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ELUCIDATION DES DETERMINANTS STRUCTURAUX IMPLIQUES DANS LA RECONNAISSANCE MOLECULAIRE ENTRE MXD1 ET MAX
ET LA LIAISON A L'ADN par
MARTIN MONTAGNE
Departement de Pharmacologic
These presentee a la faculte de medecine et des sciences de la sante
en vue de l'obtention du grade
de philosophiae doctor (Ph.D.) en Pharmacologic
These evaluee par
Pierre Lavigne, departement Pharmacologic Jean-Bernard Denault, departement Pharmacologic
Xavier Roucou, departement de Biochimie
Joelle Pelletier, departement Chimie, Universite de Montreal JUIN 2008
1*1
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L 'effort de faire un travail est plus facile que le remords de ne pas I'avoir fait.
TABLE DES MATIERES
TABLE DES MATIERES iii
LISTE DES PUBLICATIONS v
LISTE DES FIGURES vi
LISTE DES ABBREVIATIONS viii
RESUME 1
INTRODUCTION 3
LE RESEAU DE FACTEURS DE TRANSCRIPTION DE TYPE B/HLH/LZ :
C-MYC/MAX/MXD 3
1. ROLES ET FONCTIONS CELLULAIRES 3
1.1 Fonctions biologiques des heterodimeres c-Myc/Max 10
1.1.1 Le facteur de transcription c-Myc 10
1.1.2 Activation de la transcription par c-Myc 11 1.1.3 Repression de la transcription par c-Myc 18 1.2 Fonctions biologiques des heterodimeres Mxd/Max 21
1.2.1 Le facteur de transcription Mxdl 22
1.2.2 Repression de la transcription par Mxdl 25 1.3 Fonctions biologiques de l'homodimere Max/Max 25 1.4 Strategies pour inhiber efficacement les actions biologiques associees a la
2. RECONNAISSANCE MOLECULAIRE, HETERODIMERISATION ET LIAISON A L'ADN : QUELS SONT LES DETERMINANTS STRUCTURAUX ? 31
2.1 Structure generate du motif b-HLH-LZ . 32
2,1.1 Regions HLH et LZ .33
2.1.2. Domaines basiques 35
2.2 Destabilisation des homodimeres et heterodimerisation avec Max 35
2.2.1 Determinants structuraux du LZ 36 2.2.2 Heterodimeres c-Myc/Max 38 2.2.3 Homodimere de Max... 41 2.2.4 Heterodimeres Mxdl et Max 43 2.3 Liaison a l'ADN 47 3. OBJECTIFS DE L'ETUDE 53 PUBLICATION (1) 54 PUBLICATION (2) W A DISCUSSION 138 Article 1 142 Article 2 149 CONCLUSION 162 REMERCIEMENTS 166 BIBLIOGRAPHIE 168
LISTE DES PUBLICATIONS
Publications presentees dans cette these :
MONTAGNE, M., NAUD, J-F., MCDUFF, F-O. et LAVIGNE P. (2005). Toward the elucidation of the structural determinants responsible for the molecular recognition between Madl and Max. Biochemistry, 44, 12860-12869.
MONTAGNE, M., NAUD, J-F. et LAVIGNE, P. (2007). Elucidation of the structural determinants responsible for the specific formation of heterodimeric Mxdl/Max b-HLH-LZ and its binding to E-Box sequences. J. Mol. Biol. 376, 141-152.
Autres publications :
NAUD, J-F., MCDUFF, F-O., SAUVE, S., MONTAGNE, M., WEBB, B.A., SMITH, S.P., CHABOT, B. et LAVIGNE, P. (2005). Structural and Thermodynamical Characterization of the Complete p21 Gene Product of Max. Biochemistry, 44, 12746-12758.
MCDUFF, F-O., NAUD, J-F., LEBEL, R., MONTAGNE, M., SAUVE, S. & LAVIGNE, P. (2008) Reversible Dimerization Between Human c-Myc and Max b-HLH-LZ Domains. J. Mol.Biol. (soumis)
Figure 1. Representation en ruban de la structure des dimeres des regions b-HLH-LZ formes par les proteines du reseau Myc/Max/Mxd lies a l'ADN 6 Figure 2. Balance transcriptionnelle assurant les points de controle des differentes etapes
du cycle cellulaire 8
Figure 3. Schematisation des interactions proteine-proteine du reseau Myc/Max/Mxd et localisation des regions impliquees sur la structure primaire 14 Figure 4. Assemblage du complexe d'activation de la transcription initie par la liaison de l'heterodimere c-Myc/Max au promoteur d'un gene cible 15 Figure 5. Schematisation de la repression de la transcription par l'heterodimere
c-Myc/Max 20
Figure 6. Regulation de l'expression de c-Myc et des proteines Mxd par le TGF-p 24 Figure 7. Schematisation du mecanisme de repression de la transcription par
l'heterodimere Mxdl(Madl) /Max 26
Figure 8. Strategies qui permettraient d'inhiber les actions biologiques resultant de la
surexpression de c-Myc 30
Figure 9. Alignement de sequences des domaines b-HLH-LZ des proteines principales
du reseau c-Myc/Max/Mxd 34
Figure 10. Schematisation de l'interface de dimerisation des LZ par les roues
helicoidales 37
Figure 11. Interactions specifiques permettant l'heterodimerisation des LZ de c-Myc et
deMax 39
vii
Figure 13. Interface du b-HLH-LZ de Mxdl 45
Figure 14. Schematisation des interactions specifiques au sein du LZ de l'heterodimere
Max/Mxdl par les roues helicoi'dales 46
Figure 15. Representation des contacts proteine-ADN permettant la reconnaissance specifique de la sequence palindromique d'un E-Box canonique 5'-CACGTG-3'
b-HLH-LZ b-Zip CD CDK4 CDK9 c-Myc CpG DCT CycTl CycT2 CycK ACD E-Box HI HII HAT HDAC hTERT INR
Domaine basique-«Helice I-Loop-Helice II-Leucine Zipper» Domaine basique- «Leucine Zipper»
Dichroi'sme Circulaire cyclin-dependent kinase 4 cyclin-dependent kinase 9 Myc cellulaire
Sequence d'ADN avec une frequence elevee de cytosine et guanine
Domaine C-terminal CyclineTl
Cycline T2 Cycline K
Difference entre deux courbes CD
« Enhancer Box », sequence d'ADN specifique situe dans les promoteurs de certains genes cibles
Helice I Helice II
Histone Acetyl-Transferase Histone Deacetylase
« Human telomerase reverse transcriptase » Site d'initiation de la transcription
IX INIl/hSNF5 KD Mad ou Mxd Max MBI/II/III Mnt Miz-1 Myc NF-Y Ode P-TEFb SCD SAGA SID SKP2 SMAD SWI/SNF TAD TGF-P TIP48/49/60 TRRAPP
Composantes du complexe SWI/SNF humain Constante de Dissociation
« Max associated protein in differentiation » « Myc associated protein X »
« Myc Box I/II/III » « Myc antagonist»
« Myc interacting zinc finger protein 1 » Oncogene de la myelocytomatose
« Nuclear factor Y » Ornithine decarboxylase
« Positive transcription elongation factor b » Sommation de 2 courbes CD
SPT/ADA/GCN5/acetyltransferase Domaine d'interaction a m!3in3
« S-phase kinase-associated protein 2 » « Mothers against DPP homolog »
« Complexe de remodelage de la chromatine compose des genes SWI et SNF »
Domaine de Transactivation de Myc « Transforming growth factor p »
«TATA Box-binding protein-interacting protein, 48/49/60-kDa » Proteine associee avec des domaines de transactivation / transformation
RESUME
Les facteurs de transcription du reseau c-Myc/Max/Mxd assurent le controle de la transcription de plus de 1600 genes. L'heterodimerisation competitive entre les membres du reseau et la proteine Max permet des reponses cellulaires opposees. En effet, le complexe c-Myc/Max est associe a 1'activation de la transcription de genes sous 1'influence de promoteurs contenant des sites E-Box, pendant que les complexes Mxd/Max permettent l'inhibition de la transcription a ces memes promoteurs. Cependant, l'activite oncogenique associee a la surexpression de c-Myc dans plusieurs cancers semble etre assuree par l'inhibition de la transcription de genes cytostatiques causee par l'association de Miz-1 au complexe c-Myc/Max. De maniere encourageante, la reintroduction de Mxdl permet de reduire la proliferation et la croissance cellulaire et constitue une avenue therapeutique interessante. Cette these rapporte 1'elucidation de l'identite de residus specifiques impliques dans la reconnaissance moleculaire de Mxdl et de Max et la determination de la structure heterodimerique minimale requise afin de permettre une liaison stable a l'ADN.
La reconnaissance moleculaire est dictee par des determinants structuraux specifiques contenus dans les regions HLH et LZ. L'heterodimerisation specifique necessite 2 etapes essentielles : 1) la destabilisation des homodimeres, assuree par des repulsions electrostatiques a l'interface de dimerisation des 2 domaines, et 2) l'heterodimerisation avec Max. Dans notre premier article, nous avons confirme que l'unique residu acide D112a, situe a l'interface de dimerisation du LZ, previent la formation des homodimeres. Nous avons demontre que le retrait de la charge acide par la mutation D112N ou par l'abaissement du pH permettait d'augmenter de facon equivalente la population homodimerique. De plus, nos resultats demontrent que l'augmentation de l'homodimerisation du LZ et/ou de la region HLH obtenue par la mutation Dl 12N soutient efficacement la liaison a un site E-Box.
Le deuxieme article a permis 1'identification des residus impliques dans l'heterodimerisation specifique des regions b-HLH-LZ des proteines Mxdl et Max. L'augmentation de l'hydrophobicite de l'interface dimerique de la proteine Max par les mutations N78VH81L (VL) avait ulterieurement permis d'augmenter considerablement l'homodimerisation et de stabiliser la liaison a l'ADN. Dans cette optique prometteuse, nous avons augmente l'hydrophobicite de l'interface dimerisation du LZ de Mxdl par la mutation D112V. Des essais de digestions enzymatiques et de CD ont confirmes l'augmentation de la stabilite du LZ de Mxdl. Cependant, cette mutation permettant d'accroitre le taux d'helices a ne permet toutefois pas de stabiliser la liaison a l'ADN. Certaines repulsions electrostatiques, possiblement impliquees dans la destabilisation des homodimeres de Mxdl et obtenues par le rapprochement des regions HLH, ont ete hypothetiquement identifiees par modelisation moleculaire. Nous avons ensuite utilise des essais d'heterodimerisation limites strictement a certaines regions dimeriques pour
demontrer que les regions HLH heterodimerisent de maniere favorable independamment de la presence de LZ homodimeriques. Cependant, la liaison a l'ADN necessite l'heterodimerisation des regions LZ meme si l'interaction des regions HLH est observee en absence d'ADN. L'heterodimerisation complete des domaines HLH et LZ, essentielle a la liaison de l'ADN par l'heterodimere, survient uniquement lorsque l'interaction favorable des regions HLH surpasse la stabilite des LZ homodimeriques et soutient indirectement la formation des heterodimeres des regions LZ. Nous avons egalement fait la demonstration que l'heterodimerisation precede la liaison a l'ADN tel que proposee par d'autres groupes et ne peut etre decrite par le mecanisme d'heterodimerisation empruntant le «monomer pathway» qui correspondrait a la liaison successive de l'ADN par les monomeres de Mxdl et de Max avant l'heterodimerisation.
Mots cles : facteurs de transcription, b-HLH-LZ, heterodimerisation, liaison a l'ADN, reseau Myc/Max/Mxd
INTRODUCTION
LE RESEAU DE FACTEURS DE TRANSCRIPTION DE TYPE B/HLH/LZ : C-MYC/MAX/MXD
1. ROLES ET FONCTIONS CELLULAIRES
Le controle et la coordination de l'activation et/ou de l'inactivation de la transcription des genes est un processus essentiel au maintient de l'homeostasie cellulaire. L'integrite de l'organisme est serieusement compromise lorsque 1'expression genique devient incontrolee ou incontrolable. II y a trois grandes categories de genes associes aux pathologies cancereuses : les oncogenes, les genes suppresseur de tumeurs et les genes de reparation de l'ADN. L'expression non-controlee d'un oncogene et/ou l'inactivation complete ou partielle de certains suppresseurs tumoraux ou de certaines proteines de reparation de l'ADN, par exemple, peuvent initier la perte de ce controle delicat. Les proto-oncogenes sont des genes normaux qui peuvent devenir oncogenes lorsqu'ils sont surexprimes ou lorsqu'ils subissent des mutations. Ces genes encodent pour des proteines qui soutiennent positivement la proliferation et la differentiation cellulaire. Leur modification en proto-oncogene est dominante car il suffit qu'une des deux copies du gene soit modifiee. On a identifie actuellement plus de 100 proto-oncogenes. Les plus connus sont les genes ras, myc, erk et abl.
La decouverte des proto-oncogenes a permis d'expliquer la proliferation anarchique observee lors de la formation et du developpement tumoral. Ainsi, le groupe de Sheiness a premierement identifie le gene de myc chez des cellules non-infectes par le virus de la myelocytomatose dont myc (T-myc) est 1'oncogene principal. Cette maladie est associee a une infection retrovirale par 1'oncogene myc qui provoque une leucemie myelomonocytaire chez le poulet (SHEINESS et BISHOP, 1979). Cette infection provoque la formation de tumeurs des cellules myeloi'des, originaires de la moelle osseuse, et se caracterise par le developpement d'excroissance des os du crane, des cotes et des os des membres inferieurs (hanches, genou, jambes et pieds). Elle peut egalement favoriser le developpement de cancers renaux et hepatiques. Maintenant, nous savons que l'unique surexpression du gene myc ou la defaillance des modifications post-transcriptionnelles de Myc (i.e. phosphorylation, ubiquitinylation, mutation stabilisante de l'ARNm) sont suffisantes pour enclencher et maintenir le caractere proliferatif de divers types de cellules.
Myc est un facteur de transcription de type b-HLH-LZ (region basique, domaine «Helix-Loop-Helix» et domaine «Leucine Zipper»), membre du reseau Myc/Max/Mxd. La proteine c-Myc (la version cellulaire de Myc) est responsable de 1'activation ou de l'inactivation de plus de 1600 genes (myccancergene.org). La transcription de certains de ces genes influence, directement ou indirectement, la transcription d'autres genes qui amplifieront et soutiendront les processus biologiques inities par 1'expression et 1'activation de c-Myc. Au debut des annees 90, la decouverte de Max, une proteine de type b-HLH-LZ, qui s'associe en cellules avec c-Myc (BLACKWOOD et EISENMAN,
5 1991), a permis d'identifier la veritable nature de c-Myc. Cette association fut une grande decouverte puisque cette etude demontre pour la toute premiere fois que Myc doit obligatoirement heterodimeriser avec Max afin de lier l'ADN (BLACKWOOD et
al, 1992) et d'accomplir ses fonctions biologiques. Les domaines HLH-LZ, communs
aux deux proteines, assurent la reconnaissance et permettent l'heterodimerisation. Par ailleurs, la reconnaissance et la liaison specifique des sequences consensus correspondantes aux E-Box (CACGTG), sont obtenues grace aux domaines basiques (Figure 1). L'implication transcriptionnelle de c-Myc est maintenant reconnue dans le controle de la proliferation et de la transformation cellulaire, ainsi que dans l'apoptose, la tumorigenese, la neoplasie et la reparation des dommages a l'ADN.
Normalement, l'expression de c-Myc est bien regulee par le TGF-p. L'activation de la transcription par c-Myc est, entre autre, antagonisee par d'autres proteines qui doivent egalement et obligatoirement heterodimeriser avec Max afin d'initier des reponses cellulaires de nature opposees a celles obtenues par l'activation ou l'inactivation de la transcription par c-Myc. Ainsi, les proteines de la famille Mxd, anciennement connues sont l'acronyme Mad [i.e. Madl (AYER et al, 1993), Mad2 ou Mxil (ZERVOS et al, 1993), Mad3, Mad4 (HURON et al., 1995)], la proteine Mnt (HURLIN et al, 1997) et la proteine Rox (MERONI et al., 1997) ont ete decouvertes quelques annees plus tard et reconnues comme essentielles pour contrebalancer les fonctions naturelles de c-Myc. Ainsi, ces facteurs de transcription, egalement de type b-HLH-LZ, inhibent l'activation de la transcription des genes sous 1'influence de promoteurs contenant des sequences E-Box, reconnues, liees et activees egalement par les heterodimeres c-Myc/Max.
7 Les actions biochimiques resultant de la liaison des heterodimeres c-Myc/Max ou Mxd/Max (ou d'autres heterodimeres) aux sequences E-Box sont indirectes et necessitent le recrutement de co-activateurs ou de co-represseurs qui soutiennent des actions cellulaires opposees. Des domaines d'interaction proteine-proteine, permettent a c-Myc et aux proteines Mxd(x) de recruter differents complexes proteiques qui modifient 1'accessibility, pour la machinerie transcriptionnelle, au promoteur contenant une ou des sequences E-Box. A l'oppose de c-Myc, qui permet 1'activation de la transcription de genes sous le controle de sequences E-Box, les proteines Mxd, Mnt et Rox, permettent de reprimer la transcription a ces memes sites, en faveur de l'arret de la croissance cellulaire. Cependant, bien que Max possede la capacite de lier l'ADN sous forme homodimerique (FERRE D'AMARE et al, 1993, SAUVE et al, 2004) l'absence d'un domaine d'interaction pour une proteine effectrice, limite l'impact de sa presence sur les sequences E-Box en absence de c-Myc ou de Mxd(x). Cependant, un role d'occupation transitionnelle des E-Box lui est reconnu dans la litterature (GRANDORI
et al, 2000).
En dernier lieu, pour ajouter au tableau, la liaison de c-Myc au facteur de transcription Miz-1 permet egalement d'inhiber la transcription de nombreux genes, toujours en faveur de la croissance et de la proliferation cellulaire (Figure 2). L'expression regulee des proteines Mxd (SIEGEL et MASSAGUE, 2003) et de c-Myc (SKOUTERIS et SCHRODER, 1996) controle la balance transcriptionnelle afin d'assurer les passages du cycle cellulaire et/ou de la differentiation cellulaire.
9 La comprehension des mecanismes de regulation de 1'expression des proteines du reseau, ainsi que l'impact de leur activation sur la transcription sont des sujets bien explores. Cependant, le jeu de la reconnaissance differentielle et obligatoire avec Max, qui influe directement sur les populations heterodimeriques, ainsi que le mecanisme d'echange de ces populations heterodimeriques pour de memes sequences E-Box n'est pas entierement compris et necessite d'importantes clarifications. L'elucidation des determinants structuraux responsables de la destabilisation des homodimeres de Mxd ou de Myc et 1'identification des residus impliques dans la reconnaissance moleculaire avec Max permettra de mieux comprendre les mecanismes d'echange entre les membres du reseau, pour Max et pour les memes sequences de liaison a l'ADN. La presente these permet d'identifier et d'analyser les determinants structuraux impliques dans la destabilisation des homodimeres des domaines b-HLH-LZ de Mxdl (designe comme Mxdl* ulterieurement), ainsi que de leur importance dans la reconnaissance moleculaire avec Max. Un residu specifique correspondant a ces deux criteres a ete identifie durant ces travaux. Une mutation precise permet d'augmenter considerablement la stabilite de l'homodimere du b-HLH-LZ de Mxdl sans toutefois modifier son potentiel d'heterodimerisation avec Max, augmentant a la fois sa capacite a lier l'ADN sous forme homodimerique ou heterodimerique a la temperature physiologique. Ce mutant pourrait permettre de reduire la formation ou meme de provoquer la dissociation des heterodimeres c-Myc/Max, impliques dans la vaste majorite des cancers (GARDNER et
al, 2002), et permettre de s'opposer a l'etat proliferatif d'une tumeur active, assure par
1.1 Fonctions biologiques des heterodimeres c-Myc/Max
De nombreux comportements biologiques decoulent des actions transcriptionnelles de l'heterodimere c-Myc/Max (PELENGARIS et KHAN, 2003). Parfois divin, parfois meme diabolique, l'heterodimere c-Myc/Max demeure indispensable. II controle le destin cellulaire et fait parfois rimer l'immortalite davantage avec la mort qu'avec la vie.
1.1.1 Le facteur de transcription c-Myc
L'action principale de c-Myc repose sur son potentiel a activer ou a reprimer la transcription genique (GRANDORI et al, 2000; DANG et al, 2005). Comme mentionne precedemment, c-Myc active entre autre la transcription de genes essentiels a la synchronisation des passages du cycle cellulaire. Parmi ceux-ci on retrouve les genes
cad (BOYD et al, 1995), cycline D2 (BOUCHARD et al, 2001), cycline D3
(SCHUHMACHER et al., 2001), CDK4 (HERMEKING et al, 1995 ; LINDBERG et
al, 2007), ode (TOBIAS et al, 1995) et mnt, l'inhibiteur par excellence de l'activation
de la transcription par c-Myc (HURLIN et al, 1997 ; MENSSEN et HERMEKING, 2002), pour n'en nommer que quelques-uns. c-Myc permet egalement Pinhibition de la transcription de plusieurs genes cytostatiques, responsables de 1'arret de la croissance et de la proliferation cellulaire. Les genes pl5INK4b (STALLER et al, 2001), p21Cipl (WU et al, 2003) Qtp27Kipl (YANG et al, 2001) sont quelques exemples repertories dans la litterature. Les consequences cellulaires, aux allures parfois opposees, demeurent
11 encore complexes, voire imprevisibles (HURLIN et DEZFOULL, 2004 ; BERNARD et EILERS, 2006). C'est pourquoi, cette proteine qui est essentielle en condition physiologique peut naturellement favoriser et supporter la tumorigenese lors d'un mauvais controle de son expression ou d'une defaillance d'une regulation post-transcriptionnelle (LUSHER et al, 2001).
1.1.2 Activation de la transcription par c-Myc
L'activation de la transcription par c-Myc est initiee par le recrutement de proteines nucleaires effectrices. La formation de ces complexes proteiques permet de modifier chimiquement l'etat physique de la chromatine et d'augmenter 1'accessibility, au site d'induction, pour la machinerie transcriptionnelle. Les fonctions biologiques de c-Myc lui sont entierement conferees par la presence de nombreux domaines d'interactions specifiques.
Ainsi, outre les domaines d'heterodimerisation HLH-LZ, mentionnes comme impliques dans la reconnaissance entre les proteines du reseau, plusieurs domaines d'interactions situes en N-terminal sont hautement conserves chez les proteines de la famille Myc (c-Myc, v-Myc, N-Myc L-Myc). Toutefois, ces domaines d'interactions different des domaines d'interaction proteine/proteine presents chez les autres proteines qui doivent egalement heterodimeriser avec Max. Au nombre de trois, ils sont designes comme les « Myc Box » (MB) et constituent le domaine de trans-activation de Myc
(TAD) (Figure 3). lis permettent d'assurer la regulation et l'initiation des fonctions biologiques de Myc.
Tout d'abord, les domaines de regulation MBI et MBIII sont des lieux de modifications post-transcriptionnelles importants, influencant la cinetique de degradation de Myc (BAHRAM et al, 2000). Par consequent, de simples modifications telles la phosphorylation et l'ubiquitinylation permettent de synchroniser la regulation stricte de c-Myc en fonction du temps et du lieu. Tout d'abord, la phosphorylation s'effectue principalement sur trois residus, la Thr58, Ser62 et Ser71 situes sur le premier domaine du TAD (MBI). Le premier site permettrait de reduire le processus de degradation, pendant que la phosphorylation sur les residus serines permettrait, de facon generale, d'accelerer sa degradation. Dans ce meme sens, l'ubiquitinylation serait lui-meme un processus efficace pour permettre un controle temporel de faction de c-Myc. De facon generale, l'ubiquitinylation permet de favoriser la degradation de plusieurs cibles proteiques. La proteine SKP2, integree au complexe E3 Ubiquitin Ligase SCFSKP2, est une des proteines effectrices responsables de l'ubiquitinylation de c-Myc.
Celle-ci est directement recrutee par le domaine MBII de c-Myc a certains sites d'activation. En plus de reguler negativement son temps d'action, une premiere ubiquitinylation de c-Myc par SKP2 serait indispensable pour permettre son role d'activation de la transcription. Dans ce cas ci, l'ubiquitinylation de c-Myc permet de recruter certaines sous-unites proteasomales qui stimulent f activation de la transcription, independamment de leurs roles proteolytiques. L'abondance des modifications post-transcriptionnelles et les interactions avec de nombreux facteurs
13 cellulaires qui influencent les activites de c-Myc debordent de notre etude et ne seront pas abordees plus en detail dans cette these.
En resume, le domaine MBIII situe au coeur de la proteine regule negativement le caractere pro-apoptotique de c-Myc (HERBST et al, 2005) et constitue la zone d'interaction majeure essentielle pour l'activation de la transcription par c-Myc (COHEN et PROCHOWNIK, 2006). Le recrutement et l'assemblage de differentes proteines, au site d'activation reconnu par Fheterodimere c-Myc/Max, s'effectuent principalement par interactions specifiques avec ce large domaine et favorisent 1'initiation de la transcription.
Deux classes majeures de complexes proteiques permettent d'alleger l'effet repressif obtenu par le compactage de la chromatine (WORKMAN et KINGSTON, 1998). En premier lieu, on retrouve des modifications chimiques de la chromatine telle Facetylation. Dans ce modele, le domaine MBII de c-Myc recrute la proteine TRRAP (MCMAHON et al, 1998), sous unite catalytique essentielle a Factivite acetyl-transferase sur les histones (HAT) associee au large complexe proteique de 1.8 MDa appele SAGA (SPT/ADA/GCN5/acetyltransferase). L'assemblage du complexe, initie par F interaction du TAD et de TRRAP, permet le recrutement subsequent des proteines GCN5 (PARK et al, 2001), Tip48/Tip49 (MCMAHON et al, 2000) et SKP2 (KIM et
al, 2003; VON DER LEHR et al, 2003). Ce complexe modifie de facon covalente, par
acetylation, la queue N-terminale des histones (Figure 4) et provoque, par repulsion electrostatique, une reduction du compactage de la chromatine (PARK et al, 2001).
Le deuxieme phenomene permet de remodeler mecaniquement la chromatine. Ce processus est assure par des facteurs de remodelage de la chromatine, dependants de l'ATP, SWI/SNF (PARK et al, 2002; LEE et al, 2003). Le domaine MBI1 de c-Myc interagit avec le complexe INIl/hSNF5, une composante indispensable du complexe SWI/SNF (CHENG et al, 1999). L'action concertee de ces deux phenomenes d'activation, physique et mecanique, peut egalement etre observee de maniere interdependante sur quelques promoteurs. Certaines etudes demontrent egalement qu'une synchronisation est requise afin de coordonner les actions des proteines de remodelage et des proteines HAT, necessaires pour assurer l'activation d'un gene (NARLIKAR et al, 2002).
Un dernier mecanisme impliquant egalement l'heterodimere c-Myc/Max a notamment ete etudie dans le cas du gene carbamoyl-phosphate synthase/aspartate transcarbamoylase/dihydroorotase (cad). c-Myc favorise, dans ce cas particulier, l'elongation (ou le maintient) plutot que l'initiation de la transcription (EBERHARDY ET FARNHAM, 2001). Le phenomene est initie par l'interaction de ses domaines MBI et MBII avec le complexe proteique P-TEFb («positive transcription elongation factor b»). Le complexe P-TEFb est compose des cyclines Tl (reconnues par c-Myc), T2 et K (CycTl, CycT2, CycK) et de CDK9. Par phosphorylation de plusieurs cibles proteiques, dont le domaine C-terminal (DCT) de l'ARN polymerase II, il facilite l'elongation de la transcription (PRICE, 2000). Bien que c-Myc n'aie pas d'infiuence directe sur l'assemblage d'un complexe pre-initiatique, il participe neanmoins a l'activation de la transcription. De plus, ce mecanisme d'activation ne necessite aucune liaison de l'ADN
17 par l'heterodimere c-Myc/Max (COWLING et COLE, 2007). En effet, l'expression seule et soutenue du domaine de transactivation de Myc (mutant sans domaine basique) permet d'augmenter les ARN messager de certaines CDK, de stimuler la methylation des des ARNm, de faciliter le chargement des polysomes et d'accelerer la vitesse de transcription. Le domaine de transactivation de Myc (DTA), via le recrutement specifique de certaines proteines dont P-TEFb, stimule done positivement la phosphorylation du DCT de l'ARN Polymerase II, amplifiant a la fois la transcription et le metabolisme de l'ARNm. De maniere plus generalised, un groupe a demontre que 1'inhibition de P-TEFb est suffisante pour bloquer la transcription des genes, la proliferation cellulaire ainsi que l'apoptose induite par c-Myc dans la lignee renale
1.1.3 Repression de la transcription par c-Myc
Inversement a 1'activation de la transcription par c-Myc, les phenomenes d'inhibition ou de repression de la transcription par c-Myc ne necessiteraient aucune liaison specifique a l'ADN par Pheterodimere c-Myc/Max. Le recrutement de c-Myc aux abords des promoteurs de certains genes cibles permettrait d'influencer negativement la transcription de ces genes en empechant la completion de 1'assemblage des complexes d'activation de la transcription. En fait, c-Myc entre directement en competition avec certains co-activateurs de 1'initiation de la transcription. Ainsi, 1'association de c-Myc a differents facteurs de transcription interfere avec les processus normaux d'activation de certains genes cytostatiques en empechant l'echafaudage de la plate-forme d'initiation de la transcription. Par exemple, l'interaction de c-Myc avec Spl empeche 1'association avec les proteines SMAD essentielles pour 1'activation de la transcription de nombreux genes (GARTEL et al, 2001). Son interaction avec NF-Y empeche la transcription du recepteur du «platelet-derived growth factor» (PDGF) (IZUMI et al, 2001) et son interaction avec la proteine Miz-1 empeche son interaction avec la proteine p300 (SCHNEIDER et al, 1997). L'interaction avec le facteur de transcription a doigt de zinc Miz-1 est un exemple de repression par c-Myc parmi les plus etudie. Dans ce modele, la repression de la transcription par c-Myc provient du fait que son recrutement aux promoteurs de genes cibles de Miz-1 empeche l'interaction normale de p300 et de Miz-1 (Figure 5). En effet, les deux proteines partagent physiquement le meme site d'interaction avec Miz-1 (STALLER et al, 2001; SEOANE
19 (SEOANE et al, 2001), dep21Cipl (HEROLD et al, 2002; SEOANE et al, 2002), de
p27Kipl (TOYOSHIMA et HUNTER, 1994) et meme de Mxd4 (Mad4) (HURLIN et al, 1995 et 1996), agissant de concert en faveur de 1'arret du cycle cellulaire en phase
Go/Gj. Le recrutement de c-Myc par Miz-1 empeche done 1'arret a ces points de controle essentiels, en interferant avec 1'activation de la transcription de ces genes cytostatiques.
Recemment, un autre mecanisme de repression a ete observe sur le promoteur
p21Cipl (BRENNER et al, 2005). Dans ce cas, c-Myc interagirait avec la proteine
Dnmt3a, une methyltransferase qui permet la methylation de l'ADN aux ilots CpG. Les ilots CpG se definissent classiquement comme etant des regions d'ADN d'environ 200 paires de bases et contenant majoritairement des nucleotides cytosine et guanine, et ce dans un ratio superieur a 0.6. La methylation servirait principalement a restreindre la transcription ou a marquer les differents passages cellulaires en permettant d'identifier plus facilement l'ADN nouvellement synthetise qui est peu methyle. L'hypermethylation de ces regions precises est generalement associee a la repression de la transcription et au «silence d'un gene» (gene silencing) observe durant la carcinogenese (KARPF, 2007). Lorsque le complexe Myc-Dnmt3a est recrute par Miz-1 au promoteur de p21Cipl, la methylation de ce dernier est suffisant pour assurer la repression de la transcription de son gene (BRENNER et al, 2005).
21 1.2 Fonctions biologiques des heterodimeres Mxd/Max
Les actions biologiques resultantes de l'expression des proteines Myc sont naturellement reequilibrees par des actions opposees, obtenues par l'expression des proteines de la famille Mxd. La decouverte de cette famille de facteurs de transcription, sous-famille du large reseau Myc/Max/Mxd, a ete initiee par 1'identification de Mxdl (Madl) par le groupe d'Eisenman au debut de la precedente decennie (AYER et al, 1993). Rapidement les proteines Mxd2 (Mxil ou Mad2) (ZERVOS et al, 1993), Mxd3 (Mad3) et Mxd4 (Mad4) (HURLIN et al, 1995) furent egalement identifiees comme partenaires dimeriques pour Max, s'opposant aux actions cellulaires de c-Myc. D'autres proteines, telles Mnt (HURLIN et al, 1997) et Mga (MERONI et al, 1997), furent aussi reconnues comme antagonistes cellulaires des proteines Myc. Bien qu'a ce jour il semble que seules les proteines Mnt et Mxd4 soient des suppresseurs tumoraux potentiels, il n'en demeure pas moins que chacune des proteines de la famille participe activement a renverser les actions cellulaires resultant= de l'expression de c-Myc. Une analyse extensive des resultats de «knock-out» de souris des differents membres de la famille a ete revue par le groupe de PIRITY en 2006. II est cependant inutile d'aborder le sujet avec plus de details pour la presente etude.
L'expression de Mxdl, sujet principal de cette these, favorise principalement 1'arret de la croissance et de la proliferation cellulaire, en faveur de la differentiation cellulaire. Bien que Taction de Mxdl peut etre soutenue ou remplacee par l'un ou l'autre des membres de la famille Mxd en condition physiologique, la surexpression de
Mxd s'avere une strategic efficace permettant de reduire efficacement la croissance et la proliferation de certaines cellules cancereuses (GEHERING et al., 2000 ; PULVERER
et al, 2000 ; CERNI et al., 2002 ; HULTQUIST et al, 2004 ; YUN et al, 2007).
Synchronisee, l'expression temporelle distincte de Myc et de Mxdl permet d'assurer l'echange et l'association avec Max, leur partenaire obligatoire, et favorise le comportement transcriptionnel requis en reponse aux stimuli externes precis. La perte de l'expression de Mxd4, resultant de la surexpression de c-Myc, a ete frequemment observee lors de la tumorigenese (KIME et WRIGHT, 2003). Celle-ci correle habituellement avec l'expression deregulee de 1'oncogene Myc et facilite certains passages du cycle cellulaire (Go/Gi).
1.2.1 Le facteur de transcription Mxdl
Tout comme c-Myc, Mxdl doit necessairement s'associer a Max. Sous forme d'heterodimere avec Max, il peut lier l'ADN afin d'accomplir son role cellulaire. Celui-ci consiste prinCelui-cipalement a renverser certains effets biologiques resultants de l'expression de c-Myc. La competition entre Mxdl et c-Myc pour Max, ainsi que la competition des heterodimeres Mxdl/ Max et c-Myc/Max pour les memes sequences d'ADN, sont des niveaux de regulation qui influencent l'antagonisme entre c-Myc et Mxdl.
Le TGF-p est un agent cytostatique important dans la regulation de l'expression des proteines Mxd (SIEGEL et MASSAGUE, 2003). En effet, en se liant a son recepteur
23 membranaire, le TGF-P favorise la phosphorylation puis la dimerisation des proteines SMAD3 et SMAD4. La translocation au noyau du complexe SMAD3/SMAD4 puis la liaison aux promoteurs specifiques permettra la transcription de Mxdl et de Mxd4 (WERNER, 2001 ; MASS AGUE et al, 2005 ; Figure 6). II est probable que ce phenomene de regulation par le TGF-P s'applique egalement aux autres proteines de la famille Mxd.
Dernierement, la proteine Mix, («Max-like protein») rut egalement reconnue comme partenaire heterodimerique de Mxdl. Associee initialement a l'embryogenese, on lui reconnait maintenant des roles importants dans la regulation metabolique du glucose et des lipides (BILLIN et AYER, 2006). Son association avec MondoA (BILLIN et al, 2000), MondoB et ChREBP (MA et al, 2007) participe egalement a cette nouvelle avenue de la regulation metabolique. De plus, son association avec differentes proteines du reseau permet de s'interroger sur le role de ce tout nouveau reseau, parallele et independant de Max.
25 1.2.2 Repression de la transcription par Mxdl
Par opposition a c-Myc, qui stimule l'acetylation des E-Box par le recrutement d'un complexe HAT, les proteines Mxd stimulent la desacetylation des histories par l'initiation de l'assemblage d'un complexe HDAC («histone deacetylase activity complex»). La desacetylation est possible suite au recrutement de la proteine mSin3 par le domaine SID («mSin3 Interacting Domain»), situe dans la portion N-terminale des proteines Mxd. L'assemblage subsequent du complexe proteique permet de reduire le taux d'acetylation des residus lysine des histones afin de favoriser le compactage de la chromatine. Ce complexe est stimule par la presence de l'heterodimere c-Mxd/Max au site E-box et permet de reprimer 1'expression de certains genes proliferatifs (AYER et
al, 1995 ; HEINZEL et ah, 1997 ; Figure 7).
1.3 Fonctions biologiques de l'homodimere Max/Max
La proteine Max est le pivot central de ce reseau de facteurs de transcription. II est indispensable aux mecanismes d'activation ou de repression de la transcription puisque l'heterodimerisation et/ou la liaison des heterodimeres aux sites E-box precedent l'ensemble des manifestations cellulaires obtenues par l'expression soutenue de c-Myc, des proteines Mxd ou de Mnt. Decouverte au debut des annees 1990 par le groupe d'Eisenman ((BLACKWOOD et EISENMAN, 1991) et issue de l'epissage alternatif du meme gene, elle se retrouve sous deux formes cellulaires distinctes, soit
27 p21 Max ou p22 Max. Outre la proteine Mix, Max est la seule proteine du reseau capable de Her les sequences E-box sous forme homodimerique. Bien que certaines evidences suggerent et soutiennent maintenant un role transitionnel possible a l'occupation des sites E-box par l'homodimere de Max (SOMMER et al, 1998), il semble que son role fondamental reside dans sa capacite a s'associer aux autres proteines du reseau. Le recrutement et la formation des complexes proteiques aux promoteurs des genes cibles, assures par les partenaires de Max, s'averent beaucoup plus efficaces pour affecter l'expression d'un gene que l'expression unique et l'occupation des sites E-box par l'homodimere Max.
Tout comme dans les cas avec c-Myc ou les proteines de la famille Mxd, le controle serre de l'expression et les modifications post-transcriptionnelles telles la phosphorylation par la caseine kinase II (BOUSSET et al, 1993 et 1994) et l'acetylation par p300 (FAIOLA et al, 2007) permettent egalement de reguler les fonctions de Max. L'expression de Max a longtemps ete considered comme non-regulee et ubiquitaire. Cependant, 1'augmentation de l'expression de Max a ete identified dernierement a la suite d'une stimulation au TGF-P (LE et al, 2005) et influencerait la differentiation des cellules epitheliales de l'intestin (MARIADASON et al, 2005). Cet agent cytostatique permet done de controler a la hausse l'expression des proteines Mxd et de Max et, par opposition, de controler a la baisse celle de c-Myc. C'est pourquoi il n'est pas rare que Pinitiation d'un foyer tumoral soit le resultat direct de l'incapacite d'une (de plusieurs) cellule(s) a repondre au stimulus du TGF-p.
1.4 Strategies pour inhiber efficacement les actions biologiques associees a la surexpression de c-Myc dans les cellules tumorales
Comme discute brievement dans les sections precedentes, la surexpression de la proteine Mxdl permet de reduire efficacement la croissance et la proliferation de certaines cellules cancereuses (GHERING et al., 2000 ; PULVERER et al, 2000 ; CERNI et al., 2002; HULTQUIST et al, 2004; YUN et al, 2007). Cependant, l'utilisation de ce type d'approche se limite seulement a antagoniser l'activation de la transcription associee a la surexpression de c-Myc. L'antagonisme des activites repressives associees au recrutement de Miz-1 par l'heterodimere c-Myc/Max, empechant la formation du complexe Miz-l/p300 necessaire a la transcription de genes cytostatiques essentiels a 1'arret de la croissance cellulaire (pi5, p21, Mxd4), est semble-t-il plus important que l'inhibition de l'activation de la transcription par c-Myc. En effet, l'utilisation d'inhibiteurs de HDAC permet de restreindre la croissance et la proliferation tumorale. Ceci a permis le developpement d'une nouvelle voie pharmacologique prometteuse pour le traitement du cancer (SECRIST et al, 2003 ; MOTTET et CASTRONOVO, 2007). II est a noter que l'utilisation des HDAC empeche, par la meme occasion, l'inhibition de la transcription par les antagonistes de c-Myc qui necessitent la formation d'un complexe reposant sur l'activite HDAC. De plus, une autre evidence similaire permet de douter de la necessite d'inhiber l'activation de la transcription par c-Myc dans un contexte tumoral. En effet, un isoforme de la proteine Mxd2 a ete identifie (Mxd2-WR) comme etant capable de permettre 1'arret de la croissance tumorale. Puisque cet isoforme se limite exclusivement aux domaines
b-29 HLH-LZ, il ne requiert pas Taction des HDAC qui ne peuvent pas etre recrutes en absence du domaine SID.
En accord avec ces nouvelles evidences, il serait tres interessant de concevoir un mutant de Mxdl qui puisse soit 1) homodimeriser et Her l'ADN sous forme homodimerique et/ou 2) heterodimeriser avec Max afin de reduire la formation des heterodimeres c-Myc/Max, necessaire aux deux actions biologiques attributes a c-Myc (Figure 8). L'utilisation d'un isoforme partiel, homodimerique ou heterodimerique, sans domaine SID, pourrait egalement etre envisage en co-therapie avec des inhibiteurs de HDAC. Afin d'assurer le developpement de nouveaux outils pharmacologiques plus efficaces, il est done primordial de comprendre et d'identifier les determinants structuraux qui empechent l'homodimerisation de la proteine Mxdl et ceux qui assurent la reconnaissance moleculaire avec Max.
31 2. RECONNAISSANCE MOLECULAIRE, HETERODIMERISATION ET
LIAISON A L'ADN : QUELS SONT LES DETERMINANTS STRUCTURAUX ?
L'heterodimerisation differentielle, entre les membres du reseau et Max, assure une partie de la reponse pro-proliferative ou antiproliferative en presence d'hormones de croissance ou de TGF-p\ Bien que les structures de l'homodimere murin de Max (FERRE D'AMARE et al. 1993), des heterodimeres Mxdl/Max, c-Myc/Max (NAIR & BURLEY, 2003) en complexe avec l'ADN ou d'un mutant homodimerique stable de Max sans ADN (MaxVL, SAUVE et al., 2004) aient ete resolues, plusieurs questions fondamentales sur les mecanismes de reconnaissance et d'association demeurent toujours sans reponses. Jusqu'a maintenant, il est logique de statuer sur le fait que l'instabilite des homodimeres de c-Myc ou de Mxd facilite l'heterodimerisation avec Max. Cependant les determinants structuraux responsables de cette destabilisation ainsi que ceux favorisant l'heterodimerisation ne sont toujours pas clairement identifies.
Au debut de cette etude, notre groupe de recherche avait propose que la destabilisation des homodimeres de c-Myc et de Mxd residait dans l'instabilite des LZ homodimeriques, causee par la presence des residus charges a l'interface de dimerisation (LAVIGNE et al., 1995). Qu'en est-il de l'implication des domaines HLH? Afin de mieux comprendre les mecanismes de reconnaissance moleculaire, il devenait imperatifd'identifier le(s) residu(s) responsable(s) de la destabilisation de l'homodimere de Mxdl et ceux qui favorisent 1'association avec Max.
2.1 Structure generate du motif b-HLH-LZ
Tous les membres de ce reseau de facteurs de transcription possedent minimalement la structure de base composee des domaines Basique-«Helice I-Loop-Helice II-Leucine Zipper» (b-HLH-LZ, Figure 1). Pendant que les structures HLH et LZ assurent la reconnaissance moleculaire et l'heterodimerisation, les structures monomeriques des domaines basiques, positionnes en N-terminal des autres domaines, permettent de discriminer parmi les sequences non-specifiques et specifiques (SAUVE
et al, 2006) aux promoteurs de genes cibles. De nombreuses etudes structurales
realisees par resonance magnetique nucleaire ou par diffraction des rayons X ont permis de resoudre les agencements tridimensionnels des differents domaines au sein des heterodimeres c-Myc/Max et Mxdl/Max (NAIR et BURLEY, 2003) en presence d'ADN ou des homodimeres de Max en absence d'ADN (FERRE D'AMARE et al, 1993, MaxVL : SAUVE et al., 2004). Pendant que les regions basiques assurent la liaison a l'ADN, la reconnaissance moleculaire principale est presentement associee a la dimerisation des LZ qui permettrait egalement d'augmenter la stabilite de la liaison a l'ADN. En effet, notre groupe de recherche a demontre que l'augmentation de la stabilite du LZ homodimerique, a l'aide d'un mutant de Max (MaxVL : N78V, H81L) permet egalement d'augmenter la liaison a l'ADN. Les details de la liaison specifique seront discutes dans la section 2.3. Neanmoins, la destabilisation importante causee par la presence de ces residus a l'interface du LZ de la proteine de type sauvage permet de destabiliser l'homodimere et de reduire sa liaison a l'ADN homodimerique (NAUD et
33 cette liaison. Ainsi, il serait tentant de supposer que 1'instability des LZ homodimeriques diminue la stabilite de la liaison a l'ADN par les homodimeres et favorise l'heterodimerisation, bien qu'aucune evidence en ce sens n'ait ete clairement reconnue pour les autres membres du reseau.
2.1.1 Regions HLH et LZ
Chacune des structures au sein d'un dimere provient du prolongement successif d'helices a. Ainsi, par exemple, les domaines HLH, constitues par l'agencement de quatre helices a antiparalleles, resultent de la continuite du domaine LZ du cote C-terminal et se prolongent vers la region basique du cote N-C-terminale pour rejoindre les regions basiques (Figure 1). Par consequence, il devient approprie de considerer que la structure de chacun de ces domaines pourrait influencer directement la stabilite du (des) domaine(s) adjacent(s). Plusieurs residus hydrophobes, conserves dans la region HLH et LZ, favorisent l'assemblage non-specifique des homo/heterodimeres et participent a la stabilite des especes generees (Figure 9). En effet, on note une diminution de la stabilite des dimeres lorsque les residus hydrophobes conserves sont mutes a l'interieur des helices HI et H2 des heterodimeres Myc/Max (DAVIS et HALAZONETIS, 1993). L'identification des determinants structuraux de reconnaissance specifique est encore incomplete ou seulement hypothetique.
2.1.2. Domaines basiques
35
Des etudes de deletion ou d'expression de certains domaines ont permis de verifier l'implication des domaines basiques de c-Myc dans la liaison a l'ADN (DANG
et al, 1989). Certains residus basiques conserves par les proteines de type b-HLH-LZ ou
b-HLH et permettant la liaison des E-Box ont ensuite ete identifies et rapportes par deux groupes de recherche (FISHER et GODING, 1992; LITTLEWOOD et EVAN, 1994). L'elucidation de la structure tridimensionnelle de l'homodimere murin de Max (FERRE D'AMARE et al, 1993) a permis de visualiser correctement pour la premiere fois l'agencement des domaines basiques. On retrouve done, de chaque cote des sequences palindromiques CACGTG, enfouis au creux du sillon majeur de l'ADN, les domaines monomeriques des regions basiques de chacune des proteines du dimere (Figure 1). La reconnaissance specifique sera discutee dans une section suivante.
2.2 Destabilisation des homodimeres et heterodimerisation avec Max
La destabilisation des homodimeres est un phenomene intrinseque a la reconnaissance avec Max. En effet, au debut de cette etude, nous emettions l'hypothese que certains determinants structuraux importants du HLH ou du LZ assuraient la dissociation des homodimeres afm de permettre la reconnaissance subsequente et l'heterodimerisation avec Max.
2.2.1 Determinants structuraux du LZ
Initialement, tres peu d'informations permettaient d'attribuer cette reconnaissance moleculaire a un ou quelques residus des regions HLH et/ou LZ. Le LZ est une super helice de pas gauche forme par l'enroulement de 2 helices a. On schematise generalement la dimerisation des regions LZ par les roues helicoi'dales qui permettent de visualiser rapidement la disposition des residus (HODGES et al, 1988). Les 2 roues representent le LZ de chacune des proteines du dimere, sous la forme d'une heptade dimerique numerotee abcdefg. L'attribution des lettres permet done de localiser 1'emplacement relatif de chacun des residus par rapport a 1'interface de dimerisation notee par les positions a et d. Les roues helicoi'dales comprennent done 7 positions differentes (de a-g, «'-g') et representent 2 tours d'helice complets (Figure 10). Nous remarquons aisement que la region dimerique, dans la portion C-terminale des LZ, se compose principalement d'interactions favorables de nature hydrophobe et implique majoritairement les residus leucine des positions d qui constituent le corps du LZ dimerique. Nous pouvons egalement remarquer que chacune des proteines qui s'associent avec Max possede un residu acide a la premiere position a, directement a 1'interface de dimerisation. Ce residu serait implique dans la destabilisation des homodimeres (LAVIGNE et al, 1995) et la charge portee serait principalement neutralisee par les residus Asn78" et His81rf de Max lors de la formation de l'heterodimere
(LAVIGNE et al. 1995 et 1998). En accord, la localisation relative de ces residus, observee a partir de la structure de l'heterodimere c-Myc/Max et Mxdl/Max en presence d'ADN realisee par NAIR et BURLEY (2003) a permis de confirmer cette
complementarite de charge qui permettrait la formation de ponts salins (His81rf) et de
ponts hydrogenes (Asn ) favorables a la stabilisation des heterodimeres.
2.2.2 Heterodimeres c-Myc/Max
Cette premiere hypothese concernant la formation favorable de ce pont salin par l'heterodimerisation de c-Myc et de Max a ete emise durant les travaux postdoctoraux du Dr. Lavigne (LAVIGNE et al, 1995; LAVIGNE et al, 1998). Grace a la determination par RMN de la structure du LZ de l'heterodimere c-Myc/Max, il a ete possible de demontrer que la charge partielle portee par l'histidine de Max permettait d'enfouir les charge acides des deux premieres positions a du LZ de c-Myc a l'interface du LZ heterodimerique (Figure 11). La figure 11 (b) illustre bien le positionnement des charges acides des positions Glu410" et Glu417fl, directement a l'interface, placees devant
l'His81rf de Max. La formation d'un pont salin entre le(s) residu(s) acide(s) et rHis81rf est
stabilised par la formation de ponts hydrogenes avec le residu Asn78" de Max. Le modele
« knobs-into-holes » (CRICK, 1953) presente en (c) represente l'entassement qui permet d'enfouir la charge portee par c-Myc. Dans ce modele, les bosses (knobs), formees par les chaines laterales des residus des positions a ou J d'un monomere s'inserent dans des trous (holes) formes par 4 residus de l'autre monomere. Pour une position d i, le trou est
forme par les residus a1 i-3, d i, e' i+1 et a' i+4. Pour une position a i, le trou est forme
par les residus d i-4, a' i, g' i-1 et d i+3 (O'SHEA et al., 1991; BOWIE, 1997; CHAREST et LAVIGNE, 2006).
defavorables sont indiquees par des fleches pleines. B) Modelisation de l'interface dimerique du LZ indiquant la complementarite de charge entre les residus acides de Myc et le residu histidine de Max. C) Enfouissement des charges negatives du LZ de c-Myc (rouge) dans un environnement majoritairement hydrophobe (jaune) rendu possible grace a la formation d'un pont salin avec la charge positive partielle (turquoise) portee par le residu H8U et les ponts H possibles avec le residus N78 de Max (LAVIGNE et
41 2.2.3 Homodimere de Max
L'homodimere de Max doit necessairement se dissocier afm de pouvoir heterodimeriser avec les differentes proteines du reseau. La charge partielle portee par le residu His81</ servirait selon toutes evidences a neutraliser les charges acides portees par
les partenaires dimeriques et a promouvoir la destabilisation des homodimeres de Max (ZHOU et al, 1994; NAUD et al. 2003). Les repulsions electrostatiques resultant de l'occupation de la position d par ce residu unique, directement a l'interface de dimerisation, permet de reduire considerablement la capacite de dimerisation de cette region a caractere hydrophobe (Figure 12). Les asparagines Asn78" et Asn92", reduisent
ou ne contribuent pas a augmenter l'hydrophobie globale de l'interface dimerique et seraient utiles afin d'eviter la formation d'oligomeres (O'SHEA et al, 1992; WAGSCHAL et al, 1999; residus en vert Figure 1 lc) et de dimeres tres stables comme il a ete demontre par exemple avec des mutations du LZ de GCN4 qui augmentent de maniere optimale l'hydrophobie du corps dimerique (DURR et al., 1999). La double mutation des residus N78V et H81L permet de diminuer efficacement la dissociation des homodimeres du b-HLHL-LZ de Max et augmente considerablement la liaison aux E-boxes in vitro (NAUD et al, 2003; MEIER-ANDREJSZKI et al, 2007). L'enfouissement des residus mutes est favorise par ces substitutions moleculaires et les problemes causes par la necessite de neutraliser les charges destabilisatrices a l'interface de l'homodimere sont aisement surmontes (Figure 12c). Ainsi, 1'augmentation de l'hydrophobicite a l'interface soutient favorablement l'homodimerisation de Max.
43 2.2.4 Heterodimeres Mxdl et Max
A partir des quelques donnees disponibles au debut de cette etude, nous pouvions tenter de predire les forces qui permettraient la destabilisation des homodimeres de Mxdl et qui favoriseraient la formation de l'heterodimere Mxdl/Max. La representation des roues helicoi'dales nous permettait de postuler que le residu acide conserve en position a du LZ permettrait raisonnablement de prevenir la formation de l'homodimere de Mxd (Figure 13) et/ou de favoriser l'heterodimerisation avec Max (Figure 14). En effet, dans le cas d'un homodimere, les residus Asp112" de Mxdl se
positionnent l'un en face de l'autre. La presence de charges negatives repulsives non solvatees pourraient suffire a destabiliser l'homodimere de LZ comme il avait ete possible de l'observer dans les cas de c-Myc et Max (LAVIGNE et al, 1995 & 1998; Figure 1 lb). Ceci constituait notre hypothese de depart. La mutation de ce residu, pour un residu neutre ou hydrophobe pourrait possiblement augmenter la formation de l'homodimere de LZ et faciliter sa liaison stable a l'ADN.
Au cours de 1'etude, les structures des b-HLH-LZ des heterodimeres c-Myc/Max et Mxdl/Max ont ete resolues par le groupe de NAIR et BURLEY (2003). Bien que ce detail fut totalement ignore par les auteurs, il est facile maintenant de constater que la charge acide presente a l'interface du monomere de LZ de Mxdl, en position 112a, est efficacement stabilised et enfouie entre les residus Asn et His de Max. De la meme maniere, les deux residus charges de c-Myc peuvent s'engager favorablement dans la formation de l'heterodimere de LZ avec Max, grace au soutient de l'His81rf et l'Asn78"
(Figure lib et lie; LAVIGNE et al, 1995), il devenait concevable que la charge de
Q 1 J
Mxdl pourrait possiblement etre neutralisee de la meme maniere par l'His01" et etre
efficacement enfouie a 1'interface de dimerisation du LZ.
Differentes repulsions electrostatiques, aux positions e ou g en peripherie de 1'interface, pourraient theoriquement contribuer a destabiliser les homodimeres et/ou soutenir la formation des heterodimeres. Cependant, bien que le role du residu Glu1 5g a
ete avance dans ce sens par le groupe de Nair (NAIR & BURLEY, 2003) durant ces travaux, il semble que cette hypothese demeure un peu etonnante puisque ce residu s'engage fort possiblement dans la formation d'un pont salin (i, i'+5) avec la Lys13(k lors
de la formation de l'homodimere de Mxdl et ne soutient pas du tout l'association avec Max. Effectivement, lors de la formation heterodimerique avec Max, la Glu125^ se
retrouve face au residu de meme charge soit la Glu 6e.
La destabilisation de l'homodimere par le residu D112« constituerait done l'avenue la plus prometteuse. Aucune information supplementaire n'etait disponible en ce qui concerne l'affinite des autres regions dimeriques (HLH). L'organisation hydrophobe de la region HLH pourrait a son tour permettre de favoriser ou de destabiliser les populations homodimeriques et/ou heterodimeriques. L'evaluation de ces nouveaux parametres de dimerisation differentielle devaient done etre egalement a 1'etude afin de lever le voile sur certains mecanismes essentiels de la reconnaissance et permettre 1'elucidation complete des determinants structuraux impliques dans la formation des heterodimeres Mxdl/Max.
2.3 Liaison a l'ADN
47
La reconnaissance et 1'occupation successive des heterodimeres aux memes sequences d'ADN, ont ete abondamment mises en evidence par des essais d'immuno-precipitation de la chromatine («ChIPs») a l'aide d'anticorps specifiques contre differentes proteines d'interet (NOZAKI et al, 1997; KYO et al., 2000). Ces etudes ont permis d'identifier differentes sequences consensus reconnues, sans toutefois permettre d'elucider completement les mecanismes de discrimination parmi les regions non-specifiques et non-specifiques. D'autres etudes ont demontre que les regions basiques de c-Myc et de Mxdl etaient fonctionnellement equivalentes (NIKIFOROV et al, 2003) bien que leur genes cibles ne sont pas identiques. Ainsi des mutants de c-Myc ou la region basique avait ete echangee avec celle de Mxdl conservaient les memes activites cellulaires et permettait de confirmer l'hypothese de la liaison commune a certains genes sans discrimination faite par les regions basiques.
Puisque l'affinite et l'echange aux regions E-box par les differents dimeres ne sont pas dus aux differences entre les domaines basiques de Mxd et de c-Myc (JAMES, L. et EISENMAN, R.N., 2002), certains groupes ont voulu evaluer l'affinite relative de chacun des heterodimeres pour une sequence donnee. II a ete determine que l'affinite de Mxd/Max, Max/Max et Myc/Max pour un E-box specifique est sensiblement equivalente dans les cellules COS7 ou les cellules HL-60 (SOMMER et al, 1998). Des modifications post-transcriptionnelles ont ete hypothetiquement proposees afin
d'expliquer les mecanismes de discrimination qui permettent de dieter le comportement de la liaison des E-Box par les differents dimeres presents.
La resolution de la structure de l'homodimere de la proteine Max humaine (BROWNLIE et al, 1997) a permis aux auteurs de suggerer qu'il soit possible d'obtenir des structures oligomeriques d'ordre plus eleves qui induiraient le repliement de l'ADN, comme il a ete possible de 1'observer sur le promoteur du gene ode (VERVOORTS et LUSHER, 1999). Cette structure favoriserait la liaison de 2 regions E-box successives, plus ou moins distantes sur un meme promoteur, par les heterodimeres ou l'homodimere de Max. L'interet suscite par cette proposition a donne lieu a un debat d'evidences contradictoires. Des groupes ont meme propose que cette structure en epingle unique, absente suite a la liaison par les homodimeres de Max ou de USF, serait suffisante pour discriminer parmi les differents hetero./homodimeres lies a un meme promoteur (WALHOUT et al, 1997). Recemment, notre groupe a egalement fait la demonstration, par microscopie a force atomique, que l'heterodimere Myc/Max pouvait lier avec autant d'affinite les 2 E-box du promoteur hTERT sans toutefois induire un repliement ou une boucle dans le promoteur en condition de dimerisation physiologique, bien qu'un tetramere obligatoire permet l'observation du phenomene propose (LEBEL et al, 2007). II semble done que la formation possible des oligomeres soit encore un sujet obscur puisqu'elle pourrait permettre d'influencer la liaison a l'ADN ou la reponse transcriptionnelle dans certains cas.
II est maintenant reconnu d'un point de vue structural que la liaison specifique a TADN par les facteurs de transcription de type b-HLH et b-HLH-LZ est semblable. La
49 formation du complexe ADN-proteine implique toujours l'homo- ou l'heterodimerisation des domaines HLH- LZ (LITTLEWOOD et EVAN, 1994; NAIR et BURLEY, 2006). La stabilite du complexe depend de l'enfouissement de la region basique de chaque monomere a l'interieur du sillon majeur de la sequence palindromique 5' CACGTG -3'. Les residus His28 (H28), Glu32 (E32) et Arg36 (R36) sont les residus qui forment les
interactions specifiques avec les bases azotees de l'ADN, autant pour l'homodimere de Max (FERRE-D'AMARE et al, 1993; BROWNLIE et al, 1997) que pour les heterodimeres c-Myc/Max et Mad/Max (NAIR et BURLEY, 2003; NAIR et BURLEY, 2006) tel qu'illustre a la Figure 15. Plus precisement, l'H28 forme une interaction avec le groupement carboxyle de la Guanine terminate. Le residu R36 forme une interaction avec la guanine centrale. Enfin, le groupement carboxylate d'E32 forme une interaction complexe et specifique avec la premiere Cytosine et l'Adenine (BROWNLIE et al, 1997). Certains residus de la «loop» participent egalement a la liaison de l'ADN. Par contre, ces derniers ne sont pas conserves et les interactions avec les groupements phosphate du squelette polypeptidique de l'ADN permettent de stabiliser la liaison, sans toutefois etre directement impliques dans la discrimination des sites de liaison specifiques.
La resolution de la structure du mutant MaxVL lie a l'ADN, realisee par notre laboratoire (SAUVE et al., 2006), a egalement permis de preciser le role du residu E32 dans la discrimination des sites de liaison. En effet, nous avons demontre que rhomodimerisation des domaines HLH-LZ induisait un repliement partiel des premiers residus du domaine basique, en absence d'ADN, qui permet la discrimination des
sequences non-specifiques et specifiques. Cette conformation favorise une preselection plus rapide qui permet 1'induction du repliement complet du domaine basique suite a la reconnaissance obligatoire de la signature CA des E-Box canoniques par le residu E32 situe au debut de l'helice de la region basique repliee par la dimerisation. Ce mecanisme se situe a mi-chemin entre le mecanisme conformational fit», represente par l'etape de preselection conformationnelle et les premieres interactions specifiques avec l'ADN, et le mecanisme «induced fit», represente par le repliement ulterieur et consequent a une preselection favorable par E32. L'etape de preselection permet d'eviter la necessite de replier et de deplier la region basique a chaque site de liaison non-specifique.
Une autre etude a alimente une toute nouvelle polemique concernant les mecanismes de liaison des E-Box. En effet, le groupe de Goss a tente d'evaluer in vitro, par anisotropic de fluorescence, l'affinite relative des dimeres Myc/Max, Mxd/Max et Max/Max pour des sequences d'ADN (HU et ah, 2005). Les auteurs ont demontre que la vitesse de liaison d'un monomere pour l'ADN etait tres favorable en comparaison avec la liaison d'un dimere; appuyant la possibilite d'un mecanisme de liaison appele le « monomer pathway », ou l'assemblage d'un heterodimere survient suite a la liaison successive de 2 monomeres sur l'ADN, en opposition avec le « dimer pathway » qui represente la liaison de l'ADN par un dimere pre-assemble. A partir d'un monomere du b-HLH-LZ de Max lie a l'ADN, en utilisant de tres faibles concentrations de Max, les auteurs ont demontre que l'heterodimerisation avec le b-HLH-LZ de c-Myc ou la proteine complete Mxdl etait defavorisee par rapport a l'homodimerisation de la proteine Max. Neanmoins, l'affinite pour le deuxieme monomere est reduite
