium oxysporum f. sp. albedinis, F oxysporum f. sp. ciceri, F oxysporum f. sp. lentis, F.

oxysporum f. sp. lini, F oxysporum f. sp. lycopersici, Fusarium culmorum, F graminearum, Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea, Pythium irregulare et Mucor ramannianus, ainsi que Alternaria sp. et Penicillium sp., sont fortement inhibés (Zitouni, 1995; Lamari et al., 2002a).

5.2.- Antibiotiques sécrétés par Sa. algeriensis NRRL B-24137

Zitouni (1995) a montré que l'extrait au dichlorométhane du filtrat de culture de Sa. algeriensis

NRRL B-24137 donnait, par chromatographie sur couche mince, deux taches jaune vif, actives contre les bactéries et les champignons. Après analyse par HPLC, le premier produit, nommé Al s'est révélé être constitué par un seul antibiotique, tandis que la deuxième tache PS s'est révélé être un complexe de cinq antibiotiques nommés PS A, PS B, PS C l , PS C2 et PS D.

Après purification et analyses spectroscopiques, la structure chimique des six molécules a été déterminée. Ces antibiotiques font partie du groupe des dithiolopyrrolones qui sont des hétérocycles contenant des atomes de soufre et d'azote (Lamari et al., 2002a,b). L'antibiotique principal, Al, a été identifié à la thiolutine (syn. acétyl-pyrrothine, acéto-pyrrothine, farcinicine). La structure chimique de ces antibiotiques est donnée par la figure 2. Sa. algeriensis est le seul taxon de Saccharothrix à produire des antibiotiques de la famille des dithiolopyrrolones.

R = CH3 R = CH(CH3)2 R = (CH2)2-CH3 R = CH=C(CH3)2 R = C(CH3)=CH(CH3) R = C6Hs Thiolutine (AJ). Iso-butyryl-pyrrothine (PS C l). Butanoyl-pyrrothine (PS C2). Sénécioyl-pyrrothine (PS A). Tigloyl-pyrrothine (PS B). Benzoyl-pyrrothine (pS D).

Figure 2. Antibiotiques du groupe des dithiolopyrrolones synthétisés par Sa. algeriensis NRRL B-24137.

Il.- DONNEES SUR LES DITHIOLOPYRROLONES

1.- Caractéristiques chimiques des dithiolopyrrolones

Les dithiolopyrrolones sont des dérivés d'un hétérocycle caractérisé par la présence d'un noyau appelé dithiolopyrrolone (pyrrolinodithiole, pyrrolinonodithiole ou encore pyrroloisothiazole) de type 1 ,2-dithiolo-[4,3-b] pyrrol-5(4H)-one. Leur structure bi-cyclique est composée de deux cycles condensés de cinq membres. Un cycle dithiol (contenant deux atomes de soufre) et un cycle pyrrole qui porte des radicaux reliés à l'azote nO 4 et l'azote nO 7. La structure aromatique confère aux dithiolopyrrolones une couleur variant entre le jaune, l'orangé, le vert et le noir (Eisenman et al., 1 953; Schachtner et al., 1 999). Plusieurs structures ont été décrites dans le groupe des dithiolopyrrolones, mais deux types sont principalement distingués, selon la nature de groupement lié à l'azote n° 4 (H ou CH3). La principale dithiolopyrrolone est la thiolutine, découverte par Tanner et al. (1 950).

Les propriétés physico-chimiques et spectroscopiques des dithiolopyrrolones, d'après Seneca et al. (1 952), Celmer et Solomons (1 955), Yamagishi et al. (1 971) et Lamari et al. (2002b), sont résumés ci-dessous.

1.1.- Propriétés physico-chimiques

- Aspect: Poudre ou cristaux de couleur jaune vif orangé ou vert noirâtre (Aiguilles brillantes dans le n-butanol).

- Solubilité: généralement très bonne dans le chloroforme et dans le diméthylsulfoxyde, bonne dans le méthanol et le dichlorométhane, moyenne à bonne dans l'acétate d'éthyle, le n-butanol, l'éthanol et l'acétone, moyenne dans le benzène et l'eau et très faible dans le n-hexane et l'éther diéthylique.

- Stabilité: thermostabilité remarquable (une heure à 100 oC ou plus de 20 min. à 120 oC pour la thiolutine), stable dans les solutions acides et neutres et non ou peu stable dans les solutions alcalines.

- Point de fusion: 243-245 oC (pour la thiolutine).

- Point de décomposition: 273-276 oC (pour la thiolutine). - Sublimation: 200° / 0,1 mm (pour la thiolutine).

1.2.- Propriétés spectroscopiques

- Spectrométrie de masse: fragment principal: 1 72 pour les dérivés N-H (azote nO 4, voir figure 2) et 1 86 pour les dérivés N-CH3 (azote nO 2) (Okamura et al. , 1 977; Mc Inerney et al., 1 991). - Poids moléculaire: entre 172 (holothine) et 673 (thiomarinole B).

- Spectroscopie UV-Visible: le spectre des dithiolopyrrolones présente une absorption dans le visible (due à la couleur jaune). Ils sont caractérisés par des longueurs d'ondes maximales de 205 à 219, 287 à 3 1 1 et 386 à 406 nm.

- Spectroscopie Infra-Rouge (dans du KBr): Principales bandes d'absorption: 740, 1235, 1 547, 1 600, 1 640, 1 670, 3050 et 3250 cm·l . Cette analyse a permis de déterminer certains groupements fonctionnels (NHz, OH, CO, etc.), d'aromatiques, de groupements CH, CHz, CH3, etc. L'interprétation effectuée, selon Williams et Flemings (1 989), montre la présence d'aromatique (bandes à 1 605 et 3050 cm'

\

de fonctions cétones (bandes à 1640 et 1 670 cm,I), de liaison

NH

(bandes à 1550 et 3260 cm,l) et de groupements CH3 (bandes à 2975 cm,I).

Tableau nO 3. Caractéristiques de différentes dithiolopyrrolones sécrétées par les microorganismes.

Antibiotique Formule et R,

PM

Pyrrothine C6H6N,OS, CH3

PM: 1 86

Thiolutine (syn.: acétyl- C,H,N,O,S, CH3

pyrrothine, acéto-pyrrothine, PM: 228 farcinicine).

Auréothricine (syn.: propionyl- C9HlON,O,S, CH,

pyrrothine, propio-pyrrothine). PM: 242

Iso-butyryl-pyrrothine (syn.: iso- CIOH12N,O,S, CH,

butyro-pyrrothine, PM: 256 2-methvlpropanoyJ:pyrrothine).

Xénorhabdine VII (syn.: CIOH12N,O,S, CH,

butanoyl-pyrrothine, butyro- PM: 256 pyrrothine).

Sénécioyl-pyrrothine (syn.: 3- C" H 12N,O,S, CH,

methyl-2-butenoyl-pyrrothine ). PM: 268 Tigloyl-pyrrothine C" H12N,O,S, CH3 PM: 268 Benzoyl-pyrrothine C\3HION,O,S, CH, PM: 290 2-méthyl-pentanoyl-pyrrothine C\3H'9N,O,S, CH, PM: 299

Xénorhabdine VI (syn.: 3- CIIH'4N,O,S, CH,

methylbutanoyl-pyrroth ine). PM: 270

Xénorhabdine IV C12H'6N,O,S, CH,

PM: 284

Pentanoyl-pyrrothine C12H'6N,O,S, CH3

PM: 284

Xénorhabdine V (syn.: 5- C\3H18N,O,S, CH,

methylhexanoyl-pyrrothi

n�_

--PM: 298 --- -- -R2 H-N-H H-N-CO-CH3 H-N-CO-CH,-CH3 H-N-CO-CH(CH,), H-N-CO-(CH,),-CH, H-N-CO-CH-C(CH,), H-N-CO-C(CH,)-CH(CH,) H-N-CO-C6H, H-N-CO-CH3-(CH,),-CH-(CH,), H-N-CO-CH,-CH(CH,), H-N-CO-(CH')4-CH, N-H-CO-(CH')3-CH, H-N-CO-(CH,),-CH-(CH,), --- -- ---1 4 Espèces productrices Streptomyces sp. Streptomyces thioluteus,

S. celluloflavus, S. albus, S. pimprina, S. kasugaensis, S. luteoreticuli, Saccharothrix algeriensis.

Streptomyces kasugaensis, S. pimprina, S. farcinicus, S. thioluteus,

S. luteoreticu/i, S. celluloflavus, S. cyanoflavus, (et aussi synthétisé chimiquement).

Streptomyces pimprina. Saccharothrix algeriensis, (et aussi synthétisé chimiquement). Xenorhabdus nematophilus, X luminescens, X biovienii, Saccharothrix algeriensis. Saccharothrix algeriensis. Saccharothrix algeriensis. Saccharothrix algeriensis. Saccharothrix algeriensis. Xenorhabdus nematophilus, X luminescens, X biovienii. Xenorhabdus spp. Xenorhabdus nematophilus, X luminescens, X biovienii. Xenorhabdus nematophilus, X luminescens, X biovienii. -- - --Références

1

Furumai et al., 1 982 ; O_{liva et al., 200 1 .}

, Celmer et Solomons, 1 955; Celmer et

1

Solomons, 1 963; Yamagish et ai., 197 1 ; Lamari et al., 2002a,b.

Umezawa et al., 1 949; Cel mer et aI., 1 1 952; Cel mer et Solomons, 1 955;

Yamagishi et al., 1 97 1 ; Juhl et Clark, 1990; Naik et al., 200 1 .

1 Bhate et al., 1 960; Lamari et al.,

2002a,b.

1

Lamari et al., 2002a,b., Webster et al., 2002.

i

Lamari et al., 2002a,b. 1 Lamari et al., 2002a,b.

1

Lamari et al. (Résultats non publiés). Lamari et al. (Résultats non publiés). Mc Inemey et al., 1 99 1 ; Webster et al., 1 2002.

Mc Inemey et al., 1 99 1 ; Paik et al., 2001; Webster et al., 2002.

Webster et al., 2002.

Mc Inerney et aI., 199 1 ; Paik et al., 2001 ; Webster et al., 2002.

Holomycine (syn.: déméthyl- C7H6N202S2 H H-N-CO-CH3 Streptomyces sp. P6621 , S. griseus, Ettlinger et al., 1 959; Okamura et al., PM: 2 1 4 S. clavuligerus, S. clavuligerus, 1 977; De la Fuente et al., 2002.

thiolutine). _{S. pimprina.}

Propionyl-holothine CsHsN202S2 H H-N-CO-CH2-CH3 Streptomyces P662 1 , (et aussi synthétisé Okamura et al., 1 977.

PM: 228 chimiquement).

Xénorhabdine 1 (syn .. : hexanoyl- C" H'4N202S2 H H-N-CO-(CH2)4-CH3 Xenorhabdus nematophilus, Li et al., 1 996; Forst et Nealson, 1 996;

holothine). PM: 270 X luminescens, X biovienii. Webster et al., 2002.

Xanthydrol (dérivé de la C24H22NP3S2 Xanthy- H-N-CCJ-(CH2)4-CH3 Transformation chimique de la Mc Inerney et al., 1 99 1 .

Xénorhabdine 1). PM: 450 dry] Xénorhabdine 1.

Xénorhabdine " (syn .. : 5- C'2H'6N202S2 H H-N-CO-(CH2)3-CH-(CH3)2 Xenorhabdus nematophilus, Mc Inerney et al., 1 99 1 ; Paik et al.,

methylhexanoyl-holothin). PM: 284 X luminescens, X bovienii. 200 1 ; Webster et al., 2002.

Xénorhabdine J1I (syn .. : octanoyl- C13H,sN202S2 H H-N-CO-(CH2)6-CH3 _{Xenorhabdus nematophilus. Mc Inerney et al., 1 99 1 ; Webster et al.,}

holothine). PM: 298 2002.

Thioaurine (syn.: orosomycine ou C7H6N202S2 H CH3-N-CHO Streptomyces sp. Von Daehne et al., 1969; Laskin et

antibiotique vD 844) PM: 2 1 4 Lechevalier, 1984.

Antibiotique vD 846 C6H4N202S2 H H-N-CHO Streptomyces sp. Laskin et Lechevalier, 1 984.

PM: 200

Thiomarinole A C30H44N209S2 H H-N-CO-C25H4007 Alteromonas rava. Shiozawa et al., 1993; Shiozawa et

PM: 640 Takahashi, 1 994.

Thiomarinole B C30H44N20" S2 H H-N-CO-C25H4009 Alteromonas rava. Shiozawa et al., 1995.

PM: 672

Thiomarinole C C30H44N20SS2 H H-N-CO-C25H4006 Alteromonas rava. Shiozawa et al., 1 995.

PM: 624

Thiomarinole D C31 H46N209S2 H H-N-CO-C26H4207 Alteromonas rava. Shiozawa et al., 1 997.

PM: 654

Thiomarinole E C32H4SN209S2 H H-N-CO-C27H4407 Alteromonas rava. Shiozawa et al., 1 997.

PM: 668

Thiomarinole F C30H42N209S2 H H-N-CO-C25H3S07 Alteromonas rava. Shiozawa et al., 1997.

PM: 638

Thiomarinole G C30H44N20SS2 H H-N-CO-C25H4006 Alteromonas rava. Shiozawa et al., 1 997.

2.-Microorganismes producteurs de dithiolopyrrolones

La thiolutine a été isolée pour la première fois par Tanner et al. (1950) à partir de

différentes souches de Streptomyces albus. Sa structure chimique fut déterminée pour la

première fois par CeImer et Solomons en 1955. Par la suite, la thiolutine a été isolée à partir

d'autres espèces de Streptomyces: S. celluloflavus, _S. Kasugaensis, S. luteoreticuli, _S. pimprina

et S. thioluteus (Yamagishi et al., 1971 ; Furumai et al., 1 982).

Plusieurs autres dithiolopyrrolones tels que l' auréothricine, l'holomycine, les xénorhabdines et les thiomarinoles (Minamiguchi et al., 2001), furent isolés de certaines espèces de Streptomyces

citées précédemment, mais aussi de S. cyanoflavus et S. griseus (Seneca et al., 1952; Celmer et al.,

1 952; Eisenman et al., 1953; Ettlinger et al., 1 959; Bhate et al., 1960; Von Daehne et al., 1 969; Yamagishi et al., 1 971; Okamura et al., 1977) ou de bactéries non mycéliennes telles que

Xenorhabdus bovienii, X luminescens et X nematophilus qui sont des Enterobacteriaceae vivant

en symbiose avec certains nématodes pathogènes d'insectes nuisibles dans l'agriculture (Mc Inemey et al., 1 99 1 ; Isaacson et Webster, 2002; Webster et al., 2002), ou encore de Alteromonas

rava, une bactérie marine (Shiozawa et al., 1993). Lamari et al. (2002a,b) ont isolés des

antibiotiques dithiolopyrrolones à partir de Saccharothrix algeriensis NRRL B-24137, montrant

ainsi pour la première fois qu'une souche d'actinomycète autre que Streptomyces pouvait produire des antibiotiques de ce groupe. Une liste des microorganismes producteurs de dithiolopyrrolones est donnée dans le tableau 3.

Les xénorxides font partie d'un autre groupe de métabolites proche des dithiolopyrrolones, synthétisés également par les genres Xenorhabdus, mais aussi par Photorhabdus. Ces substances possèdent la même structure que les dithiolopyrrolones avec, cependant, une oxydation d'un atome de soufre (figure 3). Les xénorxides possèdent des activités antibactériennes, antifongiques et anticancéreuses (Webster et al., 2002).

o

\

)lR

R=n-CsHl l

o

R

= (CH2)3CH(CH3)2

Figure 3. Antibiotiques du groupe des xénorxides synthétisés par les genres Xenorhabdus et Photorhabdus.

3.- Spectre d'action des dithiolopyrrolones

La thiolutine, tout comme les autres dithiolopyrrolones, possède un spectre d'action assez large. L'activité biologique des dithiolopyrrolones a été étudiée par plusieurs chercheurs: Gopalkrishnan et lump (1952), Lewis et Michener (1 954), Li et Webster (1 995), Zitouni (1995), Yang et al. ( 1998), Yang et al. (2001), Merrouche (2001), Oliva et al. (2001), Lamari et al. (2002a) et Meklat (2004). Ce spectre est très large et touche les bactéries (à Gram positif et à Gram négatif), les levures, les champignons microscopiques et même les protozoaires et les insectes (Webster et al., 2002). Cependant, l'utilisation des dithiolopyrrolones dans la lutte contre les bactéries infectieuses est limitée par leur forte toxicité, tout comme les anthracyc1ines (Niemi, 1995). Certaines dithiolopyrrolones possèdent une activité anticancéreuse; cependant, elles présentent aussi des effets secondaires toxiques (Xu, 1 998). Les microorganismes inhibés par la thiolutine ou par d'autres dithiolopyrrolones, sont cités dans le tableau 4 (liste non exhaustive).

. � , , ' . , : -.

Tableau 4. Liste des microorganismes inhibés par les dithiolopyrrolones.

Microorganismes-cibles

Bactéries à Gram positif

Bacillus cereus, Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, Clostridium

sp.,

Micrococcus luteus; Mycobacterium phlei, Mycobacterium tuberculosis,

Mycobacterium

spp.,

Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis

et

Streptococcus pyogenes.

Bactéries à Gram négatif

Aerobacter aerogenes, Agrobacterium tumefaciens, Alcaligenes faecalis,

Bordetella pertussis, Erwinia amylovora, Escherichia coli, Haemophilus

influenzae, Klebsiella pneumoniae, Neisseria catarrhali�

•.

,Neisseria

gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, , Proteus mirabilis, Proteus

" ' , .

'

vulgaris, Pseudomonas

, . . . .

aeruginosa, Pseudomonas jluorescens;

'1 '

Pseudomonas syringae, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi,

Salmonella schottmulleri, Salmonella typhi, Sal,monella typhimurium,

Serratia marcescens, Shigella dysenteriae, Shigella sonnei,

et

Vibrio

cholerae.

Champignons filamenteux ou

Blastomyces dermatitidis, Candida albicans, Candida kefyr, Candida

lévuriformes pathogènes pour

vulgaris, Cryptococcus neoformans, Endomyces albicans,

l'homme

Epidermophyton jloccosum, Microsporon audouini, Microsporum

fulvum, Trichophyton mentagrophytes

et

Trichophyton rubrum'.'

Champignons filamenteux

Botrytis Cinerea, Botiyiis fàbae, Càèiispora arachidicola, Chaetomium

phytopathogènes

globosum,

F.

culmorum, F. graminearum, Fusarium oxysporum

f. sp.

albedinis,

F.

o.

f. sp.

ciceri, F. o.

f. sp.

lentis,

F.

o.

f. sp.

lini,

F. 0, f. sp.

lycopersici, Myrothecium verracaria, Peronospora tabacina,

Phytophtora boehmeriae, Phytophtora cinnamoni, Phytophtora

infestans, Plasmopora viticola, Puccinia recondita, Pyricularia oryzae,

Pythium irregulare, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Venturia

..

inaequalis

et

Verticillium aIQo-atrum.

' ... . � - : . .

Champignons filamenteux et

Alternaria

sp.,

Aspergillus

sp.,

Mucor ramannianus, Penicillium

lévuriformes non pathogènes

notatum, Rhizopus nigricans

et

Saccharomyces cerevisiae.

Protozoaires pathogènes

Entamoeba histolytica, Histoplasma capsulatum, Leishmania donovani,

(parasites) pour 1 'homme

Leishmania tropica, Sporotrichum schenkii, Trichomonas fœtus

et

Trypanosoma cruzi.

Larves et insectes

Heliothis punctigera

et

Lucilia sericata.

.

.

Note:- l'activité est généralement très forte contre les bacténes à Gram positif, forte contre les champignons, moyenne à forte contre les levures et faible à moyenne contre les bactéries à Gram négatif.

4.- Mode d'action des dithiolopyrrolones

La thiolutine, comme d'autres dithiolopyrrolones, empêche la synthèse de l'ARN messager en

inhibant les ARN polymérases. Cette action à été démontrée chez les eucaryotes comme

Saccharomyces cerevisiae (Tipper, 1 973; Jimenez et al., 1 973; Herrick et al., 1 990; Adams et

Gross, 1991; Lee et al., 1 996; Webster et al., 2002) et chez les procaryotes comme Escherichia coli

(Khachatourians et Tipper, 1 974; Sivasubramanian et Jayaraman, 1 976 et 1 980; O'Neill et al.,

2000). L'action principale de la thiolutine concerne surtout l'ARN messager et la synthèse des protéines. Cet antibiotique empêche d'une façon réversible la synthèse de l'ARNm chez

Saccharomyces cerevisiae à des concentrations inférieure à 2 I-lg/mL. En revanche, cette synthèse

est bloquée immédiatement, et d'une façon irréversible, à des concentrations entre 2 et 4 I-lgimL et

le blocage de la synthèse protéique se fait après 20 minutes (Webster et al., 2002). La thiolutine

peut aussi inhiber la synthèse de la paroi de Saccharomyces cerevisiae en agissant sur la glucane et

la mannane synthétases (Elorza et al., 1976). Elle peut agir aussi sur la membrane plasmique de

certaines bactéries avec pour conséquence, l'empêchement de l'entrée de certains composés du

milieu comme l'uridine exogène, à l'intérieur des cellules de Salmonella typhimurium (Joshi et al.,

1 982) ou encore du glucose et d'autres sources carbonées, dans les cellules d'Escherichia coli

(Bergman, 1 989). Selon O'Neill et al. (2000), la thiolutine et l'holomycine sont considérées

comme importantes pour une utilisation en thérapie.

5.- Biosynthèse et synthèse chimique des dithiolopyrrolones

5.1.- Biosynthèse des dithiolopyrrolones

Furumai et al. (1982), étudiant la biosynthèse de l'auréothricine par S. kasugaensis, pensent

que les gènes responsables de cette biosynthèse sont d'origine chromosomique. Le précurseur de l'auréothricine serait la L-cystine dont l'accumulation nécessite la présence de certains acides gras tels que l'acide palmitique et l'acide oléique. Le noyau de base provient donc de la condensation de

deux cystéines (Adelberg et Rabinovitz, 1 956; Ettlinger et al. , 1 959). Une fois le noyau pyrrothine

formé, une réaction avec le propionyl-CoA aboutirait à la formation de l'auréothricine. Les mêmes

auteurs soulignent qu'une acétylation du noyau pyrrothine, à l'aide de l'acétyl CoA, conduirait

également à la formation de la thiolutine. Les informations sur la biosynthèse de quelques

dithiolopyrrolones sont données sous forme d'hypothèse, comme le montre la figure 4, selon

Furumai et al. (1982). Aucune étude sur la biosynthèse des dithiolopyrrolones n'a été entreprise