Évaluation du profil en acides aminés et mesure de la digestibilité de l'azote du tourteau de canola chez des vaches laitières

Évaluation du profil en acides aminés et mesure de la

digestibilité de l'azote du tourteau de canola chez des

vaches laitières

Mémoire

AMAL ROUISSI

Maîtrise en sciences animales

Maître ès sciences (M. Sc.)

Québec, Canada

Évaluation du profil en acides aminés et mesure de

la digestibilité de l'azote du tourteau de canola chez

des vaches laitières

Mémoire

AMAL ROUISSI

Sous la direction de :

Doris Pellerin, directeur de recherche

Daniel Ouellet, codirecteur de recherche

III

Résumé

Des études ont montré que la substitution, par le tourteau de canola (TC), d’autres sources protéiques augmente la production laitière des vaches d’en moyenne 1 kg/j. Par contre, les prédictions des protéines métabolisables (PM), en utilisant le modèle du NRC (2001), laissent penser que l'inclusion de TC diminue l’approvisionnement en PM pour les vaches. Une différence majeure entre le tourteau de soya (TS) et le TC est la valeur de la digestibilité intestinale estimée dans le modèle du NRC (2001): la digestibilité du TC est de 75 % contre 93 % pour le TS. Cela pourrait être dû à une sous-estimation de la digestibilité avec la technique de sachets mobiles.

Ainsi, notre objectif était d'évaluer la digestibilité des protéines non dégradées dans le rumen par la méthode conventionnelle des sachets mobiles et par l’enrichissement avec le15_{N. Quatre vaches munies d’une fistule ruminale et d’une} canule duodénale ont été nourries avec : deux sources de tourteau de canola, une commerciale (TCC) et l’autre marquée avec 15_{N(TCM), et du tourteau de soya (TS).} Les résultats montrent qu’il n’y a aucune différence significative dans la dégradabilité effective de la protéine brute entre le TS, le TCC et le TCM (63,5 %, 62,8 % et 63,1 %, erreur standard moyen (ESM) = 2,47, respectivement). Pour la digestibilité intestinale de la protéine brute, aucunedifférence n’a été observéeentre les deux méthodes citées pour le TCM (76,1 %, et 70,04 %, ESM = 0,2, respectivement). Par contre, les résultats indiquent un effet significatif de la taille des pores des sachets sur la digestibilité intestinale. Comme nos résultats montrent qu’il n’y a pas une sous-estimation de la digestibilité, plusieurs questions se posent sur le profil des acides aminés du TC qui pourrait être responsable de la réponse positive sur la production laitière de substitution d’autres sources protéiques.

IV

Abstract

Many studies have shown that substituting canola meal (CM) to other protein sources in dairy cows, increases milk production average by 1 kg/d. Contrariwise, the predictions of metabolizable protein, using the model of the NRC (2001), showed that the inclusion of CM decreases the predicted availability of metabolizable protein for cows. A major difference between soybean meal (SBM) and CM is the value of the estimated intestinal digestibility in the model of NRC (2001): the intestinal digestibility of CM is 75% against 93% for SBM. This could be caused by an underestimation of the intestinal digestibility with the mobile bags technique.

Then, the goal of this study was to evaluate intestinal digestibility of the undegraded protein by the conventional method of mobile bags and 15_{N method. Four} cows equipped with ruminal fistula and duodenal cannula were fed with: two sources of canola, commercial canola meal (CCM), and the other canola meal labelled with15_{N (LCM), and a commercial soybean meal (SBM). Results showed that there is} no significant difference in the effective degradability of CP for SBM, CCM and LCM (63.5%, 62.8% and 63.1%, standard error of the mean (SEM) = 2.47, respectively). For intestinal digestibility of the crude protein CP, there was no difference between the method of mobile bags and 15_{N method for the LCM (76.1%,} 70.04%, SEM= 0.2, respectively). Contrariwise, the results indicate a significant effect of bag pore size on the intestinal digestibility. As our results show that there is no underestimation of digestibility, several questions arise on the amino acid profile of the CM that may be responsible for the positive response in milk production of substituting CM to other protein sources.

V

Table des matières

Résumé ... III Abstract ... IV Table des matières ... V Liste des tableaux ... VIII Liste des figures ... IX Liste des abréviations ... III Remerciements ... IV Avant-propos ... VI

Chapitre 1 : Introduction ... 1

Chapitre 2 : Revue des travaux antérieurs... 3

2.1. Caractéristiques anatomiques, les particularités digestives des bovins et milieu physico-chimiques du rumen ... 3

2.1.1. Anatomie du rumen ... 3

2.1.2. Particularités digestives des bovins ... 4

2.1.2.1. La rumination ... 4

2.1.2.2. La digestion ruminale ... 5

2.1.3. Flore microbienne ... 5

2.1.3.1. Les protozoaires ... 6

2.1.3.2. Les bactéries ... 6

2.1.4. Conditions physico-chimiques du milieu ruminal ... 7

2.1.4.1. Le pH ... 7

2.1.4.2. La température ... 8

2.1.4.3. L’anaérobiose ... 9

2.1.4.4. Pression osmotique... 10

2.1.4.5. Humidité ... 10

2.2. Métabolisme protéique chez la vache laitière ... 11

2.2.1. Besoin en acides aminées ... 12

2.2.2. Mécanisme de la dégradation ruminale des protéines ... 14

2.2.2.1. Dégradation ruminale des protéines ... 14

2.2.2.2. Vitesse de dégradation ... 15

2.2.2.3. Synthèse microbienne ... 16

2.2.3. Mécanisme de la digestion intestinale des protéines... 17

VI

2.2.3.2. Mécanismes d’absorption ... 19

2.2.3.3. Le bilan azoté ... 20

2.2.3.4. L’azote exogène et endogène dans le système digestif ... 21

2.2.3.5. Extraction hépatique des acides aminés ... 22

2.2.4. L’azote de la matière fécale et l’excrétion urinaire ... 23

2.3. Méthodes d’évaluation de dégradation et de digestion ... 24

2.3.1. Dans le rumen: méthodes d’évaluation de dégradabilité dans le rumen (in sacco)... 24

2.3.2. Dans l’intestin ... 26

2.3.2.1. Méthode des sachets mobiles ... 26

2.3.2.2. Méthode de marqueur isotopique ... 27

2.3.2.3. Méthode des poulets ayant subis une typhlectomie (résection du caecum ou en anglais « cecectomized rooster »). ... 28

2.3.2.4 Méthode in vitro en 3 étapes ... 29

2.3.2.5. Comparaison entre les différentes méthodes de mesure de digestibilité ... 30

2.4. Caractérisation nutritionnelle du TC ... 30

2.4.1. La fabrication du tourteau à partir des graines ... 30

2.4.2. Composition chimique du TC ... 31

2.4.2.1. Contenu en protéines et en AA ... 33

2.4.2.1.1. Les protéines ... 33

2.4.2.1.2. Le profil en acides aminés ... 33

2.4.2.2. Minéraux et vitamines ... 34

2.4.2.3. Glucides et fibres... 35

2.4.2.4. Teneur en huile ... 36

2.4.2.5. Les facteurs antinutritionnels ... 36

2.4.3. Dégradabilité ruminale du TC ... 38

2.4.4. Effet d'une complémentation en TC chez la vache laitière ... 40

2.5. Objectifs du projet de maîtrise ... 42

2.6. Listes des ouvrages cités ... 43

Chapitre 3 ... 54

Evaluation of the nutritive value, the rumen degradability and the intestinal digestibility of canola meal ... 54

ABSTRACT ... 55

RÉSUMÉ ... 56

VII

3.2. Material and Methods ... 58

3.2.1. In Situ Procedure ... 58

3.2.2. Solubility Measurement ... 59

3.2.3. Intestinal Digestibility using Mobiles Bags ... 59

3.2.4. Intestinal Digestibility using 15_{N-labelled Canola Meal ... 60}

3.2.5. Calculations and Statistical Analyses... 60

3.3. Results and Discussion ... 62

3.3.1. Feed Chemical Composition ... 62

3.3.2. Rumen Degradation Kinetics ... 64

3.3.3. AA Composition of the RUP ... 65

3.3.4. Intestinal Digestibility Evaluated by Mobile Bags Method ... 68

3.3.5. Intestinal Digestibility Evaluated by 15_{N method ... 69}

3.4. Conclusions ... 71

3.5. Acknowledgments ... 72

3.6. References ... 73

VIII

Liste des tableaux

Chapitre 2

Tableau 1. Besoins en acides aminés exprimés en pourcentage de l’apport en protéine digéré chez la vache laitière. Adapté de Rulquin et al. (2001) et Doepel et al. (2002).

... 14

Tableau 2. Vitesse de dégradation des protides dans le rumen. ... 16

Tableau 3. Composition (%) et digestibilité intestinale (%) de l’azote microbien. .... 17

Tableau 4. Principales enzymes intervenant dans la digestion intestinale des protéines et des peptides. AA : acides aminés. ... 19

Tableau 5. Comparaison de la composition chimique entre le TC et le TS. ... 32

Tableau 6. Comparaison des compositions en acides aminés essentiels (AAE) du TC et du TS (% des AAE). ... 34

Tableau 7. Teneur en vitamines dans le TC et dans le TS. ... 35

Tableau 8. Teneur en minéraux dans le TC et dans le TS... 35

Tableau 9. Composants glucidiques et fibres du TC et du TS. ... 36

Tableau 10. Effets de différentes doses de glucosinolates sur les bovins. ... 37

Tableau 11. Teneurs en sinapine, tannins et acide phytique dans le TC. ... 38

Tableau 12. La production de lait des vaches (kg/jour) nourries de TC par rapport au TS ou de tourteau de coton (traitement Contrôle). ... 42

Chapitre 3 Table 3.1. Chemical composition and AA composition of the feed ingredients ... 63

Table 3.2. Rumen degradation parameters and effective degradability of DM and CP for the feed ingredients... 66

Table 3.3. Amino acid composition of the 3 feed ingredients residues after 12-h of ruminal incubation (% of CP) and the ratio 12-h AA concentration to original feed concentration (ratio) ... 67

IX

Liste des figures

Figure 1.Structure générale du tube digestif. Repérée à http://www.epathologies.com. ... 4 Figure 2. Digestion ruminale (% par h). Tirée de Ferran (2010). ... 5 Figure 3. Mesures du pH ruminal prises en continu sur 24 heures chez une vache Holstein. Tirée de Mutsvangwa et Wright (2012). ... 8 Figure 4.Évolution du pH du rumen en fonction de la température ruminale. ... 9 Figure 5. Relation entre NADH-oxydase et la pression partielle d'oxygène. Tirée de Samah et Wimpenny (1982)... 10 Figure 6. Métabolisme azoté et production d'urée chez les ruminants. PID = protéine ingérée dégradée; PIND = protéine ingérée non dégradée; AR= ammoniac ruminal. Tirée de Lefebvre (1996). ... 12 Figure 7. Contribution des différentes tissus à la masse protéique, la synthèse protéique et à l’utilisation nette d'oxygène qui représente un indicateur de l'énergie utilisée. Tirée de Lobley (2002). ... 13 Figure 8. Effet de la teneur en matières azotées du régime sur l’ingestion de matière sèche. Tirée de Journet et al. (1983). ... 15 Figure 9. Calcul simplifié de la digestibilité. Tirée de Low (1982). ... 20 Figure 10. Prévision des matières azotées (MA) au duodénum à partir des mesures de dégradabilité de l’azote in sacco. Tirée de Sauvant et Nozière (2013). ... 22 Figure11. Variation des protéines métabolisables en fonction de la variation des protéines du lait estimée par le NRC (2001) suite à l’ajout de TC. ... 27 Figure 12. Résultats de la dégradabilité effective de la protéine du TC évaluée par la technique in saccod’après quelques études. ... 39 Figure 13. Crude protein intestinal digestibility estimated with mobile bags ... 68 Figure 14. Effect of pore size on CP intestinal digestibility, P-value (pore size × materials) = 0.005, SEM = 0.47. ... 69 Figure 15. Atom % excess enrichments of 15_{Nin faecal collected between 0 and 28 h} after the introduction of labelled canola meal into the duodenum of cow. ... 70 Figure 16. Individual cumulative excretion of 15_{N (% of dose given) in fecal N after} cows were dosed with 15_{N-labelled CM. ... 70}

III

Liste des abréviations

AA :Acides aminés

AGV :Acides gras volatils ANP :Azote non protéique EE : Extractif éthéré

ESM : Erreur standard moyen

FDA : (acid detergent fiber) fibre au détergent acide FDN : (neutral detergent fiber) fibre au détergent neutre MAT : Matière azotée totale

MA : Matière azotée MG : Matière grasse

MOF : Matières organiques fermentées dans le rumen MS : Matière sèche

PB : Protéine brute

PIA : Protéines alimentaires non digères dans le rumen PM : protéines métabolisables

IV

Remerciements

J’exprime toute ma reconnaissance à mes directeurs de maîtrise, Dr Doris Pellerin et Dr Daniel Ouellet. Merci infiniment à vous deux pour votre encadrement, pour votre gentillesse, votre disponibilité pour ce projet, pour la confiance que vous m’avez accordée, pour vos multiples conseils et critiques et pour votre compréhension surtout.

Un grand merci à Dre Hélène Lapierre, pour sa gentillesse durant ces deux années, pour ses conseils scientifiques et son implication dans ce projet de maîtrise. Je vous suis reconnaissante de m'avoir aidée.

Un merci particulier à Danielle Bournival, technicienne de laboratoire au centre de recherche d’Agriculture et agroalimentaire Canada à Sherbrooke, pour votre gentillesse, pour votre aide tout le long des différentes étapes de ce projet, pour vos conseils et surtout votre soutien moral. Danielle, vous resterez toujours mon amie. Merci à Sylvie Dallaire et à Catherine Morin pour vos conseils et vos aides durant les préparatifs pour la phase animale. Merci à Mario Léonard pour votre disponibilité pendant la phase animale de projet et pour votre soutien moral. Je remercie également Dre Khalida Bekri et Jocelyne Renaud pour votre participation à la phase laboratoire de ce projet.

Je tiens à remercier les personnes qui m’ont entourée durant ces deux années qui sont au même temps mes collègues et mes amies : Sophie, Douglass, Luca, Noémie,

Sabine, Marika, Daniel, Enrique, Aline, Michaël, Hanen et Fadi, un grand merci pour

vos amitiés et votre disponibilité en tout temps.

A mes chers parents Hamadi et Monia, pour leur soutien, leur aide, leur patience et leur présence tout au long de mes études. Je n’y serais pas arrivée sans vous. C’était assez difficile de vous quitter pour venir au Canada, mais c’est la vie ! Que Dieu vous exauce de santé etvous garde pour moi.

V

A mes sœurs Aya, Farah et Sirine, je ne peux pas exprimer à travers ses lignes tous mes sentiments d’amour et de tendresse envers vous. Puisse l’amour et la fraternité nous unir à jamais.

A ma chère amie Olfa Hannech, mon âme sœur depuis 9 ans, la personne qui m’a toujours soutenue et encouragée, qui m’a partagé la joie et le malheur durant des années. Et malgré la distance qui nous sépare, elle est toujours présente avec moi. Je te souhaite tout le bonheur du monde. Que Dieu nous réunisse bientôt.

Merci à Khaoula Amaimi, pour tous les bons moments qui sont devenus inoubliables, merci d’être là et de m’écouter pendant ces moments.

A mes chers amis, spécialement, Khaoula Bedis, Sabah Mabrouki, Ensaffe Riahi,

Amani Bahri, Mohamed Boulbeba Farhat, Ali Abdellali et Hamdi S' hall, qui m’ont

toujours soutenu avec un grand cœur. Que malgré la distance et le décalage horaire surtout, vous trouvez toujours le temps pour moi. Si on ne se parle pas à chaque jour, c’est sûr qu’on se parle à chaque semaine. Vous avez fait preuve d’une amitié sincère et durable et dont je garde un souvenir merveilleux. Vous m’avez aimablement soutenu quand j’en avais besoin. Qu’ils trouvent ici tous mes vœux de bonheur et de réussite. Je vous souhaite une bonne chance pour votre vie. À bientôt !

VI

Avant-propos

Ce mémoire contient trois chapitres: le premier chapitre contient l’introduction, le deuxième chapitre est consacré à la revue de littérature et le troisième chapitre présente, sous forme d’article scientifique, les résultats de mon projet.

Je suis l’auteure principale de cet article, les coauteurs sont les chercheurs Hélène Lapierre, Daniel Ouellet, Doris Pellerin et la post doctorante Khalida Bekri. Toutes ces personnes se sont impliquées dans les travaux. L’article porte le titre «Evaluation of the nutritive value, the rumen degradability and the intestinal

digestibility of canola meal» et sera soumis prochainement pour une publication

1

Chapitre 1 : Introduction

Le canola, une plante oléo-protéagineuse qui appartient à la famille des crucifères, est le résultat d’une sélection génétique du colza réalisée au Canada visant à diminuer les concentrations d’acide érucique (retrouvé dans l’huile) et des glucosinolates (retrouvés dans le tourteau), des composés toxiques et non-appétants (Ravichandiran et al. 2008).

D’après la fédération des producteurs de cultures commerciales du Québec (2013), en quelques dizaines d’années, le canola est devenu l’une des plus importantes cultures oléagineuses au monde et la denrée la plus rentable pour les agriculteurs canadiens. Le Conseil canadien du canola vise une production de 15 millions de tonnes en 2015. Le canola est principalement cultivé dans l’Ouest canadien (Casséus, 2009), mais il est aussi cultivé dans plusieurs régions de la province de Québec: Abitibi-Témiscamingue, Québec, Bas du Fleuve, Beauce, Mauricie (Denis, 2003).

D’après Denis (2003), il y a deux types de canola: • Le type argentin ou Brassica napus ; • Le type polonais ou Brassica campestris.

Au Québec, c’est le type argentin qui est cultivé, son rendement étant de 20 à 25 % plus élevé que pour le type polonais (Denis, 2003).

La graine de canola contient environ 42-43 % d’huile qui est extraite pour la consommation humaine. Après l’extraction de l’huile, il reste le tourteau de canola (TC) très utilisé en alimentation animale. Ce tourteau contient moins de protéines brutes (PB), que le tourteau de soya (TS) (37,8 et 49,9-53,8 % PB, pour le TC et le TS, respectivement ; NRC, 2001), mais présente un profil d’acides aminés (AA) qui pourrait être avantageux pour la production laitière (Jeejeebhoy, 2000 ; NRC, 2001).

2

Le TC, ce complément protéique très appétant pour les ruminants (Spörndly et Asberg, 2006), peut être une solution de remplacement économique au TS dans les rations des bovins laitiers d’Amérique du Nord. De même, Brito et Broderick (2007) indiquent clairement que, même à des niveaux élevés de production, le TC est encore un complément de protéines de qualité supérieure en comparaison au TS ou au tourteau de coton.

En effet, une méta-analyse récente (Martineau et al., 2013) démontre que la production de lait des vaches laitières a augmenté avec la substitution du TS par du TC dans les rations, et cela sans tenir compte de l’augmentation de la prise alimentaire. Les rendements en protéines ont varié positivement lors de la substitution d’une source de protéines par le TC. En plus, cette variation en rendement dépendait de la source de protéine substituée; la variation positive observée pour la substitution du TS par le TC était la moitié de celle constatée pour la substitution des autres sources de protéines.

Le but de ce travail était d’évaluer la dégradabilité ruminale du TC et de comparer deux méthodes d’évaluation de la digestibilité intestinale du tourteau de canola : la méthode des sachets mobiles et la méthode de disparition intestinale de15_{N de TC enrichi.}

La partie expérimentale, résultats et discussion de ce mémoire est présentée sous forme d’un article scientifique qui sera publié dans une revue internationale avec comité de lecture.

3

Chapitre 2 : Revue des travaux antérieurs

2.1. Caractéristiques anatomiques, les particularités digestives des bovins

et milieu physico-chimiques du rumen

2.1.1. Anatomie du rumen

Le rumen est le compartiment le plus volumineux des réservoirs gastriques : il contient presque 150 - 200 L chez un bovin adulte pour un poids vide d’à peu près 7 kg (Sauret, 1988).«Le rumen a la forme d’un sac allongé crânio-caudal, divisé en sac dorsal et un sac ventral à mi-hauteur par un sillon longitudinal, le sillon caudal qui sépare le cul-de-sac dorsal du rumen et le cul-de-sac ventral du rumen. Ces deux cul-de-sac sont séparés du sac ventral et dorsal par les sillons coronaires (dorsaux et ventraux)».

On trouve au niveau du rumen les quatre constituantes de la paroi gastrique (Figure 1) :  Adventive (ou séreuse)

Elle est une couche externe qui enveloppe toute la surface de l’organe. C’est une couche de tissu conjonctif dense vascularisée et comportant nombreux adipocytes.

 La musculeuse

C’est une couche épaisse, formée de cellules musculaires lisses disposées selon deux axes : une couche circulaire interne et une couche longitudinale externe. Entre les deux, on trouve des plexus nerveux d’Auerbach.

 Sous muqueuse

Elle est constituée de tissu conjonctif lâche et contient le plexus nerveux de Meissner ainsi que des vaisseaux sanguins et lymphatiques pour la muqueuse.

 La muqueuse

Elle est située au-dessus d’un chorion composé d’un tissu conjonctif lâche, très vascularisé, riche en cellules immunitaires. La muqueuse se termine par la musculaire de la muqueuse appelée muscularis mucosae qui est formée de cellules musculaires lisses.



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5

organismes du rumen. Une vache peut mastiquer de 50 à 70 fois par minute et pendant 10 à 12 heures par jour, soit 40 000 à 45 000 mouvements de mâchoire par jour (Gilles, 2015.) 2.1.2.2. La digestion ruminale

La digestion se déroule en grande partie dans le rumen grâce à sa flore microbienne et à son volume important. La durée de rétention d’un aliment dans le rumen varie selon sa forme: environ 10 heures pour les liquides et jusqu’à 25 à 60 heures pour les solides (Rémond et al., 1995). Le temps de digestion ruminale dépend de la nature d’aliment, la taille des particules de l’aliment et sa teneur en sucre (Figure 2).

Figure 2. Digestion ruminale (% par h). Tirée de Ferran (2010).

2.1.3. Flore microbienne

Les micro-organismes sont présents en nombre variable dans les réservoirs gastriques des mammifères. On trouve des bactéries, des protozoaires et des mycètes. Cette flore microbienne d’après Gouet (1986) dégrade jusqu’à 60 à 90 % des aliments digestibles. Ils remplissent un rôle important dans la nutrition et la physiologie de l’animal.

6 2.1.3.1. Les protozoaires

Les protozoaires sont des organismes unicellulaires, microscopiques et eucaryotes découvert par Gruby et Delafond en 1843. Ils appartiennent à l’embranchement des ciliés et leur nombre peut être jusqu´à un million par mL de liquide de rumen. Ils peuvent représenter 40 à 50 % de la biomasse du rumen lorsque le pH y est stable entre 6 et 7. Avec des rations très riches en concentrés, le pH peut baisser à 5,5 ce qui fait diminuer le nombre des protozoaires voire les faire disparaitre (Thivend et al., 1985).

Les protozoaires du rumen représentent deux groupes : les «holotriches» et les «entodiniomorphes» (Robles, 2006). Les protozoaires ciliés se nourrissent de deux manières, soit de bactéries soit de glucides et protides provenant des aliments digérés (Williams et al., 1992). Les genres Epidinium, Entodinium et Polyplastron sont capables d’ingérer des débris végétaux et de digérer leurs composants y compris la cellulose, les hémicelluloses et les substances pectiques. De plus, la plupart des protozoaires ingèrent des bactéries dont les protéines sont dégradées; ils sont activement protéolytiques mais n’utilisent pas l’ammoniaque.

2.1.3.2. Les bactéries

Il y a eu plusieurs recherches pendant ces 40 dernières années dont l’objectif était l’étude de la population bactérienne (Guillaume, 2007). Leur nombre est de l’ordre de 109 _à 1010 _{/mL de contenu de rumen. Selon Czerkawski et al. (1988), les bactéries ruminales ont} été classées en quatre groupes en fonction de leur environnement:1) les bactéries vivant librement dans la phase liquide du rumen, 2) les bactéries associées aux particules alimentaires, 3) les bactéries associées à l’épithélium ruminal et 4) les bactéries attachées à la surface des protozoaires.

Il existe plusieurs genres de bactéries: cellulolytiques, hémicellulolytiques, amylolytiques, protéolytiques ou uréolytiques et pectinolytiques. Les espèces de bactéries les plus importantes appartiennent au groupe des cellulolytiques (ou encore fibrolytiques) qui comprennent principalement Bacteroides succinogenes, Ruminococcus albus,

7 2.1.3. 3. Les mycètes

Contrairement aux bactéries et aux protozoaires, il y a très peu de travaux sur les mycètes. L’existence de champignons anaérobiques stricts dans le rumen a été découverte en 1975 par Orpin.

Selon Bauchop (1979), ils sont au nombre de 103_{à 10}5 _{zoospores/mL de contenu de rumen.} Les champignons produisent une importante quantité d’hydrogène (H2) et sont donc associés aux bactéries méthanogènes (bactéries consommatrices de H2). Généralement, les champignons ne sont pas indispensables et sont parfois absents et augmentent avec des rations contenant des fourrages de mauvaise qualité (Guillaume, 2007).

2.1.4. Conditions physico-chimiques du milieu ruminal

Le développement des micro-organismes du rumen est directement dépendant des conditions physico-chimiques du milieu ruminal.

2.1.4.1. Le pH

Le pH du complexe gastrique est reconnu depuis plusieurs décennies comme un paramètre physico-chimique essentiel. Il joue un rôle très important pour la flore microbienne du rumen (Sauvant et al., 1999).

Le pH ruminal se situe normalement près de la neutralité à environ 6,5 mais peut varier selon la composition de la ration ingérée et la gestion de l'alimentation d’après Brugère (1983). Le pH baisse dans la période qui suit la prise de repas et augmente avant la prise alimentaire (Figure 3). Parmi les éléments responsables des variations de pH, on cite, les acides gras volatils (AGV), et l’acide lactique produits par les fermentations, les phosphates de la salive et l’ammoniac provenant de la protéolyse ou de l’uréolyse.

8

Figure 3. Mesures du pH ruminal prises en continu sur 24 heures chez une vache Holstein.

Tirée de Mutsvangwa et Wright (2012). Moment de prise de repas

2.1.4.2. La température

La température dans le rumen est de l’ordre de 39,5 à 40°C et elle peut atteindre 41°C en cas des fermentations très intenses. Elle peut diminuer de 5 à 10°C après une ou deux heures de l’ingestion de grandes quantités d’eau froide (Brugère, 1983). Le chute du pH ruminal peut entraîner une augmentation du Température du rumen (AlZahal et al., 2007, 2008). En fait, il existe une relation linéaire significative entre Le pH et la température ruminale (AlZahal et al., 2008;Wahrmund et al., 2012), (Figure 4). Grâce à la relation biologique entre la production d’acide et la chaleur dégagée par la fermentation. L’exploitation de cette relation pour prédire le pH pourrait permettre de résoudre les problèmes liés à la surveillance à long terme du pH ruminal avec des électrodes (Mohammed et al., 2014). Donc, il est très important de maintenir une bonne température afin de mener à un métabolisme normal et des bonnes fonctions microbiennes.

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Figure 4. Évolution du pH du rumen en fonction de la température ruminale.

Tiréed’Alzahal et al. (2007).

2.1.4.3. L’anaérobiose

Le rumen est un milieu d’anaérobie strict : les bactéries aérobies font disparaitre la quantité d’O2apportée par déglutition ou diffusée à partir des vaisseaux des parois (Brugère, 1983). En fait, Samah et Wimpenny en 1982 (Figure5) ont démontré la présence de NADH-oxydase soluble qui est supposé réduire l’O2 en H2O ou H2O2. Le superoxyde produit dans cette réaction serait par la suite métabolisé par une superoxy de dismutase de sorte que l’O2 ne représente que 1 % des gaz (Stewart et Bryant, 1988). La teneur en CO2 est la plus élevée (60 %), celle du NH4 est de 27 %, alors que celles du N2et du H2 sont de 7 % et 0,2 %, respectivement (Tiret, 2001).

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Figure 5. Relation entre NADH-oxydase et la pression partielle d'oxygène. Tirée de Samah

et Wimpenny (1982). 2.1.4.4. Pression osmotique

La pression osmotique du rumen a une plage de 200 à 400 mosm/L, cette valeur est presque identique à la pression osmotique du sang (Brugère, 1983). Elle augmente après la prise de repas généralement. Dans le cas d’un stress hyper-osmotique, l’eau va passer du secteur vasculaire au rumen et s’il y a une situation hypo-osmotique, c’est le passage inverse qui aura lieu.

2.1.4.5. Humidité

Le rumen est un milieu riche en eau (85 à 90 %). L’apport en eau est assuré par l’ingestion d’eau, par une intense salivation et par l’ingestion des aliments humides. Or le pourcentage d’eau n’est pas identique dans tous points du rumen. En effet, la partie supérieure du rumen est occupée par les éléments grossiers alors que la partie inferieure contient les particules de petites tailles qui baignent dans un milieu liquide (Brugère, 1983).

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2.2. Métabolisme protéique chez la vache laitière

Les protéines sont des polypeptides ayant une succession d’AA d’ordre bien déterminé, liés entre eux par des liaisons peptidiques. La fonction primordiale des protéines est de fournir les AA nécessaires pour le maintien, la croissance, la lactation et la reproduction pour les ruminants (Jouany et al., 1994). La synthèse des protéines au niveau corporel est la somme de la synthèse protéique au niveau de tous organes et tissus.

Le rumen est essentiellement une chambre de fermentation (Figure 6) contenant une population microbienne de bactéries, de protozoaires et de mycètes très variée ce qui rend les ruminants bien adaptés et capables d’utiliser de l’azote non protéique pour synthétiser des protéines, et pouvant dégrader la paroi cellulaire des plantes (Jouany, 1994 ; Damry, 2009 ; Gebeyehu et Mekasha, 2013). Grâce aux sécrétions des enzymes protéolytiques, une partie des protéines ingérées est dégradée en peptides et en AA, qui sont désaminés en ammoniac et en AGV. Une fraction des protéines alimentaires échappe à la dégradation ruminale, De plus, certains AA, tels que la méthionine ou la lysine, sont disponibles commercialement sous forme protégée, i.e. qu’ils sont recouverts d’une matrice leur permettant d’échapper à la dégradation ruminale, (Berthiaume et al., 2001; Broderick et al., 2008). Puis, à leur entrée dans l’abomasum puis dans l'intestin, le digesta subit les attaques des enzymes gastriques et pancréatiques et de la bile. (Corring et al., 1989).

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Figure 6. Métabolisme azoté et production d'urée chez les ruminants. PID = protéine

ingérée dégradée; PIND = protéine ingérée non dégradée; AR= ammoniac ruminal. Tirée de Lefebvre (1996).

2.2.1. Besoin en acides aminées

Au total il existe 20 alpha-AA qui servent pour la synthèse de toutes les protéines selon une disposition bien déterminée. Ces AA se divisent en deux catégories: les AA essentiels et les AA non essentiels. L’animal est incapable de fabriquer les AA essentiels (AAE : histidine, isoleucine, leucine, lysine, méthionine, phénylalanine, thréonine, tryptophane et valine) sauf à partir de métabolites provenant de ces AA mêmes, alors qu’il possède les voies métaboliques de synthèse pour les AA non-essentiels (AANE : alanine, aspartate, asparagine, cystéine, glutamate, glutamine, glycine, proline, sérine, tyrosine). L’arginine est classé comme un AA semi-essentiel puisque l’animal est capable de le synthétiser, mais en quantité très faible. Chez la vache laitière, la synthèse protéique totale est de l’ordre de 3,5 à 5 kg/j (Thivierge et al., 2002). D’après Lobley (2002), il y a une contribution importante du tissu gastro-intestinal à la synthèse corporelle de protéines (32 à 45% chez la vache laitière), suivi par le tissu mammaire à la hauteur de 35 à 45% et enfin la synthèse protéique au niveau musculaire qui représente 15 à 20% chez un animal en croissance (Figure 7).

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Des expériences montrent qu’il y a une augmentation de la synthèse protéique de l’ordre de 17 % soit en augmentant l’apport en protéines métabolisables (Lapierre et al., 2002), soit lors de perfusion de caséine au niveau duodénal (Vanhatalo et al., 2003). Selon Berthiaume et al.(2001), la disparition dans le petit intestin des AANE était de 65,2 %, alors que la disparition des AA E était de 66,5 %. La leucine, la lysine et la méthionine sont oxydées par le tube digestif mais pas la phénylalanine ou la thréonine (Lobley et Lapierre, 2003). Les AA qui sont absorbés par l’intestin proviennent principalement de trois sources : 60% sont issus des bactéries qui ont crû dans le rumen, 15%des protéines alimentaires qui ont résisté à la dégradation ruminale (Rulquin et al., 2001) et aussi les sécrétions endogènes qui sont présente dans l’intestin. Les sécrétions endogènes (15-25%) seront réabsorbées en grande parties dans l’intestin et comme elles représentent un recyclage cela n’est pas un gain d’AA (ou apport net) pour l’animal.

Figure 7. Contribution des différentes tissus à la masse protéique, la synthèse protéique et à

l’utilisation nette d'oxygène qui représente un indicateur de l'énergie utilisée. Tirée de Lobley (2002).

Il y a des recommandations dans le NRC (2001) quant aux apports d’AA nécessaires pour maximiser la synthèse du lait. Cependant, seulement deux AA, la lysine et la méthionine, sont présentés. Ces recommandations sont exprimées en pourcentage de l’apport total en

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protéines métabolisables (disponibles) à la vache: il est recommandé que la lysine représente 7,2 % et la méthionine 2,4 % des protéines métabolisables. Des recommandations pour les autres AA essentiels ont été proposées par Rulquin et al. (2001) suite à des études où les AA ont été perfusés de façon individuelle et par Doepel et al. (2002) suite à une revue d’études où les AA ont été perfusés en groupe (Tableau 1).

Tableau 1. Besoins en acides aminés exprimés en pourcentage de l’apport en protéine

digéré chez la vache laitière. Adapté de Rulquin et al. (2001) et Doepel et al. (2002). Acide aminé Rulquin et al., 20011 _{Doepel et al., 2004}2

Histidine 3,2 2,3 Isoleucine 5,0 5,3 Leucine 8,8 9,6 Lysine - 7,3 Méthionine - 2,2 Phénylalanine 5,0 5,4 Thréonine 4,0 5,0 Valine 5,3 6,1

1_{Composition (%) de la protéine digestible} 2_{Composition (%) de la protéine métabolisable}

2.2.2. Mécanisme de la dégradation ruminale des protéines

2.2.2.1. Dégradation ruminale des protéines

Les protéines qui viennent de l’alimentation sont dégradées par les micro-organismes du rumen en premier lieu par protéolyse (Nugent et Mangan, 1981) en peptides et en AA et après par la réaction de désamination (Fonty et al., 1995) en ammoniac (NH3) ainsi qu’en chaines carbonées. Ces dernières sont ensuite fermentées, ce qui entraine la formation d’AGV (Wallace et Cotta., 1988). Il y a d’autres voies qui contribuent à la formation de l’ammoniac dans le rumen telles que citées par Satter et Roffler (1975) : l'azote non-protéique (ANP) des aliments et l'urée recyclée dans le rumen par l'intermédiaire de la salive ou la paroi du rumen.

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S’il y a excès d’ammoniac dans le rumen, il va causer un gaspillage d’azote et peut engendrer des cas d’intoxication et même la mort de l’animal. Dans le cas contraire où l’ammoniac est déficitaire, les besoins des micro-organismes ne sont pas satisfaits et la digestion de l’aliment va diminuer.

Il y a plusieurs recherches sur l’alimentation azotée (Journet et al., 1983 ; Roffler et al., 1986 ; Allen, 2000) qui montrent qu’il y a un effet positif entre l’ingestion et les apports azotés (Figure 8).

Figure 8. Effet de la teneur en matières azotées du régime sur l’ingestion de matière sèche.

Tirée de Journet et al. (1983). 2.2.2.2. Vitesse de dégradation

La vitesse d’hydrolyse des protéines (Tableau 2) varie en fonction des caractéristiques physico-chimiques des protéines alimentaires (solubilité, structure, accessibilité) (Vérité et Peyraud, 1988 ; Jouany et al., 1995). En plus, l’affinité des enzymes microbiennes est faible pour les protéines ayant une conformation tridimensionnelle rigide (due à la présence de ponts disulfures), ce qui se traduit par une faible dégradabilité (Debroas et al., 1998). Le temps de dégradation ruminale varie selon le type d’aliments et la forme sous laquelle ils se présentent.

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Tableau 2. Vitesse de dégradation des protides dans le rumen.

Protides Vitesse de dégradation

Azote non protéique (urée) Ultra rapide

Protéines solubles rapidement dégradables

(ensilages/tourteaux colza, soya) 0,5 à 4,5 %/min

Protéines insolubles progressivement

dégradables (drêches) 2 à 30 %/h

Azote indégradable et indigestible (Blocage

par lignine, tannage, formol) 0

Tiré de Rousseau (2012); cité par Boye (2014). 2.2.2.3. Synthèse microbienne

Jouany et al. (1992) ont montré que plus de 75 % de l’activité protéolytique totale est associée à la phase solide du rumen.

La flore microbienne utilise l'ammoniac pour assurer sa croissance normale. Si la quantité d'ammoniac est suffisante dans le rumen, sa transformation en protéine bactérienne dépendra donc de la quantité d'énergie disponible sous forme d’ATP (Wattiaux, 2005). Selon Jouany(1994), il y a une synthèse de 20 à 45 g d’azote microbien par kg de matière organique fermentée dans le rumen. En terme de production quotidienne, il y aune synthèse qui varie de 400 g à plus de 1500 g de protéines microbiennes selon de la digestibilité de la ration. Le pourcentage de protéine dans les bactéries varie de 38 à 55 % (Tableau 3).

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Tableau 3. Composition (%) et digestibilité intestinale (%) de l’azote microbien.

Items Bactéries Protozoaires

Moyenne variation Protéines vraies 47,5 38-55 - Acides nucléiques 27,6 - - Lipides 7,0 4-25 - Hydrates de carbone 11,5 6-23 - Peptidoglycanes 2,0 - - Cendres 4,4 - -

Protéine brute totale 62,5 31-78 24-49

Digestibilité intestinale 71,0 44-86 76-85

Tiré de Van Soest (1982).

L’importance de la dégradation des matières azotées dépend de la durée de leur séjour dans le rumen et de l’intensité de l’activité microbienne (Vérité et Peyraud, 1988). Les micro-organismes ruminaux sont capables de synthèse protéique, cette dernière dépendant de leur densité, de leur taux de croissance et du rendement avec lequel ils utilisent les substrats (NH3 et les chaines carbonées) et l’énergie dont ils disposent. Il peut y avoir un délai de 8 à 9 heures entre la dégradation d’une protéine et la synthèse microbienne qui en est issue (Sauvant et Van Milgen, 1995). Ces protéines d’origine microbienne couvrent 60 à 70 % de l’apport protéique des ruminants (Demeyer et Fievez, 2000).

2.2.3. Mécanisme de la digestion intestinale des protéines

Le petit intestin est le deuxième organe en importance pour le processus de la digestion protéique. Le chyme se déplace rapidement dans le duodénum et le jéjunum. Par contre, l'iléon possède un temps de rétention supérieur. C'est à ce niveau que les protéases sont les plus actives car le pH devient moins acide.

18 2.2.3.1. Mécanisme de digestion

La digestion protéique commence dans l’estomac par l’enzyme gastrique : la pepsine, qui est activé par l’acide chlorhydrique à un pH acide (1 à 2) (Ferran, 2010). La pepsine est considérée comme un endopeptidase qui découpe les protéines en polypeptides.

En arrivant dans l’intestin, la digestion intestinale des protéines alimentaires fait intervenir des protéases d’origine pancréatique et des peptidases intestinales (Tableau 4). Les produits de la digestion sont constitués d’AA libres et de peptides. Ces derniers vont être transportés dans l’entérocyte où ils vont subir une hydrolyse. Afin d’assurer la synthèse des protéines, l’intestin prélève des AA à la fois dans la lumière intestinale et dans le sang artériel. Cet organe renouvelle plus de 50 % de ses protéines par jour et la synthèse de protéines bien particulières comme les mucines engendre des besoins élevés en certains AA comme la thréonine (Lefloc’h et Sève, 2000).

Les protéases pancréatiques sont subdivisées en endopeptidases et en exopeptidases (Roze et Levy, 2005). Les principales endopeptidases sont la trypsine qui est l’enzyme la plus importante du suc gastrique car elle est l’origine de l’activation des autres zymogènes, de la chymotrypsine et des élastases. Ces enzymes hydrolysent les protéines en clivant les liaisons peptidiques situées au centre de la protéine. Les exopeptidases exercent leur activité protéolytique aux extrémités de la molécule, libérant les AA situés en bout de chaîne. Il s’agit des carboxypeptidases A et B (Lefloc’h et Sève, 2000).

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Tableau 4. Principales enzymes intervenant dans la digestion intestinale des protéines et

des peptides. AA : acides aminés.

Enzyme Origine Catégorie de

peptidases

AA impliqués dans la liaison peptidique où s'exerce l'action de l'enzyme

Trypsine Pancréas Endopeptidase Arg/Lys/AA basiques Chymotrypsine A Pancréas Endopeptidase Tyr/Phe/Trp

Chymotrypsine B Tyr/Phe/Trp + Leu

Chymotrypsine C Tyr/Phe/Trp + Leu + Gln/Met

Elastase I Pancréas Endopeptidase Ala/Gly

Elastase II Tyr/Phe/Trp

Carboxypeptidase Pancréas Exopeptidase AA situés à l'extrémité carboxylique

Aminopeptidase Bordure en brosse

intestinale Peptidase - neutre Arg/Leu/Met - acide Glu/Asp Dipeptidyl peptidase Bordure en brosse

intestinale Peptidase Pro

Di et tripeptidase Cytoplasme des entérocytes

Di et

tripeptidase Pro Tiré de Le floc’h et Sève, (2000).

2.2.3.2. Mécanismes d’absorption

Les AAE sont absorbés plus rapidement que ceux non essentiels, la méthionine étant l'un des AA les plus rapidement absorbés. Les composés alimentaires non absorbés à la fin de l’intestin grêle constituent la fraction alimentaire indigérée. Cette fraction conduit au calcul de la digestibilité réelle de l’azote alimentaire. Ces composés transitent vers le caecum puis

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le côlon où une partie est fermentée par la flore endogène. Ceci permet de calculer la digestibilité vraie présente dans la figure 9 (Low, 1982) qui fournit des valeurs additives pour les apports d’azote et d’AA provenant de diverses sources de protéines introduites en mélange dans un aliment (Sève et Henry, 1996).

Figure 9. Calcul simplifié de la digestibilité. Tirée de Low (1982).

2.2.3.3. Le bilan azoté

Le bilan azoté est utilisé pour décrire l’évolution de la fraction protéique de l’aliment chez l’animal. La quantité d’azote total et la quantité d’azote uréique excrétées dans l’urine sont étroitement liées à la consommation de matières azotées totales (Blanchart et al., 1980). Selon Miller et Payne (1969) la détermination du bilan azoté repose sur le dosage de la quantité d’azote dans l’ingéré, dans les fèces et dans les urines et ainsi le calcule selon les équations suivantes :

Azote retenu par l’animal (R ; g/j) = I - F - U Azote digéré par l’animal (g/j) = I - F

Digestibilité apparente de l’azote (%) = 100*(I – F)/ I Avec I, F et U en g d’azote/j

21 F : azote dans les fèces

I : azote ingéré U : azote dans l’urine R : azote retenu

Les valeurs du bilan azoté dépendent fortement de la nature et de la composition de la ration. En effet, la quantité d’azote retenue augmente en même temps que la quantité d’azote ingérée, la matière organique digestible ingérée et la digestibilité du fourrage, alors qu’il diminue lorsque la teneur en cellulose brute augmente. L’existence d’un bon équilibre entre les quantités d’azote et d’énergie apportées aux micro-organismes du rumen et absorbées dans l’intestin, permet des rétentions élevées d’azote (Grenet et Demarquilly, 1977).

2.2.3.4. L’azote exogène et endogène dans le système digestif

Les protéines endogènes comprennent les protéines des cellules desquamées dans la lumière intestinale (Tamminga et al., 1995), les protéines des sécrétions salivaire, gastrique, intestinale, biliaire et pancréatique, et les pertes d’origine plasmatique (Huneau et al., 1997). De même, le recyclage de l’urée au niveau du rumen est considéré comme une source d’azote endogène par certain auteurs (Leng et Nolan, 1984).

Les sécrétions d’azote endogène sont dépendantes de plusieurs facteurs : la nature du régime, sa composition protéique, lipidique et glucidique ainsi que la présence de facteurs antinutritionnels.

Le modèle français de prédiction du flux duodénal est établi pour relier le flux de protéines alimentaires non digérées dans le rumen (PIA), et de matières azotées (MA) endogènes in vivo (PIA+MAendo_duo en g/kgMS) à la quantité de matières azotées totales du régime (MAT) non dégradée in sacco: MAT (1- 0,01 DTN). La régression intra-expérience obtenue est (Figure 10):

PIA+MAendo_duo = 14,2 + 0,96 MAT (1- 0,01 DTN%) (n=311, nexp=121, écart-type résiduel =8,8) (Sauvant et Noziere, 2013)

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Figure 10. Prévision des matières azotées (MA) au duodénum à partir des mesures de

dégradabilité de l’azote in sacco. Tirée de Sauvant et Nozière (2013).

Dans cette régression (Figure 10), la pente de 0,96 n’est pas différente de 1 et la constante de 14,2 g MAT g/kg MS est différente de 0 : cette valeur représente la fraction protéique endogène passant au niveau duodénal. Puisque la pente est considérée comme égale 1, l’équation de calcul devient:

MAendo_duo g/kgMS = 14, 2

et on a PIAg/kgMS = MAT (1-0,01 DTN%).

Où MAendo_duo = matière azotée endogènes au duodénum. 2.2.3.5. Extraction hépatique des acides aminés

Après avoir été absorbés dans la veine porte, les AA sont dirigés vers le foie, qui occupe une position stratégique anatomiquement et a un métabolisme actif. En général, le foie extrait 45 % du total des AA absorbés (Lapierre et al., 2005), mais l’importance de l’extraction va dépendre de l’AA en question. Par exemple, l'extraction d'AA comme l'histidine, la méthionine, la phénylalanine, la tyrosine et la thréonine varie de 13 à 50 % de leur absorption portale alors que d'autres AA tels que la leucine, l'isoleucine, la valine et la

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lysine ne sont pas ou très peu extraits, sur une base nette, par le foie (Blouin et al., 2002; Hanigan, 2005).

2.2.4. L’azote de la matière fécale et l’excrétion urinaire

Il y a deux sources principales d'azote dans les matières fécales. Une première partie provient des aliments et des la synthèse microbienne non digérés et une deuxième partie provient de l'azote métabolique. Au total, plus de 80 % des protéines qui arrivent dans l'intestin y sont digérées et le restant passe dans les matières fécales (Dixon et Milligan, 1984). L'azote métabolique fécal est une perte d'azote due aux enzymes digestives sécrétées dans l'intestin et au renouvellement rapide des cellules intestinales. En moyenne, le NRC (2001) suggère 23 g de protéines par kilo de matière sèche (MS) d'aliment ingéré, pour pouvoir être digéré et absorbé dans l'intestin, mais Ouellet et al. (2002) suggèrent 16 g de protéines brutes par kg de MS ingérée (soit environ 15 % du débit duodénal).

Par ce fait, les matières fécales des ruminants sont considérées comme une excellente source d’engrais parce qu'elles sont riches en matière organique et en particulier en azote (2,2 à 6,0 % d'azote ce qui est équivalent à 12 à 16 % de protéines).

Le rejet de l’azote par les animaux suit aussi un autre chemin que les fèces, c’est l’excrétion urinaire. L’azote excrété par cette voie se retrouve essentiellement sous forme d’urée et les variations de la teneur en azote uréique expliquent à elles seules 80 % des variations de la teneur en azote total de l’urine. Les origines de ces pertes sont principalement d’ordre métabolique. Elles sont aussi influencées par le niveau d’utilisation de l’azote dans le rumen (Blanchart et al., 1980 ;Beckers, 2013). Malheureusement, parfois l'excrétion d'azote fécal et urinaire augmente, aussi significativement avec l’apport des protéines protégés et la supplémentation des AA tels que la méthionine (Raskin et al., 1998). En effet, lorsque les besoins pour la synthèse protéique sont couverts, les AA en excès seront catabolisés et excrétés dans l'urine principalement sous la forme d'urée (Dourmad et al., 2009).

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2.3. Méthodes d’évaluation de dégradation et de digestion

2.3.1. Dans le rumen: méthodes d’évaluation de dégradabilité dans le rumen (in sacco)

La technique des sachets est très ancienne. Elle a été utilisée la première fois par Quin et al. (1938) selon Doreau et Noziére (1999). Ensuite, elle était reprise par Balch et Johnson (1950) pour comprendre l’activité cellulolytique dans les différents compartiments du rumen, et par Demarquilly et Chenost (1969). Mais dans tous ces travaux, il n’y avait pas d’approche en termes de cinétique de dégradation. C’est juste à la fin des années 70 que cette technique a été utilisée pour apprécier la vitesse de dégradation des aliments dans le rumen (Michalet-Doreau et al., 1987). La méthode in situ (ou in sacco ou technique des sachets de nylon) est un moyen direct de mesure de la dégradabilité des aliments dans le rumen. Elle consiste en la mesure de la quantité de nutriments disparue après l'incubation d'aliment pendant un temps déterminé dans le rumen de bovins porteurs de fistules du rumen.

Cette technique consiste à introduire des petits sachets de nylon contenant les échantillons d’aliments (préalablement broyésà2mm, appelés substrats) dans le sac ventral du rumen en respectant les éléments suivants:

- La taille des pores des sachets doit permettre l’entrée du liquide du rumen et des micro-organismes. Les pores des sachets doivent en plus être fins pour minimiser les pertes des particules du substrat non dégradé. Pour cela, les mailles des pores les mieux adaptés comme standard sont de 50 μm (+/- 10) (Ørskov, 2000).

- Le rapport taille échantillon/surface des sachets est estimé à 15 mg MS/ cm2 (Ørskov, 2000) donc les sachets contiennent environ 5 à 6g d’aliment.

- La période d’incubation est de 0, 2, 4, 8, 12, 16, 24, 48, et 72 heures et après chaque période d’incubation, les sachets sont enlevés, lavés avec l’eau distillée et séchées à 65 C pendant 48 heures (Pamungkas et Sevilla, 2005).

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L’ajustement des cinétiques de dégradation repose en général sur des modèles simples, notamment le modèle d’Ørskov et McDonald (1979):

D = a + b (1 – e-ct₎

Où D = dégradabilité mesurée au temps t, a = dégradabilité au temps 0 (dégradabilité immédiate obtenue par lavage d'un sachet contenant une prise d'essai sans incubation dans le rumen), b = fraction potentiellement dégradable et c = vitesse de dégradation de la fraction b.

Cette technique est d’intérêt car elle est facile à mettre en œuvre et la connaissance des caractéristiques dynamiques des processus de dégradation qu’elle permet d’obtenir est nécessaire pour évaluer les aliments de la ration (Sauvant et al., 1995). Les mesures sont réalisées directement dans le rumen, donc vraiment dans les conditions les plus proches des conditions naturelles de dégradation. De plus, elle rend possible l’estimation de la qualité des fourrages (Mehrez et Ørskov, 1977).

Toutefois, les problèmes méthodologiques liés à l'utilisation de cette technique ont fait l'objet de nombreuses mises au point bibliographiques (e.g. Setala, 1983; Lindberg, 1985; Nocek, 1988). Elle est considérée comme coûteuse et longue (Gosselink et al., 2004). Elle nécessite l’utilisation d’animaux fistulés. De plus, la taille des pores du sachet peut entraîner une sélection des micro-organismes entrant dans le sachet (Michalet-Doreau et Ould-Bah, 1989). Cette méthode est difficilement applicable pour les aliments solubles ou les aliments dont les particules de petite taille peuvent s’échapper du sachet sous une forme non dégradée (Cone et al., 1994). D’autre part, même en procédant à des lavages des sachets après l’incubation, les résidus de sachets restent contaminés en micro-organismes, ce qui peut introduire des biais (Michalet- Doreau et Nozière, 1999). Par ailleurs, cette méthode souffre d’une faible répétabilité (Michalet-Doreau et Aufrère, 1990).

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2.3.2. Dans l’intestin

2.3.2.1. Méthode des sachets mobiles

La méthode des sachets mobiles, n’a pas pour objectif de simuler la digestion dans ce compartiment, mais elle permet de fournir un index de la quantité azotée alimentaire réellement non digestible dans l’intestin. Cette technique permet d’établir, un classement relatif des aliments (Hvelplund, 1985 ;Voigt et al., 1985).

Elle a été développée chez les vaches laitières pour estimer la teneur en azote indigestible des aliments. Les sacs en nylon ont été incubés en premier lieu dans le rumen puis chaque aliment est combiné, et on les réintroduit dans les petits sacs qui vont être incubés dans un bain contenant de la pepsine pour simuler la digestion abomasale. Ces sacs sont ensuite introduits dans l’intestin via une canule duodénale pour être récupérés ultérieurement à la fin de l’intestin grêle ou dans les fèces afin de déterminer la quantité azotée résiduelle non digérée dans cette portion du tube digestif. Dès leur récupération, les sachets sont rincés et lavé.

La technique des sachets a été appliquée pour l’estimation de la digestibilité intestinale des protéines alimentaires (Hvelplund 1985; Rae et Smithard, 1985 ; de Boer et al., 1987; Vérité et al., 1987).

Cette méthode dépend de nombreux facteurs:

- la durée d’incubation préliminaire dans le rumen, en fait, la part de la MS alimentaire qui disparaît dans le rumen augmente avec la durée d’incubation et le contenu du sachet s’enrichit en constituants lentement dégradables. Aussi Hvelplund et al. (1991) et Yang (1991) montrent que la part d’azote alimentaire qui disparaît dans l’intestin grêle diminue quand le temps d’incubation des sachets dans le rumen augmente.

- le lieu de récupération des sachets, au niveau iléal ou dans les fèces. La digestion dans le gros intestin reste en moyenne faible (Yang, 1991) et les résultats sont comparables quel que soit le lieu de récupération des sachets d’après Vanhatalo et Ketoja (1994). Or on sait que le gros intestin est un compartiment de fermentation et

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la colonisation microbienne des sachets peut y être importante pour certains aliments pauvres en azote, conduisant à une surestimation de la fraction azotée alimentaire indigestible ou à une sous-estimation si une partie de ce qui est arrivé dans le sachet est fermenté dans le gros intestin et disparaît du sachet (Varvikko et Vanhatalo, 1990; Yang, 1991).

Récemment, la méta-analyse de Martineau et al. (2013) a montré qu’il a une relation négative entre l’augmentation du rendement en protéines du lait et les protéines métabolisables lors de l’inclusion du tourteau de canola dans la ration (Figure 11). Donc, il semble qu’il y pourrait y avoir une sous-estimation de la digestibilité intestinale du tourteau de canola décrite dans le NRC (2001) qui a été estimé par la méthode des sachets mobiles.

Figure11. Variation des protéines métabolisables en fonction de la variation des protéines du lait estimée par le NRC (2001) suite à l’ajout de TC.

2.3.2.2. Méthode de marqueur isotopique

Cette méthode consiste à enrichir l'azote, en15_{N, de l'aliment ou de l'animal pour créer une} différence dans l’enrichissement entre l'azote endogène et l'azote alimentaire (de Lange et al., 1990 ; Tamminga et al., 1995; Nyachoti et al., 1997).

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L'enrichissement des aliments est d'usage limité pour déterminer les sécrétions endogènes en raison du recyclage rapide des AA alimentaires suite à l'ingestion d'un repas marqué (Leterme etal., 1996). L'enrichissement des aliments peut se faire via la fertilisation des plantes avec des composés azotés marqués alors que l'enrichissement de la fraction azotée de l'animal se fait par perfusion, en continu ou par une dose simple, d'AA marqués. Par la suite, on mesure le ratio d'AA marqués dans le digesta par rapport au ratio d'AA marqués dans le bassin précurseur de la synthèse de protéine dans l'intestin (Nyachoti et al., 1997). Pour que la méthode soit valide, les composés azotés du bassin précurseur et de l'azote endogène de l'intestin doivent être tous enrichis uniformément (Nyachoti et al., 1997). Dans le cas des ruminants, la situation est compliquée par les micro-organismes du rumen qui peuvent utiliser des composés enrichis pour fabriquer leurs protéines. Cette méthode va aider à l’établissement d’un bon équilibre en AA. On sait que ce bilan est déjà fait pour les monogastriques à raison qu’ils ont un système digestif simple et que les AA qui arrivent au niveau de l’intestin sont presque les mêmes que ceux ingérés (Lapierre, 2002). Ce qui n’est pas le cas chez les ruminants, les protéines qui arrivent dans l’intestin sont un mélange de protéines non dégradables dans le rumen, de protéines microbiennes.

Le coût élevé des perfusions d'AA enrichis est une autre limite à cette méthode. Par contre, le principal avantage de la méthode de marquage isotopique est qu'elle permet de pouvoir comparer l’effet des rations sur le taux de sécrétion d'azote endogène. De plus, elle permet de quantifier directement les sécrétions endogènes présentes dans le digesta iléal ou les fèces ainsi que la digestibilité réelle des composés azotés. En plus, c’est une méthode pour évaluer la digestibilité intestinale des protéines brutes en utilisant des aliments marqués au15_{N et en faisant une collecte de fèces appropriée dans le temps. Cette dernière va nous} permettre de bien estimer la digestibilité intestinale.

2.3.2.3. Méthode des poulets ayant subis une typhlectomie (résection du caecum ou en anglais « cecectomized rooster »).

C’est une technique alternative pour simplifier la mesure de la digestibilité des protéines chez les bovins en utilisant les poulets comme modèle. En effet, l'utilisation des poulets

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sans caecum élimine la majeure partie de la capacité de fermentation du tractus gastro-intestinal aviaire.

Les poulets subissent une ablation de caecum suivant le modèle de Biester et Schwarte, (1959). Tous les poulets sont nourris avec la ration de base pendant 7 jours; après cela, 24 heures de jeûne est imposé avant que le régime d'essai ne soit introduit. L’aliment (30 g) doit être broyé à travers un tamis de 1 mm. Les poulets sont logés individuellement dans des cages grillagées équipées avec des plateaux de collecte des excréments, et les excréments totaux sont recueillis pendant 48 heures et lyophilisés (Sibbald, 1983).

L'excrétion endogène des AA a été préalablement déterminée par 48 heures de collecte des excréments des poulets à jeûn (Parsons, 1985 ; NRC, 1994), et la digestibilité vraie est estimée à partir de la digestibilité calculée en soustrayant des AA endogène. En plus, la typhlectomie présente plusieurs avantages par rapport à la collecte de digesta de l'iléon. La typhlectomie est une procédure chirurgicale qui est beaucoup plus simple que l’implantation de canules iléale (Biester et Schwarte, 1959). Les poulets sans caecum est une nouvelle approche qui peut être maintenue beaucoup plus facilement que les canules. 2.3.2.4 Méthode in vitro en 3 étapes

La méthode in vitro en 3 étapes (« three-step in vitro procedure »; TSP) de Calsamiglia et Stern (1995) a été développée pour: 1) simuler fidèlement les conditions physiologiques de ruminants, y compris les effets potentiels des fermentations du rumen; 2) être rapide, fiable et peu coûteuse; 3) être applicable à une grande variété de compléments protéines; et 4) refléter des différences dans la digestion des protéines. Dans cette méthode, la digestion de la protéine est calculée en divisant l’N soluble dans l’acide trichloroacétique par la quantité total d’N dans l'échantillon de départ (Calsamiglia et Stern, 1995).

Les étapes de cette technique se résument en : - 1) Incubation de l’aliment dans le rumen - 2) Digestion acide (pepsine – HCl)

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Plus récemment, McNiven et al. (2002) ont modifié la méthode en remplaçant l’étape de l’incubation in situ dans le rumen avec un procédé in vitro impliquant une pré-incubation avec une protéase suivi d'incubations à la pepsine et la pancréatine. Avec cette digestion in vitro, l'étape de fermentation in situ dans le rumen pourrait être excluse. On peut éliminer ainsi l'utilisation d’une fistule au niveau du rumen des vaches. McNiven et al. (2002) ont conclu que leur méthode pourrait prédire la digestion intestinale des protéines.

2.3.2.5. Comparaison entre les différentes méthodes de mesure de digestibilité

Il y a des études qui comparent ces méthodes chez les ruminants. La plupart concluent que la méthode de marquage isotopique est très intéressante pour déterminer et comparer la digestibilité des protéines (Roos et al., 1994). D’autres comparent la méthode de 3-Steps et la méthode des sachets mobiles et concluent qu’il y a un grand écart entre ces deux méthodes qui peut être expliqué par la perte des particules soit au cours du transit intestinal ou pendant le procédure de lavage dans la machine qui induit des valeurs plus élevées de la digestibilité comparant aux résultats par la méthode in vitro (Borucki et al., 2007). Finalement, la méthode à choisir est celle qui donne une mesure de la digestibilité biologiquement acceptable et qui est robuste et applicable facilement.

2.4. Caractérisation nutritionnelle du TC

2.4.1. La fabrication du tourteau à partir des graines

Les oléagineuses ont une place remarquable dans le domaine agricole (Shahidi et Naczk, 1992). Le canola est considéré comme une des plus importantes oléagineuses à l’échelle mondiale (Matalalah, 2006). Le Canada est le plus grand producteur des graines de canola dans le monde, la production atteint 14,1 millions de tonnes pendant la compagne 2013-2014 (Lavergne, 2013-2014).

Les graines de canola sont utilisées pour la production d’huile et le résidu qui résulte de cette extraction s’appelle tourteau qui est un excellent aliment pour les animaux: bovins, volailles porc et poissons et pour plusieurs autres utilisations. Les graines de canola sont composées à peu près de 44 % d’huile et 56 %de tourteau (Slominski et al., 2015).

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Les étapes de transformation des graines du canola pour produire le tourteau sont les suivantes:

Étape 1 : les graines sont aplaties, préchauffées et laminées ou brisées en flocons ; ce procédé éclate les cellules et facilite l’extraction de l’huile.

Étape 2 : les graines sont cuites pour diminuer la teneur en eau et on les soumet à une opération de pressage doux qui retire une certaine partie de l’huile et comprime les graines en gros morceaux appelés fragments de tourteau.

Étape 3 : ces fragments subissent une transformation supplémentaire pour en retirer la majorité de l’huile restante (extraction de solvant après pression). Les lipides résiduels (6-10 % matière grasse) sont ensuite extraits par lavage du tourteau de première pression à froid par des solvants organiques apolaires (comme l’hexane, à une température légèrement inférieure à son point d’ébullition).

Étape 4 : la dernière étape est une distillation par chauffage (115-120°C) du mélange et séparation d’huile et des tourteaux.

2.4.2. Composition chimique du TC

Le TC est une source importante de protéines (Tableau 5). En plus, il possède un bon équilibre en AA (Newkrik, 2003) de telle sorte qu’il sera suffisant pour répondre à exigences en AA essentiels et non essentiels pour l’homme (Bos et al., 2007). Aussi, il est riche en minéraux essentiels, en vitamines, en glucides et en fibres. Cependant, il contient de faibles concentrations (<30 μmol/g) de composés antinutritionnels (Newkrik, 2009).

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Tableau 5. Comparaison de la composition chimique entre le TC et le TS.

TC TS

MS (%) 90,3 89,5

Protéines brutes 37,8 53,8

Protéines dégradable dans le rumen (%) 64 57

ADICP 2,4 0,4 NDICP 6,3 0,7 FDA(%) 29,8 6,2 FDN (%) 20,5 9,8 Extrait Ethéré 5 ,4 1,1 Cendre 7,4 6,4 NRC(2001)

FDA : fibres insolubles au détergent acide, FDN : fibres insolubles au détergent neutre. Le TC contient une quantité modérée en fibres insolubles au détergent acide (FDA), mais un niveau relativement faible de fibres au détergent neutre (FDN). Ce rapport relativement faible de FDN : FDA a un effet positif sur l’alimentation des ruminants. La forte concentration de fibres dans le TC dilue les nutriments digestibles (Bell, 1993) en réduisant son énergie métabolisable. Le TC contient environ 7,7 % de saccharose (Slominski et Campbell, 1991), ce qui contribuerait environ à 255 kcal/kg à la teneur en énergie métabolisable.