MJTAGmŒ:SE DIRIGEE
ru
SITE AC!'IFDE LA PROTEINASE .AIDO\TIRALE HCJmINE DE Tn'E 2: EXPREl>SIΠET ANALYSE DE L 'AC!'IVI'l'E DE TROIS KJ'l'1\NTS
par
Martin Bourbonnière
département de microbiologie
Mémoire présenté à la faculté de médecine en vue de 1 'obtention du grade de
rraître ès sciences (M.Sc.)
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Là où je cesse de comprendre ... Je commence à m'émerveiller ...
Albert Einstein avril 1954.
A tous ceux qui ont cru en moi il y a deux ans.
i Table des natières
Table des ne.tières. . . i
Liste des figtlr'esi. . . iii
Liste des tableaux... iv
Liste des abréviations. . . v
R~t.lllé. . . vi i Introduction A - Généralités . . . • . . . 1 B - Projet... 9 Matériel et méthodes A - Manipulation de virus 1 - Infection virale... 14 2 - Purification de virus. . . 14 3 - Préparation de substrat. . . 15
4 - Purification d'ADN viral ... 15
B - Manipulation de l 'ADN 5 - Enzymes de restriction et de rrodi.fication de l'ADN. 16 Bactéries et vecteurs. . . 16
Purification d'un fragment d'ADN à partir 6 -7
-8 9 -10 -11 -d'un gel d'agarose ... 16Préparation de cellules ccmpétentes et transformation d'ADN double brin ...•.. 17
Sélection des clones recanbinants par hybridation .. 17
Préparation d'une sonde d'ADN double brin ... 18
Préparation de plasmides ou de formes réplicatives... 18
C - Mutagénèse 12 - 01 igonucl éotides. . . • . . . • . . • . . . • . . . 19
13 - Phosphorilation et marquage des oligonucléotides ... 20
14 - Fabrication d'un stock de phage et préparation d'ADN simple drin ...•... 20
15 - Hybridation des oligonucléotides et synthèse du brin complémentaire ... 21
17 - Séquençage. . . 22
D - Expression 18 - Système d'expression. . . 22
19 - Induction de l'expression ... 23.
20 - Marquage in vivo des protéines induites ... 23
21 - Test d'activité... 24
22 - Transfert de protéines et iodination ... 24
23 - Détermination du pic d'induction ... 25
Résultats A - Mutagénèse... . . . 26
B - Développement et caractérisaton du vecteur d'expression ... 32
C - Activité des mutants de la protéinase ... 40
Discussion. . . 45
Raœrcienelts. . . 56
Bibliographie. . . 58
iii
Liste des f iqures
1 - Le site actif de la chym:itrypsine... 8
2 - Carte génétique du plasmide d'expression pRIT2T •...•... 10
3 - Corrq;>araison des séquences en acides aminés de protéinases adénovirales hurraines ... 12
4 - Méthode de mutagénèse à deux amorces ... 28
5 - Séquençage des trois mutants de la protéinase d'Ad2 ... 30
6 - Cadre de lecture ouvert de la protéinase d'Ad2 •.•••... 31
7 - Création du nouveau vecteur d'expresion pLID1 et stratégie de clonage de la protéinase virale ... 34
8 - Début de la séquence en acides aminés de la protéinase recanbinante. . . 37
9 - Marquage court des protéines induites à partir de différents vecteurs.. . . • . . • . . . 38
10 - Graphiques de la détermination des pics d'induction .•... 39
11 - Transfert sur nitrocellulose de protéines induites hybridé avec un sérum anti-protéinase ... 41
12 - Test d'activité des diverses protéinases recanbinantes .•... 43
13 - Corrq;>araison des séquences en acides aminés de toutes 1 es protéinases adénovirales connues à ce jour ... 51
Liste des tableaux
1 - Protéinases virales... 4 2 - Résumé des éléments de la mutagénèse ... 33
A: Ad: ADN: lIDNc: ARN: ARN-rn: ATP: BAV: BSA: C: CPE: CPM: DFP: llŒM: dNTP: D.O.: OTT:
EDTA:
Fe: g: G: HIV: IgG: IPI'G:k:
kb: kd: LB: LBA: rrCi: MCS: ng: Adénine AdénovirusListe des abréviations
Acide déoxyribonucléique 1IDN canplémentaire Acide ribonucléique ARN messager Adénosine triphosphate Adénovirus bovin
Albumine sérique de boeuf Cytosine
Effet cytopathique Canptes par minute Diisopropylfluorure
Milieu Eagle mxlifié par Dulbecco Déoxyribonucléotides triphosphates Densité optique
Dithiothréitol
Ethylènediarnine tétraacétate
Fragment cristallisable d'une irmrunoglobuline Unité de force centrifuge
Guanine
Virus de l'inrmmodéficience hurraine Irmrunoglobuline de classe G Isopropyl-B-thio-galactoside Kilodalton Kilobase Kilodalton Milieu Luria-Bertani
Milieu Luria-Bertani supplémenté d'arrq;>icilline Millicurie
Site de clonage multiple (multiple cloning site) Milligranme
ml: Millilitre
nm: Millimètre
rrM: Millirnolaire
MOI: Multiplicité d'infection (multiplicity of infection) NEM: N-éthylmaléimide
ng: Nanogramne
nm:
NananètrenM: Nanaoolaire
PAGE-SOS: Electrophorèse de gel de polyacrylami.de-sulfate dodécyl de sodium pb: PCMB: PEG: PEU: J;:M: PMSF: pTP: P/V: RPM:
sœ:
SDS: T: TE: TP: TPCK: ts:u:
X-Gal: µCi: µg: µl: Paire de bases p-chlor~rcuribenzoate Polyéthylène glycolUnité de formation de plage (Plaque forming tmits) Picaoolaire
Phénylméthylsulfonylfluorure
Précurseur de la protéine terminale liée à l'ADN Poids/volume
Révolutions par minute Site de clonage multiple sulfate dodécyl de sodium Thymine
Tampon Tris-HCl 10 rrM, EDTA 1 rrM, pH 8,0 Protéine terminale (Terminal protein)
L-1-Tosylami.ne-2-phényléthylchloranéthylcétone Thenoosensible Unité 5-brcmo-4-chloro-3-indolyl-B-galactoside Microcurie Microgramne Microlitre
Trois mutants de 1 a protéinase d 'Ad2 ont été créés par mutagénèse dirigée. Les mutations effectuées tiennent carpte du sous-groupe respectif de chaque acide aminé: l'histidine 54 a été remplacée par une arginine (H54R), l'aspartate 102 par une glutamate (Dl02E) et la sérine 160 par une glycine (Sl60G). Dans le but de vérifier leur activité suite à la mutagénèse, les mutants ont été introduits dans un nouveau vecteur d'expression. La mise au point d'un vecteur permettant la production d'une protéine le plus près possible de la protéinase d'Ad2 était nécessaire si la caractérisation de cette enzyme voulait être poussée plus avant. Le vecteur pRIT2T, déjà utilisé pour produire une protéine fusion entre la protéine A de Staphylococcus aureus et la protéinase d 'Ad2 (Houde et Weber, 1990), a été modifié par une délétion du gène de la protéine A pour donner naissance au vecteur "tronqué" pLAM. Ce nouveau vecteur produit jusqu'à 3, 25 fois pl us de protéines et ce en deux fois moins de temps. Un système canbinant les deux vecteurs permet d'envisager la purification de la plupart des protéines et la production rapide d'anticorps dirigés contre celles-ci. Donc des trois mutants de la protéinase exprimés avec le nouveau vecteur , seul H54R est incapable de cliver les protéines précurseures de Ad2tsl. Ces résultats ccmbinés à de
nouvelles études (Webster et al., 1989a, cai et al., 1990a, 1990b) nous amènent à proposer que la protéinase d'Ad2, jusqu'alors classée cœrne une sérine protéinase de type chymotrypsine (Bhatti et Weber, 1979a), serait une cystéine protéinase de type chymotrypsine, un intermédiaire évolutif entre les cystéine et les sérine protéinases classiques(Bazan et Fletterick, 1988).
~ - GEltmALI'l'ES
Lorsque l'on mentionne le terme protéinase, les rôles généralement associés à celles-ci sont assez limités. On pense d'abord à la dégradation des protéines dans le système digestif par des enzymes carme la trypsine, la chymotrysine et la pepsine. La facilité d'accès de ces enzymes a fait qu'elles ont été parmi les premières à être étudiées en profondeur, d'où la grande quantité d'infomation disponible à leur sujet.
En opposition à cette dégradation, la présence de protéolyse limitée dans
des cellules (Holzer et Heinrich, 1980, Bond et Butler, 1987) a permis de mettre en évidence d'autres rôles des protéinases; la participation à des fonctions de régulation carme par exenple la coagulation sanguine, l'activation du canplément , la fertilisation et la production d'hoIIOOiles
(Kay et Dunn, 1990). Un autre rôle très important associé aux protéinases, dans ce cas-ci les "signal peptidases", est le clivage du "peptide signal" des protéines inq>ortées dans le réticulum endoplasmique lors de la traduction (Damel 1 et al. , 1990) . Les protéinases sont des molécules retrouvées chez tous les organismes vivants en passant par les bactéries jusqu'à l 'hcmœ. Toutes ces enzymes, qui ont pour rôles d'hydrolyser des liens peptidiques, ont pu être classées dans quatre grandes familles selon la canposition de leurs sites actifs: les aspartate protéinases, 1 es métal 1 o-protéinases, 1 es cystéine protéinases et 1 es sérine protéinases.
2
Examinons brièvement le site actif des deux classes de protéinase les mieux connues: les cystéine et les sérine protéinases dont l'acide aminé du centre réactionnel ne diffère que par tm seul atane; tm atane de soufre chez la cystéine qui est rerrplacé par un oxygène chez la sérine.
Ces deux classes de protéinases sont présentes dans les différents cœpartiments d'une cellule et certaines d'entre elles peuvent être excrétées. C'est le cas de la trypsine, tme des sérine protéinases les mieux connues, retrouvées dans le système digestif des vertébrés. Les acides aminés irrpliqués dans le site actif de cette enzyme sont l'histidine 57, l 'aspartate 102 et la sérine 195 (numérotation de la chymotrypsine pour des raisons historiques) (Sprang et al., 1987). Pour ce qui est des cystéine protéinases, la première caractérisée a été la papaïne, l.me enzyme isolée à partir du fruit d' tm arbre, 1 e Corica papaya. Le site actif de la papaïne est cœposé par la cystéine 25, l'histidine 159 et 1 'asparagine 17 5 (Dufour, 1988) . Ces deux cl asses de protéinases, bien que partageant le même type de mécanisme d'hydrolyse à cause des acides aminés ccrrposants leur site actif, diffèrent dans la disposition de ceux-ci dans la protéine. Ces deux types de disposition suggèrent, malgré leurs ressemblances, tme évolution différente pour les cystéine et les sérine protéinases.
L'avènement de techniques de plus en plus perforrrantes en biologie moléculaire a permis l'étude de ccrrposantes jusqu'alors peu connues. La virologie rooléculaire a joué un rôle irrportant dans cet élan technologique. En effet, lors de la caractérisation du géncme de plusieurs virus, la présence de protéinases virales spécifiques, jouant
un rôle clef dans le processus de maturation, a pu être mise en évidence (revues: Krausslich et Wimœr, 1988, Wellink et van Kamnen, 1988, Kay et
Dunn, 1990). La protéolyse contrôlée de polypeptides précurseurs est un événement majeur dans 1 e processus de production de protéines biologiquement actives. La réplication de plusieurs virus dépend du clivage de ces protéines précurseures. Ce type de maturation est surtout retrouvé chez des virus à ARN +, i.e. dont le génane a la même polarité que l'.ARN-m, et chez les rétrovirus. Ils produisent une polyprotéine, clivée par une protéinase encodée par le virus, libérant ainsi les protéines de structure et autres protéines responsables de la réplication.
Ces deux groupes de virus sont présentement les mieux connus en ce qui
concerne les protéinases virales (cf. tableau 1). On retrouve, chez le
premier, des virus de plantes ( caoovirus, potyvirus) aussi bien que des virus d'animaux (picomavirus, etc ... ). Les virus à ARN
+
codent généralement pour des cystéine protéinases à 1 'exception des togavirus quiencodent une sérine protéinase. Pour ce qui est des rétrovirus, ils codent tous pour des aspartate protéinases (HIV, caulimovirus, etc ... ). La protéolyse limitée requiert quel 'enzyme soit spécifique dans le choix de ses substrats. Cette spécificité est un avantage car ainsi le virus dépend rroins de 1 'hôte. Par contre, ce même avantage fait des protéinases virales une cible de choix pour l'éventuelle synthèse d'inhibiteurs (Dreyer et al., 1989). La protéolyse spécifique ne se limite pas seulement aux polyprotéines, mais aussi aux protéines précurseures. Ces protéines sont produites sous formes inmatures, puis la protéinase du virus en question les transforme en protéines matures par un ou plusieurs clivages que ce soit à l'extrémité N- ou C-terminale. Un ex~le de ce
Protéinases virales
Virus Genetie Name/ Proteinase
material protein type
Adeno DNA Adeno 23K serine
Toga RNA Sindbis nsP2 senne
(Alpha) RNA Semliki forest senne (Pesti) RNA Bovine Viral
Diarrhoea serine Flayi RNA Yellow Fever NS3 serine?
Pi corna RNA Polio 2A cysteine
(Entero/ RNA Rhino 2A cysteine
Rhino) RNA Polio 3C cysteine
RNA Rhino 3C cysteine
RNA Hepatitis A 3C cysteine
(Cardio) RNA EMCV3C cysteine
(Aphtho) RNA FMDV LProtein cysteine?
FMDV 3C cysteine
Corno RNA Cowpea Mosaic 24K cysteine Poty RNA Tobacco Etch Nia cysteine RNA Plum Pox Nia cysteine
Retro RNA HIV-1 PR aspartic
RNA HIV-2 PR aspartic
RNA MoMLV PR aspartic
RNA HTLV-1 PR aspartic
RNA BLVPR aspartic
RNA RSVPR aspartic
RNA MAY PR as partie
Caulimo DNA Cauliflower Mosaic as partie? Hepadna DNA Hepatitis B aspartic?
tableau 1. Listes de protéinases virales les mieux caractérisées. Tiré de Kay et Dunn, 1990.
type de protéinases est celle d'adénovirus, le seul virus à ADN dont la protéinase a été bien caractérisée. Ce nouveau type de clivage nous fait réaliser cœment 1 'amiprésence des protéinases est importante et canbien elle contribue au rraintien de l'hanéostasie de divers organismes.
Les adénovirus sont des virus non-enveloppés de forme icosahédrique contenant tm ADN double brin dont 1 a tai 11 e peut varier entre 30 000 et
36 000 paires de bases (pb) (Green et al., 1967, Van der Eb et al., 1969). Ces virus causent des infections des voies respiratoires supérieures, du système digestif et des yeux, selon les sérotypes. Certains sérotypes humains peuvent mener à 1 'appari tian de tumeurs chez des souris nues, et tous possèdent le potentiel d'imnortaliser des cellules en culture (Horwitz, 1985), d'où l'intérêt envers les adénovirus carme m:xièle d'étude du cancer. Les adénovirus sont classés en sept sous-groupes selon quatre critères: leurs groupes. d'hérraglutination, leurs sérotypes, leurs potentiels oncogéniques et leurs pourcentages de G+C. On retrouve aux
extrémités 5' de chaque molécule d 'ADN encapsidée tme protéine de 55 kilodaltons (kd), liées de manière covalente, ncrcmée protéine terminale et (TP) irrq;>liquée dans la réplication. L'expression des gènes du virus à l'intérieur d'tme cellule est divisée en deux phases séparées par la réplication du génc:me viral: précoce et tardive. Les deux brins du géncme d'adénovirus dolUlent naissance à des transcrits (Tooze, 1981).
Les virions produits suite à une infection doivent passer par une étape de maturation avant d'atteindre leur plein pouvoir infectieux. Cette rraturation a lieu lorsque le virus est assemblé et est effectuée par
6
tme protéinase, encodée par le virus, qui est encapsidée avec le génane. Chez adénovirus type 2 humain (Ad2), cette protéinase clive cinq protéines précurseures: . deux protéines de 1 a capside, PVI en VI et PVI II en VIII; trois protéines associées à 1 'ADN, PVII en VII, 87kd (pTP) en 55kd (TP) et llkd en X(µ) (Walter et Maizel, 1974; Weber, 1976; Weber et al., 1977; Lishwe et St.mg, 1977; Challberg et al., 1980; Lewis et Mathews, 1980; Stillrran et al., 1981; Weber et Anderson, 1988; Anderson et al., 1989). Son activité a été détectée dans des virions matures et des noyaux de cellules infectées (Bhatti et Weber, 1979b). Il a aussi été dém:mtré que la protéinase est associée à la matrice nucléaire et à la chrorratine virale (Everitt et Ingelrran, 1984, Khittoo et al., 1986). La protéinase d'Ad2 semble reconnaître tme séquence d'acides aminés bien précise en ce
qui concerne ses sites de clivage: M(L)XGX\G et M(L)XGG\X, où \ indique le site de clivage (Webster et al. 1989b). De plus, ce groupe prédit la présence de nouveaux si tes de clivage jusqu'alors non soupçonnée dans des protéines de Ad2 (hexon, penton, 52kd, 2lkd, 14,Skd et D-172).
La protéinase d 'Ad2 à été cataloguée ccmne étant tme sérine protéinase de type chyrootrysine (Bhatti et Weber, 1979a). Ces conclusions ont été tirées à partir d'tme caractérisation partielle de l'enzyme qui
nous roontre qu'elle est inhibée par le phénylméthylsulfonylfluorure (PMSF), le L-l-tosylarnine-2-phényléthylchloranéthylcétone (TPCK) et le diisopropylfluorophosphate (DFP). Ce profil d'inhibition est caractéristique des sérines protéinases de type chymotrypsine. La présence d' éthy 1 ènediarnine tétraacétate (EDTA) n'a auctm effet sur
1978, Tremblay et al., 1983). Le site actif des sérines protéinases est ccmposé de trois acides aminés: une histidine, une aspartate et une sérine. La figure 1 nous montre le site actif de la chyrootrypsine: ses trois acides aminés forment un système de transfert d'électrons qui pennet
à la sérine de devenir le centre réactionnel de l'enzyme.
La mise en évidence d'une protéinase chez un virus de la taille d'Ad.2 n'est pas une tâche facile. Ceci a pu être accQ"!Pli grâce à la découverte d'un mutant therioosensible de Ad2 nœmé H2Tsl ou Ad.2tsl (Bégin et Weber, 1975). A la tarq;>érature permissive, ce mutant se ccmporte de la même manière que le virus de type sauvage. Par contre, à 39lc, certaines protéines virales ont des poids moléculaires plus élevés que chez le type sauvage. Ces protéines sont PVI, PVII, PVIII, 87kd et llkd. De plus, les virions produits à la tarq;>érature restrictive ne sont pas infectieux (Weber, 1976). Toutes ces observations permirent de soupçonner la présence d'une enzyme responsable du clivage de certaines protéines inpliquées dans la maturation tardive des virions. Le cadre de lecture ouvert responsable du phénotype de Ad.2tsl se trouve dans 1 'uni té de transcription tardive L3, codant pour trois protéines (PVI, hexon et 23kd), et est si tué entre 1 es cooordonnées 60, 0 et 61, 7. Pl us précisément, la mutation de transition change un C en T à la position 61,1 de 23kd (Yeh-Kai et al., 1983) qui se traduit chez la protéine par le changement d'une proline en une leucine. Ce cadre de lecture de 612 nucléotides est depuis lors désigné cc:mne codant pour la protéinase adénovirale.
figure 1. Site actif de la chyrrntrypsine. Ces trois acides amines de
1 'enzyme forment lll1 système de transfert de charges qui permet
à la sérine de devenir le centre réactionnel de l'enzyme. Tirée de Molecular biology of the cell,
t
édition, 1989,~ - PROJET
La preuve que la gène de 23kd codait bien pour la protéinase d'Ad2 nous a été fournie par Houde (1990) . L 'ADNc du gène de 23kd a été introduit dans tm. vecteur faisant partie d'tm. système d'expression inductible. Ce système utilise le pranoteur droit du bactériophage lambda
qui est incapable de promouvoir la transcription en présence du répresseur
cr+.
En utilisant tm.e bactérie qui produit le répresseur thenoosensibleC.I857, il nous est possible d'induire à volonté la synthèse protéique. Le
choix d 'tm. système de ce type s'est avéré nécessaire vue la toxicité, pour 1 es bactéries, de 1 a protéinase produite consti tuti vement (Houde et Weber,
1990) . Le vecteur pRIT2T (fig. 2) pennet de produire une protéine fusion avec la protéine A de Staphylococcus aureus qui a la capacité de fixer la partie Fe des anticorps hurrains. En utilisant tme colonne d'immmo-affinité, il est possible, à partir d'un lysat de bactéries induites, de purifier la protéine de fusion grâce à 1 'extrémité protéine A (Nilsson et al. , 1985). La protéine ainsi purifiée peut servir à la production d'anticorps spécifiques à la deuxième partie de la protéine de fusion (Lowenadler et al., 1986). Les conclusions des travaux de Houde (1990)
sont , entre autres, que la protéinase produite dans ~. coli est capable
de reconnaitre les protéines précurseures de Ad2tsl et de les cliver correctement. La validité du système utilisé a penn:i.s d'envisager de nouvelles expériences.
figure 2.
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CCG GGG AAT TCC CGG GGA TCC GTC GAC CTG CAO
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pBR322 orl Hae 11 (0.10) Prot•ln A (:ue-110:11 pUCI Pol1'Unk1r Ptoteln A (1150·1120) Pro11tn A l'•noncodtnQCarte génétique du plasmide d'expression pRIT2T {lamlxia Pe:
praooteur droit du bactériophage lambda; T: signaux de temri.naison de la transcription dans les trois cadre de
Le site actif de la protéinase d'Ad2 est soupçonné être semblable à celui de la chyrootrypsine selon son profil d'inhibition. L'tm des outils les plus efficaces pour identifier les cœiposantes d'tm site actif est la rnutagénèse dirigée. Elle utilise de oligonucléotides, carplémentaires à tme région donnée, qui carporte tm mauvais appariement, habituellement au centre de 1 'oligonucléotide, qui lors de la réplication du vecteur utilisé, changera tm nucléotide créant ainsi la mutation
désirée. Pour sélectionner les acides aminés à changer, nous avons aligné toutes les séquences connues de protéinases adénovirales hurraines (fig. 3). Nous avons sélectionné les acides aminés selon trois critères: d'abord leurs positions dans la protéine carparativement au modèle (ch:ymotrypsine; HIS 57, ASP 102 et SER 195}, leurs conservations parmi tous les sérotypes connus et le profil d'hydrophobicité théorique de la protéinase d'Ad2. Les acides aminés suivants ont été sélectionnés: HIS
54, ASP 102 et SER 160 pour la mutagénèse. Ces acides aminés seront remplacés par d'autre faisant partie des mêmes sous-groupes (radical chargé, non-chargé, etc ... ). L'histidine 54 sera r~lacée par tme
arginine, 1 'aspartate 102 par tme glutamate et la sérine 160 par tme glycine. La mutagénèse se fera sur le gène viral à l'aide du vecteur
Ml3~18, CCIIT(parativement aux travaux précédents qui utilisaient l 'ADNc
(Houde et Weber, 1990). Les mutants seront exprimés avec le système inductible déjà utilisé, sauf que la portion protéine A sera délétée du vecteur original . Toute ces modifications de 1 'enzyme ont pour but d'inactiver la protéinase pour démontrer que les acides aminés touchés sont essentiels à son bon fonctionnement. De plus, la protéinase mutante de Ad2tsl sera exprimée dans le même système pour constater si l'absence
Ad2 Ad3 Ad4 Adl2 Ad40 Ad41 GE CGSGl^S A A G£ qEQEipjMjlREl GS G£ G£ SEQEl SEQEl slEQElJVkllARD 10 M VRD LGCC ^ivRELGCC LGCCi
S EQEl K M VKD LGC^FLGTtYlDKRFPGI^S PHKLAIgAI VNTAGRETGG S|EQEl|K|MjVRD LGCG F fFLGl F DKRFPGF MAPDKLA GAI VNTAGRETGG
[LGCG F TFTjGI F DKRFPGF MAPHKVA GAIVNTAGRETGG
F YFLGlF DKRFPGF VSRDRl^ GAIVNTAGRETGG F VELGIF DKRFPGF MAPHKIj^ GAIVNTAGRETGG
stYFLGIlFbKRFPGFlMAPNKLAbAIVNTAGRETGG
* ** 20 30 40 50 Ad2 Ad3 Ad4 AdI2 Ad40 Ad4I Ad5 VHVMAEPWlIa FG*JNFlRYlïrCYLFlDWNF|RSK|rCYLFjE
EHV VHV VHV
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PFGFSE G RUCC V IfQFEYE S PFGFSE E RLKÇ I !fQFEYE
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L LIRRSA GjLlRRSA G LIRRSA LIRRSA I L L LAlA SSPDRCI TK TK TK AWNFKNBrCYLFDPFGFSE|ElRIJCq(l|YQFEYE}GtLI^SA|L (AjSTPlCfrfc
[LAbNmSFfrCYLFtotPFGFSEiEiRLKaifyQFEYiGLlRfesAE [^TFfflç
H ** ** * * * * * 60 70 80 90 100 * ILEi< ILEK CjVIW K qVILEK ILK ILVK * Ad2 Ad3 Ad4 AdI2 n Ad40' Ad4I Ad2tsl SIG SI siqr SIGI Sitjr sfgtcrvrvgrcg IIO VQ VQ VQ VQ tVQQPN SAAC GLFCCMFTi] A FAN WF QT PP DE NPTFM
PR SAAC GLFCCMFLE A FVE UF DR PP DG NPTP K L FSAACS T ACA OT TPPDKNPTPNL PF SAAC GLFCCMFLE A FTH JF DH PM DK NPTP D PF SAAC GLFCCMFIii A FVN »F TS PN ER NPTP D
PF|SAACjGLFCCMFLFiA}FIEjwiFSNpPEO^PTP^
L * * * * 130 140 150 LL V 120 EGVPSS fPGV ijirGV TGV EGVSSSJFl IGVPNGIIG FSG^IG PSStt FNS^l ^LN * * 160 Ad2 Ad3 Ad4 Adl2 Ad40 Ad4I QVQF riRRNC QVQF TlRRNCEVLGtRFINTHS QV QVVF IIRENC QMEIGllRIm * 170 EF TIRRNC EÇLGi QV VG II QR NC NE L^ K FI NSL S SFIERHS EALGiRFINSHSA ERLGiRFIAQRS ERORiEPQli 180 FYF SYF YF PYF FYFQIR FYF H KRH SAQ flRSjAÏSlF|CHLKNM RARIERAI AFDRPID MQ RARIEKAI A FDRM NQDM ttlRERjljEKKljs FIKMQNGUC CERI KK)AI]A}F|DQMKNNM RERIgEK^aA0DQMKNAQVLFHNKI FY * 190 200figure 3. Ccupcuraison des séquences en acides andnés de protéineises
adénovirales humsdnes. Elles ont été alignées manuellement
afin d'obtenir le maximum d'hcmolcjgie. Les séquences
conservées sont encadrées et les changements conservatifs scxit indiqués par une étoile. La numérotation correspond aux acides aminés Ad2. Les séquences de Ad5 et d'Ad2tsl différent de celle de Ad2 par m seul résidu aux positions 63 (Ad5) et
137 (tsl). Les triangles noirs indiquent la triade catalique
de clivage chez les virions produits à terrq;:>érature restrictive est due à
tm défaut d'encapsidation de la protéinase et/ou à l'incapacité de l'enzyme à cliver les précurseurs.
14
MATERIEL ET MJmlODES
A - .MANIPULATICli DE VIRUS
1 - Infection virale
Des cellules de type HEp-2 (Moore et al., 1955) sont cultivées
dans
des plats de pétri de 100 mn contenant du milieu Eagle modifié par Dulbecco (IMEM) (Dulbecco et Freerran, 1959) supplérœnté avec 10% de sérum de veau. Les cellules sont infectées lorsqu'elles atteignent une confluence de 90% à 95%, avec une multiplicité d'infection (MOI) de 10 unités de formation de plage (PFU, PLAQUE FORMING UNIT). Par la suite, la concentration de sérum dans le rMEM a été abaissée à 2,5%.2 - Purification du virus
Les cellules infectées sont incubées à
39lc
pendant 44 heures. Une fois récoltées, elles sont lysées par 6 cycles de congélation-décongéla-tion. Les particules virales présentes dans le surnageant sont concen-trées sur gradient de chlorure de césium préformé (1,2-1,5 g/ml) par une centrifugation à 35 000 REM pendant 1,5 heure àifc
(Weber, 1976; Khittoo et Weber, 1977). La bande virale, correspondant à une densité de 1,345g/ml, est récoltée par aspiration, déposée sur tme solution de CsCl (1,4 g/ml) et centrifugée à 27 000 RPM pendant 18 heures à ~C. Les particules virales sont ensuite dialysées contre le tampon TE lX à 4'C.
3 - Préparation du substrat
Des cellules HEp-2 sont infectées, tel que décrit ci-haut, avec tm rrutant thermosensible de Adénovirus Type 2 (Ad2tsl). Après 20 heures d'incubation à 39°C, de la méthionine-[35s] (Amersham) a été ajoutée à
raison de 100 µCi/ml pendant 3 heures. Sui te au marquage, 8 ml de rMEM sont ajoutés à chaque plat de pétri et l'incubation se poursuit à 39°C jusqu'à la 44è heure. Les virions ont été purifiés sur tm gradient de CsCl, puis les capsides ont été éclatées par tm traitement à la pyridine 10% pendant 30 minutes. Une dernière dialyse contre du TE lX est nécessaire avant d'obtenir le substrat radioactif.
4 - Purification d'ADN viral
Les virions purifiés sont incubés à
3-fc
pendant 1 heure dans tm tampon Tris-HCl 10 rrM pH 7,5, KCl 15 rrM, et sulfate dodécyl de sodium (SDS) 0 ,5% P/V contenant 500 µg/ml de protéinase K (Sigrre). L'ADN est extrait 2 fois avec du phénol, saturé avec du Tris-HCl 100 rrM pH 7,5, 2 fois avec du chloroforme-isoarnylalcool (24:1).16 B - Ml\NIPULATION DE L 'Aœ
5 - Enzymes de restriction et de modification de l'ADN
Les enzymes de restriction et de modification de 1 'ADN, achetées chez Pharrna.cia et Arnersharn, ont été utilisées tel que recannandé par leur fabricant.
6 - Bactéries et vecteurs
Le vecteur d'expression pRIT2T ainsi que les bactéries, ~ coli .j.
N99CI'et N4830, nécessaires respectivement au clonage et à l'expression, proviennent de Pharrna.cia. Les formes réplicati ves des bactériophages M13mpl8 et M13mpl9, servant pour la nn.ltagénèse et le séquençage, ainsi que
leur bactérie-hôte, ,E. coli TGl, ont été achetées chez Amersharn.
7 - Purification d'tm fragrren.t d'ADN à partir d'un gel d'aqarose
Sui te à tme digestion de 1 'ADN avec tme enzyme de restriction et migration sur gel d'agarose 0,8%, le morceau d'agarose contenant la bande désirée est découpé à l'aide d'tm scalpel. L'ADN est extrait avec le sys-tème "GENE CLEAN" vendu par la carpagnie BIO 101 INC. Ce système utilise des billes de verre pour purifier l'ADN.
8 - Préparation de cellules ccmpétentes et transfonnation d'ADN
Fait selon un protocole non-publié à notre connaissance provenant de 1 'Irrperial Research Cancer Fund ( IRCF), cambridge (cf. annexe). L'étalement de bactéries transfonnées par les· fonnes réplicatives du phage Ml3 nécessite 1 a préparation de 3 ml d'agar mou pour chaque pétri . A chacun de ces tubes fondus au micro-onde et tenpérés à 45°C sont ajoutés, si nécessaire, 10 µl d'isopropyl B-thio-galactoside (IPl'G) 10 rrM, 40 µl de 5-brano-4-chloro-3 indolyl-B-galactoside (X-Gal) 2% (P/V), 200 µl de ~. coli TGl en phase logarithmique de croissance et 40 µl de bactéries venant de subir le choc thermique. Les tubes sont bien mélangés puis vidés rapidement sur pétri. Une fois 1 'agarose de surface solidifié, les pétris sont incubés à
3-fc
pendant la nuit.9 - Sélection des clones recanbinants par hybridation
La stratégie de clonage utilisée pour insérer la protéinase dans le vecteur d'expression nécessite tme ligation de bouts francs. De plus, il a été évalué que les
E.
coli N99CI+, utilisées dans le système d'expres-sion, sont environ 500 fois moins canpétentes que les J;. coli DH5. Donc pour faciliter la sélection des bons recanbinants, la technique d'hybrida-tion, se servant de l'insert cornne sonde, a été utilisée. Suite à la transfonnation des N99cr+, chaque colonie est ensemencée dans 1 ml de milieu LB arrpicilline (LBA), 50 µg/ml, et incubée 16 heures à 37°C. Vingt microlitres (20 µl) de chaque culture sont déposés sur un filtre de nylon,18 imbibé de 6X SSC, monté sur un appareil MINIFOLD I (dot blot). Les puits sont ensuite lavés avec 200 µl de 6X SSC. Le filtre est retiré de l'appareil et déposé 3 minutes, les bactéries vers le haut, sur un papier
Whatman 3MM imbibé de SDS 10%. Ensui te 1 e fi 1 tre est déposé 5 minutes sur un Whatman 3MM imbibé d'une solution dénaturante (0,5 N NaOH, 1,5 M NaCl), puis déposé 5 minutes sur un Whatman 3MM imbibé d'une solution neutrali-sante (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl pH 7.4) et finalement déposé 5 minutes sur un Whatman 3MM imbibé de 6X
ssc.
Le filtre est ensuite placé àscfc
pendant 2 heures puis préhybridé et hybridé avec la sonde requise.10 - Préparation d'une sonde d'ADN double brin
Le système de marquage à aioorces nn.Il tiples a été utilisé pour rendre
1 'ADN radioactif. Ce système est vendu par Arnersham sous le nan de ''MULTIPRIME DNA LABELLING SYSTEM" et a été utilisé tel que reccmnandé.
11 - Préparation de plasmides ou de formes réplicatives
La méthode de lyse alcaline a été utilisée pour la mini-préparation de plasmide et de formes réplicatives (Maniatis et al. 1982), avec certaines modifications. Les 5 ml de bactéries sont centrifugées et utilisés pour la lyse plutôt que 1,5 ml et l'étape d'extraction au phénol/chloroforme est r~lacée par tm.e extraction au phénol suivie d'une
extraction au chloroforme. Pour la préparation à grande échelle, les plasmides ont été aJTPlifiés avec du chloranmphénicol et extrait par lyse alcaline (Maniatis et al., 1982).
c-~
12 - Oligonucléotides
Les oligonucléotides #910 à #914 ont été synthétisés dans le laboratoire du Dr. Ken Deugau à Kingston et les oligonucléotides JWl et
JW2, dans le laboratoire du Dr. Bourgaux à Sherbrooke.
Oligonucléotides de séquence et position en nucléotide:
JWl 5'-ACCCGAGAGTGTACA-3' 187 - 202 JW2 5'-AGCATGTI'TTTGAGC-3' #911 5'-TAGTCCACAGGCGGC-3' #912 5'-CGAGTGGCGCTCCAG-3' 662 - 677 357 - 372 531 - 546
Oligonucléotides de rnutagénèse et position en nucléotide:
#910 5'-CATCCAGCGTACGCC-3' 153 - 168 #913 5'-Cl'GGGGACCGTTAAG-3' 477 - 492 #914 5'-TACAGCGCTCGGGGG-3' 298 - 313
20 13 - Phosphorylation et marquage des oligonucléotides
Deux cents picaooles (200 pM) d'oligonucléotides ont été diluées dans un tanpon 0,1 M Tris-HCl pH 8,0, lOrrM MgC12, lOrrM DT!' et 10 rrM ATP. La T4 polynucléotide kinase (4,5 U) a été ajoutée et le volwne final était de 30 µl. Le tout a été incubé à
3i'c,
pendant 45 minutes, puis transféré à 65°C pendant 10 minutes. Pour 1 e marquage de 1 'extrémité 5' , vingt picanoles (20 i;t-1) d'oligonucléotides ont été utilisées et l'ATP a été renplacée par du "tf"-ATP-[32P] (Amersham), à raison de 2 µCi/pM d'oligonucléotides. La réaction a eu lieu dans un volwne final de 20µ1.14 - Fabrication d'un stock de phage et préparation d'ADN simple brin
Une colonie de ~. coli TGl provenant d'un plat de pétri de milieu minirrn.nn (M9) est ensemencé dans 5 ml de LB, et incubé à
31Jc
toute une nuit. La culture est ensui te di 1 uée 100 fois dans 2 ml de LB, mise en présence d'une plage piquée à l'aide d'une pipette Pasteur et incubée 1 heure à 37°c. Huit (8) ml de LB sont ajoutés et l'incubation peut se poursuivre pendant un minirrn.nn de 6 heures. La culture est ensui te centrifugée 15 minutes à 3 000 RPM. Le surnageant, contenant le phage, est conservé à 4°c. Pour la préparation de 1 'ADN sirrple brin, les phages ont été précipités avec 20% de polyéthylène glycol (PEG), resuspendus dans 500µ1 de TE et lysés avec un voltnne de phénol. Deux traitements avec un voltnne de chlorofonne ont servi à éliminer les traces de phénol, puis l'ADN a été précipité avec de l'éthanol.15 - Hybridation des oligonucléotides et synthèse du brin cc:mplémentaire Une picaoole (1 pM) d'ADN s~le brin contenant le gène de la
protéinase d'Ad2 ont été diluée dans un tarrpon 20 rrM Tris-Hel pH 7,5, 10 rrM MgC12, 50 rrM NaCl et 1 rrM
u:rr.
Vingt (20) pM de l'oligonucléotide de mutagénèse phosphorylé et 20 pM de l'anX>rce universelle, nonphosphory-lée, du phage Ml3, sont ajoutées pour donner un volume final de 10 µl. Le tout est incubé à 60°c pendant 10 minutes et refroidi 10 minutes à la
t~érature de la pièce. Puis un volume de 10 µl, contenant 2,5 U de
Klenow, 10 U de ligase, 0,4 rrM dNTP et 1 rrM ATP, est ajouté à la réaction
d'hybridation et incubé pour la nuit à 16°c.
16 - Sélection des mutants
Deux (2) µl du stock de phages sont déposés sur un filtre de nylon, imbibé de 6X SSC, monté sur un appareil MINIFOLD I. Le filtre est ensuite
séché 2 heures à
ac:Jlc
et préhybridé 1 heure à61c
avec une solution de6X SSC, lOX Denhart et 0, 2% SDS. Le filtre est lavé avec 50 ml de 6X SSC 1 minute et hybridé dans 4 ml de
?X
SSC et lOX Denhart contenant la sonde oligonucléotidique (5 x 106 cprn), pendant une heure à 25°c. Le filtre est par la suite lavé 3 fois avec 50 ml de 6X SSC pour un total de 10 minutes et séché 15 minutes à la t~érature de la pièce. La stringence estaugmentée par une élévation graduelle de la t~érature en lavant 1 minute
avec du 6X SSC. Après chaque lavage, le filtre a été exposé pour
22 17 - Séquence
La séquence de l 'ADN des mutants et du plasmide p!AM a été déterminée avec le système de la T7 polyrnérase, vendu par Pharmacia, utilisant la méthode des didéoxynucléotides (Sanger et al., 1977). Les réactions de séquence ont été déposées sur un gel de polyacrylamide de 6% ayant une épaisseur de 0,2 rrM, le tout monté sur un appareil MACROPHOR 2010 (LKB). Les conditions utilisées pour la migration sont celles suggérées par le fabricant.
D - EXPRE$IOO'
18 - Système d'expression
Le premier vecteur d'expression utilisé est pRIT2T (Pharmacia). Ce vecteur possède le promoteur droit du bactériophage lambda situé en amont du gène de la protéine A. Un site de clonage multiple permet d'insérer entre le gène de la protéine A et des signaux de terminaison de la trans-cription, tm gène quelconque, dans notre cas celui de la protéinase d'Ad2,
de manière à produire, lors de 1 'induction, une protéine fusion. Le deuxième vecteur utilisé est p!AM, un dérivé de pRIT2T, dans lequel la protéine A a été délétée, rapprochant ainsi le promoteur du site de clonage multiple. L'activité des mutants a été testée avec ce dernier. L'utilisation du promoteur droit de lambda nous pennet d'induire à volonté
1 'expression de protéines. En effet, la production constitutive de protéinases est toxique pour la bactérie. D'abord, la sélection des plasmides reccmbinants se fait dans les E_. coli N99CI+ qui produisent de rranière constitutive le répresseur cr+, se fixant au praooteur, bloquant ainsi toute transcription.
19 - Induction de l'expression
Pour induire l'expression de protéines, les plasmides reccmbinants ont été introduits dans E. coli N4830, produisant tll1 répresseur
thennosen-sibl e,
cr857.
Une colonie est prélevée d 'lllle gélose rraintenue à 30°c, ensemencée dans 10 ml de LBA et incubée à 30<\::! jusqu'à 1 'obtention d' tllleD.o.
600 de 0,5. Les cultures sont ensuite incubées à 42°c, ce qui inactive le répresseur, pendant 2 heures dans le cas des plasmides reccmbinants dérivés de pLAM, ou 4 heures dans le cas de ceux dérivés de pRIT2T.20 - Marquage in vivo des protéines indu_i te_ê_
Dans la but de visualiser les protéines nouvellement produites, tllle induction est faite en présence de rnéthionine-[35s] (Arnersham). L' induc-tion a lieu dans 2 ml de LBA pendant 30 minutes, puis la méthionine-[35s]
est ajoutée à raison de 100 µCi/ml de culture. L'induction se poursuit pour tll1 autre 30 minutes. Les bactéries sont recueillies par centrifu
rrM pH 8, 1 et resuspendues dans 200 µl de TE.
24 Quarante ( 40) µl de bactéries ont été mis en présence d'un tampon de lyse (Tris-Hel 50 nM pH
6,8, SDS 1%, B-rnercaptoéthanol lrrM, glycérol 10%), bouillis 3 minutes et déposés sur gel de polyacrylamide-SDS (SDS-PAGE) (Maizel, 1969). Après électrophorèse (200 volts pendant 2 heures), le gel a été séché et mis en présence d'un film X-œAT RP (KODAK).
21 - Test d'activité
Les bactéries induites, d'une culture de 10 ml, sont recueillies et
1 avées, carme décrit précédemnent, et resuspendues dans 200 µl de TE. Elles ont subi alors deux cycles de congélation-décongélation, suivi de 3 sonications de 15 secondes. Les débris cellulaires ont été déposés par centrifugation et le surnageant a été conservé. Vingt (20) µl du lysat a été mis en présence de 105 CPM de Ad2tsl-[35s] (substrat) et incubé pendant 16 heures à 37°c. Le tout a été déposé sur un gel de polyacrylami-de-SDS et les résultats ont été visualisés par autoradiographie.
22 - Transfert de protéines et iodination
Après une migration sur gel de SDS-PAGE, les protéines sont trans-férées sur filtre de nitrocellulose (Hybond C d'Amersharn) par le système d'électro-transfert polyblot de la CC!Tq?agnie ABN tel que décrit par le fabricant. La préhybridation, l'hybridation et le lavage des filtres sont
décrits par Towbin et al. (1979) sauf que nous avons utilisé le sénun d'albumine de boeuf au lieu du lait en poudre cc:mne agent bloquant. L' iodination de 1 'anticorps ou de la protéine A avec :Z5I par la méthode à
la chlorarnine Ta été décrite par McConahey et Dixon (1980).
23 - Détennination du pic d'induction
Des bactéries induites, contenant un plasmide recombinant produisant la protéinase adénovirale, sont recueilies à toutes les heures pendant 6 heures. Elles sont lavées et lysées cœme décrit précédemnent, puis déposées sur un filtre de nitrocellulose monté sur un appareil MINIFOLD I. Le filtre est ensui te mis en présence d'anticorps radioactifs; dans
le cas des plasmides dérivés de pRIT2T, des IgG cœmerciaux (SIGiA) iodinés-[1251] sont utilisés, tandis que pour les plasmides dérivés de pl.AM, on utilise d'abord des anticorps spécifiques à la protéinase adénovirale, puis dans une seconde étape, de la protéine A iodinés-['.25 r]. L'intensi-té des points, suite à une exposition, est mesurée à l'aide d'tm densitanètre.
26
RESULTATS
La protéinase d'adénovirus type 2 a été cataloguée, selon son profil d'inhibition, carme étant une sérine protéinase de type chymotrypsine (Bhatti et Weber, 1979a). Considérant ces inforrrations, le site actif suggéré de la protéinase d 'Ad.2 serait CClli>OSé d'une triade d'acides aminés; une histidine à la position 57, une aspartate à la position 102 et i.me sérine à la position 195 (nanenclature de la chyrootrypsine). La Jmltagénèse dirigée est i.m outil de choix pour déterminer 1 'in;?ortance de différents résidus dans le rôle d'i.me protéine. Après avoir cOOi)aré les différentes séquences en acides aminés de protéinases de sérotypes hurrains d'adénovirus i.e. Ad2, Ad3, Ad.4, Ad5, Adl2, Ad40, et Ad.41, notre choix s'est arrêté sur trois acides aminés conservés chez tous 1 es sérotypes;
l'histidine 54, l 'aspartate 102 et la sérine 160 (nanenclature de la protéinase d 'Ad2: c. f. figure 3) . Le but de 1 a Jmltagénèse dirigée est donc de r~lacer les acides aminés du site actif par des acides aminés
incapables de catalyser l'hydrolyse de liens peptidiques.
A - MUTAGEM'SE
Jusqu'à présent, le gène de la protéinase d'Ad.2 cloné à partir de l 'ADNc avait été utilisé dans les expériences i~liquant une protéinase
recombinante (Houde et Weber, 1990). Cette fois, les expériences de mutagénèse dirigée ~liqueront directement le gène viral de la protéinase
d'Ad.2 pour éviter les erreurs qui auraient pu se glisser lors de sa synthèse de 1 'ADNc. Le fragment HincII J de 1382 pb, des nucléotides 21 453 à 22 835 du génane de Ad.2, contenant le cadre de lecture ouvert de la protéinase, a été inséré dans le site de clonage multiple de la forme réplicative du bactériophage M13np18 (vecteur de mutagénèse et de séquençage) au site HincII. Suite à tme transformation, les plages blanches (système X-GAL/IPI'G) ont été piquées. Des bactéries, infectées par les virus présents dans ces plages, ont été recueillies et les formes réplicatives isolées par minipréparation d'ADN. L'orientation des inserts a été déterminée par tme digestion avec BglII, vérifiée par séquençage et le clone utilisé pour la mutagénèse a été nœmé M13npl8Ad2HcJ.
Une fois la bonne orientation déterminée, i.e. celle carq;>lérrentaire aux oligonucléotides préalablement synthétisés, le bactériophage recanbinant a été arrplifié et l 'ADN sinple brin isolé. La méthode des deux amorces a été utilisée pour synthétiser le brin cooplérnentaire (fig. 4). Cette technique utilise deux oligonucléotides: tm de mutagénèse dont
1 'extrémité 5' a préalablement été phosphorylée et tm second, appelé amorce tmi verse! 1 e, qui est non phosphory 1 é. L'amorce tmi vers el 1 e hybride avec l'ADN sinple brin en amont de l'oligonucléotide de mutagénèse. Une polymérisation partielle avec de la Klenow est faite in vitro en présence de ligase. Des bactéries sont transfonnées de rranière à ce que la polymérisation se termine in vivo. La Klenow ne possède pas, ou très peu, d'activité exonucléasique s•-.3•, donc l'oligonucléotide deirn.ltagénèse ne sera pas déplacé par la polymérase et la ligase liera 1 'extension de l'amorce mriverselle à l'extrémité 5' phosphate de l'oligonucléotide de
phosphorylated 5' P mutagenic ~ oligonucleotide ( ( 3'
!
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3' nonphosphorylated ~ u~iversal sequencing \ \ primer 5' OHsingle-stranded bacteriophage M13 template
DNA polymerase four dNTPs DNA ligase Transfect E. coli 0 0 0 0 0 0 0 0
Screen bacteriophage M13 plaques by hybridization, using radioiabeled mutagenic oligonucleot1de as a probe
figure 4. Méthode de Irutagénèse dirigée à deux aroorces telle que décrite par Maniatis et al., 2e édition, 1989, p.15.58
mutagénèse. Par contre in vivo, 1 'ADN polymérase I de ~- coli possède
l'activité exonucléasique 5'+ 3' qui peut déplacer une dizaine de nucléotides avant qu'il y ait ligation (Maniatis 1990). Le rôle de 1 'amorce universelle est de protéger 1 'oligonucléotide de nru.tagénèse contre l'activité exonucléasique 5'+3' de l'ADN polymérase I lors d'une polymérisation inc~lète.
Des bactéries sont infectées avec les phages résultant de la
transformation et incubées pendant 16 heures à 37°c. Les cellules sont centrifugées et une partie du surnageant, contenant les phages, est déposée sur un filtre de nylon. L'oligonucléotide de nru.tagénèse, marqué en 5' au 32P, nous sert de sonde pour sélectionner 1 es nru.tants. L'hybridation entre l'oligonucléotide et le nru.tant est parfaite et donc résiste à une température de lavage plus élevée que l'hybride entre l'oligonucléotide et le type sauvage, où il y a mauvais appariercent d'une paire de base. Les nru.tants sont sélectionnés en lavant le filtre à des tercpératures de plus en plus élevées. Après chaque lavage, le filtre est mis en présence d'un film et exposé. La présence d'un contrôle de type sauvage sur le filtre nous indique que la stringence est suffisamnent élevée lorsque qu'il ne donne plus de signal sur l'autoradiogranme.
L'ADN sinple brin est isolé des phages roontrant toujours un signal à stringence élevée. Dans le but de vérifier les mutations, l'ADN des phages a été séquencé (fig. 5). Quatre amorces synthétiques disposées à
intervalle régulier ont permis de séquencer rapidercent tout le gène de la protéinase virale (fig. 6). Il est à noter que le brin codant de la
~
mutant
wt
A
c
G
T
A
c
G
T
/
c 3' c }..
G-
.,._ 1 c--
A-
T G c---i>-
-
•---T
G A c....
c-
T
'l
~
A-·
...._
CS,...
::::
-
L. ...
b
mutent Wl ~ mldi!Dl Wl Ac
G c---o(> figure 5. T Ac
G T--
Ac
G T-
-
Ac
G-
T ~G3'-....
/ G 3 '-
-
-
A A T3
..
-
T G G •+----T Gc
c
T-
A G +----G...
G G--
G&
-
-
G T A es'c
A ---~ T5,-
--
-Séquences irontrant les mutations résultant de la mutagénèse dirigée. A gauche, indiquée par un triangle ouvert, on
observe la nutation tandis qu'à droite de chaque figure
(a:H54R;
b:Dl02E et c:Sl60G) la séquencede
la protéinase de type sauvage est indiquée. Le nucléotide qui a été roodifiéest indiqué par un triangle fetmé. Il est à noter que les séquences lues directement sur ces autoradiogramœs correspondent au brin carplémentaire du brin codant et vont de 1 a fin de 1 a protéinase au début (de bas en haut) .
010 ~m~m~~~w~w~mmwmm~m~m M G S S E Q G L K A I V K D L G C G P 020 030 mmm~~m~~~m~~mm~~~~~~ Y F L G T Y D K R F P G F V S P H K L A 040 050 ~~mmmm~~~~~~~mŒ~~~m~ C A I V N T A G R E T G G V H W M A F A
ow
o~ m~==mwm~m~m~~m~mTCTmw~ W N P R S K T C Y L F E P F G F S D Q R 080 090 ~~~mm™m~m~m~~~~~~m~TCT K Q V Y Q F E Y E S L L R R S A I A S L 100 110 m=m~mmm~w~~~™~~~~=wm S P D R C I T L E K S T Q S V Q G P N S 120 130 ~~m~mm~~mm~Œ~m~m~=™~ A A C G L F C C M F L H A F A N W P Q T ill l~ =mm~m=~~mmm~~m=mmmmw P M D H N P T M N L I T G V P N S M L N ~O DO ~=™m™~~~~~Œ™™™~m~m~~ S P Q V Q P T L R R N Q E Q L Y S F L E l~ l~CGC CAC TCG CCC TAC TTC ~ AGC CAC AGT GCG CAG A'l"l' AGG AGC GCC ACT TCT TTT TGT
R H S P Y F R S H S A Q I R S A T S F C 200
CAC TTG AAA AAC ATG TAA aaataatgtactag-3'
H L K N M .
figure 6. Séquence en nucléotides et en acides aminés du cadre de lecture ouvert de la protéinase d'Ad2.
32
protéinase est celui qui est encapsidé dans le phage. La séquence qui est 1 ue directement sur 1 'autoradiograrrrne correspond au brin non-codant, partant de la fin de la protéinase vers le début (de bas en haut). La figure S nous montre, à droite, les séquences du type sauvage, et à gauche les bases qui ont été changées chez les mutants. La figure Sa montre une mutation d'un T en C sur le brin non-codant, donc d'un A en G sur le brin codant, qui se traduit dans la protéine par le changement de l'histidine S4 (CAC) en une arginine (CGC). Pour ce qui est de la figure Sb, une guanine (G) est remplacée par une cytosine (C), se traduisant sur le brin codant par le remplacement d'une cytosine (C) par une guanine (G). Ce mutant lorsqu'exprirné aura à la position 102 une glutamate (GAG) au lieu d'une aspartate (GAC). Finalement la dernière ITR.ltation remplace un T par un C, substituant sur le brin codant un A par un G. Dans la protéine, la sérine 160 (AGT) sera remplacée par une glycine (GGT). Le tableau 2
résume les éléments de la mutagénèse.
B - DF.:VELOPPEMmT ET CARACTERISATIOO OO VECTEUR D'EXPRESSIOO
L'ADN complémentaire de la protéinase d'Ad2 a été exprimé sous fonne de protéine fusion à l'aide du vecteur pRIT2T (Houde et Weber 1990). En gardant en tête les avantages du système utilisant pRIT2T (cf. matériels et méthodes D-18) nous avons modifié ce vecteur de manière à éliminer le gène de la protéine A (fig. 7). Une double digestion EcoRI-HindIII, suivie d'un traitement à la Klenow en présence de nucléotides, pennet d'obtenir des bouts francs. Une ligation circularise le nouveau vecteur,
oligonucléotides: séquences #910 S'catccagcgtacgcc 3' #914 S'tacagcgctcggggg 3' #913 S'ctggggaccgttaag 3' positions(pb) rôles 153 - 168 mutagénèse 298 - 313 mutagénèse 477 - 492 mutagénèse positions(A.A.) mutations: avant/après 54 HIS/ARG 102 ASP/GLU 160 SER/GLY
tableau 2. Résumé des divers éléments de mutagénèse dirigée découlant de l'utilisation des sept différentes amorces: i.e. numéros, séquences, positions, rôles et mutations.
Pr PROTA T 1-éooR 1-Hh:l Il 2-Klenow Smal pAtT2T 4.2i<b AMPICILUN
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He PROTEINASE 1 pl.AM a5Kb AMPIC1WN SmalPr PROTA PROlEI T Pr ROTEINAS T
pAPAD<W 5.:J<b AMPICIWN
figure 7.
AMPICIWN
Délétion de la protéine A du vecteur pRIT2T pour donner le vecteur tronqué pLAM . Une double digestion EcoRI-HindIII élimine la protéine A, le traitement à la Klenow rend les extrémités franches permettant ainsi une ligation. La stratégie de clonage de la protéinase virale dans ces deux vecteurs est identique. Le fragment HincI I J d' Ad2 est digéré par PvuII tandis que les plasmides sont ouverts par SmaI. Le tout subit une ligation pour donner les plasmides pRPAD2W et pLPV. P~: promoteur droit du bactériophage lambda; T: signaux de terminaison de la transcription dans les trois cadres de
appelé pLAM (Lambda protein A Modified). Cette opération élimine 753 paires de bases (251 a.a.) du gène de la protéine A, rapprochant ainsi le SCM du prcrnoteur, tout en gardant inchangé le cadre de lecture. Les douze premiers acides aminés du vecteur original sont conservés. Le site de restriction EcoRI est le premier du SCM de pRIT2T et Sma.I le second. La délétion élimine le site EcoRI mais doit laisser intact le site SmaI ce qui nous permettra plus tard d'introduire le gène de la protéinase dans pLAM. Après ligation, les ADN recombinants ont été sélectionnés par une digestion avec Sma.I. Les plasmides montrant une délétion d'environ 750 pb par rapport au vecteur original , donc une tai 11 e de 3. 5 kb, ont été séquencés pour vérifier que le cadre de lecture escal"\Pté soit respecté.
Pour optimiser le nouveau système utilisant le vecteur tronqué, nous avons introduit le gène de la protéinase virale dans pLAM et pRIT2T, et comparé certains paramètres d'expression. La forme réplicative du phage M13rrq;>l8Ad2HcJ est digérée par les enzymes PvuII et HincII, libérant un fragment de 1066 pb. Le résultat de la digestion est déposé sur gel préparatif d'agarose 0,8% et la bande correspondant au bon poids moléculaire est éluée du gel. Les plasmides pLAM et pRIT2T sont digérés avec Sma.I. Le fragment de 1066 est introduit dans le site Sma.I donnant respectivement les plasmides pLPV et pRPAD2W. L'orientation détenninée par une digestion avec BglII, donne des fragments, pour pLPV de 4387 et 187 pb et pour pP..PAD2W de 4387 et 940 pb (résultats non montrés).
Dans le cas de pLPV, la protéine produite aura les douze premiers acides aminés de la protéine CRO et trois acides aminés résultant du
36 clonage, avant de rencontrer le premier acide aminé (méthionine) de la protéinase virale (fig. 8). La nouvelle protéine sera donc une petite protéine de fusion de 219 acides aminés dont seulement les 15 premiers seront étrangers à la protéinase d'Ad2.
Pour vérifier que le nouveau vecteur produit bien une protéine, nous avons procédé à un rrarquage court (pulse). De la méthionine-[35s] a été ajoutée à des cultures de bactéries N4830 contenant les plasmides pLAM, pLPV, pRIT2T et pRPAD2W, 30 minutes après le début du choc thermique à
4ic.
La figure9
nous montre un autoradiogranme des protéines totales des bactéries induites. Dans la piste b (pLPV) apparaît une nouvelle protéine d'environ 23 kilodaltons (kd), la protéinase, qui est absente de la piste c (pLAM). Les bandes des pistes d et e correspondent respectivement à la grande protéine de fusion de 55 kd (pRPAD2W) et à la protéine A. de 32kd (pRIT2T). A 1 'aide de cet autoradiograrrrne nous avons estimé par densi tanétrie une expression de 3. 25 fois pl us élevée de protéinase pour pLPV comparativement à pRPAD2W. L' estirration de 1 a différence d'expression entre 1 es deux vecteurs a été effectuée en se référant à une bande conmune dans les deux essais pour standardiser la quantité totale de protéines dans chaque piste. Elle tient compte du nombre de méthionine présente dans chaque protéine, dix (10) pour la grande protéine de fusion (pRPAD2W) et huit (8) pour la petite (pLPV). La comparaison des courbes d'induction, déterminée à l'aide d'anticorps dirigés contre les produits des vecteurs, nous montre un pic, deux heures après 1 e début du choc thermique pour pLPV, et quatre heures pour pRPAD2W (fig. 10) .MET-GLU-GLN-ARG-ILE-THR-LEU-LYS-GLU-ALA-ASN-SER-PRO-ALA-ALA-MET- ... ATG GAA CAA CGC ATA ACC CTG AAA GAA GCT AAT TCC CCT GCC GCC ATG ..•
figure 8. Séquences en acides anunes et en nucléotides du début de la protéinase reccrnbinante créée lors del 'insertion du gène dans
le plasmide pl.AM pour donner pLPV. Les douze premiers résidus proviennent de la protéine Cra de lambda et les trois suivants résultent du clonage. I 1 y a donc production d'une petite
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figure 9. Marquage à la méthionine-[35s] des protéines induites à partir de différents vecteurs. Les extraits bactériens induits à 42°C pendant 30 minutes et marqués à la rnéthionine-[35s] pendant 30 minutes, sotmri.s à une électrophorèse (PAGE-SDS) sont comparés Les protéines supplémentaires sonti;ndiquées par une flèche. Les protéines du virion de Ad2-[ S] sont utilisées comne marqueur de poids moléculaire (piste a).
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0 w 2 0 0 2 3 4 5 8HEURES
pRPAD2W
0 2 3 4 5HEURES
figure 10. Graphiques représentant les pics d'induction des vecteurs utilisés (pLPV et pRPAD2W) pour produire la protéinase adénovirale. Des bactéries induites ont été recueillies toutes les heures pendant six heures, déposées sur llll filtre de nitrocellulose et hybridées avec des anticorps radioactifs. Une densitcrnétrie (450nrn) a été faite sur l'autoradiogramne. Le pic de chaque plasmide a été fixé arbitrairement à 10. Les essais ont été effectués en triplicata et les valeurs extrêmes pour chaque heure sont indiquées sur les graphiques.
40 En parallèle, des anticorps radioactifs de lapin (125r), dirigés contre la grande protéine de fusion, capables de reconnaître la petite protéine de fusion, nous ont permis de vérifier 1 'authenticité de la protéine produite par le vecteur tronqué. Ces anticorps avaient été testé sur le virus et nous révélaient une protéine de 23 kd ("western blot": résultats non montrés). La figure 11 représente un autoradiogranme de protéines transférées sur filtre de nitrocellullose qui a été mis en présence d'anticorps anti-protéinase. Les protéines ont été révélées à l'aide de la protéine A-[125r]. La piste b montre un extrait cellulaire de bactéries N4830 induites deux heures, contenant le plasmide pLAM et la piste c 1 e plasmide pLPV . Les pistes d, e, f et g représentent 1 es autres plasmides utilisés dans mes travaux contenant quatre protéinases mutantes dont celle de Ad2tsl. L'apparition d'une nouvelle bande de 23 kd dans les pistes c, d, e, f et g nous indique que la protéine produite par les vecteurs de la famille de pLPV sont reconnues par les anticorps anti-protéinase.
C - ACTIVITE DES MO'l_'ANTS DE LA PROTEINASE
La mise au point d'un nouveau vecteur d'expression permet de se servir d'un test simple et rapide ne nécessitant aucune purification pour vérifier l'activité des mutants. Un extrait cellulaire contenant la protéinase peut cliver les précurseurs présents dans les virions éclatés de Ad2tsl (Bhatti et Weber 1979a). Suite à la mutagénèse, les différentes protéinases mutantes sont sous-clonées dans le vecteur pLAM de la même
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f gfigure 11. Transfert sur filtre de nitrocellulose de protéines provenant de bactéries induites mis en présence d'un sérun contenant des anticorps dirigés contre la protéine de fusion de 55kd ("western blet") . Les protéines ont été révélées par autoradiographie suite à la formation du carplexe entre les anticorps et la protéine A-[ 1251] . L • appari tian d'une nouvelle protéine d'environ 23 kd dans les pistes c, d , e, f et g nous m::mtre que les vecteurs de la famille pLPV produisen~ bien la
protéinase d' Ad.2 . Les protéines du virion Ad2-( S] sont utilisées carme marqueur de poids moléculaire (piste a).
42 rranière que la protéinase de type sauvage lors de la mise au point du vecteur d'expression. Les nouveaux clones sont nomnés ccmne suit: pLPV-H54R, pLPV-Dl02E et pLPV-Sl60G, où la première lettre après le tiret correspond à l'acide aminé du type sauvage, le chiffre à la position de 1 'acide aminé et la dernière lettre au nouvel acide aminé du mutant. Par exemple, dans le mutant pLPV-H54R, 1 'histidine a été remplacée à la position 54 de la protéine par une arginine. En plus, pour vérifier
l'activité de la protéinase mutante de Ad2tsl, nous avons introduit le gène dans pLAM de la même rranière que ci-haut, donnant naissance à pLPV-Tsl. La protéinase de Ad2tsl a une mutation à la position 137 changeant une praline en leucine (Pl37L).
Une fois les bons clones sélectionnés, une culture en phase exponentiel 1 e ( 30°c) est induite à 42°c pendant deux heures, lysée et mise en présence de substrat radioactif (Ad2tsl) pendant 16 heures puis déposée sur gel PAGE-SDS. Le gel est séché et mis en contact avec un film Kodak.-X.AR pour une période de 24 heures. L' autoradiograrrme de la figure 12 montre pour pLPV (piste e) le clivage de PVII en VII, le paramètre établi pour indiquer l'activité de la protéinase (Tremblay et al., 1983). La piste d, pLAM, où la protéinase est absente, montre que PVII n'a pas été clivé. Dans le cas des trois mutants issus de la mutagénèse dirigée, pLPV-Dl02E et pLPV-Sl60G montrent un activitée protéasique comparable à pLPV tandis que pour pLPV-H54R, PVII n'est pas clivé. On rem:i.rque aussi
la disparition de 11 kd, une autre protéine précurseur d'Ad2, dans les pistes où l'on observe le clivage de PVII. Le test d'activité des mutants a été répétés cinq fois. Le taux de clivage de PVII en VII variant d'un
