Étude des propriétés prioniques de la huntingtine mutée dans des modèles in vitro et in vivo

Étude des propriétés prioniques de la huntingtine mutée

dans des modèles in vitro et in vivo

Mémoire

Florian Lauruol

Maîtrise en neurobiologie - avec mémoire

Maître ès sciences (M. Sc.)

Étude des propriétés prioniques de la huntingtine

mutée dans des modèles in vitro et in vivo

Mémoire

Florian Lauruol

Sous la direction de:

Résumé

La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative causée par la mutation du gène codant la protéine huntingtine (HTT). Cette protéine, exprimée par toutes les cellules de l'organisme, peut adopter une forme mutée qui lui confère un aspect toxique. Dans les cellules, la mHTT va s'agréger et former diérentes structures dont des agrégats, marqueurs distinctifs de la maladie, ou des brilles. Dans le cerveau, la présence de la mHTT va causer une mort neuronale dramatique entraînant, à l'échelle de l'individu, une panoplie de troubles moteurs, cognitifs et psychiatriques.

Depuis plusieurs années des études tendent à démontrent que la mHTT peut se propager de cellules à cellules et corrompre la HTT non mutée tel un prion. Pour mon projet de recherche, j'ai ainsi investigué les propriétés prioniques de la mHTT sous sa forme brillaire particulière-ment toxique. Des brilles synthétiques contenant la mutation pathologique ont été utilisées pour infecter des cellules en culture et des souris. De cette manière, nous avons démontré la capacité des brilles à se propager et à provoquer des dommages divers dans 3 types de cellules humaines. La présence des brilles a également induit l'agrégation de la forme non mutée de la HTT endogène, normalement présente dans les cellules. Chez la souris, ces résultats ont été conrmés suite à l'injection des brilles dans le cerveau des animaux. La présence des brilles dans le système nerveux central des souris sauvages a provoqué la manifestation de signes caractéristiques de la MH (troubles cognitifs et moteurs). De plus, une apparition de décits moteurs et cognitifs qui s'apparentent à la maladie a été observée chez des souris R6/2, modèle transgénique de la MH, suite à l'injection des brilles.

Les résultats de mon projet de recherche renforcent ainsi l'hypothèse prionique de la mHTT et appuient l'hypothèse que ces propriétés pourraient être impliquées dans la physiopathologie de la MH.

Table des matières

Résumé ii

Table des matières iii

Liste des tableaux iv

Liste des gures v

Figures supplémentaires v

Liste des acronymes et abréviations vii

Remerciements xi

Avant-propos xii

Introduction 1

1 Demonstration of prion-like properties of mutant huntingtin brils in

both in vitro and in vivo paradigms 18

1.1 Résumé . . . 19

1.2 Abstract . . . 19

1.3 Introduction. . . 20

1.4 Materials and methods . . . 21

1.5 Results. . . 31 1.6 Discussion . . . 45 1.7 Supplementary gures . . . 49 References . . . 56 Conclusion 61 Bibliographie 66

Liste des tableaux

Liste des gures

0.1 Atteintes périphériques dans la MH. . . 4

0.2 Présence d'agrégats de mHTT caractéristiques de la MH. . . 5

0.3 Structure de la HTT.. . . 8

0.4 Synthèse aberrante de la partie N-terminale de la mHTT. . . 10

0.5 Les diérentes formes de la mHTT. . . 12

0.6 Les propriétés prioniques de la mHTT. . . 13

0.7 Présence de mHTT chez les patients huntingtoniens transplantés. . . 15

1.1 Uptake of brillar HTTExon1Q25 and Q48 by dierent cell types . . . 33

1.2 Seeding of endogenous HTT by exogenous HTTExon1Q48 brils . . . 35

1.3 Manifestation of behavioral impairments in adult WT mice injected with HT-TExon1Q48 brils . . . 37

1.4 Post-mortem identication of HTTExon1Q25 and Q48 brils in adult WT mice 39 1.5 Precipitation of behavioral phenotype in R6/2 mice following injection of HT-TExon1Q48 brils . . . 41

1.6 Colocalization of HTTExon1Q48 brils and endogenous mHTT in R6/2 mice . 44

Figures supplémentaires

1.2 Absence of motor impairments in WT adult mice injected with HTTExon1Q48 brils . . . 50

1.3 Examples of behavioral measures not aected in R6/2 mice following injection of HTTExon1Q48 brils . . . 51

1.4 Colocalization of HTTExon1Q48 brils with endogenous mHTT in R6/2 mice at 4 weeks of age . . . 52

1.5 Colocalization of HTTExon1Q48 brils with ubiquitin . . . 53

1.6 Changes in staining patterns of endogenous HTT following injection of HT-TExon1Q48 brils . . . 54

1.7 Development of an immune response following intravenous injection of

Liste des acronymes et abréviations

ARN Acide RiboNucléique BSA Bovine Serum Albumin CFP Cyan Fluorescent Protein chFP mCherry

CSPi Cellules Souches Pluripotentes induites DAPI 4',6-DiAmidino-2-PhenylIndole

DMEM Dulbecco's Modied Eagle's Media DNA Deoxyribose Nucleic Acid

dPBS Dulbecco's Phosphate-Buered Saline DTT DiThioThreitol

ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay FBS Fetal Bovine Serum

GFP Green Fluorescent Protein HD Huntington's Disease Hsp70 Heat shock protein 70 HTT protéine huntingtine HTT gène huntingtine IF ImmunoFluorescence IHC ImmunoHistoChimie MA Maladie d'Alzheimer MH Maladie de Huntington

mHTT protéine huntingtine mutée MP Maladie de Parkinson

NHS N-HydroxySulfosuccinimide polyQ Polyglutamines

PBS Phosphate-Buered Saline PFA ParaFormAldehyde

PCR Polymerase Chain Reaction

PBST Phosphate Buered Saline with Tween-20 RIPA RadioImmunoPrecipitation Assay

RT Room Temperature SDS Sodium Dodecyl Sulfate SOD SuperOxyde Dismutase

TDP-43 TAR DNA binding Protein 43 TFA TriFluoroacetic Acid

Science sans conscience n'est que ruine de l'âme.

Remerciements

Je tiens tout d'abord à remercier Francesca Cicchetti, ma directrice de recherche, qui m'a accueilli au sein de son équipe et m'a donné l'opportunité de réaliser mes projets de recherche. Je remercie également toute l'équipe du laboratoire : Giacomo, Alberto et Alexander qui sont devenus de bons amis et qui rendent nos journées au laboratoire bien plus joyeuses. Ma camarade Hélèna, la vampire, avec qui j'ai eu le plaisir de rédiger une revue et à collecter du sang (notre sang aussi) à de nombreuses reprises. À Linda et Melanie, les deux postdocs pour leur aide précieuse et nos nombreuses conversations scientiques, philosophiques et autres moins pertinentes. Martine, notre professionnelle de recherche qui résout tous les problèmes et sans qui le laboratoire ne tournerait plus. Maria, qui avait son bureau à côté du mien pendant plusieurs mois et qui m'a supportée tout ce temps. Josiane, l'une des dernières arrivées qui a aussi eu le malheur de se retrouver au bureau adjacent au mien et qui apporte beaucoup de bonne humeur dans les cubicules. Merci ègalement à Marie pour le Tux et à Philippe et Shireen

Je remercie aussi Alexandra, ma collaboratrice d'Hôtel-Dieu, pour son aide précieuse.

Un grand merci à Sarah, ma collègue de cubicule, pour toutes les soirées passées à discuter, pour ses conseils, ses plats et sa bonne humeur.

Un grand merci à mes camarades de l'axe repro (BCC) qui sont toujours là pour me remonter le moral et qui n'ont pas ni de me supporter, un doctorat est prévu ! Alexis, er alsacien que j'ai rencontré grâce à l'escalade et qui est devenu un de mes meilleurs amis. Zoheir, qui est toujours partant pour une partie de football ou de Magic. Oona, qui comprend ma passion des chats et du sucre. Katerina, notre maman à tous, et Laura, camarade de jeux et de beuverie. Je remercie aussi Lisa qui me supporte depuis plusieurs années déjà et qui a toujours été là pour moi.

Un remerciement particulier à mes amis que j'ai quittés en venant au Canada : Baptise, Basile, Maxime , Hamza et Shaneel.

Je tiens enn à remercier ma mère et Christian pour leur soutien inconditionnel et qui m'ont toujours accompagné dans mes projets.

Avant-propos

Durant mon séjour dans le laboratoire de la Dre Francesca Cicchetti, j'ai eu l'occasion d'être impliqué dans les expériences in vitro d'une vaste étude qui fait l'objet du chapitre1. Outre ce projet, j'ai co rédigé, en collaboration avec ma collègue Hélèna Denis, une revue traitant des immunothérapies dans la maladie de Huntington. J'ai également participé à plusieurs autres projets. Pour cela, j'ai élaboré un protocole pour déterminer l'haplotype TAU à partir de ces échantillons. J'ai également participé à l'élaboration d'un protocole pour détecter et quantier la protéine TAU en immunobuvardage à partir des échantillons sanguins. De plus, j'ai eectué des expériences sur les cellules immunitaires présentes dans les échantillons. J'ai ainsi analysé les vésiculaires extracellulaires dérivées de ces cellules en cytométrie en ux pour essayer de les utiliser comme marqueur. Enn, en collaboration avec l'entreprise pharmaceutique AFFiRiS, j'ai participé à tester un anticorps visant à empêchant la propagation de la mHTT dans un modèle in vitro.

L'article intitulé "Demonstration of prion-like properties of mutant huntingtin brils in both in vitro and in vivo paradigms" présenté au chapitre 1 a été publié dans le journal Acta Neuropathologica le 20 février 2019 (DOI : 10.1007/s00401-019-01973-6).

Cet article a été eectué en collaboration avec deux autres équipes de recherche. L'une en France (Dr Ronald Melki, Institut François Jacob, MIRCen, CEA, CNRS) et l'autre aux États-Unis (Dr Jerey H. Kordower, Rush University Medical Centre, Chicago, USA). Je suis co-auteur sur ce papier. J'ai eectué toutes les expériences in vitro sur les THP-1 et une partie de celles sur les SH-SY5Y, c'est-à-dire la section portant sur la culture cellulaire. J'ai également eectué les immunouorescences sur ces cellules et l'analyse et la quantication des images de microscopie ainsi qu'une partie des statistiques.

La liste complète des auteurs de l'article est la suivante : Maria Masnata1,2_{, Giacomo Sciacca}1,2_, Alexander Maxan1,2_{, Luc Bousset}4 _{· Hélèna L. Denis}1,2_{, Linda David}1,2_{, Martine} Saint--Pierre1,2_{, Jerey H. Kordower}3_{, Ronald Melki}4_{, Melanie Alpaugh}1,2 _{et Francesca Cicchetti}1,2_. Aliations :

2. Département de Psychiatrie & Neurosciences, Université Laval, Québec, Canada 3. Department of Neurological Sciences Rush University Medical Centre, Chicago, USA 4. Laboratory of Neurodegenerative Diseases, Institut François Jacob, MIRCen, CEA,

Introduction

La maladie de Huntington

Historique

La maladie de Huntington a été décrite pour la première fois par le médecin américain George Huntington en 1872 et sa description de la maladie a été publiée dans le journal scientique Medical and Surgical Reporter (Huntington, 1872). L'une des caractéristiques les plus mar-quantes de la maladie est la présence de mouvements involontaires faisant penser à une danse. C'est d'ailleurs pour cette raison que Huntington dénit cette nouvelle maladie comme étant une chorée. En eet, chorée vient du latin choreus qui, à l'antiquité, référait à une danse. La nature héréditaire de la maladie est déjà supposée par Huntington quand il observe que lorsqu'un des parents soure de la maladie, un ou plusieurs de leurs enfants développeront à leur tour la maladie (avec une probabilité d'environ 50%), et lorsque l'un des enfants n'ayant pas hérité de la maladie a à son tour des enfants, ces derniers ne développent jamais la chorée de Huntington (Huntington, 1872). Il faudra attendre jusqu'en 1993 pour que le gène soit identié par le Huntington's Disease Collaborative Research Group (HDCRG, 1993). Il sera d'abord appelé IT15 pour Interesting Gene 15 (gène intéressant 15) avant d'être plus tard renommé huntingtine. L'aspect génétique de la maladie sera décrit plus en profondeur dans la section "cause génétique".

Prévalence

D'après les résultats d'une méta-analyse (Pringsheim et al., 2012) eectuée sur une vingtaine d'articles originaux portant sur l'incidence et la prévalence de la maladie de Huntington (MH), la prévalence de cette dernière serait de 2,71 cas pour 100 000 individus dans le monde. Il y a cependant une diérence marquée entre les populations d'origine européenne et les populations asiatiques. En eet, la prévalence est en moyenne de 5,70 cas pour 100 000 habitants en Europe, Amérique du Nord et Australie comparée à 0,4 en Asie. L'incidence mondiale, elle, se mesure à 0,38 nouveau cas pour 100 000 personnes chaque année. Au Canada, la prévalence de MH est plus élevée que la moyenne avec 13,7 cas pour 100 000 habitants (Fisher et Hayden,

les zones géographiques habitées par des populations d'origine européennes par rapport aux populations asiatiques. Diérentes théories pourraient expliquer cet écart. Tout d'abord, la taille moyenne de la répétition de CAG dans le gène huntingtine (HTT ), étant corrélée avec la probabilité de développer la mutation de novo, est plus élevée dans les populations européennes (moyenne de 18,4 triplets CAG) comparées aux populations asiatiques et africaines (moyenne de 16,4 triplets) (Squitieri et al.,1994). Il existe également diérents haplotypes du gène HTT caractérisés par des PSN (polymorphisme d'un seul nucléotide) dont certains corrèlent avec la présence de longues répétitions de CAG. On retrouve plus souvent ces haplotypes associés à une instabilité génétique dans les groupes d'origine européenne (Warby et al., 2009).

Enn, la dernière explication serait à mettre du côté d'une région riche en CCG adjacente aux répétitions de CAG. Eectivement, cette région varie selon diérentes versions du gène (allèle), dont certaines sont associées à l'apparition de la mutation de novo. Or, ces allèles  propices  à la survenue de la mutation sont retrouvés plus fréquemment dans les populations d'origine européenne. A contrario, on observe plus souvent des allèles  protecteurs  dans les populations asiatiques (Pêcheux et al., 1995). Il existe aussi une hypothèse plus dicilement vériable et qui serait plus d'ordre "culturelle". En eet, dans les populations asiatiques, une certaine honte peut apparaître au vu de l'existence de cas de la MH, ces derniers seraient donc "dissimulés" faussant ainsi les données épidémiologiques dans ces régions.

Symptômes

La MH se déclare généralement dans la mi-quarantaine ; avec de rares cas de formes juvéniles et tardives. La maladie comporte plusieurs étapes, dont la phase présymptomatique qui pré-cède l'apparition des premiers symptômes. La phase prodromique qui s'étale sur une période d'environ 15 ans est marquée par une légère altération des fonctions cognitives et motrices sans pour autant sure à établir le diagnostic de la maladie. Le diagnostic dénitif est posé lors de l'apparition de symptômes moteurs spéciques chez un individu avec des antécédents familiaux et/ou ayant eectué un test génétique (Reilmann, Leavitt et Ross,2014). Une fois la maladie déclarée, s'ensuit une aggravation des symptômes cognitifs, moteurs et psychiatriques conduisant inexorablement au décès du malade. Les personnes atteintes vont sourir de mou-vements involontaires (chorée), d'une coordination altérée et de bradykinésie (ralentissement et perte de la nesse des mouvements). Des troubles de l'équilibre et de la posture sont aussi présents, mais également des dicultés à articuler et déglutir (Bates et al., 2015). Le spectre des symptômes cognitifs dans la maladie est, quant à lui, assez large. On retrouve notamment des troubles de l'attention, des pertes de mémoire, de la diculté à s'orienter. À un stade avancé de la maladie, la démence s'installe, privant le patient de son autonomie (Bates et al.,

2015; Peavy et al., 2010). Enn, on constate la présence de troubles psychiatriques très va-riables entre les patients ; les manifestations les plus courantes étant la dépression, l'irritabilité et l'apathie (état d'indiérence aective)(Duijn et al., 2014; J. C. Thompson et al.,2012). Un

récapitulatif des symptômes rencontrés dans la MH ainsi que leurs traitements sont présentés au tableau 0.1de la section"traitements actuels et futurs".

Répercussions anatomiques et cellulaires

D'un point de vue anatomique, la MH est caractérisée par l'atteinte du striatum qui subit une atrophie au cours de la maladie. Ce sont les neurones GABAergiques qui sont le plus particulièrement ciblés (Han et al., 2010). L'atteinte de ces neurones provoque ainsi une al-tération irrémédiable de la microcircuiterie GABAergique du striatum (Tepper, Koós et Wilson, 2004). Cette structure cérébrale sous-corticale fait partie des ganglions de la base et est constituée du noyau caudé, du putamen et du noyau accumbens. Elle est impliquée, no-tamment, dans la génèse et l'inhibition des mouvements volontaires et involontaires (Kravitz et Kreitzer, 2012) ce qui explique les graves symptômes moteurs caractéristiques de la patho-logie, telle la chorée. Même si l'atrophie du striatum est particulièrement marquée dans la maladie, d'autres zones du cerveau sont également touchées par une dégénérescence neuronale avec une atteinte du cortex, du cervelet, de l'hippocampe, de la substance noire ainsi que les noyaux du tronc cérébral (Paulson et Albin, 2011). Même si la maladie est considérée comme neurodégénérative, elle ne touche pas seulement le système nerveux central. En eet, le gène muté de la huntingtine (mHTT) (et sauvage HTT) étant exprimée dans toutes les cellules de l'organisme, elle provoque des répercussions dans plusieurs organes périphériques (gure 0.1). Au niveau cellulaire, l'expression de la mHTT provoque la formation d'agrégats (composés majoritairement de mHTT) dans le corps cellulaire, le noyau, mais également dans le milieu extracellulaire (gure 0.2) (Gutekunst et al., 1999). Le lien entre présence d'agrégats et la mort cellulaire n'est pas établi. Toutefois, on retrouve très peu d'agrégats dans les neurones du striatum malgré la très forte mort cellulaire dans cette zone. Il semblerait, en eet, que les agrégats en soit ne sont pas toxiques pour les cellules les hébergeant. D'autres études ont démontré que les agrégats pourraient adopter diérentes structures dont certaines seraient toxiques, et d'autres non (Honer et Djian, 2015).

Cause génétique

Cette maladie neurodégénérative est causée par une mutation du gène HTT provoquant l'ex-pansion d'une région du gène constituée d'une répétition non interrompue du codon cytosine (C), adénine (A) et guanine (G) (CAG) codant la glutamine (M. Duyao et al., 1993). Quand le nombre de répétitions de CAG de ce gène localisé dans la région 4p16.3 du chromosome 4 (J. F. Gusella et al., 1983) excède 39, la maladie se déclare obligatoirement. Dans les cas où la répétition de CAG est comprise entre 35 et 39, la pénétrance est incomplète ; la maladie se dé-clare chez certains individus (Kay et al.,2016). Cette répétition élevée de CAG va provoquer chez la protéine synthétisée, la présence d'une queue polyglutamine (polyQ) anormalement longue qui engendrera, à son tour, un repliement de la protéine compromettant

dramatique-Figure 0.1  Atteintes périphériques dans la MH.

L'expression de la mHTT engendre des répercussions dans plusieurs organes périphériques. Les patients malades peuvent ainsi sourir de troubles du rythme cardiaque, d'atrophie musculaire ou d'ostéoporose. On peut aussi observer une atrophie des testicules, une baisse de la production d'insuline par le pancréas, une inammation chronique ainsi qu'une diminution de la synthèse de certaines hormones thyroïdiennes. D'après Burg, Björkqvist et Brundin,2009.

ment sa fonction (Labbadia et Morimoto,2013), déclenchant ainsi la MH. L'allèle muté est dit dominant, car sa présence en un seul exemplaire sut à provoquer la pathologie (Conneally,

1984). C'est ainsi qu'un couple dont l'un des partenaires est porteur de l'allèle morbide aura 50% de probabilité d'avoir un enfant malade à son tour. Cette maladie héréditaire est, de ce fait, dénie comme étant autosomique dominante (Conneally, 1984). Il est également à noter qu'environ 10% des cas de MH sont sporadiques, c'est-à-dire causés par une mutation de novo (Falush et al.,2001). Le nombre de répétitions de CAG est très important dans la pathologie. En eet, le nombre de CAG est directement corrélé avec la sévérité de la maladie (J.-M. Lee et al.,2012). Plus le nombre de CAG est élevé, plus la maladie va se déclarer tôt. On observe ainsi de très rares cas juvéniles qui possèdent une répétition de CAG extrêmement élevée (en général supérieure à 60) (Sunwoo, S.-T. Lee et M. Kim, 2010).

Figure 0.2  Présence d'agrégats de mHTT caractéristiques de la MH.

Image A : immunohistochimie (IHC) réalisée sur une coupe de putamen de cerveau d'un patient hun-tingtonien. Neurones marqués avec l'anticorps MAP2 (en marron) et agrégats marqués avec l'anticorps EM48 (en noir). Présence d'agrégats à l'intérieur des neurones (èche rouge), mais également dans le milieu extracellulaire (èche noire). Image B : immunouorescence (IF) réalisée sur une coupe de cer-veau de souris R6/2. mHTT marquée avec l'anticorps EM48 (en rouge), noyaux marqués au DAPI (en bleu) et neurones marqués avec l'anticorps MAP2. Agrégats présents dans le noyau des neurones (èche blanche). Échelle = 10 µm. Laboratoire de Francesca Cicchetti, données non publiées.

Traitements actuels et futurs

À l'heure actuelle, il n'existe aucun traitement curatif de la MH et toutes les médications peuvent seulement amoindrir ou contrôler certains symptômes (voir liste complète au tableau

0.1). D'ailleurs, la plupart des traitements utilisés ne sont pas spéciques à la MH. Seule la tétrabénazine est spécique et sert à contrôler la chorée. (Frank, 2014). Pour pallier au manque d'options thérapeutiques réellement ecaces et spéciques, de nombreuses molécules et traitements non médicamenteux sont testés en essais cliniques. Ainsi, des thérapies sont spéciquement développées pour cibler les symptômes de la MH. Par exemple de rares pa-tients ont bénécié de la stimulation cérébrale profonde (Wojtecki et al., 2016). Cette opé-ration chirurgicale consiste a poser un stimulateur électrique dans le cerveau pour contrôler les troubles moteurs et cognitifs et particulièrement la chorée. Les retours sur les quelques patients ayant subi l'opération ont été plutôt satisfaisants avec une amélioration signicative de certains symptômes. Également, de plus en plus d'évidences démontrent le rôle du système immunitaire dans la maladie. C'est ainsi, toujours dans l'optique de mieux cibler les symp-tômes, que des médicaments ont été testés pour diminuer l'inammation chronique observée chez les patients. Toutefois, les résultats de ces essais sont pour le moment plutôt mitigés, d'où la poursuite de ces études précliniques (Denis, Lauruol et Cicchetti, 2018). Il est en-n envisagé d'empêcher l'expression du gène muté mHTT. Par conséquent, un essai clinique

(NCT02519036) vise à diminuer l'expression de la mHTT grâce à l'utilisation de l'interférence par ARN (acide ribonucléique). Cet essai, IONIS-HTTRx est actuellement en phase 1/2a et est mené chez 46 patients. Des résultats préliminaires démontrent une diminution de la présence de mHTT dans le liquide cérébro-spinal des patients traités (S. Tabrizi et al., 2018). Pour terminer, des pistes sont étudiées pour corriger dénitivement la mutation. C'est ainsi qu'une équipe (S. Yang et al., 2017), en utilisant le système d'édition du génome CRISPR/cas9, a pu corriger la mutation dans le striatum de souris malades. Cette thérapie génique a permis l'amélioration des symptômes moteurs et une diminution signicative du nombre d'agrégats présents dans le striatum, mais n'a pas eu d'eet sur la longévité.

Symptômes Traitements

Perte de poids Olanzapine, cannabinoïdes

Psychose, agressivité, impulsivité Aripiprazole, halopéridol, olanzapine,_{rispéridone ou autres neuroleptiques}

Anxiété Benzodiazépines

Dépression Aripiprazole

Apathie Amantadine ou stimulants

Dystonie Amantadine, benzodiazepines

Essais cliniques et précliniques

Stimulation cérébrale profonde Essai sur quelques patients : amélioration_{de certains symptômes moteurs et cognitifs}

Immunothérapie

Précliniques : vaccination active et passive Essais cliniques : immunomodulateurs visant à diminuer la réponse inammatoire, mais résultats très mitigés.

Thérapie antisens Essai clinique IONIS-HTTRx : ARN interférant pourdiminuer expression de mHTT : baisse de la mHTT dans liquide céphalo-rachidien.

Thérapie génique Essai préclinique : suppression de la mutation mHTT_{en utilisant CRISPR/Cas9 chez la souris.} Table 0.1  Symptômes et traitements associés de la MH

Modèles de souris

La souris est l'animal le plus étudié dans le cadre de la MH. En eet, il existe plus de 25 modèles de souris huntingtoniennes (Pouladi, Morton et Hayden,2013). Selon la manière dont la mHTT a été introduite dans le génome de la souris, on retrouve 2 catégories de souris modèles de la MH. Ainsi, soit seul l'exon 1 du gène HTT est introduit dans le génome de la souris soit on remplace le gène HTT endogène par sa version humaine mutée. Les modèles varient également au niveau du type de promoteur utilisé et du nombre de répétitions de CAG introduit. Parmi ces diérents modèles, la souche R6/2 est l'une des plus utilisées. C'est

également ce modèle que nous avons choisi pour notre étude. Cette souris exprime l'exon 1 de la HTT humaine avec une répétition de 160 CAG sous l'inuence de son promoteur humain. Le modèle R6/2 développe la maladie à l'âge de 9 semaines et soure de lourds symptômes moteurs et cognitifs (Mangiarini et al., 1996). Au sein des modèles exprimant tous les exons de la HTT, nous avons le modèle zQ175 utilisé au laboratoire. Cette souris, au contraire de la R6/2, développe la maladie plus lentement (Menalled et al.,2012). On utilise ainsi ce modèle pour étudier des phénomènes sur le plus long terme.

La protéine huntingtine

Caractéristiques

Généralités

La protéine codée par le gène HTT est la huntingtine (HTT). La HTT est composée de 3 144 acides aminés (dans le cas d'une queue polyQ de 23 résidus glutamines) et a un poids moléculaire de 348 kDa. Le gène en lui-même est formé de 67 exons et peut subir un épissage alternatif pour donner diérents variants (Saudou et Humbert, 2016). La répétition des CAG, qui est mutée dans le cas de la MH, est localisée au niveau de l'exon 1 de la HTT. Le gène HTT est très conservé au cours de l'évolution. On le retrouve aussi bien chez la mouche que chez les vertébrés. L'exon 1, lui, a beaucoup varié au cours de l'évolution et notamment la présence de la queue polyQ. Eectivement, la présence d'une longue queue polyQ est spécique aux mammifères et c'est chez l'Homme que le nombre de CAG est le plus important (Saudou et Humbert, 2016).

Les domaines fonctionnels de la HTT

L'exon 1 est composé de 3 domaines principaux (0.3) 1) le domaine N-terminal composé des 17 premiers acides aminés très conservés chez les vertébrés, 2) la queue polyQ composée uniquement de glutamines et qui est très polymorphique chez l'Homme et enn 3) le domaine riche en prolines (DRP) qu'on ne retrouve que chez les mammifères et qui est composé de 50 acides aminés (Tartari et al., 2008). Le domaine N-terminal agit comme un signal d'export nucléaire et est sujet à de nombreuses modications post-traductionnelles qui aectent la dégradation et la localisation de la protéine (Atwal et al., 2007; Maiuri et al., 2013; L. M. Thompson et al., 2009). Le rôle du domaine polyQ, dont l'expansion anormale conduit à la MH, n'est pas vraiment connu. Cependant, il pourrait être impliqué dans l'autophagie. En eet, des expériences ont montré que la suppression de ce domaine chez la souris engendrait une augmentation de l'autophagie et de la longévité (Zheng et al., 2010). Le DRP connaît aussi un polymorphisme élevé. Il est impliqué dans l'interaction avec d'autres protéines et sa délétion n'est pas néfaste chez la souris (Neveklovska et al.,2012). En outre, il semblerait que le domaine N-terminal et le DRP jouent un rôle important dans la propension de la protéine à

s'agréger et pourraient donc réguler son agrégation dans les cas pathologiques. Ceci pourrait, en partie, expliquer les diérences symptomatologiques entre patients possédant un même nombre de répétitions CAG (Kuiper et al., 2017).

Des domaines moins connus de la HTT

Les 97,8% restant de la protéine composée, par les 66 autres exons, sont beaucoup moins carac-térisés, car la mutation induisant la MH est présente dans l'exon 1. Ainsi, les rares recherches conduites sur ces exons ont montré qu'ils étaient surtout constitués de plusieurs répétitions HEAT (structure particulière formant des solénoïdes alpha et qu'on retrouve chez 4 protéines : l'huntingtine (H), le facteur d'élongation eucaryote 2 (E), la protéine phosphatase 2A (A) et la kinase TOR1 (T)). Ces motifs sont impliqués dans les interactions protéines-protéines (Pa-lidwor et al., 2009). Les répétitions HEAT sont également responsables d'interactions intra-moléculaires conduisant à la formation d'homodimères de HTT et pouvant aussi faire adopter à la HTT diérentes conformations tridimensionnelles. Une étude a par exemple montré que la HTT était capable d'adopter une centaine de conformations diérentes (Seong et al.,2010). Enn, une séquence d'exportation nucléaire est présente dans l'exon 18 (Xia et al.,2003).

Figure 0.3  Structure de la HTT.

polyQ : queue polyglutamine, PR : domaine riche en proline, NES : séquence d'exportation nucléaire. D'après Kolobkova et al.,2017

HTT : une protéine multifonctionnelle

Le rôle de la HTT a longtemps posé question, mais aujourd'hui, il est clair que c'est une protéine multifonctionnelle. La HTT est tout d'abord exprimée de manière ubiquitaire et est ainsi retrouvée dans tous les tissus de l'organisme même si son expression est plus élevée dans le système nerveux central (Fagerberg et al., 2014; Marques Sousa et Humbert, 2013). La HTT est une protéine essentielle ; l'inhibition de son expression pendant le développement embryonnaire est létale chez la souris (M. P. Duyao et al., 1995; Nasir et al., 1995; Zeitlin et al., 1995). En revanche, son inhibition chez la souris adulte à peu ou pas d'eets sur la longévité, les performances motrices ou cognitives (Wang et al., 2016).

HTT : une protéine impliquée dans plusieurs mécanismes de transport

La HTT est impliquée dans le trac vésiculaire antérograde et rétrograde. En interagissant avec des protéines de transport telles que la dynéine, la protéine associée à la huntingtine 1,

la dynactine et la kinésine, la HTT est capable de réguler le transport des vésicules. La HTT régule donc le transport de diérents éléments cellulaires dont des vésicules pouvant contenir des facteurs tropiques tels le BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor : facteur neurotro-phique dérivé du cerveau, impliqué dans l'ontogenèse sur SNC et dans la survie des neurones), de l'APP (Amyloid Precursor Protein : protéine précurseur de l'amyloïde impliquée dans la maladie d'Alzheimer), mais également des précurseurs de vésicules synaptiques (Saudou et Humbert,2016). En interagissant avec des protéines de l'endocytose, HTT médie l'endocytose (Engqvist-Goldstein et al.,2001), le recyclage des vésicules (Modregger et al.,2003) et le trac endosomal (Pal et al., 2006). Également, la HTT joue un rôle très important dans l'autopha-gie via de multiples mécanismes dont notamment la régulation du transport antérograde des autophagosomes au niveau des axones des neurones (Wong et Holzbaur, 2014). Elle est aussi impliquée dans le transport des protéines ubiquitinylées dans l'autophagosome.

HTT : une protéine essentielle

La HTT possède une fonction de régulateur de la transcription via son interaction dans le noyau cellulaire avec de nombreux facteurs de transcription tels que NF-κB (Takano et James F. Gusella, 2002) ou p53 (Stean et al., 2000), mais également par son interaction avec des récepteurs nucléaires comme PPARγ (Futter et al., 2009). De plus, on retrouve la HTT dans les cellules mitotiques au niveau du fuseau mitotique et des microtubules astraux montrant ainsi son implication dans la régulation de la division cellulaire (Elias et al.,2014; Godin et al.,

2010). La HTT est aussi primordiale pour la ciliogenèse (Haremaki, Deglincerti et Brivanlou,

2015; Keryer et al.,2011). Enn, cette protéine ubiquitaire joue un rôle dans la survie cellulaire via au moins deux mécanismes : 1) la HTT peut inhiber l'activation des caspases 3 et 9 et ainsi prévenir l'apoptose (Rigamonti et al., 2001; Zhang et al.,2006) et 2) elle peut favoriser la transcription et le transport de BDNF.

La HTT est indispensable lors de l'embryogenèse. Eectivement, cette protéine est essentielle à la diérenciation des neuroblastes pour la formation du cortex, du striatum et du thalamus (Reiner et al., 2001). Elle est aussi impliquée dans la migration des neurones corticaux de la zone ventriculaire vers la plaque corticale (Tong et al., 2011), mais également dans la circulation du liquide céphalorachidien via la motilité ciliaire des épendymocytes (Dietrich et al., 2009; Keryer et al.,2011). En outre, durant le développement, la HTT serait impliquée dans l'organogenèse via sa capacité à réguler le métabolisme (Pouladi, Xie et al., 2010; Van Raamsdonk et al., 2006).

Au vu des multiples rôles que joue la HTT dans l'ensemble de l'organisme, il est facile de concevoir que cette protéine, lorsqu'elle est mutée, puisse engendrer un nombre impressionnant de répercussions négatives, non seulement au niveau du système nerveux central (SNC), mais également dans toute la périphérie.

La protéine HTT mutée

En temps normal, le gène HTT est transcrit puis traduit pour former la protéine HTT entière. Dans le cas de la MH, la répétition anormalement longue de CAG peut entraîner la forma-tion d'un transcrit (ARN messager) aberrant codant seulement l'exon 1 et conduisant ainsi à la synthèse de la partie N-terminal de la protéine (Sathasivam et al., 2013). Ce fragment N-terminal contenant la queue polyQ est considéré comme étant la principale forme toxique de la mHTT (Ross et S. J. Tabrizi, 2011). Il peut également être obtenu par clivage protéo-lytique de la protéine entière. Eectivement, la HTT possède plusieurs sites de protéolyse qui peuvent être clivés par diérentes protéases, dont des caspases (Y. J. Kim, Yi et al., 2001), des calpaïnes (Gafni et Ellerby, 2002), des cathepsines (Y. J. Kim, Sapp et al., 2006) et la métalloprotéinase MMP10 (Tebbenkamp et al.,2012). Bien qu'observée in vitro, la protéolyse de la HTT non pathologique n'a jamais été observée in vivo au contraire de la mHTT. Chez les individus atteints de la MH, on observe également une augmentation de l'activité des protéases susmentionnées (Saudou et Humbert, 2016). Les diérentes étapes conduisant à la formation du fragment N-terminal toxique de la mHTT sont schématisées en gure 0.4.

Figure 0.4  Synthèse aberrante de la partie N-terminale de la mHTT.

Dans le cas de la MH, la transcription de l'allèle muté peut conduire soit à la synthèse d'un ARNm complet (1) soit d'un ARNm codant seulement l'exon 1 de la HTT (2). La traduction de l'ARNm aberrant va conduire à la synthèse de la partie N-terminal de la protéine (4). L'ARNm codant la protéine entière va, après traduction, permettre la synthèse de la mHTT (3). La mutation va entraîner la protéolyse de la mHTT conduisant à la formation de diérents fragments dont le N-terminal toxique (5). D'après Bates et al.,2015.

Agrégation de la mHTT

Tel que décrit à la section "répercussions anatomiques et cellulaires", la MH est caractérisée par la présence d'agrégats de mHTT dans les tissus, mais la mHTT, en s'autoassemblant, peut former de nombreuses structures plus ou moins toxiques (voir gure0.5). De nombreuses études ont ainsi été menées pour déterminer quelles étaient les structures de mHTT les plus toxiques et la littérature tend à s'accorder sur le fait que la forme brillaire serait particulièrement nocive contrairement à la forme agrégée qui serait potentiellement bénéque (Drombosky et al.,2018; Hoop et al.,2016). De par sa toxicité établie, nous avons décidé d'utiliser cette forme de la protéine pour notre projet de recherche décrit au chapitre1.

La forme brillaire que peut adopter la mHTT est très similaire à ce qu'on retrouve dans d'autres maladies neurodégénératives. En eet, les maladies comme Parkinson (MP) ou Alz-heimer (MA) sont caractérisées par la présence de brilles amyloïdes également toxiques (Fernàndez-Busquets, 2013). Dans chacune de ces pathologies, des brilles insolubles sont retrouvées dans les tissus. Ces dernières sont formées par une protéine qui est spécique à la maladie. Ainsi, dans la MA c'est la bêta amyloïde et dans la MP, l'alpha-synucléine. Ces protéines précurseurs de brilles ont comme caractéristique commune leur propension à former des feuillets β qui sont très importants dans les interactions protéines-protéines. Cette pro-priété est également présente chez les prions. Dans le cas de la mHTT, la formation d'épingles à cheveux β est un processus primordial dans l'induction de l'agrégation (Hoop et al., 2016). Il semblerait que la taille de la queue polyQ corrèle avec la formation de ces structures déclen-chant le processus d'agrégation. En eet, pour une queue polyQ composée de moins de 25Q, il n'y pas de formation stable d'épingle à cheveux β (Kar et al., 2011).

Pathogénicité de la mHTT

Il est aujourd'hui admis que la partie N-terminale de la mHTT est la forme la plus toxique et est ainsi responsable en grande partie de la MH. Il semblerait également que plus les fragments N-terminaux sont courts et plus ils sont toxiques (Ross et S. J. Tabrizi,2011). La toxicité de ces fragments s'expliquerait majoritairement par le fait qu'ils sont capables de transloquer dans le noyau et de perturber la transcription, induisant la mort cellulaire (Saudou, Finkbeiner et al.,

1998). Ces fragments sont également responsables d'une pléthore de dysfonctionnements liés aux nombreuses fonctions de la protéine vues dans la section"HTT : une protéine multifonc-tionnelle". Ainsi, on observe une inhibition du protéasome et de l'autophagie et des atteintes au niveau des mitochondries entraînant des répercussions sur le métabolisme. La présence des fragments toxiques provoque aussi une altération de l'endocytose, une décience de l'activité synaptique et de l'excitotoxicité (Ross et S. J. Tabrizi, 2011).

Figure 0.5  Les diérentes formes que peut adopter la mHTT.

La mauvaise conformation de la mHTT due à la présence de la queue polyQ anormalement longue va déclencher le processus d'agrégation qui commence par la formation d'oligomères. Ces derniers peuvent former des agrégats amorphes ou des espèces plus structurées que sont les brilles. L'interaction de ces deux derniers types de structures va mener à la formation de larges agrégats de plusieurs µM de diamètre. D'après Legleiter et al., 2010.

Propagation de la mHTT

Premières évidences de la propagation de la mHTT

Une première étude menée en 2002 (W. Yang et al.,2002) a permis de montrer que certaines cellules (Cos-7 et PC12) étaient capables d'assimiler des peptides polyQ synthétiques lorsque ces derniers étaient introduits dans le milieu de culture. La cytotoxicité de ces polyQ a été démontrée lors de l'ajout d'une séquence de localisation nucléaire. Cette étude a ainsi été la première à mettre en évidence la capacité de la mHTT à être assimilée par des cellules en culture. Une seconde étude parue en 2009 (Ren et al., 2009) s'est intéressée plus particuliè-rement à la forme brillaire que peut adopter la mHTT en utilisant des brilles synthétiques contenant seulement le polyQ (Q44). Ces travaux ont permis de montrer que diérents types de cellules (cos-7, HEK293, neuro2A, CHO et HeLa) sont capables d'assimiler des brilles ajoutées au milieu de culture. Ces brilles se retrouvent dans le cytoplasme et semblent être assimilées par les cellules via un passage passif à travers la membrane plasmique. On retrouve également, colocalisées avec les brilles, diérentes protéines, dont l'ubiquitine, la sous-unité du protéasome et la Hsp70 (protéine de choc thermique). Aussi, des cellules HEK293 modiées pour exprimer l'exon 1 de la HTT avec une queue polyQ non pathologique de 25Q étiquetée avec une protéine uorescente CFP (CFP-HttQ25) ont été mises en contact avec les brilles,

ces derniers ont bien été assimilés et ont altéré la distribution de la CFP-HttQ25. En eet, au lieu d'observer une distribution homogène de CFP-HttQ25 dans le cytoplasme, ce dernier forme des points qui colocalisent parfaitement avec les brilles synthétiques (voir gure0.6), suggérant ainsi une capacité des brilles à agréger la forme non mutée de la HTT. Ce méca-nisme est semblable à ceux des prions. Enn, une dernière expérience où des cellules HEK293 exprimant soit la GFP-HttQ71 soit chFP-HttQ25 ont été mis en coculture a permis de montrer une modication de la distribution de chFP-HttQ25 (formation de points) suggérant ainsi que la GFP-HttQ71 a été capable de se propager vers les cellules exprimant la forme non mutée de l'exon 1 de la HTT et induire son agrégation. Cette étude a ainsi mis en évidence la capacité prionique de la mHTT. D'autres études ont par la suite permis de conrmer ces résultats dans d'autres modèles in vitro (Herrera et al., 2011), mais également de mettre en évidence de nouveaux modes de transmissions de la mHTT, notamment via les nanotubes (Costanzo et al., 2013) et par la voie transsynaptique (Pecho-Vrieseling et al., 2014).

Figure 0.6  Les propriétés prioniques de la mHTT.

Image du haut : cellules HEK293 exprimant la construction CFP-HTTQ25 en absence de brilles Q44 synthétique. La distribution de CFP-HTTQ25 est homogène dans tout le cytoplasme. Figure du bas : cellules HEK293 exprimant la construction CFP-HTTQ25 en présence de brilles Q44 dans le milieu de culture. Une modication de la distribution de CFP-HTTQ25 est observée, suggérant que les brilles synthétiques ont corrompu la HTT non pathogène exprimée par les cellules Ren et al.,2009.

Propagation chez l'Homme

En 2014, Cicchetti et al (Cicchetti et al., 2014) publient une étude résumant les analyses ef-fectuées sur des cerveaux de patients huntingtoniens ayant reçu des grees de tissus f÷taux de striatum. L'étude a porté sur 3 patients greés décédés environ 10 ans après l'opération des suites de la maladie. Les cerveaux ont été observés en IHC au niveau du striatum où les grees ont été réalisées. Tout d'abord, la présence d'agrégats de mHTT a bien été conrmée dans diérentes zones du cerveau comme attendu, mais des agrégats ont également étaient observés au niveau du greon (gure 0.7). Ces résultats paraissent étonnants, car les cellules du greon ne possèdent pas la mutation du gène HTT, elles ne sont donc pas censées pro-duire d'agrégats. Ainsi, la présence d'agrégats mHTT dans ce tissu génétiquement sain semble pouvoir s'expliquer, entre autres, par la propagation de la mHtt présente dans les cellules de l'hôte ou dans l'environnement extracellulaire vers les cellules greées. Ce papier a ainsi été le premier à suggérer que la capacité de propagation de la mHTT observée in vitro serait également existante dans des conditions physiologiques chez l'humain.

Les propriétés prioniques de la mHTT

Suivront ensuite plusieurs études cherchant à déterminer par quels mécanismes la mHTT se propage de cellules à cellules et quelles sont les implications de ce phénomène à la pathogenèse de la maladie. Deux études ont notamment étaient menées chez la drosophile (Babcock et Ganetzky, 2015; Pearce et al., 2015). Dans la première, une construction contenant les 12 premiers exons de la HTT avec un polyQ de 138 répétitions et une étiquette uorescente a été exprimée seulement dans les neurones olfactifs du cerveau de la drosophile. Après induction de l'expression du transgène, des agrégats de mHTT se forment et s'accumulent dans les boutons terminaux des axones des neurones olfactifs, mais au cours du temps, on retrouve également des agrégats dans d'autres populations de neurones dans tout le cerveau causant de même la mort de certains neurones. Ceci démontrant ainsi que les agrégats ont été relâchés par les neurones olfactifs et internalisés par des neurones environnants. Par ailleurs, bloquer l'endocytose prévient la propagation des agrégats et la mort neuronale indiquant donc que les agrégats sont internalisés par les cellules environnantes via ce mécanisme. Enn, cette étude a aussi montré l'existence de motifs de propagations spéciques qui suggèrent donc que la mHTT se dissémine via des circuits neuronaux dénis.

Dans la seconde étude, les chercheurs ont spéciquement fait exprimer dans les neurones olfactifs de la mouche, l'exon 1 de la HTT avec 91Q (HttQ91) fusionné avec la protéine uorescente mCherry. Comme dans les travaux précédents, l'expression de HttQ91 induit une accumulation d'agrégats dans les boutons terminaux des neurones génétiquement modiés. Les chercheurs ont ensuite chirurgicalement endommagé ces neurones. Suite à cette opération, les cellules gliales environnantes ont phagocyté la protéine HttQ91 relâchée dans le milieu extracellulaire par les neurones endommagés. Enn, en exprimant HttQ91 dans les neurones

Figure 0.7  Présence de mHTT chez les patients huntingtoniens transplantés.

IHC sur coupe de cerveau d'un patient huntingtonien (53 CAG, stade 4) ayant reçu une gree de cellules souches embryonnaires dans le striatum. Marquages utilisés : EM48 pour détecter les agrégats de mHTT et MAP2 pour marquer les neurones. F : striatum avec les zones greées (p-zone) et non greées (non p-zone). G et H : présence d'agrégats de mHTT dans les zones greées (èches noires). I : présence d'agrégats dans le tissu non greé (èche noire). J : présence d'agrégats dans le cortex Cicchetti et al.,2014.

olfactifs et HttQ25 dans les cellules gliales, des agrégats formés des deux formes de la HTT ont été retrouvés et certains étaient composés seulement de HttQ25. Ces agrégats ont seulement été observés dans les cellules gliales à proximité des neurones olfactifs exprimant HttQ91. Cette étude a ainsi été la première à démontrer la capacité de la mHTT à corrompre la forme non mutée de la protéine dans un modèle in vivo.

En 2016 a été publié une étude portant sur la thématique de la propagation de la mHTT. Dans ces travaux (Jeon et al., 2016), des broblastes et des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) de patients huntingtoniens ont été injectés dans les ventricules cérébraux de souris néonatales sauvages ne possédant donc pas la mutation. Ces injections ont provoqué le développement d'un phénotype MH (troubles cognitifs et moteurs, pertes de neurones dans le striatum et présence d'agrégats dans le striatum). Dans ce même papier, des expériences in vitro ont été menées an de caractériser les potentielles voies de propagation de la mHTT. Ainsi, des cellules SH-SY5Y (lignée cellulaire dérivée d'un neuroblastome humain) transfectées

pour exprimer l'exon 1 de la HTT avec un polyQ pathogène ont été mises en culture et 5 jours d'incubation plus tard, le milieu de culture a été analysé et les exosomes (vésicules produites par les cellules et relâchées dans le milieu extracellulaire) présents ont été isolés. Des analyses eectuées sur ces échantillons ont permis de démontrer la présence de mHTT à la fois dans le milieu de culture et dans les exosomes. Ces observations supposent que la mHTT peut être sécrétée par les cellules et qu'elle pourrait également se propager via les exosomes. D'ailleurs, des exosomes de broblastes d'un patient huntingtonien ont été mis en culture avec des neurones de souris sauvages et après plusieurs jours de culture, la présence d'agrégats au sein des cellules fut conrmée. Enn, une dernière expérience consistant à cultiver des cellules SH-SY5Y en présence du milieu conditionné ayant servi à cultiver des cellules HEKs transfectées pour exprimer l'exon 1 de la HTT avec un polyQ pathogène a permis de démontrer la présence de la protéine pathogène dans les SH-SY5Y en immunobuvardage.

Plusieurs études permettront ensuite de révéler l'existence d'autres mécanismes usités par la mHTT pour se propager. Une équipe a ainsi montré que la mHTT pouvait être assimilée par endocytose dépendante de la clathrine dans un modèle in vitro (Ruiz-Arlandis et al.,2016) et une autre étude a montré que la mHTT était capable de se propager via de grosses vésicules appelées exophers dans un modèle de C.elegans (Melentijevic et al., 2017).

Projet de recherche

De nombreuses études ont été menées an de caractériser les mécanismes impliqués dans la propagation de la forme mutée de la HTT et ainsi mieux comprendre l'aspect prionique de cette protéine. Ces diérentes recherches se sont globalement focalisées sur le cerveau et plus particulièrement les neurones. Or, comme expliqué plus haut, la pathologie touche l'ensemble de l'organisme et on peut ainsi se poser légitimement la question à savoir si la mHTT peut se propager en périphérie et si cette dernière joue un rôle dans la pathogenèse de la MH. De plus, comprendre l'implication de cette potentielle propagation périphérique pourrait avoir des répercussions dans la conception de nouveaux traitements. Pour mon projet de maîtrise présenté au chapitre1, nous avons souhaité tester la robustesse de la théorie de la propagation et de l'aspect prionique de la mHTT en utilisant diérents types de cellules humaines in vitro exposées à diérentes formes de la protéine, mais également dans des modèles murins. Nous avons ainsi utilisé 3 types de cellules humaines, des SH-SY5Y, des THP-1 diérenciés en macrophages et des neurones GABAergiques iGABA. Nous avons tout d'abord voulu tester le potentiel d'assimilation et de toxicité de brilles synthétiques composées de l'exon 1 de la HTT avec 25 ou 48 répétitions de glutamines dans ces diérents types de cellules. Nous nous sommes ensuite intéressés à la capacité des brilles ainsi assimilées à corrompre, et donc agréger, la protéine HTT endogène naturellement exprimée dans ces cellules. Nous avons choisi d'utiliser la forme brillaire, car cette dernière est particulièrement toxique et est capable d'induire la formation d'agrégats (Pieri et al., 2012). Nous avons ensuite évalué la capacité

de ces brilles synthétiques à induire la MH chez des animaux sauvages et également sa capacité à précipiter la maladie chez des souris exprimant la mHTT. De plus, nous nous sommes intéressés aux répercussions de la présence de ces brilles sur la HTT endogène.

Chapitre 1

Demonstration of prion-like properties

of mutant huntingtin brils in both in

vitro and in vivo paradigms

Maria Masnata1,2_{, Giacomo Sciacca}1,2_{, Alexander Maxan}1,2_{, Luc Bousset}4_{, Hélèna L. Denis}1,2_, Florian Lauruol1,2_{, Linda David}1,2_{, Martine Saint-Pierre}1,2_{, Jerey H. Kordower}3_{, Ronald} Melki4_{, Melanie Alpaugh}1,2_{, Francesca Cicchetti}1,2

1_{Centre de Recherche du CHU de Québec, Axe Neurosciences, Québec Canada.}2_Département de Psychiatrie & Neurosciences, Université Laval, Québec Canada. 3_{Department of} Neurolo-gical Sciences, Rush University Medical Centre, Chicago, USA. 4_{Laboratory of} Neurodege-nerative Diseases, Institut François Jacob, MIRCen, CEA, CNRSFontenay-aux-Roses, Cedex France.

Correspondence : Dr Ronald Melki : E-mail : ronald.melki@cnrs.fr

Dre Melanie Alpaugh : E-mail : melanie-jeanne.alpaugh.1@ulaval.ca

Dre Francesca Cicchetti : E-mail : francesca.cicchetti@crchul.ulaval.ca

Maria Masnata, Giacomo Sciacca, Alexander Maxan and Luc Bousset contributed equally to this work.

1.1 Résumé

Au cours des dernières années, les preuves se sont accumulées pour suggérer que la protéine mutante huntingtine (mHTT) peut se répandre dans les tissus sains normaux d'une façon semblable aux prions. Cette théorie reste toutefois controversée. An d'aborder pleinement ce concept et de comprendre les conséquences possibles de la propagation à la pathologie de la maladie de Huntington, nous avons étudié les eets des brilles exogènes composées des frag-ments N-terminaux humains de la mHTT(Q48) et huntingtine (HTT) (Q25) dans 3 modèles cellulaires et 3 modèles animaux distincts. Pour les expériences in vitro, des cellules neuro-nales humaines (neurones GABA dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iGABA) et (SH-SY5Y) ainsi que des macrophages humains dérivés de THP-1 ont été incubés avec des brilles de mHTT recombinant. Les brilles recombinantes mHTT et HTT ont été absorbées par tous les types de cellules, induisant des changements de morphologie cellulaire et leur mort. Des variations dans l'agrégation de la HTT ont également été observées après incuba-tion avec des brilles dans les cellules THP-1 et SH-SY5Y. Pour les expériences in vivo, des souris sauvages adultes ont reçu une injection corticale unilatérale et des nouveaux-nés R6/2 et sauvages ont reçu des brilles par injections intraventriculaires bilatérales. Dans les deux protocoles, l'injection de brilles mHTT (Q48) a entraîné des troubles cognitifs et une augmen-tation de l'anxiété. L'analyse post-mortem des souris sauvages adultes a indiqué que la plupart des brilles avaient été dégradées ou éliminées du cerveau 14 mois après l'intervention. Malgré l'absence de brilles à ces moments tardifs, un changement dans le prol de coloration de la HTT endogène a été détecté. Un changement similaire a été révélé dans l'analyse post-mortem des souris R6/2. Ces eets étaient spéciques à l'administration centrale des brilles, car les souris recevant des injections intrapéritonéales ne subissaient pas de changements au niveau de comportement. En fait, l'administration périphérique a entraîné une augmentation de la réponse immunitaire contre les brilles. Ensemble, les données in vitro et in vivo indiquent que l'administration exogène de mHTT peut à la fois provoquer et exacerber la pathologie.

1.2 Abstract

In recent years, evidence has accumulated to suggest that mutant huntingtin protein (mHTT) can spread into normal healthy tissue in a prion-like fashion. This theory, however, remains controversial. To fully address this concept and to understand the possible consequences of spreading to Huntington's disease pathology, we investigated the eects of exogenous human brillar mHTT (Q48) and huntingtin (HTT) (Q25) N-terminal fragments in 3 cellular models and 3 distinct animal paradigms. For in vitro experiments, human neuronal cells (induced pluripotent stem cell derived GABA neurons (iGABA) and (SH-SY5Y) as well as human THP-1-derived macrophages were incubated with recombinant mHTT brils. Recombinant mHTT and HTT brils were taken up by all cell types, inducing cell morphology changes and death. Variations in HTT aggregation were further observed following incubation with

brils in both THP-1 and SH-SY5Y cells. For in vivo experiments, adult wild-type (WT) mice received a unilateral intracerebral cortical injection and R6/2 and WT pups were administered brils via bilateral intraventricular injections. In both protocols, the injection of mHTT (Q48) brils resulted in cognitive decits and increased anxiety-like behaviour. Post-mortem analysis of adult WT mice indicated that most brils had been degraded/cleared from the brain by 14 months post-surgery. Despite the absence of brils at these later time points, a change in the staining pattern of endogenous HTT was detected. A similar change was revealed in post-mortem analysis of the R6/2 mice. These eects were specic to central administration of brils, as mice receiving intra-peritoneal injections were not characterized by behavioural changes. In fact, peripheral administration resulted in an immune response mounting against the brils. Together, the in vitro and in vivo data indicate that exogenously administered mHTT is capable of both causing and exacerbating disease pathology.

1.3 Introduction

Huntington's disease (HD) is an autosomal dominant neurodegenerative disorder that pro-gresses to death over 10 to 30 years (Tang et Feigin, 2012). During the pre-manifest phase, subtle changes in personality, cognition and motor control can be observed which, over time, lead to diagnosis based on motor features of the condition. Once manifest, HD patients exhibit progressive cognitive impairments that impact activities of daily living along with psychiatric disturbances that can evolve to frank psychosis and a worsening movement disorder. In the nal stages, patients become demented and bedbound (Ha et Fung, 2012; Tang et Feigin,

2012; F. O. Walker,2007; Zheng et Diamond, 2012). The classic neuropathological feature is a massive atrophy of the caudate and putamen which results from neuronal dysfunction and loss, especially of the medium spiny projection neurons. Progressive neuronal loss and atrophy is also observed in other areas of the brain including the deep layers of the cerebral cortex and it is likely that degeneration of cortical areas are responsible for the more critical cognitive and personality-related abnormalities seen in HD patients (Reiner, Dragatsis et Dietrich,2011; Vonsattel, 2008). Non-neuronal cell types are also impacted, with cell-autonomous changes in neuro-inammatory cells such as microglia having also been described (Crotti et al., 2014). Importantly, HD is caused by a CAG repeat expansion beyond 35 in exon1 of the huntingtin gene which encodes for huntingtin (HTT), a cytoplasmic protein ubiquitously expressed and present both in humans and rodents, with a particularly high expression in the brain (Sassone et al., 2009). This leads to the production of a mutant protein (mHTT) with an expanded polyglutamine stretch (Bates, 2003; Zheng et Diamond, 2012).

Many proteins that play a central role in common neurological disorders, including α-synuclein, tau, TDP-43, amyloid, and SOD, have now been described to have prion-like properties (Brun-din, Melki et Kopito, 2010; Jucker et L. C. Walker,2013; Soto, 2012). The concept of prions as disease causing agents was pioneered in 1982 with the seminal discovery by Stanley

Pru-siner that neurodegeneration in sheep and goats could result from exposure to a protein in an aggregated abnormal form, specically to what has come to be known as a prion protein (Prusiner, 1982). It was demonstrated that this entity is capable of spreading and seeding pathology (Das et Zou, 2016). However, to be qualied as prion, a protein must be capable of irreversible conversion of other normal proteins into a pathogenic form that can spread di-sease independently. From studying the proteins associated with neurodegenerative didi-seases, it has become clear that various factors inuence how infectious a specic protein is. For example, the brillar form of α-synuclein is more toxic than the monomeric or oligomeric pre-cursors (Pieri et al.,2012). Dierent cleavage products of proteins have dierential abilities to be recruited and to subsequently seed pathology. Amyloid is the classic example of this with specic truncated forms such as amyloid-β 42 conveying far greater toxicity and infectivity than other similar structures such as amyloid-β 40 (Felsenstein, Hunihan et Roberts, 1994). From the initial reports, mHTT spreading/seeding was indeed highly debated, however, this theory is rapidly gaining support from both in vitro and in vivo experiments (Ast et al.,2018; Calignon et al., 2012; Desplats et al.,2009; Hansen et al.,2011; Luk, V. Kehm et al., 2012; Luk, V. M. Kehm et al., 2012; Masnata et Cicchetti, 2017; Meyer-Luehmann, Coomaras-wamy et al., 2006; Meyer-Luehmann, Stalder et al.,2003; Williams et al.,2015). Despite the increased acceptance of mHTT spreading and seeding, the relevance of these phenomena in HD still raises signicant scepticism ; scepticism which is being further challenged by recent reports that mHTT with high seeding capacity is associated with greater neuronal toxicity in a Drosophila model of HD (Ast et al.,2018). To shed further light on these properties and their consequences, 3 distinct human cell models and 3 animal paradigms were used in which the impact of recombinant N-terminal HTT brillar fragments, termed HTTExon1 throughout the manuscript, were thoroughly investigated.

1.4 Materials and methods

1.4.1 Recombinant HTTExon1Q25 and Q48 brils

The expression and purication of human HTTExon1 with a 25 (normal) or 48 (pathologi-cal) glutamine stretch was performed, as previously described (Tabrizi et al., 2013). Briey, HTTExon1 was assembled in 20 mM TrisHCl, pH 7.5, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM ATP, 100 mM imidazole and 10% glycerol, at 37°C for 24 hours (hrs) (without shaking). HTTExon1 brils were centrifuged twice at 15,000 g for 10 minutes (min) and resuspended twice in phosphate buered saline (PBS). The brils and BSA were labeled with ATTO-555 or ATTO-488 (ATTO-Tec GmbH Siegen, Germany, #AD 488-35 and # AD 550-35) N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) uorophore following the manufacturer's instructions using a protein to dye ratio of 1 :2. The labeling reactions were stopped by the addition of 1 mM Tris pH 7.5. The unreacted uorophore was removed by a nal cycle of two centrifugations at

15,000 g for 10 min and resuspension of the pelleted brils in PBS. The amount of ATTO-555 or ATTO-488 incorporated was assessed by mass spectrometry. The samples were de-salted with 5% acetonitrile, 0.1% Triuoroacetic acid (TFA) and eluted from a C18 reversed phase Zip-Tip (Millipore, Billerica, MA, USA, Cat# ZTC18M096) in 50% acetonitrile, 0.1% TFA. Peptide samples were mixed in a ratio of 1 :51 :20 (v/v) with sinapinic acid (10 mg/mL) in 50% acetonitrile and 0.1 % TFA and spotted (0.5 µL) on a stainless steel MALDI target (Opti-TOF ; Applied BioSystems Foster City, CA 94404 USA, Cat# 4347686). MALDI-TOF-TOF MS spectra were acquired with a MALDI-MALDI-TOF-TOF/MALDI-TOF-TOF 5800 mass spectrometer (Applied Biosystems Foster City, CA 94404 USA) using linear mode acquisition.

Fluorescently-labeled HTTExon1 brils were fragmented for 15 min at 30°C in 2 mL Eppendorf tubes in a VialTweeter powered by an ultrasonic processor UIS250v (250 W, 24 kHz, Hielscher Ultrasonic, Teltow, Germany) set at 75% amplitude, 0.5 s pulses every 1 s. The nature of brillar HTTExon1 forms before and after fragmentation was assessed using a JEOL 1400 transmission electron microscope following adsorption onto carbon-coated 200-mesh grids and negative staining with 1% uranyl acetate. The fragmented brils were ash frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C until use.

1.4.2 Cell lines and culture conditions

Experiments were performed in three dierent cell types : SH-SY5Y human neuroblastoma cell line, THP1 monocytes dierentiated into macrophages, and iGABA high purity post-mitotic human neural cells derived from induced pluripotent stem cells (iPSC). The concentration of brils was selected based on a dose response curve of SH-SY5Y cells using MTT reduction as an indicator (Figure 1.1c). The dose used in our experiments (0.05 µg/µL e.g. 312 nM) was selected such that we observed sucient toxicity without detrimental eects incompatible with long-term observations.

Incubation with brils

The SH-SY5Y (human neuroblastoma) cell line was cultured in Dulbecco's Modied Eagle's Media (DMEM) F12 (Sigma-Aldrich, ON, Canada, Cat #51445C-1000ML) supplemented with 10 % FBS (Sigma-Aldrich, Cat #F2442-500ML) and 1X antibiotic antimycotic solution (100 units penicillin, 0.1 mg streptomycin and 0.25 µg amphotericin B per mL) (Sigma-Aldrich, A5955-100mL). Cells were plated on gelatin (Sigma-Aldrich, Cat #G1393) coated 12 mm coverslips (Fisher Scientic, ON, Canada, Cat #12-545-81) in 24-well plates (Sarstedt, Num-brecht, Germany, Cat #83.3922.005). Twenty-four hrs post-plating, cells were exposed to 1 µL of 5 µg/µL mHTTExon1 brils (312 nM) or 1 µL of 1 µg/µL BSA (15 µM) (BSA, BioShop Canada, ON, CA, Cat #ALB999) for 3 days (Tabrizi et al., 2013) (Figure1.1a).

The THP1 (human leukemic monocyte) cell line was cultured in DMEM (Sigma-Aldrich, ON, Canada, Cat# 56499C-50L) supplemented with 10% FBS (Sigma-Aldrich) and 1X

antibio-tic/antimycotic solution (100 units penicillin, 0.1 mg streptomycin and 0.25 µg amphotericin B per mL). Cells were plated onto uncoated 12 mm coverslips (Fisher Scientic) in 24-well plates (Sarstedt) and dierentiated into macrophages by adding 100 ng/mL phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA, Sigma-Aldrich, Cat# P8139-1MG) for a period of 72 hrs. Cells were then exposed to 1 µL of 5 µg/µL mHTTExon1 brils (312 nM) or 1 µL of 1 µg/µL BSA (15 µM) for 24 hrs (Figure 1.1a).

The iCell Neurons cell line (iGABA) ; Cellular Dynamic International, WI, USA)) were thawed following company guidelines (iCell Neurons User's Guide, Cellular Dynamic International). Briey, cells were plated in complete maintenance medium (Cellular Dynamic International) on Poly-L-ornitine (Sigma-Aldrich, Cat# P4957-50ml)/laminin (Sigma-Aldrich, Cat# L9393-100UL) coated 18 mm coverslips (Menzel-Glaser, Dublin, Ireland, Cat# BB018018A1) in 12-well plates (Sarstedt, Numbrecht, Germany, Cat# 83.3921.005). The iGABA cells were treated 24 hrs post-plating with 1 µL of 5 µg/µL mHTTExon1 brils Q25 and Q48 for 3 days and untreated cells were used as control (Figure 1.1i).

Immunouorescence for in vitro experiments

After treatment, SH-SY5Y cells were washed with 37°C DMEM F12 (Sigma-Aldrich) and 1x Dulbecco's phosphate buered saline (DPBS) calcium magnesium (Thermo Fisher Scientic, ON, Canada, Cat# 14040133) and xed for 20 min with 4% paraformaldehyde (PFA, Electron Microscopy Science, PA, USA, Cat# 19208) pH 7.3. Cells were washed (3 x 5 min) with 1X DPBS, permeabilized for 10 min with 0.5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, Cat# T8787-100ML) in 1X PBS, and blocked for 1 hr in 3% normal donkey serum (Sigma-Aldrich, Cat# D9663-10ML) in 1X PBS. Cells were then incubated with primary anti-Cleaved Caspase 3 antibody (Asp 175) (1 :400, Cell Signaling, ON, CA, Cat# 9661S,) or anti-huntingtin (1 :500, Millipore, CA, USA, MAB2168,) diluted in blocking solution overnight at 4°C, washed (3 x 5 min) in 1X DPBS, and incubated with Alexa 647 or Alexa 488 conjugated secondary antibody (1 :500 ; Thermo Fisher Scientic, Cat# A32733 or A32723) diluted in blocking solution for 1 hr at room temperature (RT). Cells were then stained with Phalloidin Alexa 647 or Alexa 488 (5 µl per unit, Thermo Fisher Scientic, Cat# A22287 or A12379) for 15 min, washed (3 x 5 min) and nally incubated for 1 min with 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) nuclear stain (0.022%, Thermo Fisher Scientic, Cat# D1306). Both Phalloidin and DAPI were diluted in 1x DPBS. Coverslips were mounted on glass slides in Fluoromount G (Thermo Fisher Scientic, Cat# 00-4958-02). After treatment, THP1 cells were washed with PBS (3 X 5 min) and xed for 15 min with 4% PFA pH 7.3. Cells were washed with PBS (3 x 5 min), permeabilized for 4 min with 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) and 1 % BSA in PBS, washed with PBS (3 x 5 min) and blocked for 45 min in 1% BSA in PBS. Cells were then incubated with anti-Cleaved Caspase 3 (Asp 175) (1 :400) or anti-huntingtin (1 :500) primary antibodies diluted in blocking solution overnight at 4°C, washed with PBS (3 x 5 min), and incubated in Alexa 647 or Alexa

546 (1 :500) conjugated secondary antibodies diluted in blocking solution for 1 hr at RT. Cell were then stained with DAPI and Phalloidin as described for SH-SY5Y cells.

Filter retardation assay

SH-SY5Y cells and THP1 cells were cultured as described above and plated in 6-well plates (Sarstedt, Cat# 83.3920.005). Twenty-four hrs post-plating, cells were incubated with 1 µL of 5 µg/µL mHTTExon1 brils (Tabrizi et al., 2013) or 1 µL of 1 mg/mL BSA for 5 days for SH-SY5Y and 24 hrs for THP1 cells. Cell lysis was performed on ice, after one wash with PBS at RT, adding 150 µL of RIPA buer (1% SDS) with 1% protease and phosphatase inhibitor cocktail 100x (Thermo Scientic, Cat# 78440). Samples were then sonicated for 2 X 10 seconds and resuspended with a 26G needle 5 times. After 30 min on ice, samples were centrifuged at 12,000 g for 5 min at 4°C. The lter trap assay was performed in triplicate with 50 µg of cell lysate diluted in PBS to complete a volume of 70 µL to which 30 µL of SDS :DTT mix was added (nal concentration SDS : 2%, nal concentration DTT : 100 mM). Samples were boiled at 100°C for 10 min, cooled to RT and the cellulose acetate membrane (Steriltech, WA, USA, Cat #1480025) was washed 2 X 5 min in 1% SDS in PBS prior to loading. After assembling the apparatus (HYBRI DOT Manifold, BRL Bethesda Research Laboratories, USA, Cat #1050MM), 100 µL of sample was loaded per well. After sample ltration, the membrane was washed 2X 5 min with 0.1% SDS in PBS in the ltration apparatus, removed from the apparatus, dried for 30 minutes, washed 3X5 min with 0.1% SDS in PBS and rinsed once in PBS to remove excess SDS. The membrane was then blocked with 5% BSA in PBS for 1 hr at RT, then incubated with huntingtin (1 :500, Millipore, MAB2166) or anti-huntingtin clone EM48 (1 :500, Millipore, MAB5374) in 2.5% BSA in PBS-Tween overnight at 4°C. Incubation in secondary Azure spectra 800 goat anti-mouse antibody (Azure Biosystem, CA, USA, Cat# AC2135) was performed for 45 min and membranes were visualized using Odissey CLx imaging system (LI-COR, Bad Homburg, Germany).

in vitro quantication

All quantications of photomicrographs were carried out with FIJI (ImageJ) on confocal images obtained using a 40X objective from multiple randomly selected regions across the entirety of the coverslip. Quantication of intracellular brils or conditioned media derived mHTT aggregates was performed manually and the position of brils/mHTT aggregates was conrmed using the orthogonal projection application of the software. The quantication of bril size was performed using the "measure particles" function of ImageJ. The total number of cleaved caspase 3 positive cells was obtained using the "Cell counter" plug-in of ImageJ. The length of the longest projection emerging from the cell soma (dened as the primary neurite) was measured manually for each cell. The number of cells with secondary projections was counted manually. Filter retardation assay quantications were carried out with