Évolution de la qualité microbienne de l'air circulant
dans les centrales de traitement de l'air (CTA) d'un
centre hospitalier
Mémoire
Pamela Morissette
Maîtrise en microbiologie - avec mémoire
Maître ès sciences (M. Sc.)
Évolution de la qualité microbienne de l’air circulant
dans les centrales de traitement de l'air (CTA) d'un
centre hospitalier
Mémoire
Pamela Morissette
Sous la direction de :
Résumé
Dans les hôpitaux, les bioaérosols en suspension dans l’air peuvent contenir des cellules bactériennes ou fongiques provenant des patients, des visiteurs, du personnel et de l’environnement extérieur. Les centrales de traitement de l’air (CTA) sont des unités permettant de filtrer, de conditionner et d’assurer une bonne qualité de l’air aux occupants et sont présentes dans certains hôpitaux. Dans la littérature, il n’y a pas de consensus sur le choix des échantillonneurs d’air et les méthodes d’analyse lorsqu’on désire évaluer la qualité de l’air qui est traité dans ces centrales. Le principal défi consiste à éviter la perturbation des soins aux patients lors de l’échantillonnage de l’air dans les CTA.
Le présent projet a permis de développer un protocole permettant l’échantillonnage des bioaérosols dans les CTA en utilisant des cannes d’échantillonnage sans perturber les activités qui se déroulent dans l’hôpital. L’objectif de cette étude longitudinale était d’analyser la qualité microbiologique de l’air lors de dix campagnes s’échelonnant sur une période d’un an.
Les résultats de cette étude ont démontré que les saisons affectaient significativement les concentrations de microorganismes cultivables et totaux dans l’air intérieur et extérieur d’un hôpital, mais l’effet saisonnier n’influençait pas les concentrations de particules. Le traitement de l’air réalisé avec plusieurs filtres s’est avéré efficace afin de réduire les charges microbiennes et les particules. L'utilisation des méthodes de séquençage Sanger pour l’identification des colonies isolées et de séquençage à haut débit de gènes universels a permis d'obtenir un aperçu de la diversité des espèces bactériennes et fongiques et de valider l’utilisation de marqueurs d’air biologiques.
Ce projet a permis d’élaborer des méthodes d’échantillonnage en air dynamique et à haut débit. Il permettra de proposer une stratégie assurant le suivi à long terme de la qualité de l’air à l'intérieur d’un hôpital sans perturber les activités qui s’y déroulent.
Abstract
Air contains bioaerosols, which are airborne particles of biological origin, including bacterial or fungal cells. Bioaerosols in hospitals may contain microorganisms from patients, visitors, staff, and the outdoor environment. Air treatment units (ATU) are present in certain hospitals and aim to ensure the best air quality for occupants. The literature is scarce when it comes to the choice of air samplers and the method of analyses to assess the air quality in these ATUs. The main challenge is to avoid disruption of patient care during air sampling.
The present project developed a protocol allowing the sampling of bioaerosols in ATU using sampling rods and, therefore, without disturbing the activities taking place in the hospital. The objective of this longitudinal study was to analyze the microbiological quality of the air during ten campaigns over one year.
The results of this study demonstrated that the seasons significantly affect the concentrations of culturable and total microorganisms in the indoor and outdoor air of a hospital. Airborne particle concentrations were not affected by these seasonal changes. Air treatment with several filters was proven to be effective in reducing microbial loads and particles. The use of Sanger sequencing to identify isolated colonies and next-generation sequencing methods provided insight into the diversity of bacterial and fungal species.
This project developed high-velocity dynamic air sampling methods. The study proposes a strategy ensuring long-term monitoring of air quality inside a hospital without disturbing the activities that are taking place inside and to validate the use of biological markers for contaminants in the air in a normal situation.
Table des matières
Résumé ... iii
Abstract ... iv
Table des matières ... v
Liste des figures ... vii
Liste des tableaux ... x
Liste des abréviations et des sigles ... xi
Remerciements ... xiii
Introduction ... 1
Les bioaérosols ... 1
Les bioaérosols dans les environnements intérieurs bâtis ... 2
Les bioaérosols dans les centres hospitaliers ... 4
Infections nosocomiales ... 6
Systèmes de ventilation ... 10
Fonctionnement d’une centrale de traitement d’air (CTA) ... 12
Échantillonnage de l’air ... 15
Traitements et analyses des échantillons d’air et limites des méthodes ... 19
Contraintes d’échantillonnage de ce projet ... 22
Chapitre 1 : Problématique, hypothèses et objectifs ... 24
1.1 Problématique ... 24
1.2 Hypothèses ... 24
1.3 Objectifs ... 25
Chapitre 2 : Matériel et méthodes ... 26
2.1 Campagnes d’échantillonnage... 26
2.2 Centrales de traitement d’air ... 26
2.3 Points de prélèvement ... 27
2.4 Validation des cannes d’échantillonnage ... 28
2.5 Quantification des bactéries et des moisissures par culture ... 30
2.6 Quantification des bactéries et des moisissures par méthodes de biologie moléculaire .... 32
2.7 Comptes de particules et mesures physicochimiques. ... 33
2.8 Identification des colonies par séquençage Sanger ... 34
2.10 Analyses statistiques ... 36
Chapitre 3 : Résultats ... 38
3.1 Validation des cannes d’échantillonnage ... 38
3.2 Variabilité entre les CTA ... 39
3.3 Quantification des bactéries et des moisissures par méthode de culture ... 40
3.4 Quantification des bactéries et des moisissures par méthodes de biologie moléculaire .... 43
3.5 Compte de particules et mesures physico-chimiques ... 47
3.6 Identification des colonies par séquençage Sanger ... 53
3.7 Biodiversité bactérienne et fongique par séquençage à haut débit ... 56
Chapitre 4 : Discussion ... 62
4.1 Validation des cannes d’échantillonnage ... 62
4.2 Quantification des bioaérosols ... 63
4.3 Identification des colonies par séquençage Sanger ... 69
4.4 Biodiversité bactérienne et fongique par séquençage à haut débit ... 70
Conclusion ... 74
Bibliographie ... 76
Annexe A Protocole d’extraction d’ADN de la trousse DNeasy PowerLyzer PowerSoil ... 81
Annexe B Protocole qPCR Bactéries totales ... 82
Annexe C Protocole qPCR Staphylococcus spp. ... 83
Annexe D Protocole qPCR Cladosporium spp. ... 84
Annexe E Protocole qPCR du regroupement Penicillium spp. et Aspergillus spp. ... 85
Annexe F Identification des bactéries par séquençage ... 86
Liste des figures
Figure 1. Les bioaérosols émis par une personne et leur devenir dans l'air selon leur taille. ... 2
Figure 2. Différentes voies de transmission d'un pathogène émis d'un individu infecté. ... 8
Figure 3. Centrale de traitement d'air construite sur deux étages avec une roue thermique en rotation. ... 13
Figure 4. Différentes composantes d’une centrale de traitement de l'air d'un hôpital. ... 14
Figure 5. Super Air Sampler Duo. ... 17
Figure 6. Smart Air Sampler System 3100. ... 18
Figure 7. Compteur optique de particules ... 19
Figure 8. Cannes d'échantillonnage utilisées pour les échantillonneurs : SAS Duo (a), SASS 3100 (b) et l'OPS (c). ... 23
Figure 9. Localisation des huit points d'échantillonnage dans une centrale de traitement d'air illustrant en bleu le parcours de l'air extérieur et en rouge celui de l'air intérieur. ... 27
Figure 10. Port d'accès de type Ventlok installé à chaque point d'échantillonnage. ... 29
Figure 11. Échantillonneurs d'air reliés à leurs cannes d'échantillonnage : SASS 3100 (a), SAS Duo (b) et l'OPS (c). ... 29
Figure 12. Échantillonneur SAS Duo placé à l'intérieur de la CTA à gauche et l'échantillonneur placé à l'extérieur de la CTA relié à la canne d'échantillonnage. ... 30
Figure 13. Procédure pour la quantification des bactéries et des moisissures cultivables provenant d'un échantillon d'air récolté avec le SAS Duo. ... 31
Figure 14. Procédure pour le traitement du filtre contenant les bioaérosols récoltés avec l’échantillonneur d’air SASS 3100. ... 33
Figure 15. Whatman® FTA® Cards ... 34
Figure 16. Comparaison des résultats obtenus avec l'échantillonnage de l'air à l'intérieur de la CTA et avec la canne d'échantillonnage. ... 39
Figure 17. Comparaison des concentrations de bactéries cultivables dans l’air à chaque point d’échantillonnage (moyenne des 6 CTA). Les dix campagnes sont illustrées en rouge pour les mois plus chauds et en bleu pour les mois plus froids. La ligne pointillée indique la limite de quantification. ... 41
Figure 18. Comparaison des concentrations de moisissures cultivables dans l’air à chaque point d’échantillonnage (moyenne des 6 CTA). Les dix campagnes sont illustrées en rouge pour les mois plus chauds et en bleu pour les mois plus froids. La ligne pointillée indique la limite de quantification. ... 42
Figure 19. Comparaison des concentrations de bactéries totales l’air à chaque point d’échantillonnage (moyenne des 6 CTA). Les dix campagnes sont illustrées en rouge pour les mois plus chauds et en bleu pour les mois plus froids. La ligne pointillée indique la limite de quantification. ... 44
Figure 20. Comparaison des concentrations de génomes Staphylococcus spp. dans l’air à chaque point d’échantillonnage (moyenne des 6 CTA). Les dix campagnes sont illustrées en rouge pour les mois plus chauds et en bleu pour les mois plus froids. La ligne pointillée indique la limite de
quantification. ... 45 Figure 21. Comparaison des concentrations de génomes de Cladosporium spp. dans l’air à chaque point d’échantillonnage (moyenne des 6 CTA). Les dix campagnes sont illustrées en rouge pour les mois plus chauds et en bleu pour les mois plus froids. La ligne pointillée indique la limite de
quantification. ... 46 Figure 22. Comparaison des concentrations de génomes pour le regroupement Penicillium spp. et Aspergillus spp dans l’air à chaque point d’échantillonnage (moyenne des 6 CTA). Les dix
campagnes sont illustrées en rouge pour les mois plus chauds et en bleu pour les mois plus froids. La ligne pointillée indique la limite de quantification. ... 47 Figure 23. Comparaison des concentrations de particules dans l’air à chaque point d’échantillonnage (moyenne des 6 CTA). Les dix campagnes sont illustrées en rouge pour les mois plus chauds et en bleu pour les mois plus froids. La ligne pointillée indique la limite de quantification. ... 49 Figure 24. Comparaison de la concentration des particules dans l’air selon leurs tailles pour les huit points d’échantillonnage. Chaque symbole représente la moyenne des concentrations de particules pour les six CTA pour une même campagne d'échantillonnage. Les lignes brisées relient les
moyennes des dix campagnes pour chaque taille de particules. La ligne pointillée indique la limite de quantification. ... 50 Figure 25. Comparaison de la température à chaque point d’échantillonnage (moyenne des 6 CTA). Les dix campagnes sont illustrées en rouge pour les mois plus chauds et en bleu pour les mois plus froids. La ligne pointillée sépare les températures positives et négatives. ... 51 Figure 26. Comparaison de l’humidité relative à chaque point d’échantillonnage (moyenne des 6 CTA). Les dix campagnes sont illustrées en rouge pour les mois plus chauds et en bleu pour les mois plus froids. ... 52 Figure 27. Comparaison de la vitesse du vent à chaque point d’échantillonnage (moyenne des 6 CTA). Les dix campagnes sont illustrées en rouge pour les mois plus chauds et en bleu pour les mois plus froids. ... 52 Figure 28. Diagramme de Venn des genres bactériens cultivables identifiés aux points
d'échantillonnage 1, 2 et 3 (air extérieur) ainsi que les points 7 et 8 (air intérieur). Le nombre de fois que le genre a été identifié est indiqué entre parenthèses. ... 54 Figure 29. Diagramme de Venn des genres fongiques cultivables identifiés aux points
d'échantillonnage 1, 2 et 3 (air extérieur) ainsi que les points 7 et 8 (air intérieur). Le nombre de fois que le genre a été identifié est indiqué entre parenthèses. ... 55 Figure 30. Comparaison des pourcentages des quatre phylums bactériens majoritairement retrouvés aux points d'échantillonnages 2, 3 et 7 pour les campagnes de septembre, octobre et décembre 2018. ... 56 Figure 31. Comparaison de l’abondance relative des quatre phylums bactériens les plus abondants pour les points d'échantillonnages 2, 3 et 7 selon les trois campagnes de septembre, octobre et décembre 2018. ... 58
Figure 32. Abondances relatives des cinq genres les plus abondants parmi les trois phylums
bactériens majoritaires ; Proteobacteria, Actinobacteria et Firmicutes ... 59 Figure 33. Abondances relatives des dix genres les plus abondants parmi les phylums fongiques majoritaires ; Basidiomycota et Ascomycota ... 61
Liste des tableaux
Tableau 1. Moyenne des microorganismes cultivables (UFC/m3) isolés dans différents secteurs de l'hôpital. ... 5 Tableau 2. Dates des campagnes effectuées pendant ce projet. ... 26 Tableau 3. Préparation du mélange réactionnel pour l’amplification qPCR des bactéries totales ... 82 Tableau 4. Préparation du mélange réactionnel pour l'amplification qPCR de Staphylococcus spp. 83 Tableau 5. Préparation du mélange réactionnel pour l’amplification qPCR de Cladosporium spp. ... 84 Tableau 6. Préparation du mélange réactionnel pour l’amplification qPCR du regroupement
Penicillium spp. et Aspergillus spp. ... 85
Tableau 7. Préparation du mélange réactionnel pour l’amplification PCR du gène ARNr 16S ... 86 Tableau 8. Préparation du mélange réactionnel pour l’amplification PCR de la région ITS1 ... 87
Liste des abréviations et des sigles
ADN : Acide désoxyribonucléiqueARNr 16s : Acide ribonucléique de la petite sous-unité ribosomique de 30S des procaryotes BLAST : Basic Local Alignment Search Tool
CHUL : Centre Hospitalier de l’Université Laval CTA : Centrale de traitement d’air
g/cm3 : Gramme par centimètre cube HEPA : High Efficiency Particulate Air
IBIS-UL : Institut de biologie intégrative et des systèmes à l’Université Laval ITS 1 : Internal Transcribed Spacer 1, région du gène de l’ARNr des eucaryotes L : Litre
L/min : Litre d’air par minute
MERV : Minimum Effiency Reporting Value, min : Minute
mL : Millilitre
mps : Mètre par seconde m3 : Mètre cube
OMS : Organisation mondiale de la Santé
OPS : Optical particle sizer, compteur de particule
PCR : Polymerase Chain Reaction, réaction en chaine de la polymérase
PM10 : Particulate Matter, matière particulaire ayant un diamètre inférieur à 10 micromètres qPCR : Quantitative Polymerase Chain Reaction, réaction en chaine de la polymérase quantitative RBA : Rose Bengal Agar
SASS Duo : Super Air Sampler Duo
SARM : Staphylococcus aureus résistant à la méticilline SRAS : Syndrome respiratoire aigu sévère
TSA : Trypticase Soy Agar
UFC : Unités formatrices de colonies
UFC/m3 : Unités formatrices de colonies par mètre cube d’air μg : Microgramme
μg/m3 : Microgramme par mètre cube d’air μm : Micromètre
°C: Degrés Celcius % : Pourcentage
Remerciements
Mon premier gros merci va à une personne exceptionnelle, la meilleure directrice de recherche, Caroline Duchaine. Merci de m’avoir permis de travailler sur un projet de maîtrise passionnant. Merci Caro pour ces lab meeting professionnels, mais toujours avec une anecdote assez comique. Grâce à toi, j’ai connu une équipe de recherche hors pair et des collègues qui sont devenus des amis en or. Je tiens à remercier Caroline et les trois professionnels de recherche, Nathalie, Marc et Valérie, pour votre enseignement, votre disponibilité, votre encadrement, votre expertise technique et vos conseils. Merci à Nathalie d’avoir été responsable de ce projet, d’avoir passé 10 semaines avec moi pendant les campagnes d’échantillonnage et merci pour ton écoute, ton grand cœur et pour être très hilarante. Merci d’avoir été comme ma deuxième maman et d’y ressembler drôlement : même prénom, mêmes cheveux et même pyjama ! Merci à Marc de m’avoir aidé à comprendre la bio-info et de dire des blagues un peu tout le temps. Merci à Valérie pour toutes ces friandises, pour l’organisation des sorties d’équipe et pour t’avoir occupé pendant un an de la réception de nos échantillons terrain.
Merci au collaborateur privé de ce projet d’avoir confectionné les cannes d’échantillonnage et d’avoir établi un projet de recherche avec notre laboratoire. Merci également à tout le personnel qui nous a permis d’avoir accès au site d’échantillonnage.
Je tiens à remercier Matthieu Girard et Yves Longtin d’avoir accepté de faire partie de mon comité aviseur et de m’avoir donné des conseils lors de nos rencontres annuelles. J’aimerais remercier Serge Simard pour les analyses statistiques.
Merci à tous les étudiants qui m’ont aidé pendant nos campagnes, Joanie, Karine, Maria, Jonathan, Marie-Ève, Vincent. Un merci plus spécial à Vincent d’avoir été mon stagiaire d’été super travaillant. Merci à Nathan de m’avoir créé un protocole bio-informatique. Merci à Magali-Wen pour la belle Figure 1. Merci Hamzgras, pour ces playlists et pour toutes ces réponses à mes questions. Merci à tous les étudiants que j’ai côtoyés pendant ma maîtrise, Jodelle, Amélia, Christophe et Mathieu.
Merci à ma famille, à Rémi, à mes merveilleuses amies latuquoises et la petite trifluvienne d’être là pour moi et de m’avoir tant écouté parler de mon projet, en me disant qu’ils liront tous mon mémoire… je ne vous crois pas, mais je vous adore quand même. Un merci spécial à Jowanie, toi tu l’as lu souvent mon mémoire ! Merci pour ta grande écoute, tes conseils précieux, bref merci d’être dans ma vie !
Introduction
Les bioaérosols
Un aérosol est défini comme étant une ou des particules microscopiques en suspension dans un gaz, telles que les poussières provenant du sol, la fumée provenant des usines ou le sel provenant de l’océan. Un aérosol peut contenir des particules d’origine biologique et il sera alors défini comme un bioaérosol. Ces particules peuvent être des microorganismes vivants ou morts, soit des bactéries, des moisissures, des spores bactériennes et fongiques, ainsi que des virus (Blais-Lecours et al., 2015; Mandal and Brandl, 2011).
Les bioaérosols en suspension dans l’air ne sont pas nécessairement sphériques. Les particules hétérogènes le composant ont parfois des formes irrégulières. Afin de mieux caractériser leurs comportements dans l’air, les tailles des aérosols seront définies selon leur diamètre aérodynamique. Le diamètre aérodynamique correspond au diamètre d’une particule sphérique ayant la densité de l’eau (1 g/cm3) et qui aurait la même vitesse de déposition que l’aérosol d’intérêt (Hinds, 1999; Welty, 2009).
Les bioaérosols peuvent être secs ou humides, dépendamment des diverses sources d’émissions desquelles ils peuvent provenir. Par exemple, les bioaérosols secs sont issus du grain, du foin ou du bois, tandis que ceux humides sont générés par les courants d’eau, les robinets ou la toux. Les bioaérosols humides contiennent des gouttelettes d’eau transportées par l’air et sont sujets à sédimenter sur quelques mètres dépendamment de leur diamètre. Les gouttelettes de tailles supérieures à 200 micromètres (μm) sédimentent à un maximum d’un mètre de leur source d’émission et les gouttelettes de tailles inférieures à 200 μm peuvent sédimenter jusqu’à 5 mètres de distance (Hinds, 1999; Welty, 2009). Lors d’une respiration normale, l’expiration peut projeter des gouttelettes jusqu’à un mètre dans l’air ambiant. L’eau contenue dans les plus petites gouttelettes peut s’évaporer et en résultera des noyaux de gouttelettes. Ces noyaux de gouttelettes et les aérosols de tailles inférieures à 10 μm peuvent demeurer en suspension dans l’air pendant plusieurs heures et voir même pendant un temps indéfini. Il y a environ 3 000 noyaux de gouttelettes qui sont générés lors d’une toux et lorsqu’une personne parle pendant cinq minutes (Cole and Cook, 1998; Hinds, 1999). Les particules
en suspension dans l’air peuvent voyager par les mouvements de l’air ou adhérer à des surfaces et être déplacées avec celles-ci (Zargar et al., 2016).
Figure 1. Les bioaérosols émis par une personne et leur devenir dans l'air selon leur taille.
Ainsi, les bioaérosols pouvant demeurer en suspension dans l’air pendant de longue période de temps peuvent être inhalés. En effet, un humain peut inhaler environ 106 cellules microbiennes par jour (Mandal and Brandl, 2011). Les particules inférieures à 10 μm (Particulate Matter PM10), dites grossières, peuvent pénétrer et se loger profondément à l’intérieur des poumons. Plus petites encore, les particules fines dont le diamètre est inférieur ou égal à 2,5 μm (PM 2,5) peuvent être plus nocives pour la santé, puisqu’elles peuvent franchir la barrière pulmonaire et atteindre la circulation sanguine. Selon les lignes directrices de l’Organisation mondiale de la Santé (OMS), une exposition moyenne sur 24 heures aux particules fines ne doit pas dépasser 25 μg/m3 et 50 μg/m3 pour les particules grossières (World Health Organization, 2005).
Les bioaérosols dans les environnements intérieurs bâtis
Les microorganismes en suspension dans l’air intérieur peuvent provenir des humains, mais également des animaux, des plantes, du sol, des matériaux de construction et de l’environnement extérieur (Park et al., 2013; Prussin and Marr, 2015; Scaltriti et al., 2007). Selon un article de revue, les bactéries présentes dans l’air des bureaux, des salles de classe et des hôpitaux proviennent principalement des humains, soit de la peau, de la cavité buccale, de l’intestin ou des vêtements
(Fujiyoshi et al., 2017). D’ailleurs, le bâtiment lui-même peut être une source d’émission de moisissures dans l’air intérieur et cela peut être dû à un problème d’infiltration d’eau chronique ou de dégâts d’eau (Gouvernement du Québec, 2011). En effet, les matériaux humides peuvent être une source de prolifération de microorganismes et induire une augmentation de la concentration de bioaérosols dans l’air intérieur (Fabian et al., 2005). Les édifices ne sont pas des systèmes fermés et permettent l’entrée et la sortie d’air via les fenêtres, les portes, les systèmes de ventilation et les marchandises. La diversité microbienne peut alors se voir changée par l’entrée de microorganismes provenant principalement du sol et des plantes (Fujiyoshi et al., 2017). Dans une étude réalisée par Frankel et ses collaborateurs, la concentration des moisissures est significativement plus élevée à l’extérieur qu’à l’intérieur des domiciles pendant l’été et l’automne. En ce qui concerne les bactéries, les concentrations à l’intérieur sont toujours plus élevées, peu importe la saison. De plus, l’étude suggère que la température, l’humidité relative et les taux d’échanges d’air affectent de manière significative l’exposition aux bioaérosols dans l’air intérieur (Frankel et al., 2012).
Maladies infectieuses et non infectieuses transmissibles par l’air
Les microorganismes ne sont pas tous inoffensifs pour l’humain et quelques-uns sont même reconnus pour être responsables de certaines maladies infectieuses (microorganismes viables) ou non infectieuses (agents allergéniques et toxiques) transmises par l’air.
Notamment, la tuberculose est transmise par l’inhalation de gouttelettes contenant les bacilles viables de Mycobacterium tuberculosis (Nicas, 1995). De plus, la voie principale de contamination par
Legionella pneumophila est par l’inhalation de gouttelettes ou d’aérosols émis par des tours de
refroidissement, des condenseurs évaporatifs, des équipements d’inhalothérapie et des systèmes de distribution d’eau potable (Reingold, 1988).Les principales moisissures pouvant causer des infections opportunistes via l’inhalation de spores sont Aspergillus fumigatus (aspergillose), Cryptococcus
neoformans (cryptococcose), Pneumocytis jirovecii (pneumonie à P. jirovecii) et Penicillium marneffei
(penicilliose) (Brown et al., 2012). Les virus sont également des agents infectieux pouvant causer la grippe, le rhume et la gastroentérique. Le virus respiratoire syncytial, les virus grippaux A et B, le parainfluenza, le rhinovirus, le coronavirus, l’adénovirus sont tous des virus se transmettant par l’inhalation d’aérosols ou de gouttelettes provenant des sécrétions respiratoires de personnes infectées (Aitken and Jeffries, 2001). En outre, il a été suggéré que le norovirus pouvait être transmis par l’air à
la suite de l’inhalation de cet agent pathogène, puis à son passage vers le système digestif (Bonifait et al., 2015). De plus, la transmission par voie aérienne du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) causé par un coronavirus semble être la cause de la grande épidémie à Hong Kong (Yu et al., 2004). En janvier 2020, un nouveau coronavirus, le SRAS-CoV-2 a été identifié comme étant l’agent responsable de l’épidémie de pneumonie virale à Wuhan en Chine. Plus tard, la maladie à coronavirus, communément appelée la COVID-19, est devenue la cause d’une pandémie mondiale (National Institute of Allergy and Infectious Diseases, 2020). En date du 14 avril 2020, plus de 1,8 million de personnes infectées avaient été recensées par l’OMS. La COVID-19 peut se transmettre par l’inhalation de gouttelettes respiratoires sécrétées par les personnes infectées, mais également par un contact indirect (Organisation mondiale de la Santé, 2020).
Les bioaérosols sont également responsables d’un ensemble de maladies non infectieuses telles que l'hypersensibilité, les allergies et l'asthme. Les allergènes et les toxines peuvent provenir de la paroi cellulaire des bactéries, tels que les antigènes, les peptidoglycanes (Gram positif) et les endotoxines (Gram négatif). D’ailleurs, les moisissures peuvent produire des composés organiques volatils et des mycotoxines qui peuvent être toxiques pour l’humain. De plus, lesβ (1 → 3) - glucanes sont présents dans les parois des cellules fongiques et des plantes. Ils peuvent causer l’inflammation des voies respiratoires (Douwes et al., 2003). L’exposition à des endotoxines peut engendrer une irritation du nez et des voies respiratoires ainsi que mener à de l’inflammation chronique (Douwes et al., 2003; Rylander, 2006).
Les bioaérosols dans les centres hospitaliers
Dans l’environnement intérieur des centres hospitaliers, de nombreux facteurs affectent la concentration et la diversité des bioaérosolsdans l’air. Les concentrations de microorganismes varient en fonction du nombre d’occupants. En effet, une augmentation de la concentration est observée pendant les périodes achalandées et diminue lors des périodes vacantes (Fujiyoshi et al., 2017; Park et al., 2013). De plus, les activités humaines entraînent une remise en suspension des poussières dans l’air pouvant contenir des microorganismes (Gouvernement du Québec, 2011). La concentration de bactéries est positivement corrélée avec le nombre de personnes dans les salles d’opération (Wan et al., 2011) et dans les entrées principales d’hôpitaux (Park et al., 2013). Cependant, l’humain n’est pas le seul responsable de la présence de microorganismes en suspension dans l’air. En effet, la diversité
des microorganismes peut être affectée par les saisons, les conditions météorologiques, l’humidité et la charge microbienne extérieure. L’étude de Park et al. a démontré que les concentrations aériennes de bactéries et de moisissures dans les halls d’hôpitaux sont significativement plus élevées pendant l’été comparativement à l’hiver (Park et al., 2013).
Les concentrations de bioaérosols et la diversité microbienne varient en fonction des pièces d’un hôpital. La revue de littérature de Stockwell a analysé 36 articles comportant des données sur l’échantillonnage de l’air dans les différents secteurs d’un hôpital et des informations sur le genre des microorganismes communément retrouvés. Les types de secteurs de l’hôpital ont été classés en trois catégories, soit hébergement (chambres des patients hospitalisés), restreint (blocs opératoires, unités de soins intensifs, services d’hématologie ou d’oncologie) ou public (caféteria, corridors, hall). Le Tableau 1 présente la moyenne des microorganismes cultivables, exprimée en unités formatrices de colonies par mètre cube d’air (UFC/m3), selon les différents secteurs de l’hôpital.
Tableau 1. Moyenne des microorganismes cultivables (UFC/m3) isolés dans différents secteurs de l'hôpital.
Tableau adapté et traduit de Stockwell et al. 2019.
Moyenne des microorganismes (UFC/m3) par secteurs de l’hôpital
Genres Hébergement Restreint Public
Escherichia 1 2 11 Streptococcus 5 3 3 Staphylococcus 110 21 35 Aspergillus 3 6 2 Cladosporium 22 12 30 Penicillium 17 10 25 Microorganismes cultivables totaux 77 13 14
Les genres bactériens dominants identifiés dans la revue sont les Staphylococcus spp., les
Streptococcus spp. ainsi que les Escherichia spp. L’article de revue ne note aucune différence
significative entre les concentrations de bactéries dans les différents secteurs pour les genres
Staphylococcus spp. et Streptococcus spp. Ces deux genres proviennent des humains, principalement
Par ailleurs, les genres fongiques les plus dominants identifiés sont Aspergillus spp.,
Cladosporium spp. et Penicillium spp. (Stockwell et al., 2019). Ces trois moisissures proviennent
principalement de l’air extérieur et elles sont les plus abondantes, aussi bien dans l’air intérieur qu’extérieur (Schubert et al., 2007; Shelton et al., 2002).
Certaines concentrations maximales de microorganismes cultivables sont recommandées. Par exemple, l’OMS a des valeurs indicatives maximales de 150 UFC/m3 pour les moisissures de différents genres dans l’air intérieur. Cependant, il est recommandé d’investiguer si un genre de moisissures est présent à plus de 50 UFC/m3 (World Health Organization, 1988). Aucune valeur limite d’exposition à des microorganismes n’est mentionnée dans la documentation publiée par l’OMS. Plusieurs recommandations sont faites à propos des différents polluants dans l’air intérieur et extérieur pour les gaz et les particules, entre autres (World Health Organization, 2005; World Health Organization, 2006). À ce jour, il n’y a aucune recommandation internationale sur les concentrations maximales tolérables de microorganismes dans l’air. Les recommandations faites par l’OMS datent de plusieurs années et sont peu précises à l’égard des concentrations pour les microorganismes cultivables (World Health Organization, 1988). Cependant, certains pays vont de l’avant en offrant un guide très précis comme c’est le cas au Royaume-Uni où un rapport présente des recommandations sur les concentrations de microorganismes cultivables dans les salles d’opération. Ainsi, il est demandé d’avoir au maximum 10 UFC/m3 de microorganismes cultivables lorsque la salle d’opération est inoccupée depuis 15 minutes. De plus, une vérification de la concentration des bactéries et des moisissures doit être effectuée lors d’une opération et ne doit pas excéder 180 UFC/m3 (Department of Health, 2007). Ces mesures sont mises en place afin de réduire les risques de contracter une infection nosocomiale.
Infections nosocomiales
Dans les hôpitaux, les patients présentent plusieurs pathologies engendrant ainsi un environnement riche en microorganismes (Bing et al., 2018). Les microorganismes en suspension dans l’air dans les halls des hôpitaux sont généralement inoffensifs pour les personnes en bonne santé (Augustowska and Dutkiewicz, 2006). Cependant, tous les patients hospitalisés sont à risque de contracter une infection nosocomiale. Ce risque est grandement accru chez les groupes de patients vulnérables, tels que les patients immunodéprimés, atteints d’un cancer, subissant une chirurgie
majeure ainsi que les personnes âgées et les enfants. Ces patients sont plus susceptibles d’aggraver leur état après avoir contracté une infection nosocomiale (Bing et al., 2018).
Chaque jour aux États-Unis, environ 1 patient sur 31 contracte une infection associée à des soins hospitaliers (Centers for Disease Control and Prevention, 2018). L’augmentation du nombre d’infections nosocomiales peut entraîner une prolongation de la période d’hospitalisation, un risque de développement de résistance aux antibiotiques par les bactéries, une hausse du taux de mortalité et va engendrer des pertes financières importantes pour les usagers et le système de santé (Khan et al., 2017). Un déterminant majeur de la propagation des infections nosocomiales est le contrôle de l’utilisation adéquate des antibiotiques. En effet, la surutilisation ou la mauvaise utilisation des antibiotiques peuvent constituer un grand défi quant à la prévention et la guérison des infections. Il est alors suggéré de miser sur une meilleure hygiène et une vaccination afin de minimiser l’utilisation d’antibiotiques (Khan et al., 2017; World Health Organization, 2014).
Transmission
La transmission d’agents pathogènes peut se faire par contact physique direct ou indirect (fomites) et par l’air via des gouttelettes ou des aérosols, comme le montre la Figure 2. La transmission par l’air peut survenir à la suite d’un éternuement qui peut produire jusqu’à 40 000 gouttelettes et les projeter sur plusieurs mètres dans l’air ambiant (Cole and Cook, 1998). Les agents infectieux peuvent également se transmettre suite au contact des objets préalablement contaminés par les sécrétions des patients, notamment par la salive, le liquide nasal et les matières fécales. (Bing et al., 2018). Les patients infectieux peuvent donc contaminer l’air ambiant, mais également les sols et les murs. Ainsi, les infections peuvent se propager à la communauté par les visiteurs et le personnel (Bing et al., 2018).
Figure 2. Différentes voies de transmission d'un pathogène émis d'un individu infecté.
Figure traduite de (Otter et al., 2016)
De plus, la forte densité populationnelle peut conduire à la transmission d’organismes pathogènes par l’air (Bick, 2007). Le mouvement des personnes dans une pièce perturbe le flux normal de l’air et peut entraîner le transport d’aérosols infectieux d’un endroit à un autre (Tang et al., 2006).
Agents causant les maladies nosocomiales
Les bactéries sont des agents pathogènes les plus souvent associées aux infections contractées à l’hôpital (Khan et al., 2017). D’abord, le Staphylococcus aureus résistant à la méticilline (SARM) se transmet par contact direct et par gouttelettes. Il peut provoquer notamment une septicémie, une pneumonieune infection à la peau ou au système urinaire (Khan et al., 2017). Les entérobactéries proviennent principalement des intestins et peuvent causer une infection lors d’un transfert dans les voies respiratoires et digestives. Les plus connues sont le genre Klesbiella et l’espèce
Escherichia coli. (Khan et al., 2017). L’une des infections nosocomiales les plus fréquemment
gastro-intestinale (Magill et al., 2014). L’eau du robinet peut également être un vecteur de transmission d’infections nosocomiales. Aux États-Unis, chaque année, il y a environ 1 400 décès causés par
Pseudomonas aeruginosa à la suite de la consommation d’eau contaminée (Anaissie et al., 2002). De
plus, le genre Acinetobacter est bien connu pour déclencher des infections dans les unités de soins intensifs. Il est retrouvé dans le sol et dans l’eau.(Khan et al., 2017).
Les nouveau-nés admis dans les unités de soins intensifs néonatals sont grandement susceptibles de contracter une infection nosocomiale. Les agents pathogènes les plus fréquemment associés à ces infections sont les staphylocoques à coagulase négative et les entérocoques (Sohn et al., 2001).
Beggs a étudié l’importance de la transmission des infections par voie aérienne dans les hôpitaux. Il s’est spécifiquement concentré sur les bactéries bien connues comme étant responsables des infections nosocomiales, telles que le SARM, S. aureus, M. tuberculosis, Acinetobacter spp.,
Aspergillus spp., Pseudomonas spp. et Legionella spp. Son étude a conclu que la principale voie
d’infection est par contact direct, mais que les infections par voies aériennes sont probablement sous-estimées (Beggs, 2003).
Prévention
Une bonne qualité de l’air intérieur est primordiale pour les patients, mais également pour le personnel des établissements de santé ainsi que pour les visiteurs. Selon le guide du gouvernement du Québec sur la conception du bâtiment, plusieurs éléments doivent être considérés afin d’assurer la qualité de l’air. Par exemple, le choix des matériaux et le revêtement de finition des murs, planchers et plafonds ne doivent pas être une source d’accumulation ou de prolifération de microorganismes (Gouvernement du Québec, 2011).
Il est primordial de connaître les vecteurs de propagation possibles des agents pathogènes. D’abord, le personnel soignant et la population générale doivent être informés de leur propre état de santé et de leurs symptômes afin de réduire les risques de propagation des infections nosocomiales (Aitken and Jeffries, 2001). De plus, il est important de nettoyer les murs, le sol, les fenêtres, les lits, les salles de bains et tous les appareils médicaux entre chaque patient (Khan et al., 2017). La bonne
compréhension du potentiel infectieux des particules en suspension dans l’air et des voies de transmission est importante afin de contrôler leur dispersion.
De plus, selon la revue de littérature de Stockwell et ses collaborateurs, il a été démontré que la concentration microbienne dans l’air hospitalier varie selon le type de ventilation. Dans les zones hospitalières avec une ventilation naturelle, la concentration totale la plus élevée était de 201 UFC/m3 comparativement à 20 UFC/m3 lorsque les zones étaient ventilées mécaniquement. Ce qui laisse présager que l’utilisation de systèmes de ventilation contribue à l’amélioration de la qualité de l’air en diminuant la concentration de microorganismes (Stockwell et al., 2019). Les microorganismes en suspension dans l’air dans les centres hospitaliers peuvent être affectés par la conception et le fonctionnement du système de ventilation (Park et al., 2013).
Systèmes de ventilation
Les systèmes de chauffage, de ventilation et de conditionnement de l’air jouent un rôle majeur sur la qualité de l’air intérieur. De plus, ils permettent de contrôler la température, l’humidité et les mouvements de l’air afin d’offrir un confort aux usagers des centres hospitaliers (Gouvernement du Québec, 2011).
Température et humidité
L’air doit être acheminé dans les différentes pièces à une température et un niveau d’humidité favorables au confort et à la guérison des patients. En effet, la température ambiante peut différer en fonction de la pathologie du patient. Les soins intensifs cardiaques doivent être climatisés tandis que les patients souffrant d’arthrite rhumatoïde préféreront un environnement plus chaud et sec. Le taux d’humidité relative doit être maintenu entre 30% et 60%. Il varie naturellement selon les saisons, soit en étant plus faible en hiver et plus élevé en été. Les patients atteints d’une maladie pulmonaire chronique bénéficieront d’un taux d’humidité plus élevé. Cependant, un air plus humide peut engendrer de la condensation et favoriser la prolifération de moisissures (Gouvernement du Québec, 2011). Une étude a vérifié l’état de la contamination microbienne dans les unités de traitement d’air en comparant la croissance fongique à différentes températures et taux d’humidité. Ces résultats ont démontré que les conditions maintenues à une température de 20 °C et une humidité relative de 45% ont permis de réduire, voire même d’inhiber la croissance fongique (Lv et al., 2017).
Mouvement de l’air
La pression de l’air est contrôlée dans certaines pièces dans le but de limiter la propagation des bioaérosols. Notons que les salles d’opération ainsi que les salles d’isolement préventif pour les patients immunosupprimés sévères doivent être ventilées en pression positive pour empêcher l’intrusion de pathogènes. Tandis que les salles de bains sont maintenues en pression négative afin de limiter la propagation d’agents pathogènes potentiels. (Gouvernement du Québec, 2011)
Les pièces dans l’hôpital qui hébergent des patients plus vulnérables seront munies de systèmes de ventilation mécanique améliorés. En fait, l’amélioration sera apportée par l’augmentation du taux de changement d’air, l’ajout d’une pression positive, d’une pression négative ou d’un flux d’air. L’augmentation du taux de ventilation peut s’avérer être une stratégie efficace pour la réduction de la concentration de pathogènes (Stockwell et al., 2019). De plus, les systèmes de flux laminaire peuvent être utilisés dans les salles d’opération. Il existe deux types de flux laminaire, soit vertical ou horizontal. Chacun de ces systèmes présente des inconvénients. Le flux laminaire vertical peut être perturbé par la chaleur des lampes de chirurgie. Tandis que le flux laminaire horizontal peut être dévié par le mouvement du personnel. Les flux d’air unidirectionnels peuvent être interrompus. Pour pallier à ce problème, une combinaison du flux laminaire horizontal et vertical a été développée (Dharan and Pittet, 2002).
L’air contaminé peut être mélangé avec de l’air non contaminé, ce qui a pour effet de diluer la concentration des pathogènes. Cependant, la charge moyenne de noyaux de gouttelette va tendre à augmenter avec le temps s’il n’y a pas de systèmes de filtration de l’air (Bing et al., 2018). Les établissements en soins de santé optent pour un volet d’ingénierie pour réduire la concentration des pathogènes en suspension dans l’air en le filtrant.
Filtration
Le gouvernement du Québec recommande d’effectuer une filtration primaire avec un filtre plus grossier puis d’opter pour des filtres plus performants lors de la seconde filtration. Les filtrations secondaires sont effectuées dans les secteurs de soins d’un centre hospitalier et dans un centre d’hébergement et de soins de longue durée (CHSLD) (Gouvernement du Québec, 2011). Les filtres sont classés selon l’échelle MERV (Minimum Effiency Reporting Value) allant de 1 à 16 et qui exprime
l’efficacité à capturer les particules d’une gamme allant de 0,3 à 10 μm. Plus la valeur sera élevée, meilleur sera le trappage des petites particules. La filtration primaire doit utiliser un MERV-8 qui a une efficacité moyenne entre 70 et 84,9% pour retenir les particules de 3 à 10,0 μm. Puis, une filtration secondaire est effectuée dans les secteurs de soins avec un MERV-14, ayant une efficacité moyenne de 75 à 84,9% pour les particules de 0,3 à 1,0 μm et de plus de 90% pour les particules de 1 à 10,0 μm. Finalement, une filtration tertiaire est requise pour les salles d’opération offrant une efficacité moyenne d’au moins 99,97% pour les particules de 0,3 μm ou supérieur (Gouvernement du Québec, 2011; JAS filtration, 2008).
La majorité des blocs opératoires sont reliés à un système de ventilation utilisant des filtres ayant une capacité de 80 à 90% à enlever les particules supérieures à 5 μm. Les systèmes de ventilation peuvent utiliser un filtre HEPA (High efficiency particulate air). Ces filtres sont classés H13 ou H14 et offrent respectivement une efficacité de 99.95% et 99,995% à retenir les particules ayant un diamètre de 0,3 μm (Vectori, 2010). Les filtres H13 sont généralement utilisés pour les salles de chirurgie (Dharan and Pittet, 2002).
Prises d’air
La localisation des prises d’air extérieures est un aspect très important. L'American Society of
Heating, Refrigerating and Air Conditioning Engineers (ASHRAE) recommande une hauteur minimale
de 1,85 mètre au-dessus du niveau du sol afin de limiter l’entrée de déchets. De plus, les prises d’air extérieures doivent être munies de volets motorisés permettant leur ouverture et leur fermeture. Cette recommandation vise les mesures de sécurité quant aux possibles attaques terroristes. (Gouvernement du Québec, 2011)
Fonctionnement d’une centrale de traitement d’air (CTA)
Les centrales de traitement d’air (CTA) ont des confections particulières dépendamment du bâtiment qu’elles desservent. Elles ont toutes le même rôle, soit de renouveler l’air ambiant et de le filtrer. Elles assurent le débit d’air soufflé dans le réseau de ventilation, la climatisation, par le biais du chauffage ou du refroidissement et régulent le taux d’hygrométrie.
Le fonctionnement des CTA d’un hôpital en Amérique sera plus détaillé, car elles représentent le cœur de ce projet de maîtrise. Le nom de l’hôpital ne peut pas être mentionné pour des raisons de confidentialité. Les CTA sont construites sur deux étages, comme le montre la Figure 3. L’air extérieur est filtré et conditionné à l’étage inférieur illustré en bleu sur la Figure 3. Ensuite, l’air traité est acheminé dans le réseau de ventilation de l’hôpital. Simultanément, l’air intérieur provenant des différentes pièces de l’édifice revient à la CTA. L’air est filtré à l’étage supérieur illustré en rouge sur la Figure 3 avant de retourner à l’extérieur de l’hôpital. La particularité de ces CTA est l’ajout d’une roue thermique (à enthalpie) qui est en rotation en leur centre. Une partie de la roue est en contact avec l’air extérieur, puis la seconde partie avec l’air intérieur. L’air plus chaud cède sa chaleur et son humidité à l’aluminium de la roue thermique, puis cette énergie est transférée au flux d’air plus froid et sec. La roue thermique assure ainsi une réduction des coûts énergétiques.
Figure 3. Centrale de traitement d'air construite sur deux étages avec une roue thermique en rotation.
Figure modifiée dehttps://gifer.com/en/WXkM
Ce système rotatif a pour fonction de refroidir et déshumidifier l’air extérieur en saison estivale puis de préchauffer et humidifier l’air en saison hivernale (Gaz Métro, 2010). Un revêtement de dessiccant recouvre la roue et limite le risque de contamination croisée en ayant une forte affinité pour la vapeur d’eau (SEMCO, 2015).
La Figure 4 montre les différentes composantes d’une CTA et le parcours de l’air. D’abord, l’air extérieur est aspiré dans la centrale à partir des ventilateurs d’alimentation et est filtré. La première étape de filtration utilise des filtres MERV-8 (illustré en vert sur la Figure 4) qui permettent de retenir entre 70 et 84,9% les particules de 0,3 à 10,0 μm (JAS filtration, 2008).
Figure 4. Différentes composantes d’une centrale de traitement de l'air d'un hôpital.
L’air est ensuite dirigé vers la roue à enthalpie en aluminium où un échange de chaleur et d’humidité a lieu. Finalement, l’air circule dans les autres composantes de la CTA, telles que le serpentin de chauffage et de refroidissement, l’humidificateur et les ventilateurs d’alimentation. L’air passe finalement dans un filtre MERV-15. Ce filtre permet de retenir entre 85 et 94.9% des particules d’une grosseur de 0,1 à 1 μm et offre une efficacité de plus de 90% pour les particules entre 1 et 10 μm (JAS filtration, 2008). Une troisième et dernière filtration est effectuée avec un filtre HEPA avant que l’air soit distribué dans les pièces de l’hôpital. Le filtre de classe H13, utilisé dans cette CTA, va piéger un minimum de 99.95% des particules de taille de plus de 0,3 μm (Vectori, 2010).
Les prises d’air dans chaque pièce de l’hôpital permettent un renouvellement d’air constant. L’air ambiant de l’hôpital retourne dans les conduits de ventilation puis dans la CTA avant d’être évacué à l’extérieur. Le parcours de l’air est illustré en rouge sur la Figure 4. En effet, l’air passe d’abord au travers un filtre MERV-8, puis va passer dans la roue thermique et va céder son énergie avant d’être expulsé à l’extérieur. La chaleur et l’humidité pourront alors être transmises à l’air nouvellement entrant. La confection de ce type de centrale répond aux normes régionales en vigueur sur la filtration. Au Québec, il n’y a aucune obligation formelle en ce qui concerne le nombre de changements d’air par heure dans les pièces d’un édifice. Cependant, il y a des recommandations qui suggèrent d’offrir deux changements d’air par heure pour les chambres des patients et 15 changements d’air par heure dans
les salles d’opération (Academy of Architecture for Health, 2001; Leung and Chan, 2006). Offrant plus que la recommandation, ces CTA permettent le renouvellement d’air en continu.
De plus, il n’y a présentement aucune étude qui documente la qualité microbiologique de l’air tout au long de son traitement dans les CTA. Bien qu’il y a des recommandations quant à la fréquence de changement des filtres MERV et HEPA selon leur capacité de capture, aucune évaluation longitudinale de la qualité microbiologique de l’air n’a encore été effectuée.
Échantillonnage de l’air
Dans la littérature, il n’y a pas de consensus sur le choix des échantillonneurs d’air et les méthodes d’analyses. De plus, les variations saisonnières ainsi que la nature changeante des bioaérosols en fonction des endroits échantillonnés, rendent impossible l’élaboration d’une stratégie unique pour un suivi à long terme. Pour ce faire, il est préférable d’utiliser des méthodes d’échantillonnage complémentaires afin de caractériser adéquatement les bioaérosols, soit les techniques de culture et les approches moléculaires (Shade et al., 2012).
Le principal défi lors de l’échantillonnage de l’air en milieu hospitalier est d’éviter de perturber les activités s’y déroulant, par exemple lorsque des soins sont administrés aux patients. Dans ce projet, il était donc exclu d’arrêter l’air de circuler dans les CTA ou d’en changer le débit afin d’accommoder les échantillonnages. Afin de vérifier la qualité microbiologique de l’air traité par les CTA, il a été proposé d’échantillonner l’air tout au long de son traitement. Le défi consiste donc à effectuer un échantillonnage efficace dans des CTA où circulent de très hauts débits d’air. En utilisant les différents échantillonneurs, il est possible d’avoir un portrait plus juste et représentatif de la qualité de l’air. Pour la présente étude, un échantillonneur d’air par impaction et un échantillonneur à filtre ont été utilisés. De plus, un compteur de particules a été ajouté afin de quantifier les bioaérosols selon leurs tailles.
Échantillonneurs d’air par impaction
Les échantillonneurs d’air par impaction se divisent en deux sous-catégories, soit par impaction dans un liquide ou directement sur un milieu de culture gélosé. Le BioSampler® (SKC Inc., Eighty Four, États-Unis) et le Coriolisμ® (Bertin Technologies, Montigny-le-Bretonneux, France) sont des échantillonneurs par impaction dans un liquide. Les échantillons liquides récupérés avec ces
appareils peuvent être utilisés pour la quantification des microorganismes par culture et par biologie moléculaire. Le débit d’échantillonnage est de 12,5 litres d’air par minute (L/min) pour le BioSampler® et de 100 à 300 L/min pour le Coriolisμ®. Les faibles débits d’échantillonnage mènent à l’augmentation de la limite de détection de bioaérosols dans un environnement faiblement contaminé. Par contre, des temps d’échantillonnage trop longs peuvent réduire la viabilité des microorganismes déjà endommagés. Si le débit est augmenté pour récolter un volume d’air plus grand, le liquide de collection est plus susceptible de s’évaporer, de produire des bulles et d’entraîner la ré-aérosolisation de certains microorganismes (Lemieux et al., 2019). De plus, la nature du liquide de collection et les différents milieux de culture peuvent également avoir un impact sur la survie des microorganismes.
Le désavantage d’effectuer des cultures avec des échantillons liquides est qu’ils doivent être dilués et distribués sur des milieux de culture gélosés. À l’inverse, des échantillonneurs d’air par impaction sur milieu gélosé permettent de quantifier directement les microorganismes cultivables à la suite de l’incubation des milieux gélosés. De plus, il a été démontré dans notre laboratoire que l’impacteur Andersen à 6 étages permet d’obtenir significativement plus de bactéries cultivables que le Coriolisμ® (Dubuis, 2017).
L’impacteur à 6 étages a la particularité de répartir les microorganismes selon leurs diamètres aérodynamiques en mimant l’arbre respiratoire humain (Andersen, 1958). La vélocité de l’air augmente selon les étages et cela permet de recueillir les particules de 7 μm à l’étage supérieur jusqu’aux particules de 0,65 μm à l’étage inférieur. Cet échantillonneur fonctionne à un bas débit, soit de 28,3 L/min. Il aurait été moins approprié d’utiliser cet échantillonneur d’air dans le cadre de ce projet, puisqu’il est attendu que l’environnement soit faiblement concentré dans les CTA. De plus, l’échantillonneur permet de cultiver un seul groupe de microorganismes précis en utilisant un milieu de culture sélectif, favorisant la croissance de bactéries ou de moisissures, par exemple.
Outre l’impacteur Andersen à 6 étages, il existe l’impacteur à 1 étage Super Air Sampler Duo (SAS Duo) (Bioscience International, Rockville, États-Unis). L’avantage d’utiliser cet appareil est qu’il échantillonne l’air sur deux milieux gélosés en simultané. Il est alors possible d’isoler à la fois les bactéries et les moisissures en utilisant deux milieux de culture sélectifs différents. Une comparaison entre trois types d’échantillonneurs 1 étage démontre que le SAS Duo obtient de meilleurs comptes de moisissures que le Anderson 6 étages et le Microbial Air Sampler-100 NT (Dubuis, 2017). Le SAS Duo permet d’échantillonner un
volume d’air précis grâce à une pompe calibrée (Bioscience International, 2018). L’appareil a la capacité d’échantillonner 180 L/min et une possibilité de prélever entre 10 et 1000 litres (L) d’air. Il est suggéré d’échantillonner entre 10 et 200 L pour les endroits contaminés et entre 500 et 1000 L pour les endroits où l’air est très propre (International pbi Spa Milan, 2006). Le volume d’air échantillonné est très important afin d’éviter la surcharge des microorganismes, mais la durée de l’échantillonnage doit être suffisamment longue pour détecter les évènements rares d’émission de bioaérosols.
Le milieu de culture gélosé Rose Bengal Agar (RBA) est grandement utilisé pour le dénombrement des moisissures environnementales à croissance plus lente. Le colorant rose bengal inhibe la croissance des moisissures au développement plus rapide et restreint la taille et la hauteur des colonies. De plus, la couleur rose du milieu facilite le dénombrement. Il est possible d’ajouter un antibiotique inhibant la croissance des bactéries, facilitant l’isolation des levures et des moisissures filamenteuses. L’antibiotique chloramphénicol est le plus souvent utilisé afin de rendre le milieu de culture sélectif (Corry et al., 2003). Puis, la gélose nutritive Trypticase Soy Agar (TSA) permet d’isoler les bactéries hétérotrophes. Il est également possible de supplémenter la gélose avec un antifongique, comme l’amphotéricine par exemple, pour inhiber la croissance des moisissures.
Échantillonneurs d’air à filtre
Les différents filtres utilisés dans l’échantillonnage des bioaérosols sont divisés en trois catégories : les filtres fibreux (fibre de verre), les membranes poreuses (cellulose) et les filtres à pores capillaires (polycarbonate). Ils sont faits de matériaux différents et de porosité variant entre 0,01 μm à
10 μm (NIOSH, 2016). De plus, les échantillonneurs nécessitent une pompe afin de faire passer un volume d’air précis au travers du filtre.
Les cassettes 37 mm (SKC, Inc, Eighty Four, États-Unis) permettent d’utiliser diverses membranes et filtres de porosités diverses. Généralement, le filtre contenu dans la cassette est en polycarbonate et d’une porosité de 0,8 μm. Les cassettes sont branchées à la pompe Gilian AirCon-2 qui permet d’aspirer l’air à un débit de 12,5 L/min. Cependant, ce débit n’est pas suffisamment élevé dans le cadre de ce projet. Il a été démontré par notre équipe que la cassette 37 mm et le Smart Air
Sampler System 3100 (SASS 3100) (Research International Inc., Monroe, États-Unis) donnent des
résultats similaires quant à l’identification bactérienne et fongique des bioaérosols échantillonnés (Lemieux et al., 2019). Dans ce cas-ci, il était préférable de choisir un échantillonneur à haut débit.
Le SASS 3100 est contrôlé par un microprocesseur et il permet un débit allant jusqu’à 300 L/min. L’appareil permet de collecter les aérosols biologiques sur un filtre électrostatique placé sur l’instrument. Cette cartouche filtrante est composée de fibres ayant un champ électrique qui induit une charge positive ou négative dans les aérosols. Les filtres électrostatiques ont une efficacité de capture jusqu’à 50 fois plus élevée que les autres filtres classiques en verre ou en cellulose (Research International). Le SASS 3100 est conçu pour récupérer des échantillons qui seront analysés par biologie moléculaire. Cette méthode est complémentaire aux méthodes de culture, car elle permet de représenter la portion non cultivable des bioaérosols. Cet échantillonneur d’air est très souvent utilisé dans notre laboratoire de recherche et a démontré son efficacité pour la collecte de bioaérosols (Dubuis et al., 2017; Lemieux et al., 2019; Mbareche et al., 2018a).
Figure 6. Smart Air Sampler
Compteur de particules
Le compteur optique de particules Optical particule sizer (OPS) 3330 (TSI, Shoreview, États-Unis) est un spectromètre portatif et léger. Il permet un échantillonnage de plusieurs heures grâce à son alimentation par batterie. L’OPS fonctionne à un débit de 1 L/min. Cet appareil permet de mesurer rapidement le nombre de particules d’un diamètre allant de 0,3 à 10 μm en suspension dans l’air. Les particules sont classées dans 16 canaux selon leurs tailles et leur masse (TSI, 2018).
Anémomètre
Pour terminer, l’anémomètre à fil chaud VelociCalc 9545-A (TSI, Shoreview, États-Unis) permet de mesurer la vitesse du vent, la température et l’humidité relative. L’appareil est muni d’une sonde télescopique de 101,6 cm et de plusieurs capteurs permettant les mesures (TSI).
Traitements et analyses des échantillons d’air et limites des
méthodes
Les microorganismes peuvent être quantifiés par des méthodes de culture et de biologie moléculaire. Il est possible d’identifier les bactéries et les moisissures cultivables à l’aide du séquençage Sanger. Les microorganismes totaux peuvent être identifiés par le séquençage à haut débit.
Quantification des bactéries et des moisissures par culture
La quantification des microorganismes cultivables peut se faire en utilisant différentes conditions de culture, telles que la composition des milieux, les différents temps et températures d’incubation. En utilisant l’échantillonneur SAS Duo, deux milieux de culture sélectifs différents peuvent être utilisés afin d’isoler les bactéries et les moisissures séparément. Il est donc possible d’incuber ces deux boites de pétris à des températures et des temps d’incubation différents pour favoriser la croissance selon leurs exigences.
Figure 7. Compteur
Les microorganismes viables présents dans l’air ne sont pas nécessairement tous cultivables. En effet, plusieurs facteurs affectent la récupération des microorganismes cultivables. D’abord, les conditions de cultures appliquées peuvent ne pas être appropriées pour les microorganismes viables. De plus, la viabilité des microorganismes peut être affecté à la suite de l’exposition à l’eau salée, à l’eau douce ou à de basses températures, comme c’est le cas pour Salmonella enteritidis, Vibrio
cholerae, et V. vulnificus. Certaines bactéries fastidieuses sont reconnues pour leurs besoins
spécifiques en nutriments, tels que les Mollicutes. D’autres sont reconnues pour leur temps de croissance plus lent tel que Mycobacterium. Finalement, il y a un manque de connaissances sur les espèces inconnues qui n’ont jamais été cultivées jusqu’à présent (Amann et al., 1995). L’aérosolisation est un évènement stressant pour les microorganismes, ce qui peut affecter leur viabilité. En effet, ceux-ci peuvent être endommagés par les taux d’humidité ou par la température (Handley and Webster, 1995; Marthi et al., 1990). C’est en réponse à ces limitations que la méthode par culture est souvent couplée à la méthode de quantification par biologie moléculaire qui permet de détecter un plus grand nombre de bactéries (Kim et al., 2011).
Quantification des bactéries et des moisissures par méthode de biologie moléculaire
Les échantillons d’air récupérés par le SASS 3100 doivent être élués, filtrés puis extraits avant de pouvoir quantifier les microorganismes en utilisant des méthodes de biologie moléculaire. Cet appareil est très souvent utilisé dans notre laboratoire et la méthodologie est bien établie. Les filtres doivent d’abord être élués à l’aide de l’extracteur de particules (SASS 3100 Particle Extractor, Research International Inc., Monroe, États-Unis) avec un volume précis de solution d’extraction (Dubuis et al., 2017; Lemieux et al., 2019; Mbareche et al., 2018a). Bien que l’efficacité d’extraction soit garantie par le fournisseur, il est possible que les bioaérosols demeurent sur les filtres électrostatiques ou dans le liquide résiduel de l’appareil. Pour la seconde étape, il a récemment été démontré qu’il y avait un meilleur taux de récupération des spores de moisissures si l’éluât est filtré sur une membrane de polycarbonate (0,22 μm). En effet, ce type de filtration permet une récupération significativement supérieure que la centrifugation (Mbareche et al., 2019). Finalement, l’acide désoxyribonucléique (ADN) contenu dans les échantillons d’air doit être extrait et purifié. Plusieurs méthodes d’extraction d’ADN existent et peuvent avoir des efficacités d’extraction différentes envers certains microorganismes. L’avantage d’utiliser des trousses d’extraction commerciales, c’est que les concentrations de réactifs ont déjà été optimisées afin d’offrir un meilleur rendement. La trousse
commerciale Qiagen DNeasy PowerLyser PowerSoil (Qiagen, Hilden, Allemagne) est grandement utilisée dans notre laboratoire pour extraire l’ADN provenant des échantillons d’air (Dubuis et al., 2017; Lemieux et al., 2019; Mbareche et al., 2018b).
La quantification des microorganismes est ensuite possible en effectuant des réactions en chaîne par polymérase quantitatives (qPCR) qui permettent de suivre la quantité d’ADN produite à chaque cycle. En ciblant un gène précis, la détection de plusieurs microorganismes est réalisable à partir d’un échantillon environnemental complexe. Des amorces et des sondes spécifiques sont utilisées afin d’amplifier le fragment d’ADN d’intérêt. Ces microorganismes ciblés peuvent servir de marqueurs d’air intérieur et extérieur, car leur abondance dans l’environnement permet leur utilisation comme référence. Par exemple, la quantification des bactéries totales est possible en ciblant le gène de l’ARN ribosomal 16S et en utilisant l’espèce Escherichia coli comme courbe standard (Bach et al., 2002). Puis, en ciblant le gène TUF, cela permet d’amplifier spécifiquement le genre Staphylococcus spp (Kilic et al., 2010). Il n’existe pas de qPCR universelle pour la quantification des moisissures. Afin d’évaluer la concentration de celles-ci dans l’air, il est possible de cibler les genres les plus susceptibles de s’y retrouver. Par exemple, le genre Cladosporium spp. (Zeng et al., 2006) ainsi que le regroupement Penicilium spp. et Aspergillus spp. (EPA and MCEARD) peuvent être de bons indicateurs. Il est fort probable de sous-estimer la concentration de moisissures dans l’air, puisque ces qPCR sont très spécifiques. De plus, les appareils ainsi que les méthodes d’extraction et d’analyse ont leurs limites de détection et de quantification. Un filtre vierge peut être utilisé comme blanc, ce qui permet de soustraire le bruit de fond de l’addition des différentes méthodes. Cependant, les microorganismes présents en très faible concentration dans l’air peuvent être omis de la détection. Les qPCR peuvent être effectuées conjointement avec le séquençage à haut débit de l’ADN et ces méthodes permettront d’évaluer quantitativement et qualitativement l’exposition aux bioaérosols (Dannemiller et al., 2014).
Identification des colonies isolées par séquençage
L’extraction d’ADN des colonies pures isolées doit être effectuée avant d’amplifier le gène d’intérêt par PCR. D’abord, une colonie est prélevée afin d’en extraire l’ADN et de la purifier avec la méthode des cartes Whatman® FTA® Cards (Millipore Sigma, Oakville, Canada). Ces cartes contiennent des produits chimiques permettant la lyse des cellules et la dénaturation des protéines
tout en protégeant les acides nucléiques de l’oxydation, des UV et des nucléases. L’ADN recueilli sur les cartes peut être conservé pendant plusieurs années (Rahikainen et al., 2016). Cette méthode a seulement été utilisée pour les colonies de bactéries, puisqu’elle ne fonctionne pas toujours avec les colonies de moisissures. L’extraction d’ADN des colonies de moisissures est effectuée avec la trousse d’extraction Qiagen DNeasy PowerLyser PowerSoil.
Ensuite, l’ADN extrait est amplifié par PCR en ciblant des gènes précis. Le gène de ARNr 16S est ciblé pour les bactéries (Marchesi et al., 1998) et la région ITS1 pour les moisissures (White et al., 1990). Il est possible de vérifier l’amplification de l’ADN en effectuant une migration sur un gel d’agarose.
Biodiversité par séquençage à haut débit
Plusieurs études antérieures effectuées sur le microbiome intérieur sont basées sur des méthodes de culture et d’identifications microscopiques. Plus récemment, le séquençage à haut débit de l’ADN amplifié (16S ou ITS) a permis d’approfondir davantage les connaissances sur les communautés microbiennes (Adams et al., 2016; Mbareche et al., 2017; Mbareche et al., 2018b).
Cette analyse permettra de déterminer la biodiversité bactérienne et fongique. Le séquençage permet une quantification relative, ce qui est différent de la quantification absolue obtenue par qPCR. Les gènes cibles sont l’ADNr 16S des bactéries et la région ITS1 des moisissures. Ces gènes sont des marqueurs universels et permettent, à partir de leur séquençage, l’identification des taxons présents, sans avoir recours à la culture. Le nombre de séquences peut varier considérablement d’un échantillon à l’autre. Ceci peut être dû à la concentration initiale du gène cible dans l’échantillon et/ou par un biais avec les amorces pour certaines espèces lors de l’amplification. Il n’est pas certain que les séquences identifiées proviennent de cellules entières. Les identifications peuvent provenir d’ADN libre présent dans les échantillons ou lors d’une contamination.
Contraintes d’échantillonnage de ce projet
La première contrainte du projet concerne la distance entre le lieu d’échantillonnage et le laboratoire. Les échantillons d’air impactés sur les géloses sélectives devaient être incubés au laboratoire afin de procéder au décompte des bactéries et des moisissures cultivables. Cependant, les
