Diminution de l'incidence de la brûlure en plaques et modification de l'expression des gènes chez l'agrostide stolonifère par l'application d'éliciteurs

Diminution de l’incidence de la brûlure en plaques et

modification de l’expression des gènes chez l’agrostide

stolonifère par l’application d’éliciteurs

Thèse

Guillaume Grégoire

Doctorat en biologie végétale

Philosophiae doctor (Ph.D.)

Résumé

La brûlure en plaques, causée par le champignon Sclerotinia homoeocarpa, est la maladie la plus importante sur les terrains de golf en Amérique du Nord, et son contrôle repose essentiellement sur l’utilisation répétée des fongicides de synthèse. Au Québec, les gestionnaires de terrains de golf doivent trouver des méthodes alternatives de contrôle pour cette maladie afin de réduire leur utilisation de pesticides. L’utilisation d’éliciteurs des réactions de défense des plantes est une méthode peu étudiée pour diminuer l’incidence des maladies chez les graminées à gazon. L’objectif de cette thèse était de mesurer l’efficacité de ces produits et de comprendre les mécanismes impliqués dans leur mode d’action. Premièrement, nous avons mesuré l’efficacité de trois éliciteurs, (silicate de potassium, phosphite et acibenzolar-S-méthyle) pour diminuer l’incidence de la brûlure en plaques sur les terrains de golf. Nos résultats démontrent que le phosphite et, dans une moindre mesure, le silicate de potassium, peuvent réduire l’incidence de cette maladie. Par la suite, nous avons développé une méthode pour mesurer l’expression des gènes chez l’agrostide stolonifère (Agrostis stolonifera) à l’aide d’une hybridation hétérologue de l’ARN de cette dernière sur une biopuce de riz (Oryza sativa). Cette méthode nous a permis valider l’utilité de cette plateforme et de constater que l’infection de S. homoeocarpa sur l’agrostide stolonifère a pour effet de diminuer la transcription de l’ARN, l’accumulation des sucres, la synthèse des lipides et la synthèse de l’ATP, tout en augmentant la remobilisation protéique (dégradation des protéines et transport des peptides). Enfin, en utilisant cette même méthode, nous avons mesuré les effets de l’application de deux éliciteurs sur l’expression des gènes chez l’agrostide. Les résultats de cette expérience montrent que l’application de ces deux éliciteurs modifie l’expression des gènes chez l’agrostide, et particulièrement ceux impliqués dans la synthèse et la dégradation des protéines. Les deux éliciteurs ont aussi affecté l’expression de plusieurs facteurs de transcription, et de quelques gènes impliqués dans les réactions de défense. Nos résultats permettent de mieux comprendre les effets des éliciteurs sur la relation A. stolonifera- S. homoeocarpa et ouvrent la porte à d’autres expériences permettant raffiner les connaissances scientifiques sur cette maladie.

Abstract

Dollar spot, caused by Sclerotinia homoeocarpa, is the most important disease on golf courses in North America, and its control relies mostly on repeated fungicide applications. In Québec, golf course superintendents have to develop alternate control methods for this disease in order to comply with government-imposed goals of pesticide reduction. The use of elicitors to stimulate plant resistance mechanisms and reduce disease incidence has received little attention in turfgrass. The objectives of this thesis were to assess the efficacy of these products and to understand the molecular mechanisms involved in their mode of action. In order to do so, we first measured the efficacy of three elicitors (potassium silicate, phosphite and acibenzolar-S-methyl) to reduce dollar spot incidence on golf courses. Our results show that phosphite, and to some extent potassium silicate, can reduce dollar spot pressure on golf courses. We then developed a method to monitor gene expression in creeping bentgrass (Agrostis stolonifera) by using a rice (Oryza sativa) microarray in order to perform a heterologous hybridization. This technique allowed us to confirm the usefulness of this platform and to observe that, during the infection process by S. homoeocarpa, the expression of genes involved in RNA transcription, sugar accumulation, lipid synthesis and ATP synthesis are down-regulated in creeping bentgrass, while those involved in protein cycling (protein degradation and peptide transport) are up-regulated. Finally, by using this same platform, we were able to monitor gene expression in creeping bentgrass treated with either potassium silicate or phosphite, and inoculated with S. homoeocarpa. Our results indicate that both elicitors significantly affect gene expression in creeping bentgrass, and particularly those involved in protein synthesis and degradation. Both elicitors also affected the accumulation of transcripts coding for transcription factors and for a few genes involved in plant defense mechanisms. Our results allow us to gain a better understanding of the effects of elicitors on the A. stolonifera – S. homoeocarpa interaction and open up the possibility of other experiments using the same platform in order to increase our knowledge on this disease.

Table des matières

Résumé...iii

Abstract...v

Remerciements...xvii

Avant-propos...xix

Chapitre 1. Revue de la littérature...1

1.1 Introduction...3

1.2 La culture du gazon sur les terrains de golf au Québec...4

1.2.1 L’agrostide stolonifère...5

1.3 La brûlure en plaques...6

1.3.1 Agent pathogène...6

1.3.1.1 Développement et symptômes...7

1.3.1.2 Mécanismes de résistance chez A. stolonifera...7

1.3.2 Méthodes de contrôle...8 1.3.2.1 Lutte chimique...8 1.3.2.2 Lutte biologique...9 1.3.2.3 Pratiques culturales...10 1.4 Les éliciteurs...10 1.4.1 L’acibenzolar-S-méthyle...11 1.4.2 La silice...12 1.4.3 Le phosphite...13 1.4.5 Autres éliciteurs...14

1.5 Outils d’analyse transcriptomique...14

1.5.1 Les microarrays à courts oligoncléotides...15

1.5.2 Les microarrays à long oligonucléotides...15

1.5.3 Hybridations hétérologues sur des microarrays...16

1.6 Hypothèse et objectifs...17

Chapitre 2. Dollar spot incidence on golf courses as affected by three different elicitors ...19

2.1 Résumé...21

2.2 Abstract...23

2.3 Introduction...25

2.4 Material and Methods...27

2.4.1 Experimental sites...27

2.4.2 Treatments...28

2.4.3 Dollar spot incidence and statistical analysis...29

2.5 Results...29

2.5.1 Dollar Spot Incidence...29

2.5.2 Turf Visual Quality...31

2.6 Discussion...31

Chapitre 3. Heterologous hybridization of creeping bentgrass on a rice oligonucleotide array to monitor genes expressed during dollar spot infection...37

3.1 Résumé...39

3.2 Abstract...41

3.4.4 Microarray Hybridization and Analysis...46

3.4.5 Validation with real-time PCR...46

3.5 Results...47

3.5.1 RNA modifications...47

3.5.2 Signaling and hormones...48

3.5.3 Protein synthesis/degradation...48

3.5.5 Transport...48

3.5.6 Stress and Secondary metabolites...49

3.5.7 Sugar metabolism...49

3.5.8 Developmental processes...49

3.5.9 DNA modifications...50

3.5.10 Lipid metabolism...50

3.5.11 Cell wall...50

3.5.12 Energy and Photosynthesis...50

3.5.13 RT-PCR results...50

3.6 Discussion...51

Chapitre 4. Transcriptome analysis of creeping bentgrass treated with two elicitors during the infection process of S. homoeocarpa...65

4.1 Résumé...67

4.2 Abstract...69

4.3 Introduction...71

4.4 Material and Methods...73

4.4.1 Inoculum preparation...73

4.4.2 Treatments...73

4.4.3 RNA extraction and amplification...74

4.4.4 Microarray Hybridization and Analysis...75

4.4.5 Validation with real-time PCR...75

4.5 Results...76 4.5.1 Potassium silicate...76 4.5.1.1 Protein regulation...76 4.5.1.2 RNA modifications...77 4.5.1.3 Signaling...77 4.5.1.4 Miscellaneous processes...78 4.5.1.5 Transport...78 4.5.1.6 Stress...79 4.5.1.7 Cell organization...79

4.5.1.8 Cell wall synthesis/degradation...79

4.5.1.9 Secondary metabolites...80

4.5.1.10 DNA modifications...80

4.5.1.11 Hormones...80

4.5.1.12 Amino acid metabolism...80

4.5.1.13 Redox processes...80 4.5.1.14 Development...81 4.5.1.15 Lipid metabolism...81 4.4.1.16 Nucleotide metabolism...81 4.4.1.17 Vitamin metabolism...81 4.5.1.18 Mitochondrial processes...81 4.5.1.19 Glycolysis...81 4.5.1.20 C-1 metabolism...81 4.5.1.21 Sugar metabolism...82 4.5.1.22 Photosynthesis...82 4.5.2 Fosetyl-al...82 viii

4.5.2.1 Protein regulation ...82 4.5.2.2 RNA modifications...83 4.5.2.3 Signaling...83 4.5.2.4 Miscellaneous processes...84 4.5.2.5 Stress...84 4.5.2.6 Cell organization ...84 4.5.2.7 Transport...84 4.5.2.8 Secondary metabolism...85 4.5.2.9 Hormones...85 4.5.2.10 DNA modifications...85 4.5.2.11 Lipid metabolism...85 4.5.2.12 Development...86

4.5.2.13 Cell wall synthesis/degradation...86

4.5.2.14 Amino acid metabolism...86

4.5.2.15 Tricarboxylic acid cycle (TCA)...86

4.5.2.16 Sugar metabolism ...86

4.5.2.17 Nucleotide metabolism...86

4.5.2.18 ATP synthesis ...87

4.5.3 Validation of microarray results with RT-PCR...87

4.6 Discussion...87

4.7 Conclusion...90

Chapitre 5. Conclusion...113

Liste des tableaux

Chapitre 2. Dollar spot incidence on golf courses as affected by three different elicitors ...19

Table 2.1. Number of dollar spot lesions per plot (4 m2) at Parcours du Cerf – Brocard

experimental site ...34 Table 2.2. Number of dollar spot lesions per plot (4 m2) at Parcours du Cerf – Faon

experimental site ...35 Table 2.3. Number of dollar spot lesions per plot (4 m2) at Université Laval experimental site ...36

Chapitre 3. Heterologous hybridization of creeping bentgrass on a rice oligonucleotide array to monitor genes expressed during dollar spot infection...37

Table 3.1. Primer sequences used for the RT-PCR validation of microarray experiments 1 Represents the GenBank number of the Agrostis sequence used to design the primers...56 Table 3.2. Expression of genes involved in transcription significantly regulated seven days after inoculation with S. homoeocarpa...57 Table 3.3. Expression of genes involved in signaling and hormone metabolism significantly regulated seven days after inoculation with S. homoeocarpa...58 Table 3.4. Expression of genes involved in protein synthesis/degradation significantly

regulated seven days after inoculation with S. homoeocarpa...59 Table 3.5. Expression of genes involved in transport significantly regulated seven days after inoculation with S. homoeocarpa...60 Table 3.6. Expression of genes involved in stress and secondary metabolites pathways

significantly regulated seven days after inoculation with S. homoeocarpa...61 Table 3.7. Expression of genes involved in sugar metabolism and developmental processes significantly regulated seven days after inoculation with S. homoeocarpa...62 Table 3.8. Expression of genes involved in DNA metabolism, lipid metabolism, cell wall metabolism, energy, and photosynthesis significantly regulated seven days after inoculation with S. homoeocarpa...63 Table 3.9. Quantitative PCR validation of the microarray results, and sequence homology between rice and creeping bentgrass for the selected genes ...64

Chapitre 4. Transcriptome analysis of creeping bentgrass treated with two elicitors during the infection process of S. homoeocarpa...65

Table 4.1. Expression of genes involved in protein regulation differentially expressed in silicon-amended plants infected with S. homoeocarpa...93 Table 4.2. Expression of genes involved in RNA modifications differentially expressed in silicon-amended plants infected with S. homoeocarpa...95 Table 4.3. Expression of genes involved in signaling differentially expressed in

silicon-amended plants infected with S. homoeocarpa...96 Table 4.4. Expression of genes involved in miscellaneous processes differentially expressed in silicon-amended plants infected with S. homoeocarpa...97 Table 4.5. Expression of genes involved in transport and stress differentially expressed in silicon-amended plants infected with S. homoeocarpa...98 Table 4.6. Expression of genes involved in cell organization, cell wall synthesis/degradation, and secondary metabolism differentially expressed in silicon-amended plants infected with S. homoeocarpa...99

Table 4.8. Expression of genes involved in different pathways differentially expressed in silicon-amended plants infected with S. homoeocarpa...101 Table 4.9. Expression of genes involved in protein regulation differentially expressed in fosetyl-al amended plants infected with S. homoeocarpa...102 Table 4.10. Expression of genes involved in RNA modifications differentially expressed in fosetyl-al amended plants infected with S. homoeocarpa...103 Table 4.11. Expression of genes involved in signaling differentially expressed in fosetyl-al amended plants infected with S. homoeocarpa...104 Table 4.12. Expression of genes involved in miscellaneous processes differentially expressed in fosetyl-al amended plants infected with S. homoeocarpa...105 Table 4.13. Expression of genes involved in stress responses differentially expressed in fosetyl-al amended plants infected with S. homoeocarpa...106 Table 4.14. Expression of genes involved in cell organization and transport differentially expressed in fosetyl-al amended plants infected with S. homoeocarpa...107 Table 4.15. Expression of genes involved in secondary metabolism, hormone metabolism, and DNA modifications differentially expressed in fosetyl-al amended plants infected with S. homoeocarpa...108 Table 4.16. Expression of genes involved in different pathways differentially expressed in fosetyl-al amended plants infected with S. homoeocarpa...109 Table 4.17. Quantitative PCR validation of the microarray results, and sequence homology between rice and creeping bentgrass for the selected genes ...110

Liste des figures

Chapitre 3. Heterologous hybridization of creeping bentgrass on a rice oligonucleotide array to monitor genes expressed during dollar spot infection...37

Figure 3.1. Wheat seed inoculated with S. homoeocarpa and dollar spot symptoms on creeping bentgrass prior to leaf harvest (7 days after inoculation)...54 Figure 3.2. Functional classification of genes significantly regulated in creeping bentgrass inoculated with S. homoeocarpa...55

Chapitre 4. Transcriptome analysis of creeping bentgrass treated with two elicitors during the infection process of S. homoeocarpa...65

Figure 4.1. Functional classification of genes significantly regulated in silicon-amended creeping bentgrass inoculated with S. homoeocarpa ...91 Figure 4.2. Functional classification of genes significantly regulated in phosphite-amended creeping bentgrass inoculated with S. homoeocarpa...92

À mon oncle Pierre Faucher, Qui m’a fait découvrir l’agriculture Et qui nous a quitté trop tôt…

Remerciements

J’aimerais d’abord remercier mon directeur de thèse, le Dr. Yves Desjardins pour son soutien tout au long de la réalisation de cette thèse. Ce travail n’aurait pas pu être complété sans son soutien inconditionnel et ses conseils judicieux. Il m’a aussi permis de travailler sur d’autres projets en parallèle, ce qui m’a permis d’approfondir des connaissances qui me seront utiles pour le reste de ma carrière.

J’aimerais ensuite remercier mon ami et collègue Éric Dugal pour son aide lors des essais en champs et pour son support moral tout au long de cette aventure. Merci aussi à mes collègues de laboratoire, et particulièrement Jean-François Dubuc, pour m’avoir appris les techniques nécessaires à la conduite de mes expériences. Merci aussi à M. Jean Tremblay, président du Groupe Vertdure, pour son soutien financier à ce projet. À tous mes collègues de la FIHOQ, merci pour votre support moral et pour votre compréhension.

Un tel projet n’aurait pas pu être réalisé sans le soutien de ma famille. Merci à mes parents qui m’ont toujours supporté financièrement et moralement dans mes études. Merci aussi à mes beaux parents pour leur support moral et leurs encouragements.

Enfin, un merci tout spécial à ma conjointe Joëlle pour son amour qui nous a donné trois enfants merveilleux. Merci aussi pour ta présence, ton support, et ta patience pendant toutes ces années.

Avant-propos

Cette thèse est présentée sous forme d’articles scientifiques afin de faciliter la publication de ceux-ci dans des revues savantes. Ma contribution pour chacun de ces articles se détaille ainsi :

Chapitre 2: Dollar spot incidence on golf courses as affected by three different elicitors

Pour cette expérience, j’ai élaboré le dispositif expérimental, déterminé les traitements et trouvé les trois sites expérimentaux. En collaboration avec des auxiliaires de recherche, j’ai établi les parcelles expérimentales, appliqué les traitements et collecté les données tout au long de l’expérience. J’ai enfin analysé les données à l’aide d’outils statistiques et j’ai rédigé l’article sous la supervision de mon directeur de thèse, Dr. Yves Desjardins.

Chapitre 3 : Heterologous hybridization of creeping bentgrass on a rice oligonucleotide array to monitor genes expressed during dollar spot infection

Dans cette expérience, j’ai semé et fait pousser les plantes dans les chambres de croissance, et j’ai mis le champignon en culture avant d’inoculer ce dernier sur les plantes. J’ai récolté les échantillons de feuilles, fait les extractions d’ARN et marqué celui-ci avec les fluorophores. Les hybridations sur la biopuce ont été effectuées au « ArrayCore facility » de l’Université de la Californie à Davis. J’ai effectué les analyses statistiques à partir des données brutes obtenues et j’ai rédigé l’article sous la supervision du Dr. Yves Desjardins.

Chapitre 4 : Transcriptome analysis of creeping bentgrass treated with two elicitors during the infection process of S. homoeocarpa

Dans cette expérience, j’ai semé et fait pousser les plantes dans les chambres de croissance, et j’ai mis le champignon en culture avant d’inoculer ce dernier sur les plantes. J’ai aussi planifié les traitements et appliqué ceux-ci pendant toute la durée de l’expérience. J’ai récolté les échantillons de feuilles, fait les extractions d’ARN et marqué celui-ci avec les fluorophores. Les hybridations sur la biopuce ont été effectuées au « ArrayCore facility »

Les travaux présentés dans cette thèse ont été financés en partie par le Conseil de Recherche en Sciences Naturelles et en Génie du Canada (CRSNG) et par le Groupe Vertdure dans le cadre du Programme de bourses d’études supérieures à incidence industrielle.

1.1 Introduction

Au Québec, les gestionnaires de terrains de golf doivent produire à chaque 3 ans un plan de réduction des pesticides signé par un agronome. Cette mesure, unique en Amérique du Nord, vise à inciter les surintendants de terrains de golf à adopter des méthodes alternatives de contrôle des ravageurs, ou à choisir des pesticides moins nocifs pour la santé humaine et l’environnement. Cependant, il existe peu d’information scientifique sur l’efficacité des méthodes de contrôle alternatives sous les conditions climatiques québécoises. Les surintendants doivent donc se fier aux données fournies par les représentants qui vendent les différents produits, ou aux données provenant d’autres régions, qui ne sont pas forcément représentatives de la réalité québécoise.

Parmi les pesticides utilisés sur les terrains de golf, les fongicides représentent, de loin (82,2% des produits appliqués), la classe de produits la plus utilisée par les surintendants québécois (Laverdière et al., 2010). Les maladies les plus souvent rencontrées sur les terrains de golf sont, en ordre décroissant, les moisissures nivéales (Microdochium nivale (Fr.) Samuels & Hallett et Typhula sp.), la brûlure en plaques (Sclerotinia homoeocarpa F.T. Bennett), et la plaque brune (Rhizoctonia solani Kuhn) (Laverdière et al., 2010). Bien que la brûlure en plaques ne soit pas la maladie la plus fréquente sur les terrains de golf, le fait qu’elle puisse survenir tout au long de la saison de croissance fait en sorte que de nombreuses applications de fongicides sont souvent nécessaires pour la contrôler. À l’échelle nord-américaine, cette maladie est considérée comme le plus important fléau des terrains de golf, et on estime que les montants investis pour lutter contre celle-ci sont plus importants que pour toute autre maladie (Walsh et al., 1999).

alternatives, l’utilisation d’éliciteurs, des molécules qui stimulent l’activation des réactions de défense dans la plante, a été relativement peu étudiée dans un contexte de lutte aux maladies sur les terrains de golf. Du point de vue plus fondamental, malgré l’importance de la brûlure en plaques, il existe peu d’études portant sur les mécanismes moléculaires mis en place par la plante lors de l’infection par le champignon causant cette maladie. Cette thèse vise donc à contribuer à l’avancement des connaissances scientifiques sur l’efficacité des éliciteurs pour réduire l’incidence de la brûlure en plaques sur les terrains de golf et sur l’expression des gènes de l’agrostide stolonifère (Agrostis stolonifera L.) pendant l’infection par l’agent pathogène S. homoeocarpa.

1.2 La culture du gazon sur les terrains de golf au

Québec

La province de Québec compte 358 terrains de golf, répartis dans 17 régions administratives (Laverdière et al., 2010). Ces terrains occupent une superficie totale de plus de 10 000 hectares, et ils sont principalement concentrés dans les régions périphériques à la métropole, soit les Laurentides et la Montérégie. On estime que le Québec compte 1,14 millions de golfeurs, et que les retombées économiques directes, indirectes et secondaires de cette activité sont de plus de 5 milliards de dollars (Strategic Networks Groups Inc., 2009).

La courte hauteur de tonte du gazon et les blessures causées par le passage fréquent de la machinerie créent un environnement propice au développement de maladies fongiques sur les terrains de golf. Les fongicides y sont donc utilisés de façon plus importante que les autres classes de pesticides. Au Québec, on applique annuellement en moyenne 36 162 kg d’ingrédient actif (kg i.a.) de fongicides sur l’ensemble des terrains de golf, comparativement à 1906 kg i.a. d’insecticides et 5842 kg i.a. d’herbicides (Laverdière et al., 2010). Ces applications sont surtout concentrées sur les verts de golf, qui représentent moins de 2% de la superficie des terrains (Beard, 2002). D’ailleurs, il est important de noter

que 11% des terrains de golf utilisent près de 45% des pesticides appliqués au Québec (Laverdière et al., 2010); ces terrains sont probablement des terrains haut de gamme ayant des budgets permettant des applications sur l’ensemble des surfaces de jeu. Enfin, les pesticides appliqués sur les terrains de golf ne comptent que pour 0,87% de l’ensemble des pesticides utilisés au Québec (Gorse et Rivard, 2011).

1.2.1 L’agrostide stolonifère

L’agrostide stolonifère (Agrostis stolonifera L.) est l’espèce la plus utilisée sur les verts de golf en Amérique du Nord (Beard, 2002). Cette espèce fait partie de la grande famille des graminées, et est classée dans la sous-famille des Pooideae et dans la tribu des Aveneae (Casler and Duncan, 2003). L’agrostide stolonifère est une plante allotétraploïde (2n=4x=28) qui serait originaire d’un croisement entre l’agrostide des chiens (Agrostis canina L.) et une autre espèce encore inconnue (Rotter et al., 2010).

La tolérance de l’agrostide stolonifère aux tontes très courtes (aussi court que 3 mm), sa production de stolons et sa texture fine en font l’espèce idéale pour les verts de golf. L’agrostide est utilisée à cet effet en Amérique du Nord depuis le début des années 1900, alors que les surintendants utilisaient alors un mélange d’espèces importées d’Europe (South german bentgrass mix) composé d’un mélange d’agrostide stolonifère, d’agrostide coloniale (Agrostis capillaris L.), d’agrostide blanche (Agrostis alba L.) et d’agrostide des chiens (Casler and Duncan, 2003). Bien que semées en mélange, ces espèces se différenciaient éventuellement en plaques distinctes formées par une seule espèce. En sélectionnant les espèces les plus intéressantes du point de vue visuel dans ces plaques et en les reproduisant de façon végétative, la section verte de la USGA (United States golf Association) a crée une des premières séries de cultivar d’agrostide stolonifère (Casler and Duncan, 2003). Cependant, la seule façon d’implanter ces cultivars sur des surfaces de jeu était en utilisant la propagation végétative, par exemple à partir des stolons. Vers le milieu

semences. Ce cultivar, nommé Penncross, a été utilisé pendant plus de 30 ans sur les terrains de golf partout dans le monde, et a pavé la voie au développement de plusieurs autres cultivars d’agrostide stolonifère (Casler and Duncan, 2003). Les cultivars d’agrostide stolonifère développés dans les dernières années ont généralement une très haute densité de tiges et une résistance améliorée à certaines maladies, dont la brûlure en plaques (Dernoeden, 2012).

1.3 La brûlure en plaques

La brûlure en plaques, causée par le pathogène Sclerotinia homoeocarpa, est une des maladies fongiques les plus importantes sur les terrains de golf en Amérique du Nord (Walsh et al., 1999). Cette maladie affecte non seulement l’apparence visuelle du gazon, mais elle dégrade aussi de façon considérable les conditions de jeu. Elle se développe surtout sur les gazons à haut entretien, comme les verts et les allées de terrain de golf, mais on peut aussi la trouver sur des terrains résidentiels ou des terrains sportifs.

1.3.1 Agent pathogène

Malgré le fait que le pathogène causant la brûlure en plaques soit actuellement désigné comme Sclerotinia homoeocarpa, la classification taxonomique de ce champignon est controversée (Walsh et al., 1999). Bennett fut le premier à identifier ce champignon et à proposer sa classification comme Sclerotinia homoeocarpa (Bennett, 1937). Dès 1945, la description de la famille des Sclerotiniaceae a pour effet d’exclure S. homoeocarpa de celle-ci, puisque ce champignon ne semble pas produire de sclérotes (Kohn, 1979; Walsh et al., 1999). Depuis, on a proposé de classer ce pathogène dans le genre Rustroemia, Lanzia, et Moellerodiscus (Walsh et al., 1999; Powell et Vargas, 2007). La difficulté de classifier correctement cet agent pathogène provient en partie du fait qu’il est très rare d’observer ses apothèques fertiles (Walsh et al., 1999).

1.3.1.1 Développement et symptômes

On croit que S. homoeocarpa passe l’hiver sous forme de mycélium dans les tissus et les couronnes infectés. La colonisation des tissus se fait surtout par la pénétration des hyphes par les blessures et par les stomates. Des lésions jaunes aux bordures foncées, ayant une forme caractéristique de sablier, se développeront alors sur les feuilles infectées. Le pathogène peut ensuite coloniser les feuilles saines à proximité et ce, jusqu’à former des lésions d’environ 5 cm de diamètre (Smiley et al., 2005). Le transport du pathogène sur de longues distances s’effectue surtout par le déplacement du matériel infecté, par exemple par la machinerie, les résidus de tonte ou les souliers de golf. Les températures entre 15 et 25 °C ainsi que la présence d’eau de façon prolongée sur les feuilles favorise le développement de cette maladie (Smiley et al., 2005). La production de conidies et d’ascospores par S. homoeocarpa n’a été observée que très rarement en nature; on croit donc que ces propagules ne contribuent pas de façon significative à la dissémination du pathogène (Smiley et al., 2005).

1.3.1.2 Mécanismes de résistance chez A. stolonifera

Malgré l’importance économique de la brûlure en plaques, peu d’études ont porté sur l’expression des gènes de l’agrostide stolonifère pendant le processus d’infection par S. homoeocarpa. Des essais en champs ont démontré que les différents cultivars d’agrostide stolonifère ont une résistance variable à la brûlure en plaques (Abernathy et al., 2001). Des efforts d’amélioration génétique ont permis de constater que la résistance à la brûlure en plaques est une caractéristique transmise de façon quantitative, selon un modèle de dominance additive, et qu’elle est régie par un minimum de deux à cinq gènes (Bonos et al., 2003; Bonos, 2011). Une région génomique (quantitative trait locus, ou QTL) associée à la résistance à la brûlure en plaques a été identifiée (Chakraborty et al., 2006), mais on ne connaît pas encore les gènes qui se situent dans cette région. Des observations phénotypiques ont permis d’identifier des caractéristiques des individus plus résistants à la

Une autre étude a permis d’identifier, chez trois espèces d’agrostide, des séquences d’ARN messager exprimées de façon constitutive similaires à celles exprimées par des gènes de résistance chez d’autres espèces de graminées (Budak et al., 2006). Les protéines associées à ces ARNm étaient pour la plupart de type NBS-LRR (nucleotide-binding site – leucin-rich repeat) (Budak et al., 2006), mais leurs fonctions précises n’ont pas été déterminées.

Des croisements entre l’agrostide stolonifère et l’agrostide coloniale (Agrostis capillaris L.), une autre espèce qui possède une résistance élevée à la brûlure en plaques, a permis de produire des lignées hybrides possédant une résistance élevée à cet agent pathogène (Belanger et al., 2004). Les auteurs de cette dernière étude n’ont cependant pas étudié les gènes responsables de cette résistance accrue.

Enfin, des chercheurs ont réussi à créer des plants d’agrostide transgéniques exprimant une protéine antifongique du riz (Fu et al., 2005) ou une protéine de type PR5 (pathogenesis-related 5) (Guo et al., 2003). Ces plants présentaient une résistance plus élevée à la brûlure en plaques que les plants témoins dans des essais au champ. Cependant, il n’existe toujours pas d’agrostide stolonifère génétiquement modifiée sur le marché, notamment à cause des problèmes de dérive génique rencontrés lors d’essais de production d’agrostide résistante au glyphosate (Watrud et al., 2004).

1.3.2 Méthodes de contrôle

1.3.2.1 Lutte chimique

De façon générale, la brûlure en plaques est contrôlée par des applications de fongicides sur les terrains de golf. On estime d’ailleurs qu’à l’échelle nord-américaine, plus de fongicides sont appliqués pour contrôler cette maladie que pour toute autre maladie des graminées à gazon (Vargas, 1994). Au Canada, on compte présentement sept matières actives homologuées pour lutter contre la brûlure en plaques sur les terrains de golf : le 8

chlorothalonil, l’iprodione, le thiophanate-methyl, le propiconazole, le triticonazole, le boscalid, et le myclobutanil. Trois de ces molécules (triticonazole, propiconazole et myclobutanil) appartiennent à la famille des inhibiteurs de la déméthylation (DMI). Les applications répétées de fongicides pour lutter contre la brûlure en plaques ont provoqué l’apparition de résistance à presque toutes ces molécules, à l’exception du boscalid et du chlorothalonil (Warren, 1974; Burpee, 1997; Hsiang et al., 1997; Koch et al., 2009; Ok et al., 2011).

1.3.2.2 Lutte biologique

Certaines approches de lutte biologique ont démontré des effets intéressants sur l’incidence de S. homoeocarpa sur les terrains de golf. Par exemple, l’utilisation de composts, sous forme d’engrais, de terreautage, ou d’application liquide (thés de compost) a permis de diminuer le développement de la maladie (Nelson and Craft, 1991; Davis and Dernoeden, 2002; Grégoire, 2005). L’utilisation de la souche Tx-1 de la bactérie Pseudomonas aureofaciens, qui produit le composé antibiotique acide phénazine-1-carboxylique (APC) a démontré un certain potentiel pour diminuer l’incidence de la brûlure en plaques. L’injection de cette bactérie dans le système d’irrigation a permis de diminuer l’incidence de la brûlure en plaques lorsque la pression de la maladie était faible (Davis et Dernoeden, 2001; Hardebeck et al., 2004). L’application de l’APC purifiée, quant à elle, a permis de diminuer l’incidence de la maladie de façon comparable à un fongicide (chlorothalonil) dans des essais en serre et en champ (Powell et al., 2000). Une autre approche de lutte biologique qui a été étudiée est l’utilisation de souches hypovirulentes de S. homoeocarpa. Ces dernières sont des souches du champignon qui ont une capacité réduite de causer la maladie. Puisque cette hypovirulence est souvent associée à la présence d’un brin d’ARN double brin (dsRNA), ce caractère peut être transmis d’une souche à l’autre et ainsi diminuer la virulence de souches autrement dommageables (MacDonald and Fulbright, 1991). À partir d’une banque de 132 souches de S. homoeocarpa provenant du Canada et

mises en contact avec des souches virulentes, ces dernières ont intégré le fragment de dsRNA et sont devenues hypovirulentes (Zhou and Boland, 1997). Dans des essais en chambre de croissance et en champ, l’application d’une formulation contenant des souches hypovirulentes sur des plantes infectées avec des souches virulentes a permis de diminuer l’incidence de la maladie d’environ 50% et ce, jusqu’à 1 an après l’inoculation (Zhou and Boland, 1998).

1.3.2.3 Pratiques culturales

Bien que celles-ci ne soient pas aussi efficaces que l’utilisation des fongicides, certaines pratiques culturales peuvent diminuer l’incidence de la brûlure en plaques. Par exemple, puisque S. homoeocarpa nécessite un milieu humide pour se propager, l’enlèvement de l’eau de guttation et de la rosée accumulée sur le feuillage le matin permet de réduire le développement de la maladie (Williams et al., 1996; Ellram et al., 2007). Cette opération peut s’effectuer par la tondeuse, lors de la tonte matinale, ou par l’enlèvement de l’eau en frottant les feuilles avec un équipement spécialisé; cette dernière méthode serait cependant moins efficace que la tonte pour réduire l’incidence de la maladie (Ellram et al., 2007). La fertilisation, et plus particulièrement l’apport d’azote rapidement disponible, peut aussi diminuer l’incidence de la brûlure en plaques (Landschoot and McNitt, 1997; Davis and Dernoeden, 2002).

1.4 Les éliciteurs

Contrairement aux fongicides, les éliciteurs ne sont pas des molécules antifongiques, mais plutôt des molécules qui stimulent les réactions de défense des plantes en absence de pathogène (Vallad et Goodman, 2004). Ainsi, lorsque le pathogène entre en contact avec la plante, elle a déjà activé des mécanismes de défense, ce qui lui permet de mieux résister à l’infection. Plusieurs de ces molécules ont été développées, et commercialisées, mais elles ne sont pas toutes disponibles sur le marché canadien.

1.4.1 L’acibenzolar-S-méthyle

L’acibenzolar-S-méthyle (aussi appelé benzothiadazole ou BTH) est le premier éliciteur commercial à avoir été développé et mis en marché (Lawton et al., 1996). Cette molécule est un analogue de l’acide salycilique, qui induit la résistance systémique acquise chez les plantes, en absence de pathogène (Gorlach et al., 1996; Maleck et al., 2000). En traitant les plantes avec cette molécule avant que le pathogène ne soit présent, on active les réactions de défense, et celles-ci peuvent donc mieux se défendre lorsque le pathogène se présente (Sticher et al., 1997; Conrath et al., 2002). Parmi les gènes ou les enzymes stimulés par cette molécule, on retrouve des protéines PR (pathogenesis-related), la péroxidase, la glutathione-S-transférase, la superoxide-dismutase, et la phénylalanine ammonia-lyase (Lin et al., 2009). L’application de l’acibenzolar–S-méthyle de façon prophylactique a permis d’induire la résistance systémique acquise chez plusieurs espèces de plantes et de diminuer l’incidence de plusieurs maladies fongiques et bactériennes, et même de certaines maladies virales (Oostendorp et al., 2001; Vallad and Goodman, 2004). Peu de recherches ont porté sur l’utilisation de l’acibenzolar–S-méthyle sur le gazon. Une étude menée sur un vert en agrostide stolonifère a permis de constater une réduction de 38% du nombre de lésions de la brûlure en plaques sur les parcelles traitées avec l’acibenzolar–S-méthyle (Lee et al., 2003a). Cependant, cette réduction n’a pas été suffisante pour maintenir la qualité du gazon à un niveau acceptable selon les critères établis par les chercheurs. Dans une autre étude menée par le même groupe de recherche, l’acibenzolar–S-méthyle a permis de diminuer l’incidence de la brûlure en plaques sur trois cultivars d’agrostide stolonifère peu tolérants à cette maladie (‘Crenshaw’, ‘Penncross’ et ‘Providence’), mais n’a pas permis de réduire l’incidence de la maladie sur un cultivar modérément résistant (‘L-93’) (Lee et al., 2003a). Enfin, l’utilisation de l’acibenzolar–S-méthyle a permis de réduire de 26% l’incidence de la brûlure en plaques sur un vert d’agrostide stolonifère, mais cette réduction n’a pas permis d’améliorer de façon constante la qualité visuelle du vert comparativement au témoin non traité (Zhang et al., 2005).

1.4.2 La silice

La silice est un des éléments les plus abondants sur la terre. Les plantes peuvent absorber cet élément sous forme d’acide monosilicique, qui est ensuite transporté dans les différents organes par le flux de transpiration. La silice peut s’accumuler sous forme de polymères (SiO2  nH2O) lorsque sa concentration est suffisamment élevée (Fauteux et al., 2005). On

connaît depuis plusieurs années l’efficacité de la silice pour diminuer l’incidence des maladies fongiques. Cependant, les mécanismes responsables de ce phénomène ne sont pas encore totalement compris. Deux hypothèses majeures ont été proposées pour expliquer le rôle protecteur de la silice chez les plantes : un rôle mécanique qui implique la formation d’une barrière physique empêchant la pénétration des agents pathogènes, et un rôle biochimique qui stimulerait la mise en place des réactions de défense (Fauteux et al., 2005). Par exemple, la silice stimulerait l’accumulation de composés phénoliques et de phytoalexines, ainsi que l’activité de la chitinase et de la peroxidase (Chérif et al., 1994; Bélanger et al., 2003; Rodrigues et al., 2005). Une étude portant sur l’expression génique chez des plants d’Arabidopsis infectés avec le blanc (Erysiphe cichoracearum DC), a mis en lumière certaines caractéristiques de ce rôle biochimique, puisque l’ajout de silice a permis d’alléger l’effet du détournement des ressources causé par ce pathogène obligatoire en diminuant le nombre de gènes exprimés suite à l’infection (Fauteux et al., 2006). Cependant, dans cette même étude, la silice appliquée en absence de pathogène a uniquement affecté l’expression de deux gènes sur les quelques 40 000 étudiés. Cependant, une autre étude a démontré que chez le riz (Oryza sativa L.), l’apport de silice en absence de pathogène a stimulé l’expression de 221 gènes, dont 28 impliqués dans les réactions de défense (Brunings et al., 2009). En plus de ces résultats portant sur les effets physiologiques de l’apport en silice, on a démontré que l’application de cette dernière diminue l’incidence de certaines maladies chez plusieurs monocotylédones (Datnoff et al., 2001) et dicotylédones (Fawe et al., 2001). Les résultats des quelques essais avec la silice sur les gazons ont donné jusqu’à maintenant des résultats contradictoires. Par exemple, l’ajout d’un amendement contenant de la silice a permis de réduire significativement l’incidence de la tache grise (Magnaporthe oryzae Couch) sur le ray-grass vivace (Lolium

perenne L.) (Nanayakkara et al., 2008). Un autre étude portant sur l’agrostide stolonifère a permis de constater une diminution significative de la brûlure en plaques (environ 30%) pour une des deux années de l’expérimentation (Uriarte et al., 2005). Enfin, Zhang et al. (2006) n’ont observé aucun effet de la silice sur l’incidence de la brûlure en plaques, et ont plutôt observé une augmentation de la plaque brune (Rhizoctonia solani Kühn) dans les parcelles amendées avec la silice.

1.4.3 Le phosphite

Le phosphore est un des trois éléments majeurs essentiels à la croissance des plantes. On le retrouve en nature sous forme de composés ayant divers degrés d’oxydation (McDonald et al., 2001). C’est sous la forme la plus oxydée (acide phosphorique, ou HPO42-) que le

phosphore est absorbé par les plantes pour être utilisé par les différentes fonctions métaboliques. Cependant, une forme plus réduite de phosphore peut aussi être utilisée sur les plantes agricoles, le phosphite (acide phosphoreux, H2PO3-). Le phosphite peut aussi être

absorbé par la plante, mais contrairement à l’acide phosphorique, l’acide phosphoreux ne peut pas interagir avec les enzymes qui intègrent le phosphore au métabolisme de la plante (Thao et Yamakawa, 2009). De plus, malgré le fait que le phosphite puisse être converti en phosphate de façon naturelle dans les sols, ce processus se fait de façon trop lente pour être considéré significatif du point de vue agronomique (McDonald et al., 2001). Pour ces raisons, le phosphite n’est pas considéré comme un fertilisant, et ne peut être vendu comme tel au Canada (Agence canadienne d’inspection des aliments, 2009). Cependant, le phosphite est aussi reconnu comme une molécule ayant des effets antifongiques, et est particulièrement efficace contre les oomycètes (McDonald et al., 2001; Thao and Yamakawa, 2009; Silva et al., 2011). Le fongicide fosetyl-Al, commercialisé au Canada sous le nom Aliette® _{fait d’ailleurs partie de la famille des phosphonates, qui sont des}

phosphites possédant un lien chimique C-P. Le mode d’action complexe du phosphite n’est pas encore entièrement compris, mais ce produit aurait à la fois un effet antifongique direct, et un effet indirect en stimulant les réactions de défense des plantes (Hillebrand et al.,

protéase (Eshraghi et al., 2011; Olivieri et al., 2012). Sur le gazon, des essais ont démontré un contrôle de la brûlure pythienne (causée par Pythium aphanidermatum (Edson) Fitzp) à l’aide de produits contenant des phosphites (Datnoff et al., 2004, 2005; Cook et al., 2009). Dans une étude portant sur la brûlure en plaques, Vincelli et Dixon (2005) ont démontré que des programmes de fongicides qui incluent des phosphites peuvent diminuer l’incidence de cette maladie; cependant, l’utilisation de phosphite sans autres fongicides n’a pas été évaluée dans cette étude. Enfin, l’utilisation de phosphite a aussi permis de diminuer l’incidence des moisissures nivéales dans des essais en serre, et en champ (Dempsey, 2009).

1.4.5 Autres éliciteurs

Récemment, on a vu apparaître sur le marché canadien un fongicide à faible impact dont la matière active est une huile minérale. Ce produit, commercialisé sous le nom de Civitas™ et homologué pour un usage sur les gazons, agirait en stimulant les réactions de défense de la plante (Cortes-Barco et al., 2010). La seule étude ayant porté sur les gènes stimulés par ce produit a permis d’identifier un gène impliqué dans la voie de synthèse de l’acide jasmonique, qui est surexprimé suite à l’application de cet éliciteur (Cortes-Barco et al., 2010).

D’autres molécules ont été identifiées comme des éliciteurs chez les plantes. Plusieurs de celles-ci sont des molécules d’origine microbienne, comme des oligosaccharides ou des protéines. Cependant, peu de recherches ont porté sur l’effet de ces molécules sur les graminées à gazon.

1.5 Outils d’analyse transcriptomique

L’analyse du transcriptome des plantes est une méthode permettant de caractériser et de quantifier l’expression des gènes à un moment précis, par exemple pour un stade physiologique donné ou suite à un traitement. Cette méthode d’analyse puissante a connu un essor phénoménal dans les 10 dernières années, et plusieurs plateformes d’analyse

transcriptomiques ont été développées. Une des méthodes les plus répandues est la biopuce (aussi appelée Microarray), qui existe sous deux formes principales : les microarrays à courts oligonucléotides (type « Affymetrix ») ou à long nucléotides (type « Agilent »).

1.5.1 Les microarrays à courts oligoncléotides

Ce type de microarray est aussi connu sous le nom de biopuces de type « Affymetrix ». La création de ces puces fait appel à un processus où les nucléotides sont liés à un groupement photolabile qui empêche l’élongation lors de la synthèse. En utilisant un masque permettent d’exposer uniquement certains nucléotide à la lumière, il est possible de créer de toutes pièces des oligonucléotides, généralement d’une longueur de 25 paires de base (pb) (Dufva, 2005). Ces séquences d’oligonucléotides sont généralement disposées en ensembles de 11 à 20 paires de sondes (appelé « probe sets ») ayant pour cible une même séquence d’intérêt. Chaque paire de sonde est formé d’une sonde parfaite (« perfect match » ou PM), qui correspond à une séquence sur le gène d’intérêt, et d’une sonde imparfaite (« mismatch » ou MM) dont le 13e _{nucléotide est modifié afin de ne pas hybrider au gène d’intérêt, ce qui}

permet de mesurer le niveau d’hybridation non-spécifique (Irizarry et al., 2003). Ce type de microarray permet de produire des biopuces à très haute densité et dont les résultats sont hautement reproductibles (Hardiman, 2004; Dufva, 2005). Cependant, leur fabrication demande des installations spécialisées, et le fait que plusieurs sondes doivent être utilisées pour mesurer une même séquence limite la couverture du génome que l’on peut obtenir avec cette technologie. Pour ces raisons, ce type de biopuce est généralement considéré moins flexible que les puces à longs oligonucléotides (Skibbe and Walbot, 2009).

1.5.2 Les microarrays à long oligonucléotides

Ce type de microarray est constitué d’un ensemble de points (spots) d’ADN placés sur une lamelle de verre. Cet ADN peut être consititué d’ADNc ou d’oligonucléotides produits par

microarrays une meilleure tolérance pour la présence de bases non homologues sur les fragments (Hardiman, 2004). Il est possible de produire, grâce à cette technologie, des puces sur mesures contenant des séquences d’ADN ciblées par les chercheurs, puisque l’équipement nécessaire à leur production est beaucoup moins complexe que celui utilisé pour les puces à courts oligonucléotides (Barrett and Kawasaki, 2003). Cependant, les données obtenues à partir de ce type de microarray sont généralement moins reproductibles que celles obtenues à partir de biopuces commerciales à courts oligonucléotides (Reyniès et al., 2006; Kuo et al., 2006).

1.5.3 Hybridations hétérologues sur des microarrays

De façon générale, les microarrays destinées à être utilisées pour mesurer l’expression des gènes chez une espèce précise. Cependant, pour les espèces moins bien caractérisées du point de vue génétique, il n’est pas toujours possible d’obtenir ou de fabriquer des biopuces spécifiquement conçues pour l’espèce que l’on désire étudier. Dans cette situation, il est toutefois possible de faire une hybridation hétérologue en mettant en contact l’ADN extrait de l’espèce ciblée avec une biopuce d’une espèce plus ou moins apparentée (Horvath et al., 2003). Par exemple, dans une étude portant sur le stress hydrique chez la banane (Musa sp.), Davey et al. (2009) ont utilisé une biopuce Affymetrix® de riz (Oryza sativa L.) contenant 24 000 gènes. En se basant sur une limite minimale de fluorescence pour confirmer l’hybridation, ces chercheurs ont estimé que 16% des gènes de banane pouvaient être quantifiés à l’aide de la biopuce de riz. Dans une autre étude (Bagnaresi et al., 2008), des chercheurs ont utilisé une biopuce de tomate (Solanum lycopersicum L.) pour mesurer l’expression des gènes chez la pomme de terre (Solanum tuberosum L.) pendant la maturation des tubercules à l’aide d’une puce de type Affymetrix®. Afin de limiter les mesures d’expression des gènes aux sondes les plus pertinentes, ils ont préalablement effectué une recherche de type BLAST avec les 10 000 sondes présentes sur la biopuce sur la banque de ESTs (expressed sequence tags) de la patate, et n’ont conservé pour analyse que les sondes dont l’homologie était supérieure à 70%, soit près de 67% des sondes présentes sur la biopuce (Bagnaresi et al., 2008). Enfin, dans une étude portant sur la

réponse des fraises (Fragaria x ananassa) à des concentrations élevées en CO2 pendant

l’entreposage, Ponce-Valadez et al. (2009) ont plutôt utilisé des biopuces à cDNA de tomate. En se basant sur une limite minimale de fluorescence (1,5 fois la fluorescence de l’arrière-plan), ils ont déterminé que près de 10% des séquences présentes sur la puce résultaient en une hybridation avec une séquence de la fraise. Ces travaux démontrent qu’il est possible d’utiliser des biopuces d’une espèce autre que l’espèce d’intérêt afin de mesurer l’expression des gènes chez cette dernière, mais que cette méthode permet une moins grande couverture du transcriptome qu’une hybridation homologue. Néanmoins, pour des espèces pour lesquelles peu d’information génétique est disponible, comme l’Agrostide stolonifère, même une couverture partielle du transcriptome peut contribuer significativement à l’avancement des connaissances sur cette espèce.

1.6 Hypothèse et objectifs

L’hypothèse principale de cette thèse est que l’application d’éliciteurs sur l’agrostide stolonifère affecte significativement l’expression des gènes et diminue l’incidence de la brûlure en plaques. Plus spécifiquement, les objectifs de mes travaux sont :

D’évaluer les effets de différents éliciteurs sur l’incidence de la brûlure en plaques sur les allés de terrain de golf (Chapitre 2)

• De valider l’utilisation de biopuces (microarray) marquées avec des gènes du riz (Oryza sativa L.) pour quantifier l’expression génique chez l’agrostide stolonifère (Chapitre 3)

• D’identifier les gènes différentiellement exprimés chez l’agrostide stolonifère pendant l’infection par S. homoeocarpa à l’aide des biopuces de riz (Chapitre 3) • D’identifier les gènes différentiellement exprimés suite à l’application d’éliciteurs

chez l’agrostide stolonifère pendant l’infection par S. homoeocarpa à l’aide des biopuces de riz (Chapitre 4)

Chapitre 2. Dollar spot incidence on golf

courses as affected by three different

elicitors

Guillaume Grégoire and Yves Desjardins, Centre de Recherche en Horticulture, Pavillon Envirotron, Université Laval, Québec City, Canada, G1V 0A6

2.1 Résumé

La brûlure en plaques est une maladie importante sur les terrains de golf, et son contrôle repose principalement sur l’utilisation des pesticides. Dans le contexte où le public demande de réduire l’utilisation des pesticides, nous avons évalué trois éliciteurs pour évaluer leur capacité à diminuer l’incidence de la brûlure en plaques sur les terrains de golf. Des applications de silicate de potassium, d’un engrais avec phosphite (4-0-16) et d’acibenzolar-s-méthyle (Actigardtm_{) ont été faites à un intervalle de deux semaines en}

combinaison avec différents témoins (potassium seul, azote seul, chlorothalonil et témoin non traité). L’application de silicate de potassium a permis de diminuer jusqu’à 57% l’incidence de la brûlure en plaques, mais seulement pour quelques dates alors que le phosphite a permis de réduire la maladie de façon plus constante, avec une réduction moyenne de 49%. L’application de l’acibenzolar-s-méthyle a réduit l’incidence de la brûlure en plaques à une occasion, mais a aussi augmenté l’incidence de celle-ci à trois reprises. Même si aucun des produits évalués n’a permis d’obtenir un contrôle de la brûlure en plaques aussi efficace que le chlorothalonil, l’intégration des éliciteurs dans la régie d’entretien des terrains de golf pourrait contribuer à réduire l’utilisation des pesticides.

2.2 Abstract

Dollar spot is a major disease on golf courses, and its control relies on the extensive use of pesticides. With increasing pressure from the public to decrease pesticide use, three different elicitors were tested on golf courses to evaluate their efficacy to reduce dollar spot incidence. Applications of potassium silicate, of a fertilizer with phosphite (4-0-16), and of acibenzolar-s-methyl (Actigard™) were performed every two weeks along with different controls (potassium only, nitrogen only, chlorothalonil, and untreated). The use of potassium silicate resulted in a significant decrease in dollar spot incidence, up to 57%, but only on a few rating dates, while the phosphite product resulted in a more consistent disease suppression, with an average of 49% reduction in disease incidence. The application of acibenzolar-S-methyl did reduce dollar spot incidence on one occasion, but also resulted in an increase in dollar spot incidence on three rating dates. While none of these products provided as good a dollar spot control as chlorothalonil, their integration in a golf course maintenance program could lead to a reduction in fungicide use.

2.3 Introduction

In the province of Québec, Canada, golf courses must produce and submit a pesticide reduction plan to the government every three years, indicating which cultural practices and/or alternative products will be implemented to reduce pesticide use. However, there are currently very few products on the Canadian market that can effectively replace synthetic pesticides. In this context, a new class of products, sold as fertilizers or soil amendments, targeted at stimulating plant defense mechanisms has been offered on the market in the last few years. Among these products, potassium silicate, phosphites, and acibenzolar-s-methyl are readily available but limited scientific data is available to assess their effectiveness on golf courses. Thus, golf course superintendants currently do not have access to independent, unbiased assessments of the efficacy of these products, and rely solely on partial recommendations provided by the distributors.

The prophylactic properties of silicon against plant diseases have been exploited for hundreds of years. Silicon has been shown to increase the resistance level of both monocots (Datnoff et al., 1997; Bélanger et al., 2003) and dicots to several pathogens. In turfgrass, this element has been shown to reduce the incidence of gray leaf spot (Magnaporthe sp.) on both perennial ryegrass (Lolium perenne L.) and St. Augustinegrass (Stenotaphrum secundatum (Walter) Kuntze) (Brecht et al., 2004; Nanayakkara et al., 2008). On creeping bentgrass (Agrostis stolonifera L.), Uriarte et al. (2005) reported a 30% decrease in dollar spot incidence with the use of silicon, while Zhang et al. (2006) reported no effect of calcium silicate on dollar spot, and an increase in brown patch (Rhizoctonia solani Kühn) incidence. The mechanisms of silicon-mediated resistance in higher plants are not fully understood, but silicon is thought to act as both a mechanical barrier, and a defense-inducing molecule (Fauteux et al., 2005).

2009). Phosphites are particularly effective against oomycetes such as Phytophtora and Pythium (McDonald et al., 2001); in fact, the registered fungicide fosetyl-aluminium belongs to the phosphite family. The mode of action of phosphites is not fully understood, but they appear to possess both a direct antifungal effect, and an ability to induce host defense mechanisms (Jackson et al., 2000). In turfgrass, little research has been published on the efficacy of phosphite products in reducing disease incidence. Some studies have demonstrated suppression of Pythium blight [Pythium aphanidermatum (Edson) Fitzp] with both registered phosphite fungicides and generic phosphite “fertilizers” (Datnoff et al., 2004, 2005; Cook et al., 2009). In their evaluation of different fungicide programs with phosphite against dollar spot, Vincelli and Dixon (2007) reported significant differences in disease reduction, but they did not evaluate a phosphite-only treatment; all of the evaluated programs included other fungicide classes. Recently, phosphites have been shown to reduce the occurrence of Michrodochium patch [Microdochium nivale (Fr.) Samuels and I. C. Hallettin] in a greenhouse experiment (Dempsey et al., 2010). Thus, very little is known about the potential suppressive capacity of phosphite products against dollar spot.

Acibenzolar-S-methyl (ASM) [Benzo (1,2,3) thiadiazole-7-carbothioic acid- S-methyl ester], marketed in the U.S. under the name Actigard™, was the first commercially available elicitor. This molecule has no antimicrobial activity, but once absorbed by the plant, it can induce the expression of genes involved in defense mechanisms, mimicking the systemic acquired response (SAR) triggered by salicylic acid (Oostendorp et al., 2001). ASM has been shown to significantly reduce diseases in many host-pathogen systems (Vallad and Goodman, 2004). However, reports on efficacy of ASM on turfgrass are scarce: Lee et al. (2003a) reported a decrease of 38% in dollar spot incidence following treatment with ASM, but this reduction was not sufficient to maintain acceptable turf quality, since disease pressure was very high. In another study, ASM significantly reduced dollar spot symptoms on cultivars with a low genetic resistance to dollar spot (‘Crenshaw’, ‘Penncross’, and ‘Providence’), but had no effect on a moderately tolerant cultivar (‘L-93’) (Lee et al., 2003b).

The objective of this project was to evaluate three different elicitors, or plant defense activators, as alternatives to a conventional fungicide, against dollar spot, caused by Sclerotinia homoeocarpa F.T. Bennett. This experiment was also used as a screening process to identify elicitors that will be used in future experiments to investigate the molecular mechanisms involved in elicitor-mediated disease reduction.

2.4 Material and Methods

2.4.1 Experimental sites

Three sites were selected to conduct this experiment: one in Québec City, and two in the Montréal region. The site in Québec City was established on July 17th 2008 on the experimental green located on the grounds of Université Laval campus (46°78’N, 71°29’W). This green was built in 1992 according to the recommendations of the United States Golf Association (United States Golf Association Green Section, 1989). At the beginning of the experiment, the green was visually estimated to be composed of 60% annual bluegrass (Poa annua L.) and 40% creeping bentgrass (cv. ‘Pennlinks’). This green was mowed three times per week at a height of 5.0 mm, and irrigation was supplied to prevent drought stress. An annual amount of 3.33 kg of N, 1.13 kg of P2O5, and 3.13 kg of

K2O / 100 m2 was applied on the experimental green as monthly applications.

The Montreal sites were established on June 5th _{2008 at Golf Le Parcours du Cerf}

(45°33’N, 73°27’W), on fairways with a history of dollar spot incidence. This public golf club hosts two different courses: the Brocard Course, built in 1992, and the Faon course, built in 1997. Because of this difference in the year they were built, these two courses are very much different with respect to the turf community they harbor. One experimental site was located on the Brocard course, where turf species is a mix of annual bluegrass (80%) and creeping bentgrass (20%), and the other site was established on the Faon course, where creeping bentgrass (cv ‘Penncross’) is the dominant species. The two sites were located

Each of the three experimental sites was arranged as a randomized complete block design with four replicates. Each of the 28 plots at each site had an area of 4 m2 _{(2m X 2m) and}

were separated by 0.5m-wide buffer zones.

2.4.2 Treatments

The following treatments were applied at the three experimental sites: potassium silicate (1.7 mM silicic acid), phosphite fertilizer (4-0-16 applied at 150 mL/100 m2_{), and ASM}

(benzo (1,2,3) thiadiazole-7-carbothioic acid (S) methyl ester) (Actigard™ applied at 0.7g/100 m2_{, Syngenta Crop Protection, Inc., Greensboro, NC). Since the product used to}

provide silicon (Kasil 6, PQ Corp.,Valley Forge, PA, USA) also contains potassium, a K control treatment was also used (0.825g/100 m2 _{of KOH). Furthermore, a N control}

treatment was included to compensate for the N applied by the phosphite treatment (Phos-Fight 4-0-16, Envirosol, St-Michel, Qc, Ca). Finally, a water-treated control and a fungicide control (Chlorothalonil applied at 58g/100 m2_{) were used. All the treatments were applied}

in 10 L of water/100 m2 _{every two weeks using a 4.0L Chapin SureSpray}TM _(Chapin

International, Batavia, NY, USA) handheld sprayer.

2.4.3 Dollar spot incidence and statistical analysis

Severity of dollar spot was assessed visually by counting the number of lesions in each plot every week. This assessment started on 3 July at both Parcours du Cerf sites, and on 30 July at Université Laval, when the first disease symptoms were visible. The results from these observations were used to calculate the area under the disease pressure curve (AUDPC) with the equation:

AUDPC =

_∑

(

)

yi = the number of lesions in the plots at the ith day

ti = the time in days after appearance of the disease at the ith day n = the total number of observations.

Data for lesion numbers were analyzed with the PROC MIXED procedure in SAS (The SAS Institute, Cary, NC), and means were compared with LSMEANS (P ≤ 0.05). Cumulative AUDPC values were compared using Fisher’s least significant difference at a level of  ≤ 0.05. A logarithmic transformation was performed to normalize dollar spot data, but actual means are presented in data tables.

2.5 Results

2.5.1 Dollar Spot Incidence

pressure in control plots was lower than expected, and the control treatment was consistently ranked with one of the lowest disease incidence throughout the experiment (Table 2.1). This situation resulted in a low efficacy in disease reduction for the three evaluated elicitors. For example, ASM resulted in significantly more dollar spot incidence compared to the control on two rating dates. Phosphite was as efficient as the fungicide control to reduce dollar spot incidence from weeks 4 to 6, but its efficacy was also not significantly different from the control on these three dates. The same situation was also observed with potassium silicate on weeks 5 and 6. Phosphite did result in a significantly lower dollar spot incidence compared to the N control on week 4 where it resulted in a 63% decrease in lesion numbers. Potassium silicate and phosphite also resulted in 25% lower AUDPC values compared to their respective control treatments (i.e. potassium silicate vs potassium and phosphite vs N), but these differences were not statistically different.

Parcours du cerf - Faon

On this experimental site, plots treated with chlorothalonil consistently exhibited the lowest disease incidence while control plots had the highest lesion number for most of the rating dates (Table 2.2). ASM resulted in a significant dollar spot increase compared to the control on weeks 4 and 5, and did not provide a significant reduction in disease incidence compared to the control for the rest of the experiment. Potassium silicate significantly reduced dollar spot incidence compared to the untreated control (55% reduction) and to the potassium control (57% reduction) on week 9. The performance of phosphite to reduce disease incidence was not significantly different compared to the chlorothalonil performance on weeks 5 and 6. Phosphite applications also resulted in a significantly lower dollar spot incidence compared to the control on weeks 6, 8, 9 and 10. From weeks 8 to 10, phosphite also reduced disease incidence compared to the N control. The AUDPC value for the phosphite treatment was not significantly different than the AUDPC value for the chlorothalonil value. It was also not statistically different from the control AUDPC value despite being 48% lower.

Université Laval site

This site was characterized by a later disease development date than the other two experimental sites, as well as a lower disease pressure (Table 2.3). Neither potassium silicate nor ASM resulted in significant differences in dollar spot incidence compared to the control on this experimental site. Plots treated with phosphite were not significantly different from plots treated with chlorothalonil on weeks 5 and 8, but they were also not statistically different from the control on those dates. No significant differences were observed in AUDPC values for this experimental site.

2.5.2 Turf Visual Quality

Few differences were observed on turfgrass visual quality over the course of the experiment at the three experimental sites (data not shown). At each location, the highest visual quality was consistently observed on chlorothalonil-treated plots. Potassium silicate improved turf quality compared to the K control on weeks 9 and 10 on Faon course; visual quality of turf treated with potassium silicate on these dates was similar to that of turf treated with chlorothalonil. The use of phosphite resulted in a lower visual quality than N on one occasion (week 5) on Faon course. Finally, plots treated with ASM had a significantly higher quality rating than control plots on weeks 7 and 9 on Université Laval site.

2.6 Discussion

In this project, we evaluated the efficacy of three non-pesticide products at controlling dollar spot on turf grass in an effort to comply with regulations in the province of Québec aimed at reducing pesticide usage on golf courses. While the tested products, potassium silicate, phosphite and acibenzolar-S-methyl only gave partial or no control of the disease under our experimental conditions, our results still highlighted some new possibilities of