PROPRIETES DE DIVERS ANTIGENES GRAND T MUTANTS DU VIRUS DU POLYOME
par ANGELE LAROSE
Département de microbiologie
Mémoire présenté à la Faculté de médecine en vue de l'obtention du grade de
maitre es sciences (M. Sc.)
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TABLE DES MATIERES
TABLE DES MATIERES • • • . • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • . • • • • • • • I LISTE DES FIGURES • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • IV LISTE DES TABLEAUX • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • . • • • • • VI LISTE DES ABREVIATIONS ••••••••••••••••••••••••••.••••. VII
RESUME • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • VIII
INTRODUCTION • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1
MATERIEL ET METHODES • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • . • • • • . • • • 19 I. Souche virale et plasmides ••.••••••.•••••••••• 19 II. Méthodes de clonage ••••••••••••••••••.•••••••• 21 III. Transfections de cellules en culture .•••••...• 22 1. Cellules FR3T3, NIH3T3 et COS... 23 2. Fibroblastes d'embryons de rat... 24 i. Préparation des cellules .••••••.••••••. 24 ii. Transfection des cellules primaires 25 iii. Selection à l'antibiotique G-418 et
im-mortalisation • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • . • . • • • 25 IV. Transactivation de promoteurs viraux par
l'an-tigène grand T • • • • • • • • • • • • • • . • • . . • . . • • • • • . • • • • 2 6 V. Expression et détermination de la demi-vie de
1 ' antigène grand T • • • • • • • • • • • • • • • • • • . • • • • • • • • • 2 8 1. Marquage des cellules et chasse... 28 2. Immunoprécipitation •••••••••••••••••.•••••• 29
VI. Mutagenèse dirigée au moyen d'un oligonucléotide
synthétiqu.e ... .
1. Clonage dans le phage M13 ••••••••.••••••••• 2. Mutagenèse de délétion
. . .
. . .
.
. . .
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. . .
.
i. Phosphorylation de l'oligonucléotide ••• ii. Hybridation de l'oligonucléotide à l'ADN
30 31 31 31 monocaténaire •••••••••••••••••••••••••• 32 iii. Synthèse et ligation du brin mutant •••• 33 3. Mutagenèse d'insertion... 33 4. Purification de l'hétéroduplex synthétisé 33 par mutagenèse
. . .
.
. . .
33 5. Transformation de la souche E. coli JM109... 34 i. Préparation des bactéries compétentes •• 34 ii. Transformation des bactéries compétentes 35 VII. Analyse des mutants... 361. ''Dot blot'' . . . 36
i. Préparation de la sonde... 36 ii. Hybridation par "dot blot" •••..•••••••• 37 2. Purification par réplication et infection... 38 3. Détermination de la séqu.ence nucléotidiqu.e
de 1 1 ADN • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • . • • • • • • • • • • 3 8
RESULTATS • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 4 0
Première partie: Immortalisation et transactiva-par l'antigène grand T du virus
I. Analyse de l'efficacité d'immortalisation de
différents mutants mlt •••••••••••••.•••••••••• 41 II. Expression et stabilité des protéines mutantes. 46 III. Efficacité de transactivation des différents
mutants mlt
. . .
. . . .
. . . .
.
. . .
.
. . .
.
.
50 Deuxième partie: Liaison de la protéine grand T duvirus du polyome à la protéine RB 56 I. Mutagenèse dirigée dans le motif DLXCXE de
l'an-tigène grand T de polyome ••••••••••••••••••••.• 58 II. Caractérisation des propriétés biologiques et
biochimiques des protéines grand T mutantes
ob-tenues par mutagenèse •••••••••••••••••••••••••• 61 1. Analyse de l'efficacité d'immortalisation
des antigènes grand T mutants •••••••••••••• 61 2. Analyse de l'efficacité de transactivation
des antigènes grand T mutants •••••••••••••. 61 III. Expression des protéines mutantes de l'antigène
grand T . . . 63
IV. Liaison du grand T de polyome à la protéine RB. 66 DISCUSSION
I. Liaison de la protéine polyome à la protéine RB
grand T du virus du
. .
. . . .
. . .
. . .
. .
69 II. Propriétés de divers antigènes grand T mutants. 72REMERCIEMENTS • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 79
LISTE DES FIGURES
Figure 1. Structure génomique de la souche A2 du virus
du polyome . . . 4
Figure 2. Homologie entre les antigènes grand T des pa-povavirus et les protéines ElA d'adénovirus
et E7 du virus du papillome humain... 15 Figure 3. Structure du vecteur utilisé dans l'essai
d'immortalisation et localisation de plusieurs mutations du gène grand T du virus du polyome 42 Figure 4. Analyse des antigènes grand T mutants par
im-munoprécipitation et électrophorétogramme 47 Figure 5. Transactivation du promoteur tardif de
polyo-me (pPLCAT), de SV40 (pL2nCAT) et du promo-teur E2 d'adénovirus (pEC113) par plusieurs
mutants de l'antigène grand T... 53 Figure 6. Mutants de l'antigène grand T de polyome dans
une région de grande homologie partagée par la protéine ElA d'adénovirus et les protéines
Figure 7. Autoradiogranune de la séquence nucléotidigue
des mutants LT141 et LT147 ••••.••••••••••••• 60 Figure 8. Transactivation du promoteur tardif de SV40
(pL2nCAT) et de polyome (pPLCAT) dans les cellules de rat FR3T3 par les mutants de
grand T générés par mutagenèse dirigée... 64 Figure 9. Analyse des antigènes grand T mutants par
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1. Efficacité d'immortalisation des mutants de
délétion de grand T ••••.••••••.••••••••..•. 45 Tableau 2. Efficacité de transactivation des mutants mlt 53 Tableau 3. Efficacité d'immortalisation des mutants de
a.a.
Ci
cpm DMF DMSO DTT EDTA Hepes IPTG KDa pb PMSF PVP rpm SDS Tn Tris X-GalLISTE DES ABREVIATIONS
acide aminé curie
coups par minute
N,N-diméthylformamide dimethylsulfoxide dithiothréitol éthylène-diamine-tétraacétate de sodium acide N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonique Isopropylthio-B-D-Galactoside kilodalton paires de bases fluorure de phénylméthylsulfonyle polyvinylpyrrolidone
révolutions par minute sodium dodécyl sulfate transposon
tris (hydroxyméthyl) amine méthane
RESUME
Afin de mieux comprendre le lien existant entre les diverses fonctions de l'antigène grand T de polyome et sa contribution dans .la transformation néoplasique, nous avons étudié les propriétés de différents mutants de délétion du deuxième exon de grand T. Cette région de grand T est impliquée dans l'immortalisation cellulaire. L'antigène grand T a aussi la propriété de transactiver des promoteurs viraux et cellulaires. Nous avons vérifié l'hypothèse selon laquelle les oncogènes transactivateurs permettent l' immortalisation cellulaire en se liant au promoteur de gènes spécifiques et activent ou répriment ainsi leur transcription. Nous montrons ici qu'une étroite corrélation existe entre ces deux activités du grand T de polyome pour les mutants dl8, dl23, dl45, dl96 et dl300.
Par ailleurs, la mutation de dl8 affecte une petite séquence d'acides aminés (motif DLXCXE) hautement conservée parmi les papovavirus et qui démontre également une grande homologie avec le domaine 2 de ElA d'adénovirus impliqué dans la liaison à la protéine RB (produit du gène de la suscep-tibilité au rétinoblastome). Il existe une étroite corréla-tion entre la capacité de lier RB et celle de transformer pour SV40 et adénovirus. Nous avons montré dans un premier temps que la protéine grand T de polyome lie la protéine RB dans un essai in vitro. Nous avons ensuite crée par mutage-nèse dirigée deux mutants du grand T de polyome dans la
région du motif DLXCXE. Le mutant LT141, caractérisé par la
délétion de ce motif, est incapable de lier RB et d'immor-taliser des cellules primaires alors qu'il conserve la capacité de transactiver des promoteurs viraux. Le mutant LT147, porteur du motif DLXCXE mais conservant le reste de la délétion de dl8, est incapable d'immortaliser et de transac-tiver. Le mutant dl141 démontre que le motif DLXCXE est
essentiel pour lier RB et que la transactivation de promo-teurs n'est pas suffisante pour conférer au grand T la capacité d' immortaliser. De pl us, les résultats concernant dl141 suggèrent que l'intéraction grand T de polyome-RB pourrait être impliquée dans les phénomènes d'immortalisation cellulaire par grand T.
INTRODUCTION
L'étude de la carcinogenèse soulève un important problème qui est celui de déterminer comment les oncogènes transforment les cellules et de quelles façons ils interagis-sent entre eux pour provoquer la tumorigenèse. La car-cinogenèse est maintenant considérée comme un processus impliquant de nombreuses étapes indépendantes: chacune de ces étapes requérant l'activation d'un oncogène distinct pour 1 'obtention d'un phénotype final transformé (Land et al. , 1983). Grâce à la quarantaine d'oncogènes viraux et cel-lulaires connus jusqu'à maintenant, deux étapes de la carcinogenèse in vitro ont été identifiées: l'immortalisation et la transformation (Land et al., 1983; Ruley, 1983; Weinberg, 1985). Les oncogènes dits transformants à localisa-tion cytoplasmique, tels que ras, T moyen, ElB confèrent aux cellules établies en culture des propriétés dites néoplasi-ques telles que l'indépendance d'ancrage et des changements morphologiques. Les oncogènes dits immortalisants tels que grand T de polyome, mye et ElA dont les produits sont localisés au noyau, assurent un potentiel de croissance illimité aux cellules primaires. Deux mécanismes d'action différents sont suggérés pour ces deux classes d'oncogènes. Le produit cytoplasmique des oncogènes transformants pourrait contrôler la concentration d'un second messager critique alors que le produit nucléaire des oncogènes immortalisants
pourrait moduler l'activité de la machinerie transcription-nelle de la cellule (Weinberg, 1985).
Le virus du polyome est utilisé au laboratoire comme modèle d'étude de la carcinogenèse à étapes multiples. Il constitue un très bon modèle puisqu'au moins deux de ses gènes, l'un immortalisant, l'autre transformant, sont requis pour la transformation oncogénique (Asselin et al., 1983; 1984; 1986; Rassoulzadegan et al., 1982; 1983). Le virus du polyome, tout comme les virus SV40, BK et JC, est un membre de la famille des papovavirus (Tooze, 1981). Il a d'abord été mis en évidence dans des carcinomes de la glande salivaire de souris (Gross, 1953a; 1953b) mais il peut induire une grande variété de tumeurs chez différentes espèces animales, d'où il doit son nom (Stewart et Eddy, 1959). Le virus du polyome est constitué d'une molécule d'ADN circulaire bicaténaire de 5292 pb, associée à des histones cellulaires. La chromatine est logée à l'intérieur d'une capside protéique icosahédrique de 45 nm de diamètre (Tooze, 1981). Le génome viral est organisé en une région non-codante régulatrice qui sépare deux régions codantes. La région non-codante comprend l'origine de réplication et des signaux nécessaires à 1 'expression des gènes, incluant entre autres des promoteurs tardifs et précoces et des activateurs de transcription (Dailey et Basilico, 1985; Kern et al., 1986; Muller et al., 1983a; Mueller et al., 1984; Veldman et al., 1985). La région codante est constituée d'une région précoce et d'une région
tardive qui sont transcrites de part et d'autre de la région non-codante sur des brins complémentaires et dans des directions opposées (Soeda et al., 1980) , (figure la).
Dans une infection cellulaire lytique, la région précoce est transcrite avant le début de la réplication de l 'ADN viral. Cette région encode trois protéines différentes: les antigènes tumoraux grand T (100 KDa), T moyen (55 KDa) et petit T (22 KDa) qui ont d'abord été mis en évidence par la présence d'anticorps anti-T dans le sérum d'animaux porteurs de tumeurs (Habel, 1965; Ito et al., 1977a; 1977b; Schaffhausen et al., 1978; Silver et al., 1978). ces trois protéines sont générées par un même fragment d 'ADN grâce à trois événements d'épissage différents d'un ARN messager commun. Les trois antigènes possèdent une extrémité N-terminale commune de 79 acides aminés, et les 112 acides aminés suivants ne sont partagés que par T moyen et petit T. Toutefois chacun des antigènes a une région c-terminale unique résultant de l'utilisation de cadres de lecture différents après l'événement d' épissage (Hutchinson et al., 1978; Smart et Ito, 1978; Kamen et al., 1980; Soeda et al., 1980). La région tardive est transcrite après le début de la réplication de l'ADN viral et elle encode les trois protéines structurales de la capside virale VPl, VP2 et VP3 (Hewick et al., 1975).
Figure 1. Structure génomique de la souche A2 du virus du polyome.
A. Les unités transcriptionnelles précoces et tardives codant respectivement pour les antigènes grand T, T moyen, petit T et les protéines de la capside VPl, VP2 et VP3 sont il-lustrées ici. L'origine de réplication constitue le point de départ pour la numérotation des nucléotides dans le sens horaire. La position des sites d'initiation, d'épissage et de terminaison est indiquée par les chiffres présents à l'intérieur des régions codantes (Tooze, 1981).
B. Le génome viral de polyome est linéarisé au site Hind III (3918) et démontre les séquences codant pour les trois antigènes tumoraux grand T (LT), T moyen (MT) et petit T (ST). Les introns sont représentés par les traits pointillés et la portion non-traduite des messagers par les traits pleins. La région N-terminale commune aux trois protéines précoces est illustrée en noir, alors que les séquences uniques aux antigènes petit T, T moyen et grand T sont représentées respectivement en noir, blanc, et en hachuré. Les régions affectées par les différentes classes de mutants hr-t, ml-t et ts sont également indiquées.
8
Hindlll BomHI _ 5_,_o _ _ 6_,o _ ___,7o ~Q_~g__9 EcoRI_
Hindlll __.1o
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4,_o_ 1 11 1 1 1 11 1 1 1 111111 1 1 11 1 1 1 11 1 1 11 1 1 111 1 1 11 1 11111 1 1 11 1 1 1 1?
ç
1 1 1 4000 5000/0 1000 2000 3000 ST MT - An - - - r==:=:=J--- - An..
L'hôte naturel du virus du polyome est la souris chez laquelle l'infection est dite silencieuse. Les cellules de souris sont permissives pour le virus du polyome. Elles permettent la réplication de l'ADN viral et la production des protéines structurales menant à la production de virions. Elles sont les seules à être permissives pour le virus du polyome. A l'autre extrême, les cellules de singe sont non-permissives pour polyome puisqu'elles ne permettent aucune réplication détectable du virion. Les cellules de rat et de hamster apparaissent comme intermédiaires pour 1 'infection par le virus du polyome. Ces cellules sont semi-permissives parce qu'elles ne permettent qu'un faible niveau de réplica-tion du virion. De plus un faible pourcentage de cellules semi-permissives peuvent être transformées par polyome sous 1 'expression d 'ADN viral intégré de façon stable dans leur génome. En culture, ces cellules acquièrent alors de nouvelles propriétés telles que l'indépendance d'ancrage, la croissance à faible concentration de sérum, la perte d'inhibition de contact, une forte densité de saturation, des changements morphologiques et même la capacité d'induire des tumeurs chez des animaux syngéniques. On note l'apparition de tumeurs lorsque l'infection survient chez le rat ou le hamster. Les cellules semi-permissives ont grandement contribué à l'étude de la transformation cellulaire en augmentant la fréquence de ce phénomène par rapport aux cellules permissives (Tooze, 1981). L'acquisition du phénotype cellulaire transformé est imputable uniquement à la
région précoce du virus du polyome (Bastin et al., 1980; Novak et al., 1980; Hassell et al., 1980).
L'utilisation de cadres de lecture et d'événements d'épissage différents permet aux génomes viraux de contenir une diversité d'informations génétiques dans une molécule d 'ADN de taille relativement modeste. Toutefois ceci rend difficile l'analyse des rôles respectifs de chacun des antigènes T du virus dans la transformation néoplasique. Cette difficulté a été contournée par l'utilisation de plusieurs classes de mutants affectant différentes portions de la région précoce du génome viral: les mutants hrt, mlt, ts (figure lb); et par l'obtention des cDNAs des messagers viraux précoces clonés séparément (Treisman et al., 1981b ; Zhu et al., 1984). Les mutations hrt sont situées dans la région commune uniquement à T moyen et petit T; l'antigène grand T n'est pas affecté par ces mutations (Carmichael et Benjamin, 1980). Celles-ci rendent le génome viral incapable de transformer les cellules en culture, mais ne l'empêchent pas de se répliquer (Benjamin, 1970). Les mutations mlt résident dans la région commune uniquement à T moyen et grand T (Smolar et Griffin, 1981; Griffin et Dilworth, 1983). Ces mutants varient considérablement dans leur phénotype: certains montrent des modifications au niveau de l'expression de la transformation, d'autres au niveau de la replication et d'autres , enfin, se comportent comme le virus de type sauvage. Les mutations ts se si tuent dans la portion
c-terminale unique à grand T (Eckhart, 1969; Feunteun et al., 1976). Elles affectent la stabilité de l'antigène grand T à une température, restrictive de 39°c, température à laquelle le grand T de type sauvage n'est pas thermosensible (Paulin et Cuzin, 1975).
f érées dans le
Certaines de ces mutations ont été trans-cDNA respectif des protéines qu'elles affectent afin d'observer l'effet de la mutation sur un seul antigène précoce.
Les fonctions précises de l'antigène petit T dans la transformation néoplasique sont essentiellement inconnues. On s'explique mal la grande conservation de la structure de cet antigène parmi les papovavirus et son rôle de complémentation de l'antigène T moyen dans le processus de transformation. La protéine petit T est retrouvée à la fois dans le cytoplasme et dans le noyau des cellules infectées et serait nécessaire à l'infection lytique dans les cellules de souris (Zhu et al., 1984) à cause de sa capacité de stimuler la réplication de l'ADN viral (Turler et Salomon, 1985; Berger et Wintersberger, 1986). L'antigène petit Test aussi impliqué dans le processus de carcinogenèse puisqu'il a été démontré qu'il pouvait complémenter T moyen dans la tumorigenèse et dans la transformation de cellules primaires (Asselin et al., 1983; 1984). Il semblerait qu'un troisième groupe de complémentation puisse exister puisque l'antigène petit T qui est non-immortalisant peut complémenter l'antigène T moyen
transformant (Rassoulzadegan et al., 1983; Land et al., 1983).
Lors du processus de transformation, la protéine petit t semble réduire l'attachement des cellules au plastique en modifiant la structure du cytosquelette cellulaire (Zhu et al., 1984; Cuzin, 1984). Elle peut également augmenter l'agglutinabilité des cellules par les lectines en présence de grand T (Liang et al., 1984) et augmenter leur densité (Noda et al., ~986). Petit T aurait une activité comparable à
celle des facteurs de croissance, laquelle conférerait aux cellules une diminution de l'inhibition de croissance. Cette activité potentielle est compatible avec la structure protéique de petit T qui démontre une grande richesse de résidus cystéines distribués en régions CysXCysXXCYS caractéristiques des hormones glycoprotéiques (Friedman et al., être 1978). une Par ailleurs, activité de
l'antigène petit T aurait peut-transactivation comme semble le démontrer son homologue le petit T de SV40. Ce dernier possède la capacité de transactiver certains promoteurs requérant l'ARN polymérase II et III (Loeken et al., 1988)
L'antigène T moyen est par définition le gène trans-formant du virus du polyome car il peut à lui seul trans-former des lignées cellulaires établies (Treisman et al., 1981b; Gélinas et Bastin, 1985). Cependant l'antigène T moyen seul, ne peut transformer des cellules embryonnaires de
rat (Rassoulzadegan, 1982) ni même induire de tumeurs lorsqu'injecté à des rats nouveau-nés (Asselin et al., 1983; 1984) • Toutefois certains types cellulaires permettent la transformation par T moyen seul probablement en fournissant des facteurs complémentant 1 'action de T moyen. Tel est le cas pour les hamsters
l'apparition de tumeurs (Asselin et al., 1984) , nouveau-nés chez après injection lesquels du gène on note T moyen et pour les cellules embryonnaires de poulet transformées par T moyen uniquement (Kaplan et al., 1985). T moyen aurait aussi un rôle dans l'encapsidation au niveau de l'infection lytique (Garcea et al., 1985).
L'antigène T moyen s'associe aux membranes cellulaires et est localisé principalement au niveau du réticulum endoplasmique et dans la région périnucléaire. Au niveau de cette dernière région, il serait associé à l'appareil de Golgi et aux membranes nucléaires (Zhu et al., 1984; Dilworth et al., 1986). La capacité du gène T moyen à transformer est attribuable à une sous-population de la protéine T moyen située au niveau de la membrane cytoplasmique (Ballmer-Hofer et Benjamin, 1985; Markland et al., 1986). La protéine T moyen forme des complexes avec plusieurs protéines cel-lulaires dans les cellules transformées (Pallas et al.,1988). On sait qu'elle forme un complexe avec une protéine membra-naire qui est le produit de l'oncogène c-src (Courtneidge et Smith, 1984). Par cette association, l'activité tyrosine kinase intrinsèque de pp60c-rsc est stimulée et le niveau de
phosphorylation des deux protéines du complexe est modifié (Courtneidge, 1985; Balen et al., 1984; Yonemoto etal., 1985). Le niveau d'activité kinasique accrue associée à T moyen est en étroite corrélation avec le degré d'expression du phénotype transformé (Ito et al., 1980; Raptis et al., 1985). D'autre part, il semblerait que le complexe T moyen-pp6oc-src aurait une activité de phosphorylation du phospha-tidylinositol, un phospholipide membranaire.Le métabolisme de la forme phosphorylée du phosphatidylinositol produit du diacylglycérol et de l'inositol triphosphate qui constituent des seconds messagers importants dans la régulation de la croissance cellulaire (Nishizuka, 1984). T moyen forme aussi un complexe avec pp62c-yes qui est le produit du proto-oncogène c-yes. Sous cette association pp62c-yes phosphoryle T moyen (Kornbluth et al., 1986). L'activité kinasique associée à T moyen pourrait donc contribuer au processus de transformation par le virus du polyome (Kaplan et al., 1986; Koch et al., 1986).
L'antigène grand T, quant à lui, a plusieurs fonctions biologiques ou biochimiques pour lesquelles il est difficile d'établir avec certitude une relation avec son activité transformante. La protéine grand T est localisée dans le noyau de la cellule (Dilworth et al., 1986) où elle un joue un rôle important tant dans l'infection lytique que dans la transformation néoplasique. Cette phosphoprotéine (Schaffhausen et Benjamin, 1979) possède une activité ATPase
intrinsèque (Gaudrey et al., 1980) et se lie avec une grande affinité à des séquences d'ADN bicaténaire situées dans l'origine de réplication virale et aux promoteurs des régions précoces et tardives (Gaudrey et al., 1981; Cowie et Kamen, 1984; Dilworth et al., 1984; Prives et al., 1987).La protéine grand T aurait une activité hélicase intrinsèque (Seki et al., 1990) tout comme son homologue grand T de SV40. L'activité hélicase est responsable de l'ouverture de l'ADN double brin au niveau de l'origine virale permettant ainsi 11 initiation de la réplication du génome viral (Dodson et
al., 1987). Lors de l'infection lytique chez la souris, la protéine grand T stimule la synthèse de l'ADN cellulaire et initie la réplication de l 'ADN viral (Francke et Eckhart, 1973; Schlegel et Benjamin, 1978). Elle est responsable aussi de la répression de la transcription de la région précoce et de la transactivation de la transcription de la région tardive lors de la phase tardive de 1' infection lytique (Farmerie et Folk, 1984). La protéine grand T peut également transactiver des promoteurs cellulaires comme le fait grand T de SV40 (Kingston et al., 1986; Alwine, 1985; Pannuti et al., 1987). Par ailleurs, la protéine grand Test impliquée dans l'intégration du génome viral dans l'ADN hôte et aussi dans l'excision et l'amplification de l'ADN viral intégré (Basilico et al., 1979; Della Valle et al., 1981). Elle réduit la dépendance des cellules primaires, des cellules transformées et des lignées établies pour les facteurs sériques (Rassoulzadegan et al., 1982).
L'antigène grand T du virus du polyome diffère du grand T de SV40 principal_ement par son incapacité à transformer les cellules primaires. Mais il possède la capacité d'immor-taliser les cellules embryonnaires de rat i.e. qu'il leur confère l'habileté de croitre en culture de façon continue sans entrer en crise (Rassoulzadegan et al., 1983) • Cette fonction est si tuée dans la portion N-terminale du grand T plus particulièrement, dans les 219 premiers résidus de la protéine (Asselin et Bastin, 1985). L'antigène T moyen peut transformer ces cellules immortalisées: il s'agit alors de complémentation de T moyen par grand T dans la transfor-mation de cellules primaires. La protéine grand T est aussi impliquée dans la recombinaison homologue au niveau des séquences virales mais le mécanisme est peu défini. Certains auteurs suggèrent que 1 'antigène grand T crée un substrat favorable pour la recombinaison en provoquant l'ouverture de l 'ADN à l'origine de réplication virale par son activité hélicase (St-Onge et al., 1990). D'autres proposent plutôt que grand T induit lui-même la recombinaison indépendamment de la réplication (Colantuoni et al., 1982).
Tout récemment, Dyson et collaborateurs ont démontré que la protéine grand T de polyome forme des complexes avec certaines protéines cellulaires. Une protéine de 105 KDa a été identifiée comme étant le produit du gène de la suscep-tibilité au rétinoblastome (pl05-RB) (Dyson et al., 1990). Le
rétinoblastome est un cancer de la rétine de l'oeil observé chez les enfants. Il existe une étroite corrélation entre la perte ou l'inactivation d'un gène particulier appelé RB,
localisé au locus 13q14, et l'apparition de ce type de tumeur (Huang et al., 1988). Cette étroite corrélation suggère que la protéine codée par le gène RB est impliquée dans le contrôle de la prolifération cellulaire. Ainsi une protéine absente ou mutée ne permet plus de contrôle et amène indirectement la formation de tumeur (Green, 1989). La réintroduction d'un gène RB actif dans des lignées cel-lulaires de rétinoblastome en culture diminue leur taux de croissance et inhibe leur croissance en agar mou. Ces observations suggèrent qu'une protéine RB normale régule négativement la prolifération de lignées cellulaires de rétinoblastome en culture (Huang et al., 1988). La présence de pl05-RB dans plusieurs types de cellules suggère que le rôle de RB n'est pas spécifique. En effet des anomalies du gène RB sont fréquemment retrouvées dans plusieurs autres types de tumeurs humaines à incidence beaucoup plus élévée que le rétinoblastome telles que les carcinomes du poumon et de la vessie, les ostéosarcomes, et le cancer du sein et du col de l'utérus (Buchkovich et al., 1989 et références citées). Par ailleurs, on a démontré que la protéine RB est impliquée dans la transformation de plusieurs types cellulaires par les adénovirus, les papovavirus et les pa-pillomavirus (Green, 1989). Chacun de ces virus encode une ou quelques protéines transformantes dont l'une a la capacité de
se lier à la protéine RB. Ainsi dans le cas de !'adénovirus et de SV40, ce sont respectivement les protéines ElA et grand T que l'on retrouve complexées avec la protéine RB (Whyte et al., 1988a ; De Caprio et al., 1988). L'activité transfor-mante de ces protéines est abolie lorsque des mutations réduisant la liaison à RB sont introduites. La protéine ElA possède deux sites de liaison à RB qui se situent dans les positions 30 à 60 et 121 à 127 de la structure primaire (Whyte et al., 1989) • Deux régions de haute homologie avec ces deux régions de ElA sont également retrouvées pour toutes les lignées d' adénovirus, pour les protéines grand T des papovavirus et pour la protéine E7 du virus du papillome humain (HPV) (Moran, 1988; Dyson et al., 1989b), (figure 2). L'étroite corrélation qui existe entre la liaison à RB et la transformation cellulaire suggère que ces virus pourraient transformer en empêchant la protéine RB de jouer son rôle en s'y liant , ce qui aurait un effet comparable à une délétion génétique. Par ailleurs, il semblerait que non seulement la liaison à RB soit importante dans la transformation, mais aussi la force de liaison à RB. En effet, la protéine E7 des HPVs de type 16 et 18, associés à un haut pourcentage de cancer du col de l'utérus, lie avec plus d'affinité la protéine RB que la protéine E7 des HPVs de type 6b et 11 généralement non-oncogéniques (Münger et al., 1989; Gage et al., 1990).
REGION 1
ElA 30o N L P P P S H F E P P T L H E L Y D L D V T A P E D P N E E60
E7 1M H G D T P T L H E Y M L D L Q p E Tl9 SV40: py LPV : SA12: JCV BKM BKD lM D K V L N R E E S L Q L M D lM D R V L S R A D K E R L L E lM D Q T L S K E E R N E L M D lM D K V L N R E E S M E L M D lM D K V LN REES.MEL MD lM D K V L N R E E S M E L M D lM D K V L N R E E S M E L M D L L G L E R S A W G N I P L M R K A y34 L L K L P R Q L W G 0 F G R M Q Q A y34 L L Q I L R A A W G N L S M M K K A y34 L L G ~E R A A W G N L P L M R K A y34 L L G L D R S A W G N I P V M R K A y34 L L G L E R A A W G N L P L M R K A L34 L L G L E R A A W G N L P L M R K A y34 REGION 2 ElA C H E A G F p p s 0133 E7 lSE T c y E Q L N 0 s S E33 SV40: 99N E E N L F c s E E M P S S 0 0114 py 138E Q p D L F c y E E P L L S p Nl53 LPV : 127c C D 0 L F c s E T M S S s s 0142 SAl2: 101w 0 E 0 L F C H E 0 M F Q s o Ell6 JCV lOlW 0 E 0 L F c H E E M F A S 0 0116 BRK lOOw 0 E D L F c H E 0 M F A S 0 EllS BKD lOlw D E D L F C H E D M F A S D Ell6
Figure 2. Homologie entre les antigènes grand T des papovavirus et les protéines E1A d'adénovirus et E7 du virus du papillome humain.
Comparaison des séquences d •acides aminés des grand T du virus JC (JCV), BK (BKD et BKM), du virus de polyome humain (Py), du virus de babouin (SA12) et du virus lymphotropique de singe (LPV) qui sont homologues aux séquences conservées de liaison à RB du grand T de SV40 (a.a. 105 à 114), de ElA d'adénovirus de type 5 (a.a. 30 à 60 et 120 à 127) ainsi qu'à la protéine E7 du virus du papillome humain (Dyson et al., 1989b; Münger et al.,1989). Les séquences encadrées représen-tent les acides aminés identiques ou homologues (Dyson et al., 1990) .
RB est -une phosphoprotéine nucléaire dont le rôle pourrait varier au cours du cycle cellulaire. En effet, des changements cycliques de 1 'état phosphorylé de RB ont été démontrés au cours du cycle cellulaire (Buchkovich et al., 1989; De Caprio et al., 1989). La protéine RB est majoritai-rement sous forme déphosphorylée dans des cellules au stade Go/Gl du cycle cellulaire mais elle est présente presque exclusivement sous forme phosphorylée dans les phases S et G2 du cycle. Par ailleurs, la protéine grand T de SV40 coim-munoprécipi te seulement avec les formes déphosphorylées de RB. Ces deux observations suggèrent que la forme déphosphory-lée de RB serait la forme active impliquée dans le contrôle de la prolifération cellulaire, que grand T peut perturber ·coe Caprio et al., 1989).
Afin de clarifier le lien existant entre les diverses fonctions de l'antigène grand T de polyome et sa contribution dans la transformation néoplasique, nous avons analysé les propriétés de différents mutants de délétion du deuxième exon de grand T. Cette région de grand T est impliquée dans l'immortalisation cellulaire. Une autre propriété très importante de l'antigène grand T est la transactivation d'un grand nombre de promoteurs viraux et cellulaires. Plusieurs oncogènes immortalisants tels que grand T de polyome, de SV40 et ElA d 'adénovirus ont une p~opriété en commun
.
.
celled'encoder des protéines nucléaires qui sont capables de stimuler la transcription de promoteurs viraux et cellulaires
(Kingston et al., 1985). Ceci suggèrent que ces oncogènes transactivateurs permettent l' immortalisation cellulaire et la complémentation d'autres oncogènes dans la transformation en se liant au promoteur de gènes spécifiques et activent ou repriment ainsi leur transcription (Kingston et al., 1986). Nous avons voulu voir s'il existe effectivement une corréla-tion entre ces deux activités. Pour ce faire, nous avons analysé les propriétés d'immortalisation cellulaire et de transacti vat ion de promoteurs viraux de différents mutants de délétion du deuxième exon de grand T. Nous rapportons ici, que les mutants dl45 et dl96 ont conservé la capacité d'immortaliser des cellules primaires d'embryons de rat et de transactiver des promoteurs viraux alors que les mutants dl8, dl23 et dl300 sont déficients dans l' immortalisation comme dans la transactivation.
Par ailleurs, la mutation de dl8 est très intéressante puisqu'elle affecte une séquence d'acides aminés (motif DLXCXE) hautement conservée chez les papovavirus et qui est hautement homologue avec le domaine 2 de ElA d' adénovirus impliqué dans la liaison à RB. Une partie de ce motif est absent dans le mutant dl8. Dans le cas de !'adénovirus et de SV40 , il a été démontré qu •une étroite corrélation existe entre la capacité de lier RB et la transformation. Afin de vérifier si une telle corrélation existe pour le virus du polyome, nous avons produit par mutagénèse dirigée avec oligonucléotide synthétique, deux mutants du grand T de
polyome dans la région qui démontre une grande homologie avec le domaine 2 conservé de ElA d'adénovirus et qui est considéré essentiel pour la liaison à RB. Un de ces mutants, dl141, est caractérisé par la délétion du motif DLXCXE alors que l'autre mutant, dl14 7, est porteur du motif DLXCXE en conservant le reste de la délétion de dl8. Nous avons donc voulu vérifier si le motif DLXCXE est un motif fonctionnel utilisé par polyome dans la transformation oncogénique en déterminant s'il y avait corrélation entre l'immortalisation cellulaire, la liaison à RB et la propriété de transactiver (ou de réprimer) des promoteurs. On démontre ici que grand T de type sauvage de polyome est capable de lier la protéine RB dans un essai in vitro alors que le mutant dl 141 en est incapable. Par ailleurs dl141 n'a plus la capacité d'immor-taliser alors qu'il a conservé celle de transactiver certains promoteurs viraux. Le mutant dl147 quant à lui, est incapable d' immortaliser et de transacti ver. Le mutant dl 141 suggère que la capacité de transactiver des promoteurs n'est pas suffisante pour conférer la propriété d'immortalisation cellulaire.
MATERIEL ET METHOQES
I. Souche virale et plasmides.
Les plasmides utilisés pour réaliser ce travail contiennent des séquences de la souche A2 du virus du polyome de type sauvage (Fried et al., 1975).
pLTl contient le génome viral de polyome cloné au site BamHI de pAT153. Il n'encode que l'antigène grand T dû à une délétion spécifique de l'intron (Treisman et al., 1981a).
pLT8 contient l'antigène grand T du mutant mlt dl8 caractérisé par une délétion de 90 pb entre les nucléotides 990 et 1080 (Smolar et griffin, 1981). La mutation dl8 a été
introduite dans pLTl par recombinaison in vivo (Pinsonneault et al., 1988).
pLT23 contient l'antigène grand T du mutant mlt dl23 caractérisé par une délétion de 102 pb entre les nucléotides 1139 et 1241 (Smolar et Griffin, 1981). La mutation dl23 a
été introduite dans pLTl en échangeant les fragments de restriction appropriés.
pLT45 encode l'antigène grand T du mutant mlt dl45 qui a une délétion de 66 pb entre les nucléotides 1075 et 1140
(Bending et al., 1980).
pLT96 est un plasmide encodant le grand T du mutant mlt dl96 caractérisé par une délétion de 12 pb entre les nucléotides 1348 et 1360 (Eckhart, 1969; Gélinas et al., 1982).
pLT97 est constitué d'un grand T mutant caractérisé par une délétion de 30 pb entre les nucléotides 1367 et 1397. Ce mutant est déficient dans l'initiation de la synthèse d'ADN viral (Asselin et al., 1986).
pLTdl300 est porteur d'un grand T mutant ayant une délétion de 33 pb entre les nucléotides 1455 et 1488. La mutation dl300 provient du plasmide p91023LT dl300 (Cowie et al., 1986). Ce mutant est déficient pour la liaison à l'ADN.
pLT141 encode un grand T mutant ayant une délétion de 18 pb entre les nucléotides 978 et 996. Cette mutation a été créee par mutagénèse dirigée sur pLTl (Larose et al., 1990).
pLT147 est constitué d'un grand T mutant ayant une délétion de 84 pb entre les nucléotides 996 et 1080. Ce mutant a été produit par mutagénése dirigée de pLT8. Une tyrosine suivie d'un acide glutamique ont été insérés à la
jonction de la délétion de pLT8 (de façon à regénérer grand T de type sauvage à ces positions).
pSV2neo contient le gène néo qui code pour une aminogly-coside phosphotransférase de l'élément Tn5 de E. coli sous le contrôle du promoteur précoce de SV40 (Southern et Berg, 1982). Il confère la résistance à l'antibiotique G418.
pPLCAT encode le gène de la chloramphénicol acétyl-transférase sous le contrôle du promoteur tardif du virus du polyome. Ce plasmide ne peut pas se répliquer dû à une délétion de 2 3 pb et à 1 'addi tien d'un adapteur XhoI aux nucléotides 37 et 60 (Bautch et al., 1987).
pL2nCAT contient le gène de la chloramphénicol acétyl-transférase sous le contrôle du promoteur tardif de SV40. Ce plasmide a également une origine de réplication non-fonction-nelle (Keller et Alwine, 1984).
pEC113 contient la séquence de -285 à +40 pb de la région promoteur/activateur de transcription du gène ElA d'adénovirus type 5 liée au gène de la chloramphénicol acétyltransférase (Imperiale et al., 1985).
Les enzymes de restriction utilisés pour digérer le vecteur et le fragment à cloner proviennent de BRL
(Gaithersburg,Maryland), Amersham (Oakville, Ontario) ou Pharmacia (Baie d'Urfé, Québec). S'il est nécessaire qu'un fragment soit isolé avant de pouvoir procéder à une seconde digestion ou à la ligation, celui-ci peut-être déposé sur gel puis extrait par électroélution au moyen d'un appareil à électroélution ou à l'aide d'une membrane de diethylaminoe-thyl (DEAE-NA45, Schleicher and Schuell, Keene, New-Hampshire) •
La ligation du vecteur et du fragment à cloner se fait à la température de la pièce pendant environ 4 heures dans 20 ul de tampon de ligation (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM MgCl21
10 mM DTT, lmM ATP) contenant 2 unités de T4 ADN ligase. Les transformations bactériennes sont effectuées dans les souches E. coli HBlOl et JM109 (Boyer et al., 1969; Yanisch-Perron et al., 1985) selon les méthodes de Lederberg et Cohen (1974) et de Messing (1983) respectivement. L'amplification des plasmides recombinants de pBR322 et du phage M13 s'effectue selon les différentes méthodes décrites par Maniatis et collaborateurs (1982) ,par Messing (1983) ou en suivant les protocoles de la compagnie Amersham décrits dans "Oligonu-cleotide-directed in vitro mutagenesis system version 2" et "M13 cloning and sequencing handbook".
Les cellules sont cultivées dans du milieu minimum modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 10 % de sérum de veau foetal (SVF), 1% de fongizone (amphotéricine B, 2.5 ug/ml) et 1% d'antibiotiques (streptomycine 0.01%, pénicilline 100 unités/ml). Les cellules sont incubées à 370c sous une atmosphère contenant 5% de co2 et 95% d'air.
1. Cellules FR3T3, NIH3T3 et COS.
Les cellules FR3T3, NIH3T3 et COS sont des lignées cellulaires établies provenant respectivement de rat Fisher, de souris et de singe. Les cellules FR3T3 et NIH3T3 sont utilisées dans l'essai transitoire à la chloramphénicol acétyltransférase (essai CAT). Les cellules cos sont utilisées pour vérifier l'expression des protéines mutantes. La transfection s 1 effectue essentiellement selon la méthode
au Polybrene-DMSO (Kawai et Nishizawa, 1984).
Un Pétri de 100 mm contenant 5xlo5 cellules est incubé pendant 24 heures à 37°c puis vidé de son milieu nutritif et rincé une fois avec du milieu DMEM contenant 10% de SVF. On ajoute ensuite 10 ug d'ADN (essai CAT: 10 ug du plasmide de grand T et 10 ug du plasmide contenant le gène CAT) dans 2 ml de DMEM avec SVF 10% et 3 O ul de Polybrene ( lmg/ml dans
tampon PBSA) • On incube pendant 6 heures à 3 7 °c avec agitation occasionnelle. Le milieu est enlevé puis 4 ml de
DMEM contenant 25% de DMSO sont ajoutés dans le Pétri. On laisse agir respectivement 4 minutes, 90 et 60 secondes pour les cellules FR3T3, COS et NIH3T3. Le Pétri est ensui te rincé 2 fois avec du milieu DMEM et 10 ml de milieu DMEM contenant 10 % SVF sont ajoutés. Les cellules sont alors incubées à 37 °c pendant 48 heures.
2. Fibroblastes d'embryons de rat. i. Préparation des cellules.
Les embryons de rat Fisher de 12 à 15 jours sont prélevés stérilement, coupés, lavés trois fois au Tris salin (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM Na2HP04 , 5mM glucose, 25 mM Tris-Hel, 0.0015% rouge phénol, pH 7.4) puis traités avec de la trypsine 0.06% (75 ml Tris salin + 25 ml trypsine 0.25%) à 37°c avec agitation constante pendant 20 minutes. Les cellules sont filtrées à travers une gaze et sont recueillies dans 30 ml de sérum de veau foetal. Cet extrait cellulaire est centrifugé à 1800 rpm pendant 10 minutes et les cellules
sont resuspendues dans du milieu DMEM complet puis comptées au bleu de Trypan. Trois millions de cellules sont ensemen-cées par Pétri de 60 mm dans du DMEM complet puis sont incubées à 37°c pendant 20 à 24 heures leur permettant d'atteindre de 30 à 50% de confluence.
ii. Transfection des cellules primaires (Wigler et al.,1978).
Le milieu est changé 4 heures avant la transfection et
remplacé par du DMEM contenant 10% SVF. On dépose dans un premier tube, 8 ug d'ADN (contenu dans 12 ul de tampon TE: lmM Tris- Hel, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) ,175 ul d'ADN de thymus de veau (lOug dans 175 ul de tampon TE 1/10) et 63 ul de 1 M cac12 • Dans un second tube, on dépose 250 ul de tampon HEBS 2x (50 mM HEPES pH 7.12, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HP04}. La solution d'ADN est ajoutée lentement, pendant 30 secondes, au tampon HEBS 2X avec une agitation constante créée par 11 introduction lente de bulles d'air dans le mélange. Le
précipité est laissé pendant 30 minutes à température de la pièce puis ajouté à une boite de Pétri de 60 mm dont le tapis cellulaire est entre 30 et 50% de confluence et qui contient 5 ml de DMEM contenant 10% SVF. Après une incubation de 24 heures à 370c, les cellules sont diluées 1:2 ou 1:3 afin d'obtenir de 20,à 30 % de confluence.
iii. Sélection à l'antibiotique G418 et immortalisation. Dans l'essai d'immortalisation, on sélectionne les colonies sur la base de la résistance à l'antibiotique G418 et pour ce faire l'ADN recombinant est inclu dans un vecteur porteur du gène néo qui confère la résistance au G418
La sélection au G418 débute 18 heures après la dilution 1:2 ou 1:3 et consiste à remplacer le milieu nutritif par du milieu DMEM complet contenant du G418 (400 ug/ml). Les cellules sont alors incubées à 370c et le DMEM complet avec G418 est changé tous les 5 jours. Deux à trois semaines plus tard, les clones résistants au G418 sont prélevés sans tenir compte de leur morphologie puis cultivés par passage dans des puits de
o.
28 cm2 de surface (Linbro, Flow Laboratories, Montréal) contenant 200 ul de milieu DMEM complet contenant du G418 (400 ug/ml). Lorsque les cellules atteignent la confluence, elle sont diluées 1:2 à 1:5 dans des puits de 2~0cm2 de surface pendant 5 passages pour s'assurer de leur immortalité.
IV. Transactivation de promoteurs viraux par l'antigène grand T.
L'essai transitoire à la chloramphénicol acétyltransfé-rase s'effectue essentiellement selon la méthode décrite par German et collaborateurs (1982). Quarante-huit heures après la transfection au polybrène-DMSO, les cellules sont lavées 3 fois avec une solution de PBSA (0.17 M NaCl, 3.3 mM KCl, 0.01 M Na2HP04, 1.8 mM KH2Po4 , pH 6.8). Un ml d'une solution Tris-EDTA-NaCl (40mM Tris-HCl, lmM EDTA, 150mM NaCl, pH 7.4) est ajouté aux cellules et on laisse agir 5 minutes à la température de la pièce. Les cellules sont ensuite récoltées
dans un tube Eppendorf puis centrifugées pendant 2 minutes à 4 °c. Après avoir resuspendu les cellules dans 100 ul d'une solution de 250 mM Tris-Hel, pH 7.8, on utilise la sonication (puissance de 40 à 50 watts, 0,5 à 1 seconde répété 5 fois à 4 °c) pour lyser les cellules. Les débris cellulaires sont alors centrifugés pendant 5 minutes à 4 Oc puis le surnageant est transféré dans un nouveau tube. La concentration totale des protéines contenues dans le surnageant est évaluée au moyen du réactif BCA (Pierce Laboratories, Rockford,
Illinois) afin que chaque essai CAT soit mené avec une quantité équivalente de protéines (150 à 200 ug de protéines ) • Ensuite on réunit dans un tube le volume de surnageant requis, 0.1 uci (1 ul) de [14c]-chloramphénicol (50 mCi/mole; Amersham), 20 ul d'une solution d'acétyl coenzyme A (4 mM acétyl CoA, Tris-HCl 0.25 M, pH 7.4) et le volume nécessaire d'un tampon Tris-HCl 0.25 M, pH 7.4, pour un volume total de réaction de 180 ul. La réaction enzymatique est incubée à 37°c pendant une heure puis arrêtée par addition de 2 ml d'acétate d'éthyle froid. Le chloramphénicol et ses formes acétylées sont extraits du mélange réactionnel par trois extractions successives avec 2 OO ul d'acétate d'éthyle. La phase organique est recueillie et évaporée puis le chloram-phénicol est resuspendu dans 20 ul d'acétate d'éthyle et déposé sur une plaque chromatographique recouverte de gel de silice. Les produits de la réaction d'acétylation sont séparés par une chromatographie dans un mélange de chlorofor-me-méthanol (95:5) pendant environ 1 heure. Après
autoradio-graphie, les produits de la réaction sont recoltés séparément et le compte radioactif est évalué au moyen d'un compteur à scintillation liquide. On détermine ensuite le pourcentage de conversion du chloramphénicol en produits acétylés.
V. Expression et détermination de la demi-vie de l'antigène grand T.
L'antigène grand T des cellules immortalisées et des cellules cos marquées à la [35s]-méthionine est immunopréci-pité selon la technique décrite par Schauffhausen et Benjamin
(1981)
I. Marquage des cellules et chasse.
Les cellules à 80% de conflu€nce dans un Pétri de 100 mm sont lavées avec une solution de PBs+ (170 rnM NaCl, 3.3 rnM KCl, lOrnM Na2HP04 , 1.8 rnM KH2Po4 , 5 rnM MgC12 , 7 rnM CaC12 , pH 6.8). Elles sont marquées pendant 20 minutes à 37 °c dans 3 ml de milieu Hanks (Flow) contenant 150 uci de [35s]-méthionine (Arnersham). Pour effectuer une chasse avec de la méthionine non-marquée, le milieu radioactif est enlevé puis les cellules sont lavées 2 fois avec la solution de PBs+. Elles sont ensuite incubées dans 6 ml de milieu DMEM complet contenant de la méthionine (0.3 ug/ml), à 37 °c pendant
o,
2, 4, 6 ou 8 heures. Le chasse nécessite donc cinq boites de Pétri de 100 mm par lignée.II. Immunoprécipitation.
Les cellules sont lavées 2 fois avec une de solution de PBs+ froid puis récoltées dans un tube conique de 15 ml. Elles sont ensuite centrifugées à 1000 rpm pendant 2 minutes, resuspendues dans 500 ul de tampon de solubilisation (O. 4% SDS, 50 mM triéthanolamine-HCl, 100 mM NaCl, 2mM EDTA, 0.1 mM PMSF, 2mM mercaptoéthanol, pH 7.4) puis chauffées à 100
°c,
pendant 3 minutes. Lorsque l'extrait est refroidi, 125 ul de Triton-XlOO (10%) ainsi que 100 ul d'iodoacétamide (100 mM) sont ajoutés et le tout est centrifugé dans un tube Eppendorf à 4°c
pendant 30 minutes afin de se débarrasser des débris cellulaires. On ajoute 1. 5 ul de sérum polyclonal de lapin anti-T de polyome au surnageant et on incube à 4°c
avec une faible agitation pendant 30 minutes puis 60 ul d'une suspension de protéine A Sépharose 50% (v/v) sont additionnés au tout et le mélange est incubé à nouveau à 4°c
avec une faible agitation pendant 90 minutes. Afin d'éliminer les proteines marquées qui peuvent réagir de manière non-spécifi-que avec l 'antisérum, on lave le précipité, préalablement transféré dans un tube conique de 15 ml, 2 fois avec 5 ml de solution de PBs+, 2 fois avec une solution de lavage au LiCl (0.5 M LiCl, 0.1 M Tris-HCl, pH 6.8) et une fois avec 5 ml d'eau distillée. Chaque lavage est suivi d'une centrifugation à 4°c
jusqu'à ce que la vitesse atteigne 2000 rpm. Le culot est ensuite resuspendu dans 40 ul de tampon de dissociation(125 mM Tris-Hel, pH 6.8, 5% SDS, 20% glycérol, 0.0075% bleu de Bromophénol, 5% mercaptoéthanol). La présence de SDS augmente l'accessibilité des protéines aux protéases. Il est important que le tampon de dissociation ne soit ajouté qu'au moment où les échantillons sont prêts à être chauffés. Les échantillons sont chauffés pendant 2 minutes et déposés sur un gel de SDS-polyacrylamide 12.5% (Laemli, 1970).
La migration des échantillons se fait en présence de protéines marqueurs précolorées (BRL: 200 à 14.3 KDa) dans un tampon d'électrophorèse (25 mM Tris-HCL, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3) à 50 volts durant la nuit. Ensuite le gel est trempé pendant 30 minutes dans un mélange contenant 5% de méthanol et 7.5% d'acide acétique puis trempé à nouveau dans une solution "Amplify" (Amersham) pendant 30 minutes avec agitation constante. Le gel est séché puis exposé à -70
°c
à un film Kodak XAR-5.V. Mutagenèse dirigée au moyen d'un oligonucléotide synthétique.
La mutagenèse dirigée au moyen d'un oligonucléotide synthétique constitue une méthode générale pour la production de mutations spécifiques de délétion, d'insertion ou ponctuelle. Le fragment porteur de la région à mutagéniser est d'abord inséré dans
vecteurs synthétiques
le site de multiclonage d'un des du phage M13. L'ADN circulaire
31
monocaténaire du phage Ml3 contenant ce fragment sert de matrice à la réaction de mutagenèse. L'oligonucléotide synthétique (15 à 30 nucléotides) portant la mutation est hybridé à la matrice et sert ensuite d'amorce pour la polymérisation du second brin par le fragment Klenow de l'ADN polymérase de E. coli. Des molécules bicaténaires fermées sont générées par ligation avec la T4 ADN ligase du brin nouvellement synthétisé.
1. Clonage dans le phage Ml3.
Le fragment porteur de la région à mutagéniser est inséré dans le site de multiclonage d'un des vecteurs synthétiques du phage Ml3 ( Messing et al., 1977; Yanisch-Perron et al., 1985). Dans le présent travail, un fragment BamHI-HindIII à mutagéniser a été introduit aux sites BamHI et HindIII dans la région de multiclonage du vecteur Ml3mpl9. Après avoir mutagénisé, le fragment initial a été recloné dans le vecteur de départ.
2. Mutagenèse de délétion.
i. Phosphorylation de l'oligonucléotide.
La technique de phosphorylation est essentiellement celle décrite par Amersham dans le livret: "Oligonucleotide-directed in-vitro mutagenesis system version 211 • L'
oligonu-cléotide obtenu est non-phosphorylé mais il doit être phosphorylé pour permettre la ligation du brin synthétisé. Cinquante picomoles d' oligonucléotide contenues dans 2 ul d'eau bidistillée sont mélangées avec 3 ul de tampon kinase lOX (1 M Tris-HCL, pH 8.0, 100 mM MgCl2, 70 mM OTT, 10 mM ATP), 25 ul d'eau bidistillée et 2 unités de T4 polynucléo-tide kinase. Le tout est mélangé doucement en pipettant puis incubé à 37°c pendant 45 minutes. La réaction est ensuite arrêtée en incubant à 70 °c pendant 10 minutes.
ii. Hybridation de l 'oligonucléotide à l 'ADN monocaté-naire.
Les conditions d'hybridation utilisées proviennent du protocole de la compagnie Amersham et de la méthode décrite par Zoller et Smith (1983). On mélange 4 ug (2 pmoles) de phage Ml3 monocaténaire recombinant, 0.1 pg (20 pmoles) d'oligonucléotide phosphorylé (excès molaire: lOX /matrice), 2 ul de tampon d'hybridation (1 M NaCl, 1 M Tris-HCL, pH 8.0) et on ajoute le volume d'eau bidistillée nécessaire pour obtenir un volume total de 17 ul. Le mélange est incubé à 65
0c, pendant 10 minutes afin de défaire la structure
secon-daire de 1 'ADN et permettre ainsi une bonne hybridation de l 'oligonucléotide avec la matrice. Ensuite le mélange est incubé dans le bain à 65 °c que l'on laisse refroidir jusqu'à 40 °c (40 minutes) et encore incubé pendant 2 minutes à la température de la pièce puis placé sur glace.
iii. Synthèse et ligation du brin mutant.
Au 17 ul du mélange d'hybridation, on ajoute 5 ul d'une solution MgC12 lOOmM, lul d'ATP 50 mM, 7.5 ul d'un mélange de nucléotides (2.5 mM dATP, 2.5 mM dCTP, 2.5 mM dGTP, 2.5 mM dTTP), 6 unités d'ADN polymérase d'E. coli (fragment Klenow), 6 unités de T4 ADN ligase et le volume d'eau bidistillée nécessaire pour obtenir un volume total de 55 ul. Le mélange réactionnel est incubé à 16
°c
pendant 26 heures.3. Mutagenèse d'insertion (livret d'Amersham).
Les conditions expérimentales de la mutagenèse d'inser-tion sont les mêmes que celles utilisées pour la mutagenèse de délétion exception faite des condi tians de température d'hybridation de l'oligonucléotide à la matrice. Pour ce type de mutagenèse, le mélange d'hybridation a été incubé à 70
°c
(5 minutes), à 56°c
(20 minutes), puis à37°c
(20 min) et enfin mis sur glace.4. Purification de l'hétéroduplex synthétisé par mutagenèse.
L'étape de polymérisation du second brin génère des intermédiaires non-finis d 'ADN bicaténaire sur lesquels la ligation ne peut se faire. L'hétéroduplex synthétisé par
mutagenèse se trouve parmi ces intermédiaires et est purifié avant la transformation bactérienne afin d'augmenter le taux de mutants. La purification consiste à faire migrer le mélange obtenu après ligation sur un gel d'agarose 0.7% contenant 1 ug/ml de bromure d'éthidium puis à électroéluer la bande d'ADN correspondant à l'hétéroduplex.
5. Transformation de la souche E. coli JM109.
Les recombinants de M13 mutagénisés sont introduits dans E. coli afin de les amplifier pour pouvoir les isoler. La molécule d'ADN introduite est hétéroduplex pour la mutation mais la réplication se fait de façon à générer au-delà de 50% de molécules homoduplex pour la mutation (Zoller et Smith, 1983). Les séries JM de E. coli ont été conçues pour permettre une bonne infection par M13 et pour utiliser le système d'a-complémentation entre les différents vecteurs de Ml3 et l'hôte. Ce système très pratique est utilisé lors du clonage dans M13. Par ailleurs, il semble que les phages M13 recombinants subissent moins de délétions lorsqu'ils sont propagés dans JM109 plutôt que dans d'autres souches de la série JM (Yanisch-Perron et al., 1985).
i. Préparation des bactéries compétentes.
Le protocole de transformation utilisé s'inspire de celui de Messing et collaborateurs (1983). On ensemence 50 ml
de milieu 2XTY avec o.5 ml d'une culture fraiche d'une nuit de E. coli JM109 puis on incube à 37 °c avec agitation jusqu'à ce que la densité optique à 660 nm soit d'environ 0.5 unité. Un ml de cette culture est incubé avec 7 ml de milieu 2XTY pour produire un tapis bactérien lors de l'étalement des bactéries transformées. La culture de 50 ml est centrifugée à
3500 rpm, pendant 10 minutes et le culot de bactéries est resuspendu dans 10 ml d'un solution CMl ( lOmM acétate de sodium, 50 mM MgC12 , 5 mM NaCl, pH 5.6) à 4°c puis maintenu sur glace pendant 20 minutes. Les bactéries sont alors centrifugées à 3500 rpm, pendant 10 minutes, puis resuspen-dues dans 1 ml d'une solution CM2 {10 mM acétate de sodium, 5 mM MnCl21 70 mM cac12 , 5% glycérol, pH 5.6) et maintenues sur
glace pendant 30 minutes.
ii. Transformation des bactéries compétentes.
On ajoute environ 100 ng d 'ADN mutagénisé à 100 ul de bactéries compétentes puis on maintient sur glace pendant environ 40 minutes. Les bactéries sont ensuite soumises à un choc thermique à 42 °c, pendant 2 minutes puis placées sur glace pendant environ 10 minutes. Deux cents ul de la culture pour le tapis bactérien sont mélangés avec 10 ul d'IPTG 100 mM, 50 ul d'XGAL 2% (solvant DMF) et 3 ml d'agar mou de surface maintenus à 50 °c. on ajoute à ce mélange 100 ul de cellules transformées et on étale immédiatement le tout sur une boite de Pétri remplie d'agar.
VII. Analyse des mutants.
Une première analyse des mutants a été réalisée par "dot blot". Dans cette technique l'oligonucléotide mutant est marqué et utilisé comme sonde pour détecter les clones mutants. Tout mauvais pairage de l'oligonucléotide avec l'ADN monocaténaire du phage déstabilise la liaison de l'oligonu-cléotide. Ainsi lorsque la température d'incubation est élevée, la sonde radioactive se dissocie des clones non-mutants mais demeure hybridée aux clones non-mutants. La température d'incubation adéquate est estimée par la formule de Wallace (protocole de la compagnie Amersham) • L' ADN de quelques uns de ces clones mutants est séquencé par la méthode de Sanger pour vérifier que l'ADN porte la mutation adéquate au bon endroit.
1. "Dot blot".
i. Préparation de la sonde (livret Amersham; Zoller et Smith, 1982).
La réaction de marquage s'effectue à 37
°c
et les cons-tituants du mélange réactionnel sont ajoutés dans 1 'ordre suivant: eau bidistillée (pour un volume final de 30 ul), 3 ul de tampon kinase lOX (1 M Tris-Hel, pH 8.0, 100 mM Mgcl2), 1.5 ul de DTT 0.1 M, 20 pmoles d'oligonucléotide, 2 ul de[1-32p] ATP (Amersham, 10 uCi/ul) et 1 unité de T4 polynucléoti-de kinase. Après 45 minutes d'incubation, la réaction est arrêtée en chauffant le mélange à 65
°c,
pendant 10 minutes. La sonde est conservée à -20°c.
ii. Hybridation par "dot blot".
Au moyen d •un appareil à "dot blot", 100 ul de surna-geant de phages sont déposés par puits sur un filtre de nylon
(Hybond- N, Amersham, Oakville, Ontario). Le filtre est ensuite séché et exposé pendant 10 minutes aux rayons ultraviolets afin que l'ADN s'y fixe de façon covalente. Le filtre est mis dans un sac de plastique scellé contenant 10 ml de solution de préhybridation (6X
