Optimisation des conditions de fabrication fromagère et
d’affinage pour l’obtention d’un fromage de type Chester
enrichi en acide gamma aminobutyrique
Mémoire
Charlyne Sénéchal
Maîtrise en sciences et technologie des aliments
Maître ès sciences (M. Sc)
Québec, Canada
Optimisation des conditions de fabrication fromagère et
d’affinage pour l’obtention d’un fromage de type Chester
enrichi en acide gamma aminobutyrique
Mémoire
Charlyne Sénéchal
Sous la direction de :
Jean-Christophe Vuillemard, directeur de recherche
Daniel St-Gelais, codirecteur de recherche
iii
Résumé
L’hypertension est probablement le plus important problème de santé dont souffrent les Canadiens (Statistiques Canada, 2010). Modifier l’alimentation est une façon de contrôler l’hypertension (OMS, 2013) (Statistiques Canada, 2010). Une autre possibilité serait la consommation d’acide gamma-aminobutyrique. L’acide gamma-aminobutyrique (GABA) est un composé hypotenseur présent dans certains aliments fermentés suite à sa production par certains microorganismes en condition de stress acide.
La consommation quotidienne de 50 g de fromage de type Cheddar contenant 0,32 mg de GABA/g de fromage a entrainé une baisse de pression artérielle significative chez des hommes sujets à la préhypertension (Pouliot-Mathieu et al., 2013), mais non-significative par rapport au groupe témoin. Le Chester est un fromage à pâte semi-ferme, dont l’affinage dure plusieurs mois et dont le pH de 4,8 est obtenu naturellement, conditions qui favorisent la production de GABA.
Le but de ce projet était de produire un fromage de type Chester en employant un ferment producteur de GABA qui permettrait l’obtention d’une concentration en GABA supérieure à 0,32 mg de GABA/g. La consommation de 50 g quotidienne de ce fromage pourrait alors entrainer une baisse de pression artérielle significative comparativement à un témoin sans GABA. La production de GABA a été confirmée chez les souches productrices Lc. lactis A23 et H13 et infirmée chez les souches de Lb. casei et Lb. paracasei testées. L’ajout du cofacteur de la réaction, le pyridoxal-5’-phosphate (PLP) a été évalué sur des caillés modèles, en plus de l’effet d’une combinaison des souches productrices de GABA, soit 50 % Lc. lactis H13/50% Lc. lactis A23. Le PLP n’a pas été ajouté lors de la fabrication des fromages de type Chester. Quatre ferments ont été employés et les fromages ont été affinés à 4°C, 8°C ou 12°C. À l’exception d’une humidité plus faible, la composition des fromages produits était semblable à celle d’un Chester traditionnel mais leur texture n’était pas aussi friable. La concentration maximale de GABA produite après 90 jours d’affinage à 12°C a été de 58mg/100g de fromage en utilisant un ferment composé de 25 % Lc. lactis H13 et de 75 %
iv
Table des matières
Résumé ... iii
Table des matières ...iv
Liste des figures... vii
Liste des tableaux ... viii
Remerciements ...ix
Introduction générale ... 1
Chapitre 1 : Revue de littérature ... 3
1.1 L’hypertension ... 3
1.2 La réduction de l’hypertension par l’alimentation ... 4
1.2.1 Les peptides bioactifs... 6
1.2.3 L’acide gamma aminobutyrique (GABA) ... 6
1.3 Microorganismes producteurs de GABA ... 7
1.4 Facteurs ayant une influence sur la production de GABA ... 9
1.5 Aliments fermentés contenant du GABA ... 9
1.5.1 Céréales ... 11 1.5.2 Viandes et poissons ... 11 1.5.3 Légumineuses ... 11 1.5.4 Boissons ... 12 1.5.5 Produits laitiers ... 12 1.5.5.1 Laits fermentés ... 12 1.5.5.2 Fromages ... 13 Hypothèse ... 15 Objectifs spécifiques ... 15
Chapitre 2 : Production de GABA par Lb. casei, Lb. paracasei et Lc. lactis et influence du PLP sur la production de GABA ... 16
2.1 Résumé ... 16
2.2 Introduction ... 17
2.3 Méthodologie ... 18
2.3.1 Souches à l’étude ... 18
2.3.2 Détection de la production de GABA par l’activité de l’enzyme GAD ... 19
2.3.3 Détection de la production de GABA par la production de CO2 ... 19
2.3.4 Préparations des ferments ... 20
2.3.5 Production de poudre de caillé ... 21
v
2.3.7 Analyses microbiologiques ... 23
2.3.8 Quantification du GABA ... 23
2.3.9 Analyses statistiques ... 24
2.4 Résultats et discussion ... 25
2.4.1 Détection de la production de GABA par l’activité de l’enzyme GAD ... 25
2.4.2 Détection de la production de GABA par la production de CO2 ... 25
2.4.3 Populations microbiennes dans les caillés modèles ... 26
2.4.4 Production de GABA ... 27
2.5 Conclusion ... 29
Chapitre 3 : Fabrication des fromages de type Chester enrichis naturellement en acide gamma-aminobutyrique (GABA) ... 30
3.1 Résumé ... 30
3.2 Introduction ... 31
3.3 Méthodologie ... 34
3.3.1 Préparation des souches ... 34
3.3.2 Fabrications fromagères ... 34
3.3.3 Analyses chimiques ... 37
3.3.4 pH ... 38
3.3.5 Analyses rhéologiques ... 38
3.3.6 Analyses microbiologiques : ... 39
3.3.7 Protéolyse primaire et secondaire ... 40
3.3.8 Détermination du GABA ... 40 3.3.9 Analyses statistiques ... 40 3.4 Résultats ... 41 3.4.1 Composition ... 41 3.4.2 Populations microbiennes ... 41 3.4.4 pH ... 44 3.4.5 Évolution de la protéolyse ... 45 3.4.5.1 Protéolyse primaire ... 45 3.4.5.2 Protéolyse secondaire ... 47
3.4.6 Production du GABA dans les fromages ... 49
3.4.7 Évolution de la texture ... 51 3.4.7.1 Dureté ... 51 3.4.7.2 Adhérence ... 52 3.4.7.3 Élasticité ... 53 3.4.7.4 Cohésion ... 54 3.5 Discussion ... 55
vi
3.6 Conclusion ... 60
Conclusion générale ... 61
Bibliographie ... 63
Annexe I : Préparation d’une culture congelée ... 70
Annexe II : Schéma de fabrication d’un fromage Cheddar typique ... 71
vii
Liste des figures
Figure 1.1 : Régulation de la sécrétion d’aldostérone par le système rénine-angiotensine-aldostérone (adapté
de John Wiley et Sons, 2011) ... 4
Figure 1.2 : Décarboxylation du L-glutamate en GABA par l’enzyme GAD. (PLP : pyridoxal-5’-phosphate) (Adapté de Dhakal et al., 2012) ... 7
Figure 1.3 : Système de désacidification intracellulaire impliquant la formation de GABA (Adapté de Richard et Foster, 2003) ... 8
Figure 2.1: Résumé des traitements appliqués aux caillés modèles ... 22
Figure 2.2 : Couleur des tubes contenant respectivement de gauche à droite les souches Lc. lactis A23 et Lc. lactis H13 et Lb. paracasei A180, et une comparaison sur fond noir d’A23 (gauche) et A180 (droite) ... 25
Figure 2.3 : Concentrations cellulaires de Lc. lactis A23 et Lc. lactis H13 dans les caillés modèles ... 27
Figure 2.4 : Concentrations de GABA en fonction des traitements appliqués aux caillés modèles ... 28
Figure 3.1 : Schéma de la fabrication du fromage Chester. Les variables indépendantes sont représentées en rouge ... 35
Figure 3.2 : Profil typique de texture obtenu avec un texturomètre (adapté de Banjare et al, 2015) ... 38
Figure 3.3 : Évolution de la population de Lc. lactis ssp lactis H13 et A23 dans les différents fromages : ... 42
Figure 3.4 : Évolution de la population de Lc. lactis ssp cremoris W62 dans les différents fromages ... 43
Figure 3.5 : Évolution des indices de protéolyse primaire (IPP) dans les différents fromages (H13, A23, 50/50, 25/75) affinés à 4(a), 8 (b) et 12ºC (c) ... 45
Figure 3.6 : Évolution des indices de protéolyse secondaire (IPS) dans les différents fromages (H13, A23, 50H13/50A23, 25H13/75A23) affinés à 4 (a), 8 (b) et 12°C (c). ... 48
Figure 3.7 : Production de GABA dans les différents fromages en fonction du ferment employé (H13, A23, 50H13/50A23 et 25H13/75A23) et de la température d’affinage (4, 8 et 12 C°) ... 50
Figure 3.8 : Évolution de la dureté des différents fromages (H13, A23, 50H13/50A23, 25H13/75A23) lors de l’affinage à différentes températures (4, 8 et 12°C)... 51
Figure 3.9 : Évolution de l’adhérence des différents fromages (H13, A23, 50H13/50A23, 25H13/75A23) lors de l’affinage à différentes températures (4, 8 et 12°C) ... 52
Figure 3.10 : Évolution de l’élasticité des différents fromages (H13, A23, 50H13/50A23, 25H13/75A23) lors de l’affinage à différentes températures (4, 8 et 12°C). ... 53
Figure 3.11 : Évolution de la cohésion des différents fromages (H13, A23, 50H13/50A23, 25H13/75A23) lors de l’affinage à différentes températures (4, 8 et 12°C) ... 54
viii
Liste des tableaux
Tableau 1.1 : Concentrations et microorganismes producteurs de GABA dans les aliments (Adapté de Diana
et al., 2014) ... 10 Tableau 2.1 : Souches utilisées ... 18 Tableau 3.1 : Populations bactériennes cibles dans les laits de fromagerie en fonction du fromage à fabriquer
... 36 Tableau 3.2 : Populations bactériennes (log) dans le lait de fromagerie 10 jours après l'inoculation ... 41 Tableau 3.3 : pH obtenus pour les différents fromages au début et après 90 jours d’affinage ... 44
ix
Remerciements
Je me dois d’offrir mes plus sincères remerciements à mon directeur de recherche, M. Jean-Christophe Vuillemard ainsi qu’à mon codirecteur de recherche, M. Daniel St-Gelais, qui m’ont guidée et soutenue tout au long de cette aventure. Leur patience et leur compréhension sont légendaires! Merci également à M. Benoît Lamarche pour ses conseils en cours de route. Je vous remercie pour avoir placé votre confiance en moi et m’avoir laissé participer à ce projet.
Je souhaite exprimer ma profonde reconnaissance aux professionnels de recherche du Centre de Recherche et Développement (CRD) de St-Hyacinthe pour leur aide précieuse et leurs conseils inestimables : Annie Caron, Sophie Turcot et Gaëtan Bélanger. J’ai tant appris à vos côtés et je m’estime très chanceuse d’avoir eu la possibilité de produire les fromages ainsi qu’une bonne partie des analyses de celui-ci avec vous. J’accorde une mention toute particulière Diane Gagnon de l’Université Laval. Merci Diane, pour m’avoir toujours accueillie avec sourires, bonbons et anecdotes sur le Japon, en plus de prêter une oreille compatissante (et d'offrir des réponses pertinentes!) à mes questions et mes inquiétudes.
Pour le soutien financier ayant permis la réalisation de ce projet, je souhaite remercier l'initiative de la Grappe de Recherche Laitière (Agriculture et Agroalimentaire Canada, les Producteurs Laitiers du Canada, le Réseau Laitier du Canada et la Commission Canadienne du Lait).
Finalement, bien sûr, merci à ma famille, à mes amis et à l’homme qui a partagé ma vie durant cette période importante de ma vie. Votre soutien et vos encouragements ont définitivement eu un impact dans l’accomplissement de ce projet. Aucun parmi vous n’a jamais eu le moindre doute quant à ma réussite. Je vous dédie ce mémoire qui, sans vous, n'aurait certainement pas été aussi facile à écrire!
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Introduction générale
L’hypertension est un problème de santé responsable de plus de 7,5 millions de morts par année à l’échelle mondiale, directement ou indirectement (OMS, 2013). Au Canada, les maladies du cœur et l’AVC entrainent le plus de décès et d’hospitalisations (APSC, 2009). Aujourd’hui, plus d’un adulte sur trois souffre d’hypertension. Les coûts associés à ce problème de santé, au niveau national ou international, sont très élevés et justifient une meilleure prévention et la recherche de nouveaux traitements (OMS, 2013) (ASPC 2009). Ce problème de santé peut être traité et prévenu en changeant le mode de vie, principalement en réduisant l’apport de sodium et lipides et en ajoutant plus de fruits et légumes à l’alimentation (OMS, 2013).
Certains aliments peuvent avoir un effet hypotenseur par leur contenu en peptides bioactifs. Ces peptides interagissent avec différentes fonctions physiologiques (Zhen-Yuet et
al., 2009), notamment en inhibant certaines enzymes responsables du système
rénine-angiotensine. Une de ces enzymes est l’enzyme de conversion ou ACE, qui est d’ailleurs l’une des cibles thérapeutiques les plus visées par les médicaments hypotensifs (Zhen-Yuetal
et al., 2009).
L’acide gamma aminobutyrique (GABA) est un composé bioactif qui a un effet inhibiteur sur l’ACE (Zhen-Yu et al., 2009). Chez les mammifères, le GABA est un neurotransmetteur. Le GABA est également l’un des produits du cycle de Krebs chez les bactéries et de nombreuses plantes. Il est présent en quantités variables dans de nombreux légumes et produits fermentés (Diana et al., 2014). L’enrichissement des aliments en GABA, dans le but éventuel de prévenir l’hypertension par l’alimentation est de plus en plus étudié (Abe et al., 1995) (Diana et al, 2014). La biosynthèse du GABA par les microorganismes producteurs est au centre de ces études. La réaction implique l’enzyme glutamate déshydrogénase (GAD), dont la fonction est de décarboxyler le glutamate lors d’un stress acide, résultant en la production de GABA et de CO2.
Des laits fermentés contenant du GABA ont fait l’objet de nombreuses études et leur effet hypotensif a été démontré chez l’homme et le rat (Inoue et al., 2004 ; Hayakawa et al., 2004 ; Aoki et al., 2003). Des doses de 100 mL de lait fermenté contenant 10-12 mg de
2
GABA ont abaissé la tension artérielle de façon significative (Inoue et al., 2004). Récemment, la consommation quotidienne de 50 g d’un fromage de type cheddar enrichi en GABA (0,35 mg de GABA/g de fromage) a fait objet d’une étude pour vérifier son effet antihypertension chez l’homme. Bien que la diminution de la tension artérielle ait été plus importante chez le groupe ayant consommé le fromage enrichi en GABA, la différence entre le groupe témoin et le groupe traité n’était pas significative (Pouliot-Mathieu et al., 2013).
Bien que certaines espèces de moisissures (par exemple certaines souches de
Rhizopus et Aspergillus) produisent du GABA, les bactéries lactiques, en raison de leur usage
omniprésent dans les produits fermentés, sont les microorganismes qui ont été les plus étudiés pour la biosynthèse du GABA. Lactobacillus casei est une bactérie lactique qui participe à l’affinage des fromages de type cheddar, en tant que flore secondaire (Fox, 2000). L’emploi de la souche Lb. casei Zhang a permis d’obtenir un fromage cheddar avec une concentration de 0,68 mg GABA/g de fromage (Wang et al., 2010) après un affinage de 6 mois. Dans les travaux de Gardner-Fortier et al. (2013), l’emploi de Lc. lactis comme souche productrice de GABA et de Lc. cremoris a permis d’obtenir un fromage de type Cheddar avec une concentration de 0,35 mg/g de GABA. Les différentes variables affectant la production de GABA ont été identifiées et sont principalement le pH, la concentration de glutamate, la concentration de NaCl et l’anaérobiose (Gardner-Fortier et al., 2013 ; Dhakal et al., 2012). L’efficacité de la réaction peut également être dépendante de certains additifs (Dhakal et al, 2012). Dans certains cas, l’ajout de pyridoxal-5’-phosphate (PLP) (Yang et al., 2008) ou de glutamate monosodique (Lu et al., 2009) a un effet significatif.
L’objectif de ce projet était de produire un fromage fonctionnel contenant plus de 0,32 mg de GABA/g de fromage, dont la consommation pourrait avoir un effet significatif sur la baisse de pression artérielle.
3
Chapitre 1 : Revue de littérature
1.1 L’hypertension
L’hypertension est définie par une pression artérielle plus élevée que la normale, c’est-à-dire une pression systolique de plus de 120 millimètres de mercure (mm Hg) et une pression diastolique de plus de 80 mm Hg (120/80). Cette condition peut être due à de nombreux éléments, dont : l’hérédité, le niveau d’activité physique, l’âge, le sexe, le poids, l’environnement et l’alimentation (Zhen-Yu et al., 2009). L’hypertension est liée au développement des maladies cardiovasculaires et plusieurs autres problèmes de santé, dont notamment : l’infarctus, la perte de vue, l’insuffisance cardiaque et rénale et l’AVC (accident vasculaire cérébral) (OMS, 2015 ; Zhen-Yu et al., 2009). Lorsque la condition est causée par le mode de vie, en optant pour l’activité physique, la relaxation, l’abandon du tabac et le changement des habitudes alimentaires, l’hypertension peut être traitée et même éliminée (Zhen-Yu et al., 2009).
Au niveau physiologique, la principale enzyme responsable de l’augmentation de la tension artérielle est l’enzyme de conversion de l’angiotensine (ACE) (figure 1.1). La rénine clive le peptide précurseur de l’angiotensine, qui forme l’angiotensine-I. L’angiotensine-I est convertie en angiotensine-II par l’ACE, ce qui provoque une vasoconstriction. Lorsque l’angiotensine-II rejoint le cortex surrénal, la sécrétion d’aldostérone est stimulée. Cela provoque alors une rétention du sodium et du fluide rénal et subséquemment une augmentation du volume sanguin. Ces deux processus entrainent une augmentation de la pression sanguine. L’ACE inhibe également la bradykinine, un vasodilatateur important (DeMello et al., 2009 ; Zhen-Yu et al., 2009).
4
1.2 La réduction de l’hypertension par l’alimentation
Le traitement de l’hypertension peut comprendre la réduction des apports en sodium, lipides et en boissons alcoolisées. L’importance du sodium dans le contrôle de l’hypertension est associée à sa capacité de réguler le volume sanguin par la rétention des fluides.
Par exemple, la diète DASH (Dietary Approches to Stop Hypertension) recommande les légumes, les fruits, les produits laitiers faibles en gras, les grains entiers et limite les viandes rouges, les boissons sucrées, le gras et le sel. Le but est de limiter l’apport en sodium à 2300 milligrammes par jour (Zhen-Yu et al., 2009). Plusieurs études ont prouvé que l’adoption de cette diète réduit de façon significative non seulement l’hypertension, mais également les risques d’AVC (Fung et al., 2008 ; Appel et al., 1997).
Une autre stratégie est d’ajouter des suppléments à l’alimentation. La L-arginine est un précurseur de l’oxyde nitrique (NO), qui participe activement à la régulation de
Figure 1.1 : Régulation de la sécrétion d’aldostérone par le système rénine -angiotensine-aldostérone (adapté de John Wiley et Sons, 2011)
5
l’hypertension en étant responsable de la relaxation endothéliale-dépendante (Zhen-Yu et al., 2009). Une étude sur des rats sensibles au sel a montré que l’ajout de 1,5 % de L-arginine à leur eau de consommation était suffisant pour entrainer une baisse de la tension artérielle et régulariser le système rénal (Tomohiro et al., 1997).
Les composés dérivés de l’acide chlorogénique (CGA) entrainent une baisse de la tension artérielle, chez l’homme et les rats. La tension artérielle des sujets souffrants d’hypertension légère traités avec 140 mg par jour de CGA a diminué significativement par rapport au groupe témoin (Watanabe, 2006). Les CGA sont présents dans une grande variété de fruits, légumes et grains, tels que le café, les tomates, les pommes de terre et les aubergines (Zhen-Yu et al., 2009). Le mécanisme d’action n’est pas encore bien compris. Les CGA augmenteraient la biodisponibilité de l’oxyde nitrique (NO) en inhibant les enzymes qui génèrent des radicaux superoxydes (Zhen-Yu et al., 2009).
L’intégration dans la diète d’aliments comme l’ail, l’oignon et certains aliments fermentés qui contiennent des peptides bioactifs ou produisent naturellement des peptides bioactifs lors de leur digestion dans le tractus gastro-intestinal peut également diminuer la tension artérielle. L’ail agirait sur plusieurs mécanismes qui pourraient expliquer son effet hypotenseur : un effet inhibiteur de l’ACE, un effet inhibiteur de la synthèse de plusieurs prostanoïdes vasoconstricteurs et un effet relaxant NO-dépendant. L’effet hypotenseur de l’oignon provient de sa capacité à sauvegarder le NO, d’un effet inhibiteur de l’ACE et de l’inhibition de l’influx de calcium. Cependant, la cuisson est très souvent impliquée dans la consommation de ces deux aliments et celle-ci dénature les peptides bioactifs .
Le thé possède également un effet hypotenseur, en particulier le thé vert, qui est non fermenté et qui par conséquent contient une plus grande concentration de catéchines que les thés noirs ou oolongs (thés fermentés). À l’image du CGA, les propriétés des catéchines ne sont pas encore bien comprises, mais des études indiquent que les mécanismes expliquant l’effet hypotenseur de cette famille de polyphénols sont semblables à ceux de l’ail et de l’oignon. En plus d’un effet inhibiteur de l’ACE, ils possèdent également une action sur le NO endothélial. Les produits dérivés du soya présentent également des propriétés hypotensives. Les courts peptides produits lors de la digestion gastro-intestinale de ces aliments auraient un effet inhibiteur de l’ACE mais les études se contredisent et des travaux supplémentaires
6
seraient nécessaires pour déterminer le véritable effet des produits de soya. Le gingembre, l’huile de poisson, les oméga-3 et les peptides bioactifs provenant de la fermentation de poisson possèdent tous des propriétés hypotensives semblables à celui des produits du soya (Zhen-Yu et al., 2009). De nouvelles études restent à réaliser afin de mieux comprendre le mécanisme hypotenseur de ces aliments et des peptides bioactifs qu’ils contiennent.
1.2.1 Les peptides bioactifs
Un peptide bioactif (PB) se définit par son effet mesurable et bénéfique sur un processus physiologique. Les PB sont présents naturellement dans certains aliments, mais ces composés apparaissent normalement au cours de la digestion (Puchalska et al., 2015). Leurs effets sont très variés : antioxydants, antimicrobiens, vasodilatateurs, hypolipidémiants, anticancéreux, immunomodulateurs et hypotensifs. En 2008, 37 types d’effets avaient été observés pour les 1950 PB reconnus par la base de données BIOPEP (Puchalska et al., 2015).
Plusieurs médicaments emploient l’enzyme oxyde nitrique synthétase (NOS) pour abaisser la pression sanguine, en particulier l’enzyme de type endothélial (eNOS) qui contrôle la vasodilatation des muscles lisses vasculaires. Une fonction des PB est d’activer l’enzyme eNOS, en particulier les PB provenant de la consommation de thé et fleurs d’aubépine (Zhen-Yu et al., 2009).
C’est en 1982 que le premier PB hypotensif provenant de lait de vache hydrolysé à la trypsine a été caractérisé. Depuis, les découvertes leur étant associées ont permis de commercialiser des produits laitiers additionnés de PB (Puchalska et al., 2015). Le potentiel hypotenseur de plusieurs autres aliments a été évalué : les produits de la mer, la viande, les légumes, les légumineuses et certains aliments préparés. Plusieurs études ont démontré que combiner les fermentations bactériennes et les digestions in vitro peuvent produire des PB hypotenseurs de faible taille (2-10 acides aminés) et donc plus efficaces (Puchalska et al., 2015).
Des PB peuvent également être présents naturellement dans un aliment. C’est le cas pour l’ail, certains champignons, plusieurs fromages et autres produits fermentés.
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L’acide gamma aminobutyrique (GABA) est un puissant inhibiteur de l’ACE. Le GABA est présent dans une grande variété de bactéries, plantes et vertébrés. Chez les vertébrés, le GABA agit comme un neurotransmetteur inhibiteur du système nerveux central (Dhakal et al., 2012). En plus de son effet hypotenseur, le GABA possède également un effet antidiabétique, diurétique et tranquillisant. Étant donné ses différents effets bénéfiques pour la santé, le GABA est employé dans le domaine pharmaceutique (Puchalska et al., 2015).
Dans le domaine pharmaceutique, c’est souvent par biosynthèse que le GABA est obtenu (Choi et al., 2015). La biosynthèse du GABA à partir de l’acide glutamique est une réaction qui peut s’effectuer dans des conditions ambiantes et d’une grande efficacité catalytique (figure 1.2). Plusieurs méthodes ont été développées pour optimiser cette biosynthèse : la technologie des cellules immobilisées, la fermentation de levain et la méthode de fermentation en lot (Diana et al., 2014).
1.3 Microorganismes producteurs de GABA
Les microorganismes producteurs de GABA peuvent être des levures, des moisissures et des bactéries. La production de GABA a surtout été étudiée chez les bactéries lactiques et les levures, utilisées dans la production d’aliments fermentés (Diana et al., 2014). Les microorganismes producteurs de GABA ont en commun la capacité de produire l’enzyme « acide glutamique décarboxylase » (GAD). En conditions acides et anaérobiques, cette enzyme produit le GABA (et du gaz carbonique) à partir de l’acide glutamique et d’un proton en présence du cofacteur pyridoxal-5’-phosphate (PLP ou vitamine B6). Cette réaction
permet de réguler le pH intracellulaire par l’élimination des protons et aux microorganismes de survivre dans des conditions acides (figure 1.3) (Diana et al., 2015).
Figure 1.2 : Décarboxylation du L-glutamate en GABA par l’enzyme GAD. (PLP : pyridoxal-5’-phosphate) (Adapté de Dhakal et al., 2012)
8
Figure 1.3 : Système de désacidification intracellulaire impliquant la formation de GABA (Adapté de Richard et Foster, 2003)
Une étude récente a montré qu’un moyen rapide et efficace pour identifier les microorganismes producteurs de GABA serait l’examen préliminaire des gaz libérés combiné à une confirmation par chromatographie HPLC en phase inverse (Wu & Shah, 2015). Un autre moyen simple d’identifier les cultures productrices de GABA est d’ajouter les cellules centrifugées à du réactif GAD, une solution acide contenant du bromocrésol et du glutamate monosodique. Selon la quantité de GABA produite, la couleur du réactif passe au vert ou au bleu (Lacroix et al., 2013).
9
1.4 Facteurs ayant une influence sur la production de GABA
Plusieurs facteurs qui régissent les propriétés biochimiques de la GAD influencent la production de GABA, par exemple la température de fermentation, la durée de fermentation, le pH et les additifs, mais aussi la souche employée (Dhakal et al., 2012).
Dans le cas de la bactérie Lactococcus lactis ssp. lactis (Lc. lactis), il existe des différences majeures entre les études. En fonction de la souche, le pH optimal pour la production de GABA peut varier entre 4,65 et 5,70 (Dhakal et al., 2012 ; Diana et al., 2014). Certains additifs peuvent être ajoutés au milieu de croissance des microorganismes pour optimiser la production de GABA. L’addition de glutamate monosodique au début de la fermentation par Lc. lactis a stimulé la production de GABA, comparativement à l’addition à partir de 6 heures de fermentation et plus (Lu et al., 2009). L’addition de PLP a permis d’optimiser la production de GABA chez Lb. paracasei NFRI 7415 (Komatsuzaki et al., 2005), Streptococcus thermophilus Y2 (Yang et al., 2008) et Lc. lactis (Lacroix et al., 2013). Dans le cas de S. thermophilus, l’addition de PLP (0,02 mmol/L) a été plus efficace après 48 heures de fermentation. Cela peut s’expliquer par une dénaturation de la vitamine au cours de la fermentation. Pour Lc. lactis, l’ajout de PLP a semblé accélérer la formation de GABA.
1.5 Aliments fermentés contenant du GABA
Bien que le GABA soit synthétisé naturellement chez l’homme, sa synthèse peut être inhibée par un manque d’œstrogènes, de vitamines ou de zinc et un excès d’additifs alimentaires ou d’acide salicylique (ingrédient présent dans l’aspirine) (Diana et al., 2014). Un ajout de GABA à l’alimentation humaine serait donc justifié. De nombreuses études ont démontré que le GABA est présent de façon naturelle dans certains aliments, tel que résumé au Tableau 1 (Diana et al., 2014).
10
Tableau 1.1 : Concentrations et microorganismes producteurs de GABA dans les aliments (Adapté de Diana et al., 2014)
Aliments GABA
(mg/kg)
Microorganismes producteurs Références
Aliments à base de grains
Levain de grains entiers 258,7 Lactobacillus plantarum C48
et Lactococcus lactis spp. lactis PU1
Rizzello et al., 2008 Levain de grains entiers et
soja
1000 Lactobacillus brevis CECT 8182 Diana et al., 2014 Pain au levain « Bhatura » 2262,2 Lactococcus lactis Bhanwar et al, 2013 Pain au levain d’un mélange
de farines
504 Lactobacillus plantarum C48
et Lactococcus lactis ssp. lactis PU1
Coda et al., 2010 Pain enrichi d’enzyme GAD 115 Yersinia intermedia Lamberts et al., 2012
Céréales de flocons de son 66 Yersinia intermedia Joye et al., 2011
Céréales de flocons de quinoa 90 Yersinia intermedia Joye et al., 2011
Céréales de flocons de farine de malt
258 Yersinia intermedia Joye et al., 2011 Avoine 435,2 Aspergillus oryzae 35 232 Cai et al., 2014 Produits laitiers
Fromage de type cheddar 360 Lc. lactis ssp. lactis Pouliot-Mathieu et al., 2013
Fromage cheddar 678 Lactobacillus casei Zhang Wang et al., 2010
Yogourt 425 Lactobacillus brevis OPY-1
(KFCC 11337)
Park et Oh, 2006
Lait tibétain nm Mélange de bactéries lactiques Sun et al., 2009
Lait
970 Lactobacillus paracasei ssp. paracasei NTU 101
ou Lactobacillus plantarum NTU 102
Liu et al., 2011
102 Lactobacillus casei spp. Shirota
et Lactococcus lactis YIT 2027
Hayakawa et al., 2004 100-120 Lactobacillus casei ssp. Shirota
et Lactococcus lactis YIT 2028
Inoue et al., 2003 5000 Lactococcus lactis spp. lactis
ULAAC-A13 et ULAAC-A23 isolées de
ferments de fromages traditionnels
Lacroix et al., 2013
77,4 Lactobacillus plantarum Nejati et al., 2013
144,5 Mélange de bactéries lactiques Nejati et al., 2013 970 Lactobacillus plantarum Liu et al., 2011 Lait écrémé 15-99,9 Mélange de bactéries lactiques
isolées de fromages italiens
Siragusa et al., 2007
113,35 Lactobacillus helveticus Sun et al., 2009
Lait de chèvre 28 Mélange de bactéries lactiques Minervini et al., 2009 Lait pauvre en gras 806 Mélange de bactéries lactiques et
protéase
Hayakawa et al., 2004 Viandes et légumineuses
Nham (Saucisse de porc
thaïlandaise fermentée)
4051 Lactobacillus namurensis NH2 et Pediococcus pentosaceus HN8
Ratanaburee et al., 2013 Poisson japonais traditionnel 1300 Lactobacillus paracasei NFRI 7415 Kuda et al., 2009 Haricots Adzuki 2012 Cultures mixtes de Lactococcus lactis
et Lactobacillus rhamnosus
Liao et al., 2013 Produit de soja « Tempeh » 3700 Rhizopus oligosporus IFO 32002 Aoki et al., 2003 Boissons
Lait de soja noir 5420 Lactobacillus brevis FPA 3709 Ko et al., 2013 Lait de soja nm Lactobacillus brevis OPY-1
(KFCC 11337)
Park et Oh, 2006
Jus de framboises noires 26 500 Lactobacillus brevis GABA100 Kim et al., 2009
Moût de raisin 9 Lactobacillus plantarum DSM19463 Di Cagno et al., 2009
Jus/lait de canne à sucre 3200 Lactococcus lactis Hirose et al, 2008
Jus de fruit 579 Enterococcus avium G-15 Tamura et al., 2010
11 1.5.1 Céréales
Le pain au levain, pour lequel différentes souches de bactéries lactiques sont employées, est un excellent aliment potentiel. De nombreuses études ont évalué la capacité de bactéries sélectionnées et estimé la quantité de GABA produite, que ce soit dans le produit final ou le levain lui-même.
La quantité de GABA produite dépend de la farine ou des mélanges de farines employés. Rizzello et al. (2008) ont montré qu’un levain à base de farine de blé entier contenait plus de GABA que ceux à base de farine blanche ou de seigle. Coda et al. (2010) ont démontré qu’un mélange de farines de différents grains et légumineuses (pois chiches, quinoa, sarrasin et amarante) pouvait entrainer une production de GABA atteignant 504 mg de GABA/kg de pain. La plus haute concentration de GABA mesurée dans un pain au levain bhatura (pain frit d’origine indienne) était de 2262,2 mg/kg (Bhanwar et al., 2013). Cai et al. (2012) ont obtenu une concentration de 435,2 mg/kg en fermentant de l’avoine avec une souche d’Aspergillus oryzae.
1.5.2 Viandes et poissons
Des études ont également porté sur l’optimisation de la production de GABA dans les viandes et le poisson. Des saucisses de porc fermentées (Nham), lorsqu’additionnées de 0,5 % de glutamate monosodique et bactéries lactiques productrices, contiennent une quantité importante de GABA (4051 mg de GABA/kg) (Ratanaburee et al., 2013). Kuda et
al. (2009) ont également observé une grande concentration de GABA, soit 1300 mg de
GABA/kg dans des poissons fermentés traditionnels japonais. 1.5.3 Légumineuses
Le Tempeh est un produit de soja fermenté avec une souche de Rhizopus. En sélectionnant la souche adéquate, Aoki et al. (2003) ont obtenu des concentrations élevées de GABA (3200mg/kg). Les haricots Adzuki ont fait objet d’une étude par l’équipe de Liao
et al. (2013). Ceux-ci ont proposé des processus et conditions de fermentation spécifiques
pour l’optimisation de la production du GABA, et ont obtenu une concentration de 2012 mg de GABA/kg.
12 1.5.4 Boissons
Les jus peuvent également être de bonnes cibles pour l’enrichissement en GABA par acidification lactique (Di Cagno et al., 2009 ; Hirose et al., 2008 ; Kim et al., 2009 ; Song, et
al., 2014). Une étude effectuée par l’équipe de Shimizu et Sawai (2008) a montré que le
GABA reste stable lors de l’entreposage de jus, à 20, 37 et 55°C, suite à des traitements thermiques de 80, 90, 97 ou 115°C ou un traitement d’irradiation à 20 000 lux. Le GABA est donc un composé bioactif stable et thermorésistant.
Les bactéries lactiques ont également démontré une capacité de croissance dans la lie de shochu, un alcool japonais contenant une quantité de GABA de 1560,5 mg/kg (Yokoyama
et al., 2002)
1.5.5 Produits laitiers
Les produits laitiers font partie des aliments les plus étudiés comme vecteurs de GABA.
1.5.5.1 Laits fermentés
En combinant deux souches de bactéries lactiques, un lait fermenté a atteint une concentration de 5000 mg/L de GABA (Lacroix et al., 2013). Lactobacillus helveticus est une espèce de bactérie lactique qui a produit 113,35 mg GABA/kg dans un lait fermenté écrémé (Sun et al., 2009). Les auteurs ont avancé que ce lait pourrait être utilisé pour le traitement de l’hypertension.
Lors d’une étude clinique contrôlée, randomisée avec placébo chez des patients présentant une hypertension moyenne, Inoue et al. (2003) ont testé l’effet d’une concentration de 12 mg de GABA par portion de 100 mL de lait fermenté. Cette dose de GABA fut suffisante pour entrainer une diminution significative de la pression sanguine en deux ou quatre semaines. Selon Najati et al. (2013), une concentration de 144,5 mg/kg produite par une combinaison de Lb. plantarum et d’autres bactéries lactiques représenterait une dose adéquate pour le traitement de l’hypertension.
Cet effet hypotenseur a également été étudié chez les rats. La pression systolique et diastolique a diminué de façon significative chez des rats spontanément hypertendus (SHR) suite à une diète de lait écrémé fermenté par Lb. plantarum contenant 970 mg/kg de GABA (Liu et al., 2011). Une diminution de la pression artérielle significative a été observée après
13
trois semaines d’administration orale de lait faible en gras fermenté par Lactobacillus casei et Lactococcus lactis et contenant 102 mg de GABA/kg (Hayakawa et al., 2007).
1.5.5.2 Fromages
Les fromages pourraient être une excellente source de GABA en raison des nombreuses souches de bactéries lactiques employées pour la fabrication fromagère qui possèdent l’enzyme GAD (Siragura et al., 2007 ; Nomura et al., 1998). De plus, le glutamate, substrat de la réaction, est produit naturellement au cours de l’affinage.
La fabrication d’un fromage enrichi en GABA de façon naturelle est possible, et les fromages les plus adaptés seraient des fromages acides, avec un pH inférieur à 5 (Gardner-Fortier et
al., 2013). De plus, ces fromages devraient être affinés suffisamment longtemps pour
atteindre une concentration de GABA importante (Dhakal et al., 2012).
Le Cheddar est l’un des fromages les plus consommés dans le monde et le plus consommé au Canada (Statistique Canada, Revue laitière, 2006).
L’effet hypotenseur de l’ingestion quotidienne de 50 g d’un fromage de type Cheddar correspondant à une ingestion quotidienne de 16 mg de GABA a été démontré. Une baisse de 3,5 mm Hg de pression sanguine a été constatée chez des hommes atteints de préhypertension (Pouliot-Mathieu et al., 2013). Cependant, cette différence n’était pas significative par rapport au groupe témoin qui a également présenté une baisse de pression. Une concentration de 678 mg GABA/kg de fromage Cheddar a été atteinte avec une souche de Lactobacillus casei provenant originellement de koumiss (Wang et al., 2010).
Les caillés modèles permettent de répliquer l’effet de l’affinage des fromages, et ce, en une fraction du temps d’affinage normalement requise (Harper et Kristoffersen, 1970). En utilisant la technique des caillés modèles, différentes conditions optimales pour la production de GABA par un ferment composé de Lc. lactis et Lc. cremoris ont été mises en évidence par l’équipe de Gardner-Fortier et al. (2013), soit un pH de 4,8; 3,0 mg de glutamate par g de caillé et un ratio sel-humidité de 3%.
Le fromage Chester est l’un des plus vieux fromages existants. Le Chester était déjà mentionné dans un livre datant de 1086, Domesday Book (Linford, 2008). Il est encore
14
aujourd’hui le fromage friable le plus vendu en Grande-Bretagne. Le Chester est aussi un bon candidat comme source de GABA car son pH est d’environ 4,8, et correspond au pH optimal pour la production de GABA par Lc. lactis (Gardner-Fortier et al., 2013 ; Scott, 1986). Étant un fromage qui peut être affiné jusqu’à 15 mois, le glutamate peut être produit et transformé en GABA dans la matrice fromagère (Scott, 1986).
Le Chester traditionnel est fabriqué différemment en fonction de la saison de traite. Les caractéristiques du fromage produit varient, comme la quantité de matières grasses, l’acidité et le taux d’humidité. Le Chester en blocs (destiné à la coupe pour consommateurs) est généralement plus « sec », pour faciliter la découpe. Il est également moins acide que les fromages traditionnels, puisque le pressage ne dure qu’une nuit au lieu de trois jours à température ambiante. Habituellement, les fromages Chester fabriqués avec un lait contenant 3,5 % de matières grasses sont plus acides et supportent un affinage plus long (Scott, 1986). Puisque la production de GABA est optimale en conditions acides et sur une longue période, le Chester enrichi en GABA devrait être affiné suffisamment longtemps pour que le GABA puisse s’y développer.
Dans l’étude effectuée par Gardner-Fortier et al. (2013), la production de GABA dans un fromage de type Cheddar acidifié à pH 4,9 a atteint une concentration de 35 mg de GABA par 100 g de fromage. Dans une étude clinique subséquente (Pouliot-Mathieu et al., 2013), 50 g de ce fromage a été administré à des hommes atteints de préhypertension. Bien que la diminution de la tension artérielle du groupe expérimental (avec GABA) ait été significative et supérieure à celle du groupe témoin (sans GABA), aucune différence significative n’a été observée entre les deux groupes. Contrairement au Cheddar, le fromage Chester est un fromage à pâte ferme qui serait plus adapté à l’optimisation de la production de GABA, puisque son pH est naturellement plus bas que celui du Cheddar.
Le but de ce projet était de fabriquer un fromage de type Chester enrichi en GABA en employant les mêmes souches Lc. lactis ssp. productrices de GABA que celles employées lors de l’étude de Gardner-Fortier et al. (2013).
15
Hypothèse
La fabrication d’un fromage de type Chester selon des conditions optimales permet d’obtenir une concentration de GABA supérieure à 0,36 mg/100 g de fromage.
Objectifs spécifiques
1) Identifier des souches de Lb. casei productrices de GABA
2) Évaluer l’effet de l’addition de PLP pour l’augmentation de la production de GABA 3) Fabriquer des fromages de type Chester à teneur élevée en GABA
16
Chapitre 2 : Production de GABA par Lb. casei, Lb. paracasei et Lc. lactis
et influence du PLP sur la production de GABA
2.1 Résumé
La production de GABA chez les souches Lc. lactis A23 et H13 et plusieurs souches de Lb.
casei et Lb. paracasei a été évaluée à l’aide de deux méthodes : l’activité de l’enzyme GAD
et la libération de CO2. Par la suite, il a été possible de sélectionner les souches pour produire
le ferment dans le but de fabriquer un fromage Chester enrichi en GABA. Les résultats ont mis en évidence que les souches Lb. casei et Lb. paracasei sélectionnées ne produisaient pas de GABA. Les souches Lc. lactis A23 et H13 ont confirmé leur capacité à produire du GABA. Pour tester la production de GABA dans des caillés modèles, un ratio 50/50 des souches Lc. lactis H13 et Lc. lactis A23 a été employé ainsi que deux autres ferments composés de 100 % Lc. lactis H13 et 100 % Lc. lactis A23. Pour favoriser la croissance des souches H13 et A23, qui sont protéinases négatives, ces souches ont été combinées avec la souche Lc. lactis ssp. cremoris W62, qui est protéinase positive. Pour étudier l’effet du PLP sur la production de GABA, différentes concentrations (0 μM, 50 μM et 100 μM) ont été ajoutées aux caillés modèles. Les caillés modèles ont été affinés pendant 10 jours à 30°C. À l’exception de la concentration en GABA du caillé modèle 100 % A23 et 0 μM de PLP, qui était significativement plus faible, les productions de GABA étaient significativement comparables (P>0,05). Cela indique que l’ajout de PLP pour augmenter la production GABA ne serait pas pertinent. La concentration maximale de GABA obtenue a été de 47,4 mg/100 g de caillé modèle, dans le cas du ferment H13 avec une supplémentation de 50 μM de PLP.
17
2.2 Introduction
Le GABA est un neurotransmetteur inhibiteur de l’enzyme de conversion de l’angiotensine (ACE) et ses propriétés hypotensives ont été étudiées et confirmées à plusieurs reprises. Sous des conditions de stress acide, le GABA peut être produit par certains microorganismes. Lorsqu’un influx de protons pénètre dans la cellule, l’enzyme glutamate décarboxylase (GAD) utilise le glutamate présent dans la cellule pour le convertir en GABA et en CO2.
Cette réaction est produite en présence d’un cofacteur, le phosphate de pyridoxal (PLP), également connu sous le nom de vitamine B6. L’antiport GAD C excrète le GABA de la
cellule et entraine l’entrée d’une une molécule de glutamate, puis le cycle recommence. Yang
et al, (2008) ont démontré que l’ajout de PLP dans le milieu de croissance pourrait entraîner
une production de GABA plus importante que le témoin négatif (sans PLP).
La capacité des microorganismes à produire le GABA peut être testée à l’aide de deux méthodes qui sont basées sur ce système de détoxification. La première est une méthode colorimétrique rapide qualitative basée sur le changement de pH du milieu qu’occasionne la production de GABA, à l’aide du bromocrésol, un indicateur de pH. En convertissant les protons et le glutamate en GABA, l’acidité du milieu est neutralisée et la coloration de l’indicateur change du jaune au vert/bleu (Lacroix et al., 2009). Dans la seconde méthode, la production de gaz carbonique indique la production faible ou forte de GABA (Wu & Shah, 2015).
L’utilisation d’une souche de Lb. casei productrice de GABA comme ferment dans la fabrication d’un fromage cheddar a permis de produire une concentration de 6,77 mg GABA/g de fromage après un affinage de 6 mois, sans PLP (Wang et al., 2010).
Le but de cette étude était d’identifier des souches de Lb. casei et Lb. paracasei productrices de GABA et de confirmer la production de GABA par les souches Lc. lactis ULAAC A23 et ULAAC H13, afin de sélectionner un ferment pour une production de fromage de type Chester enrichi en GABA. De plus, l’effet de différentes concentrations de PLP sur la production de GABA a également été évalué pour déterminer si l’ajout de ce cofacteur dans le lait serait pertinent pour l’obtention d’une concentration plus élevée de GABA dans le fromage produit.
18
2.3 Méthodologie
2.3.1 Souches à l’étude
La liste des souches utilisées dans cette étude est présentée au tableau 2.1. Les souches PRT-
Lactococcus lactis ssp. lactis ULAAC A23 et ULAAC H13 et Lactobacillus casei ssp. casei
RBL-23 et RBL-24 provenaient de la collection ULAAC du Centre de recherche en science et technologie du lait (STELA) de l’Université Laval.
Les souches Lactobacillus paracasei ssp. casei A180, Lactobacillus casei ssp. casei RBL-58 et RBL-104 provenaient de l’institut Rosell (Montréal). Les souches Lactobacillus casei ssp. casei RBL-62 (ATCC 334) et Lactobacillus paracasei ssp. casei RBL-106 (ATCC 25302) proviennent de la banque American Type Culture Collection (ATCC) et finalement, la souche Lactococcus lactis ssp. cremoris W62 de Wisby, Danlac, Airdrie (AL, Canada). Les souches étaient préparées selon la méthode adaptée et présentée en Annexe I (Gardner-Fortier al, 2011). Elles étaient ensuite conservées à -80ºC jusqu’à utilisation.
Tableau 2.1 : Souches utilisées
Genre et espèce Codes attribués
Lactococcus lactis ssp. lactis ULAAC A23
Lactococcus lactis ssp. lactis ULAAC H13
Lactobacillus casei ssp. casei RBL-23
Lactobacillus casei ssp. pseudoplantarum RBL-24
Lactobacillus casei ssp. casei RBL-58
Lactobacillus casei ssp. casei RBL-62
Lactobacillus casei ssp. casei RBL-104
Lactobacillus paracasei ssp. paracasei RBL-106
Lactobacillus paracasei ssp. paracasei A180
19
2.3.2 Détection de la production de GABA par l’activité de l’enzyme GAD
Pour chacune des souches étudiées, un échantillon a été prélevé d’un cryotube correspondant maintenu congelé en grattant la surface congelée à l’aide d’une pipette sérologique d’1mL. Cet échantillon fut repiqué dans 5 mL de bouillon de culture GM17 (bouillon M17 (Difco, BD, lot 5054747) additionné de 0,5 % (w/v) de glucose (Laboratoire Mat, lot CD1D1309222029A). Après 18 à 24 heures de croissance à 30°C dans un incubateur, les tubes ont été centrifugés à 5000 g, 20 min à 25°C (Beckman Coulter, Avanti J-E, États-Unis). Les culots ont été lavés avec 5 mL d’une solution saline stérile à 0,9 % de NaCl. Après une seconde centrifugation, le culot a été suspendu dans 0,5 mL du réactif GAD (préalablement stérilisé à l’autoclave). Le réactif GAD est une solution composée de 1 g de L-glutamate (Sigma, Lot 57F-0554), 0,3 mL de Triton X-100 (Sigma, lot 126H1030), 90 g de NaCl (EM science, Lot 41165128) et 0,05 g de vert de bromocrésol (Sigma, lot B1256) dans un litre d’eau distillée, ajusté à pH 4 avec une solution de NaOH 0,5 N.
Après 4 heures d’incubation anaérobique à 37°C (Baxter incubator, scientific products ultra tech, wj301d), la couleur a été déterminée visuellement. Une couleur jaune indique que la souche n’est pas productrice de GABA. Une couleur verte ou bleue indique que la souche est productrice de GABA en quantité faible ou élevée, respectivement (Lacroix et al., 2013). Le test GAD a été effectué trois fois pour chaque souche. La souche PRT+, W62, a servi de témoin négatif et la souche productrice de GABA de témoin positif. Le contrôle négatif a été réalisé avec le réactif GAD seul.
2.3.3 Détection de la production de GABA par la production de CO2
La méthode a été adaptée de celle décrite par Wu & Shah (2015). Chacune des souches, y compris W62, a été repiquée en grattant la surface d’un cryovial congelé puis inoculée dans 15 mL de milieu M17-MSG (Difco, BD, lot 5054747). Ce milieu était additionné de 10 g/L de glutamate monosodique (Acros Organics, Lot : A0350424) ajusté à pH 6,5 avec une solution d’HCl 0,5M préalablement stérilisée par filtration sur membrane Millipore de 0,22 μm. Suite à une incubation de 24 heures à 21°C (Innova44 incubator shaker series, model I44R, lot 2401), le pH a été ajusté à 4,0 avec une solution de HCl. Après 24 h d’incubation supplémentaire à 21°C, les milieux ont été aspirés puis inversés doucement à
20
l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL (ups-downs) pour permettre au gaz dissout d’être libéré et observé.
Le test de production de CO2 a été effectué trois fois pour chaque souche. La souche W62 a
servi de témoin négatif et la souche productrice de GABA de témoin positif. Le contrôle négatif a été réalisé avec le réactif GAD seul.
2.3.4 Préparations des ferments
Les ferments ont été préparés tel que décrit par Gardner-Fortier et al. (2011). Pour les souches
Lc. lactis H13 et A23, 9,0 mL de lait écrémé reconstitué à 12 % (p/p) ont été supplémentés
par 0,2 % d’extrait de levure (BD, lot 4216756). Après stérilisation, les laits ont été inoculés avec 1 mL (10 % v/v) de bouillon de culture décongelé puis incubés à 21°C dans un incubateur programmable (Innova 44, incubator shaker series, model I44R, lot 2401) pendant 15 heures (précultures). La souche Lc. cremoris W62 a été préparée de façon similaire, mais sans ajout d’extrait de levure. Du bouillon M17 (Difco, BD, lot 5054747) a été inoculé à 1 % avec chacune des précultures et incubé à 21°C pendant 15 heures. L’ajout d’une souche PRT+ telle que Lc. cremoris W62 entraîne un effet bénéfique sur la croissance des souches PRT- (Lc. lactis A23 et H13). En effet, le système protéinase (PRT+) de Lc. cremoris favorise la dégradation des protéines et provoque l’apparition de nutriments azotés. Cela permet aux souches protéinase négative (PRT-) telles que certaines souches Lc. lactis, de croître (Fox et
al., 2017). Par la suite, les bouillons ont été centrifugés (3000 x g, 15 minutes, 4°C) et les
cellules lavées avec du tampon phosphate 0,1M pH 6.0 préalablement stérilisé (121°C/15min). Après une seconde centrifugation (3000 x g, 15 minutes, 4°C), les cellules ont été suspendues dans un nouveau tampon phosphate, de façon à obtenir une concentration de 1 x 1010 UFC/mL. Ces concentrations ont été vérifiées et confirmées sur milieu Reddy après incubation en anaérobiose (48 heures/30°C) tel que décrit à l’Annexe IV.
21 2.3.5 Production de poudre de caillé
Un caillé sans ferment a été produit au Centre de recherche et développement de St-Hyacinthe (Saint-St-Hyacinthe, Qc, Canada) selon la méthode décrite par Gardner-Fortier et al. (2013). Un volume de 400L de lait entier a été pasteurisé à 72°C pendant 20 secondes avant d’être transféré dans un bassin de fabrication fromagère à 30°C. Une solution de chlorure de calcium (33 % w/v) a été ajoutée à raison de 20 mL par 100L de lait. Après 30 minutes, 80 mL de présure double-force ainsi qu’une solution de 1,35 kg de glucono delta lactone (GDL) préparée dans 5,33L d’eau ont été ajoutées au lait. Le lait a ensuite été laissé au repos pendant 30 minutes. La cuisson du caillé a ensuite débuté immédiatement après le découpage (augmentation de la température de 30°C à 38°C sur une période de 30 minutes). Lorsque la température de 38°C a été atteinte, celle-ci a été maintenue pendant 30 minutes, puis le caillé fut égoutté (pH d’environ 5,7). Le caillé fut ensuite placé dans des moules carrés tapissés de coton à fromage et pressé à 300 kPa pendant 2 heures à température pièce. Après avoir été râpé, le caillé a été congelé à -32°C pour finalement être lyophilisé et réduit finement en poudre à l’aide d’un broyeur à disques (GlenMills Inc., Clifton, NJ, É.-U.) Pour assurer la stérilité de la poudre, celle-ci a été irradiée à 5 kGy pendant 2 heures et conservée à -20°C jusqu’à son utilisation.
2.3.6 Préparation des caillés modèles
Des caillés modèles simulant la matrice d’un fromage de type Cheddar ont été préparés tel que décrit par Gardner-Fortier et al. (2013) selon les conditions optimales de production de GABA suivantes : ratio sel/humidité de 3,5 % ; 3,0 mg de glutamate/g de caillé et un pH de 4,8. De plus, pour vérifier l’effet d’un ajout de pyridoxal-5’-phosphate (PLP, AlfaAesar, lot :10 183 440), trois différentes concentrations ont été testées : 0 μM, 50 μM et 100 μM..
La figure 2.1 présente les différents traitements appliqués aux caillés modèles. Trois tampons citrates ont été préparés selon les différentes concentrations en PLP de façon à respecter la teneur en NaCl nécessaire à l’obtention du ratio S/H visé (3,5%), un pH de 4,8 et selon la concentration de PLP calculée pour l’obtention des trois concentrations étudiées.
Suite à la préparation des tampons, ceux-ci ont été filtrés (0,22 μm) et conservés à 4°C stérilement jusqu’à leur utilisation. Étant donné la photosensibilité du PLP, les bouteilles étaient recouvertes de papier aluminium en tout temps.
22
Pour chaque traitement, 100 g de caillé modèle a été produit selon la méthode de Gardner-Fortier et al. (2013). Le pH (4,80) a été ajusté par l’ajout de 2 g de GDL (Sigma, lot 70H016, G-4750). 60 g de poudre de caillé modèle ont été pesés, puis mélangés à la GDL. 2 mL de ferments (1 mL de la souche Lc. lactis A23 ou H13 et 1 mL de la souche Lc. cremoris dans
les deux premiers cas ; 0,5 mL des deux souches Lc. lactis, 1 mL de la souche Lc. cremoris pour le troisième) ont été inoculés au moment de l'addition de 36 mL de tampon citrate. Lors de la réhydratation des caillés modèles, ceux-ci ont été inoculés avec l’un des trois ferments suivants : Lc. cremoris W62 et Lc. lactis A23 ; Lc. cremoris W62 et Lc. lactis H13 et finalement Lc. cremoris W62, Lc. lactis A23 et Lc. lactis H13. Les bactéries des deux premiers ferments étaient en proportion 1 : 1 et le dernier 2 : 1 : 1. Le nombre total de traitements était de 9 (voir figure 2.1).
La teneur en humidité du caillé modèle (mélange poudre de caillé, GDL et tampon citrate inoculé) était de 38 % (p/p). Les 100 g de caillé modèle obtenus furent répartis dans deux pots ambrés stérilisés à l’autoclave (121° C/15min) (thermo scientific, item #140-0060, # production 00061190). Le premier pot a servi aux analyses de dénombrement, du pH et de la teneur en humidité au jour 1, et le deuxième pour le dénombrement, le pH et la quantification de GABA au jour 10. L’oxygène de l’espace de tête fut remplacé à l’aide d’un courant d’azote délivré par un tube relié à une bombonne d’azote gazeux. La concentration cellulaire visée pour 50 g de caillé modèle était de 2 x 108 UFC/g (Gardner-Fortier et al., 2013 ; Roberts & Wijesundera, 1995), concentration estimée et obtenue suite à des dénombrements
23
préliminaires des ferments selon la méthode expliquée à la section 2.3.4. Le témoin négatif a été produit de la même façon, en remplaçant le ferment par un volume identique d’eau déionisée stérile. Les différents pots ambrés ont ensuite été placés dans un incubateur à 30°C
(Baxter, scientific products ultra tech, wj301d) pendant 1 et 10 jours. Trois répétitions ont
été effectuées pour chaque traitement.
2.3.7 Analyses microbiologiques
Dix grammes de caillé modèle ont été placés dans 90 mL d’eau peptonée 0,1 % stérile (BP, lot 5040673) et homogénéisés à l’aide d’un Ultraturrax (T25 ika Werke (tige : S25N-18 G))
dans un sac conçu à cet effet selon la méthode employée par Gardner-Fortier et al. (2013). Pour détruire les chaînes de lactocoques, 40 agitations vigoureuses ont été appliquées à la bouteille contenant la dilution 10-3, à laquelle 3 g de billes de verres avait été ajoutés. Suite à la dilution en série dans l’eau peptonée 0,1 %, des géloses Reddy ont été inoculées par étalement. Le milieu Reddy est un milieu différentiel pour les souches utilisées : Lc. lactis forme des colonies blanches/pourpres et Lc. cremoris forme des colonies jaunes, suite à l’acidité produite en utilisant le lactose du lait. Les boîtes de pétri alors ensemencées ont été incubées à 30°C pendant 48 heures dans une chambre anaérobie (Forma scientific anaerobic
system, model 1025 s/n 13930-475).
2.3.8 Quantification du GABA
La quantification du GABA dans les caillés modèles a été effectuée selon la méthode employée par Gardner-Fortier et al. (2013). Un échantillon de 10 g de caillé modèle été placé dans un tube conique de 50 mL, auquel 20 g d’eau distillée furent ajoutés. Le mélange a été homogénéisé à l’Ultraturrax (T25 ika Werke , tige : S25N-18 G) à une vitesse de 13 500 RPM pendant 1 minute. Les tubes ont été placés dans un bain-marie (Thermo scientific, numéro de série 205336-648) à 40°C pendant 1 heure. Cela a permis de retirer plus facilement la matière grasse après une centrifugation de 30 minutes à 4°C à 4300 RPM (Beckman Coulter, avanti J-E, numéro de série JSE08M11). La phase aqueuse a été filtrée sur papier filtre Whatman #42 (GE Healthcare Lice Sciences, lot 9692869). L’ajout de 20 g d’eau, l’homogénéisation, l’incubation et la centrifugation ont été effectués à nouveau sur le culot obtenu afin de récupérer le maximum d’azote soluble dans l’eau (NSE). Cette nouvelle phase aqueuse a été filtrée sur le même filtre Whatman que la précédente. Le dosage du
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GABA a été réalisé sur la fraction d’azote soluble dans l’eau à l’aide d’une trousse EZ : faast™ GC-FID Physiological Amino Acid Analysis.
Après dérivation, les échantillons ont été analysés pour déterminer la concentration en GABA par chromatographie en phase gazeuse couplée à détecteur à flamme ionisante (FID). Les résultats ont été exprimés en mg de GABA par 100 grammes de caillé modèle.
2.3.9 Analyses statistiques
Pour chaque caillé modèle, 3 répétitions ont été effectuées et les moyennes obtenues ont été analysées par une ANOVA selon un plan expérimental en tiroirs (split-plot design), le tiroir principal étant la quantité de PLP ajoutée et les différentes combinaisons de souches productrices de GABA à l’étude représentant le sous-tiroir. Les différences significatives ont été testées à P < 0,05 avec la procédure SAS/STAT® (SAS User’s Guide, 1999).
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2.4 Résultats et discussion
2.4.1 Détection de la production de GABA par l’activité de l’enzyme GAD
La figure 2.2 présente quelques exemples de coloration du milieu GM17 pour différentes souches testées. Parmi les sept souches testées, seules les bactéries productrices de GABA Lactococcus lactis ssp. lactis H13 et A23 ont présenté un changement de couleur. Pour les souches Lactobacillus casei et Lactobacillus paracasei, la couleur était identique à la couleur de la souche productrice W62. Par conséquent, ces souches semblent non-productrices de GABA.
2.4.2 Détection de la production de GABA par la production de CO2
Le test a produit des résultats moins affirmatifs que ceux obtenus par Wu & Shah (2015). Dans leur expérience, les souches avaient produit une quantité de CO2 dissous plus
importante comparativement aux résultats de cette étude. Lors de cette expérience, les souches testées n’ont, dans la plupart des cas, pas produit de CO2. Cependant, les résultats
obtenus ont confirmé ceux de l’enzyme GAD : seules les souches Lactococcus lactis ssp.
lactis H13 et A23 ont produit une certaine quantité de CO2, ce qui confirme leur capacité à
produire du GABA.
Figure 2.2 : Couleur des tubes contenant respectivement de gauche à droite les souches
Lc. lactis A23 et Lc. lactis H13 et Lb. paracasei A180, et une comparaison sur fond noir
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2.4.3 Populations microbiennes dans les caillés modèles
Une interaction significative triple (P ≤ 0,05) a été observée entre les différents facteurs, soit la durée d’affinage, la quantité de PLP ajoutée ainsi que le choix du ferment. La figure 2.3 présente les concentrations cellulaires dans les caillés des souches Lc. lactis A23 et H13 au jour 1 et après 10 jours à 30°C, en fonction du ferment employé (H13 100 % ; A23 100 % et 50 % H13 50 % A23) ainsi que de la quantité de PLP (0 μM, 50 μM et 100 μM). Les populations de Lc. cremoris ne sont pas présentées. Les populations initiales des souches Lc.
lactis n’étaient pas significativement différentes (P > 0,05), et en moyenne de 6,71 log
CFU/g. Dans le cas des caillés modèles contenant la souche H13, à 100 % ou 50 %, l’augmentation des populations est significative (P ≤ 0,05). Pour le ferment 100 % A23, les populations n’ont pas varié de façon significative (P > 0,05) entre le jour 1 et le jour 10. Ces résultats sont différents de ceux obtenus par Gardner-Fortier et al. (2013), dont les populations A23 et H13 ont subi en moyenne une perte de 8,23 log UFC/g de caillé. À l’exception de l’addition de PLP et l’ajout d’un nouveau ratio de ferment (50 % A23/50% H13), les différentes variables (température, sel, pH, concentration en glutamate, humidité) étaient contrôlées et d’une valeur semblable à celles de l’équipe de Gardner-Fortier et al. (2013). Dix jours d’affinage dans des caillés modèles à 30°C est équivalent à un affinage de plus de 7 mois, et dans ces conditions, les populations diminuent normalement de façon importante (McSweeney et Fox, 1993 ; Farkye et al., 1995). Les souches, la concentration des populations dans le ferment et la température d’affinage étant les mêmes que dans le cas des travaux de Gardner-Fortier et al. (2013), ces résultats pourraient être partiellement expliqués par l’usage d’une poudre de caillé modèle différente de celle employée par Gardner-Fortier et al. (2013), ce qui a pu permettre la croissance de la souche Lc. lactis H13.
Dans le cas des populations des caillés contenant le ferment 50 % H13 / 50 % A23, il est très probable que les populations dénombrées soient essentiellement des colonies formées par la souche H13. En effet, les populations sont significativement comparables (P ≤ 0,05) aux populations des caillés modèles contenant le ferment 100 % H13.
Bien que les souches A23 et H13 produisent toutes les deux du GABA et qu’elles aient été employées traditionnellement pour la fabrication de cheddar, les travaux de Gardner-Fortier
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façon différente. Par exemple, la souche H13 a montré une plus grande sensibilité au sel que la souche A23. En plus d’une tolérance au sel différente, d'autres différences existantes entre ces deux souches pourraient expliquer la meilleure survie de la souche H13.
2.4.4 Production de GABA
La figure 2.4 présente les concentrations de GABA en mg par 100 grammes de caillés modèles après 10 jours à 30°C, en fonction du ferment employé et de la concentration de PLP. La concentration de PLP et le ferment ont eu un impact sur la production de GABA. Par conséquent, une interaction double significative a été observée pour ces deux facteurs (P ≤ 0,05).
La teneur en GABA est plus élevée pour les caillés modèles ayant pour ferment la souche productrice de GABA H13 et le mélange des deux souches productrices selon un ratio 50/50, tout particulièrement sans PLP. La production de GABA plus faible dans le cas des caillés modèles 100 % A23 peut s’expliquer par l’absence de croissance de la souche, alors que dans les deux autres cas les populations de lactocoques ont augmenté de façon significative, et vraisemblablement, la quantité d’enzyme GAD présente.
Figure 2.3 : Concentrations cellulaires de Lc. lactis A23 et Lc. lactis H13 dans les caillés modèles
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Figure 2.4 : Concentrations de GABA en fonction des traitements appliqués aux caillés modèles
Un ajout de 50 μM de PLP par 100 g de caillé modèle semble avoir légèrement favorisé la production de GABA, mais en comparant les différentes concentrations et les ferments respectifs, les quantités de GABA produites ne sont pas significativement différentes. À l’exception du caillé modèle 100 % A23 en absence de PLP, les différentes concentrations de GABA des caillés modèles sont significativement comparables (P > 0,05). Les travaux de Yang et al. (2008) ont montré qu’un ajout de PLP initial ou après 24 h n’a eu pratiquement aucun effet sur la production de GABA, alors qu’un ajout de PLP après 48 h de fermentation a entrainé une production bonifiée de GABA. Dans la même étude, la culture productrice était incubée à 37ºC et le milieu maintenu à un pH de 6.8. Ils ont conclu que le PLP s’était probablement dénaturé de façon prématurée dans le bouillon de culture. La dénaturation du PLP peut être due au pH, la température et à des interactions avec des composés présents dans le milieu (Kozlov & L’vova, 1977). Le PLP ajouté aux caillés modèles aurait donc pu être partiellement dénaturé, ce qui expliquerait l’absence de différence entre les différentes concentrations de PLP.
La concentration maximale de GABA obtenue a été de 47,4 mg /100g de caillé modèle, dans le cas du ferment H13 avec une supplémentation de 50 μM de PLP. Cette concentration est plus faible que la concentration maximale observée par Gardner-Fortier et al. (2013), qui
