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K. V. ZVEREV Minatom, Moscow
Evolução cromossômica em três espécies de Deltochilum (Coleoptera: Scarabaeidae: Scarabaeinae)
D.C. Cabral-de-Mello1,2, R. Carvalho3, R.C. Moura2 & M.J. Souza1 *
1Departamento de Genética, Centro de Ciências Biológicas/CCB, Universidade Federal de
Pernambuco/UFPE, Av. Professor Moraes Rego, s/n, CEP 50670-901, Recife, Pernambuco, Brazil; (Phone: +55-81-21268520, e-mail: [email protected]);
2Departamento de Biologia, Instituto de Ciências Biológicas/ICB, Universidade de
Pernambuco/UPE, Recife, Pernambuco, Brazil;
3Departamento de Biologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco/UFRPE, Recife,
Pernambuco, Brazil.
Título resumido: Evolução cromossômica em Deltochilum
*Autor para correspondência: Departamento de Genética, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, Av. Prof. Moraes do Rego S/N, Cidade Universitária, CEP: 50732 -970, Recife, Pernambuco, Brasil. Fone: +55 81 21268520; e-mail: [email protected]
Resumo
Neste trabalho, foram analisados cromossomos mitóticos e meióticos das espécies Deltochilum
irroratum, D. morbillosum e D. verruciferum (Scarabaeinae) através da coloração convencional,
bandeamento C, impregnação com nitrato de prata (AgNO3), fluorocromos base específicos e
FISH. Deltochilum irroratum e D. morbillosum apresentaram 2n=14,neo-XY, enquanto D.
verruciferum possui 2n=20,XYp. As três espécies apresentaram cromossomos meta-
submetacêntricos. A análise da heterocromatina constitutiva (HC) revelou predominantemente cromossomos difásicos nas três espécies, com ocorrência de braços longos heterocromáticos em
D. irroratum e D. morbillosum e de braços curtos em D. verruciferum. A impregnação com
AgNO3 marcou as seqüências correspondentes a HC em D. morbillosum e D. verruciferum. Nesta
última espécie o lúmen do bivalente sexual também foi marcado. Em D. irroratum a impregnação AgNO3 evidenciou apenas a HC dos autossomos difásicos. A coloração com CMA3 e DAPI
revelou blocos de HC ricos em GC na espécie D. verruciferum. Em D. irroratum apenas os cromossomos difásicos mostraram blocos CMA3+, enquanto em D. morbillosum as sequências
ricas em GC estão restritas as regiões terminais do braço longo dos pares 1, 2 e do X. Em D.
morbillosum e D. verruciferum a FISH identificou sítios de DNAr em dois pares autossômicos e
no cromossomo X. A utilização destas técnicas permitiu a localização de marcadores citogenéticos e a análise dos possíveis rearranjos envolvidos ao longo da diferenciação cariótipica destas espécies.
Introdução
A subfamília Scarabaeinae pertencente à família Scarabaeidae representa um grupo cosmopolita com 12 tribos, cerca de 234 gêneros e 5000 espécies, das quais 618 ocorrem no Brasil. O gênero Deltochilum pertence à tribo Canthonini e possui 80 espécies ocorrentes no mundo, das quais 52 foram registradas para o Brasil até o momento (Hansky & Cambefort 1991, Vaz-de-Mello 2000).
Citogeneticamente 113 espécies pertencentes à subfamília Scarabaeinae foram analisadas, sendo os estudos em geral restritos à utilização da coloração convencional, com descrição do número diplóide, mecanismo de determinação sexual e, com menor freqüência, morfologia cromossômica. O cariótipo mais comum para o grupo é 2n=20,Xyp com predominância de
cromossomos com dois braços. Apesar desta conservação cariotípica, foram observadas variações do número diplóide de 2n=8 (Eurysternus caribaeus) a 2n=24 (Tiniocellus spinipes) e seis mecanismos de determinação do sexo, Xy, Xyp, XY, Xyr, neo-XY e X0, devido a diferentes
rearranjos cromossômicos, tais como, fissões, fusões autossomo-autossomo, fusões autossomo-X, perda do y e inversões (Smith & Virkki 1978, Yadav e Pillai, 1979; Yadav et al. 1979, Vidal 1984, Bione et al. 2005a, Wilson & Angus 2005, Angus et al. 2007, Cabral-de-Mello et al. 2007). Para a tribo Canthonini, apenas oito espécies foram descritas, com predominância do número diplóide 2n=18 e mecanismo sexual Xyp, ocorrente nas quatro espécies dp gênero
Cantochilum estudadas. Por outro lado, a espécie Deltochilum valgum apresenta 2n=14,neo-XY
(Smith & Virkki 1978, Vidal 1984).
Técnicas citogenéticas diferenciais, tais como bandeamento C, coloração com nitrato de prata (AgNO3), fluorocromos base específicos (CMA3 e DAPI) e hibridização in situ fluorescente
(FISH) foram utilizadas em 30 espécies de Scarabaeinae (Colomba et al. 1996, 2000, 2006, Bione et al. 2005a, Wilson & Angus 2005, Angus et al. 2007). O padrão mais comum de localização da heterocromatina constitutiva (HC) nesta subfamília, assim como em Scarabaeidae, é a ocorrência de blocos pericentroméricos. Em menor escala tem sido descritos padrões de distribuição da HC em regiões intersticiais, teloméricas e com cromossomos difásicos (Moura et
al. 2003, Wilson & Angus 2005, Bione et al. 2005a, b, Angus et al. 2007). A análise de três
espécies de Scarabaeinae com fluorocromos base específicos mostrou HC heterogênea quanto à composição dos pares de bases AT e GC (Colomba et al. 1996, 2000, 2006). Quanto à organização dos sítios de DNAr foram descritos dados de quatro espécies, com padrões bastante heterogêneos, com variação de um a oito sítios localizados em cromossomos autossômicos ou no cromossomo X (Colomba et al. 2000, 2006, Bione et al. 2005a).
No presente trabalho, foram analisadas citogeneticamente três espécies do gênero
Deltochilum através de técnicas citogenéticas convencionais, diferenciais e moleculares com o
objetivo de descrever suas características cromossômicas bem como realizar uma análise comparativa com outras espécies de Scarabaeidae, buscando inferir sobre os padrões de evolução cromossômica para o grupo.
Matérias e Métodos
Foram analisados 59 individuos machos de Deltochilum (Deltohyboma) irroratum (Laporte, 1840), 24 de D. (Deltohyboma) morbillosum Burmeister, 1848 e seis de D. (Calhyboma) verruciferum Felsche, 1911 coletados em diferentes áreas do estado de Pernambuco, região Nordeste do Brasil (Tabela 1). As células analisadas foram obtidas a partir
de folículos testiculares fixados em Carnoy (3:1, etanol:ácido acético) e as preparações citológicas foram feitas através da técnica clássica de esmagamento coradas com orceína lacto- acética a 2%. O bandeamento C foi realizado a partir do método descrito por Sumner (1972), a coloração com nitrato de prata foi realizada de acordo com Rufas et al. (1987) e a dupla coloração com fluorocromos CMA3/DA e DA/DAPI seguiu o protocolo descrito por Schweizer et
al. (1983).
A hibridização in situ fluorescente (FISH) foi realizada segundo Moscone et al. (1996) utilizando sonda de DNAr 45S de Arabidopsis thaliana, marcada atraves de nick translation com digoxigenina e detectada com anticorpo anti-digoxigenina produzido em ovelha e ligado ao fluorocromo FITC. O sinal de hibridização foi amplificado a partir do uso do anticorpo anti-IgG de ovelha produzido em coelho FITC conjugado (Dako). As preparações foram contra coradas com DAPI (2μg/ml) e montadas com Vectashield H-1000 (Vector). As células foram fotografadas no sistema de captura de imagens Cytovision acoplado ao microscópio Olymplus BX51 e as pranchas foram organizadas no programa Corel Photo-Paint 12.
Resultados
Coloração convencional
Deltochilum irroratum e D. morbillosum apresentaram cariótipos similares com 2n=14, sistema
sexual do tipo neo-XY e cromossomos meta-submetacêntricos (figura 1a-d). Os cariótipos são simétricos com redução gradual do tamanho dos cromossomos, exceto para o X e o Y (figura 1a,c). Em D. verruciferum o cariótipo observado foi 2n=20,XYp com oito pares autossômicos
submetacêntricos, um metacêntrico e os sexuais X e Y submetacêntricos (figura 1e,f). Os cromossomos sexuais desta espécie possuem tamanho similar e se associam nas metáfases I através das regiões terminais dos dois braços do X e do braço curto do Y gerando o mecanismo XYp (figura 1e).
Bandeamento C e Coloração com nitrato de prata
A análise da heterocromatina constitutiva (HC) revelou em D. irroratum e D. morbillosum os quatro primeiros pares autossômicos e o cromossomo X difásicos, com blocos de HC se distribuindo por todo braço longo. Os pares 5 e 6 apresentaram HC pericentromérica e o Y se mostrou quase totalmente heterocromático (figura 2a,b,d e 5a,b). Em D. verruciferum, o padrão de distribuição da HC observado foi mais complexo. Os pares de 1 a 6 foram difásicos, com a HC localizada no braço curto; o par 7 mostrou blocos de HC no braço curto e na região proximal do braço longo; o par 8 apresentou bloco centromérico e o par 9 ausência de HC. O cromossomo X foi totalmente heterocromático e o Y difásico, com HC localizada no braço longo (figura 2f e 5c). Células C-bandeadas foram utilizadas para análise da frequência de quiasmas. A observação de 35 células em metáfase I por espécie revelou a presença de apenas um quiasma nos cromossomos difásicos. Os cromossomos com blocos de HC pericentroméricos em D. irroratum e D.
morbillosum apresentaram dois quiasmas. Em D. verruciferum, o par 8, com HC
pericentromérica, apresentou um quiasma em 43% das celulas analisadas e dois em 57%, enquanto o par 9, sem HC, em 14% das células mostrou dois quiasmas e em 86% apenas um. A coloração com nitrato de prata não foi eficiente na marcação das regiões organizadoras de nucléolo (RONs), entretanto os sais de prata apresentaram afinidade pelos blocos de HC. Em D.
morbillosum e D. verruciferum a coloração com AgNO3 revelou o mesmo padrão observado
através do bandeamento C (figura 2e,g), enquanto em D. irroratum esta coloração marcou apenas a HC localizada nos quatro pares autossômicos difásicos (figura 2c). Além disso, nas metáfases I de D. verruciferum foi observada marcação do lúmen do bivalente sexual XYp, evidenciando a
presença de proteínas argirofílicas na associação deste bivalente (figura 2g).
Fluorocromos base específicos (CMA3 e DAPI) e Hibridização in situ Fluorescente (FISH)
Através da dupla coloração CMA3/DA foi possível identificar blocos de heterocromatina
constitutiva (HC) CMA3+ nas três espécies (figura 3a,c,e e 5a,b,c), enquanto a coloração com
DA/DAPI não revelou nenhuma marcação (figura 3b,d,f). Todos os blocos de HC de D.
verruciferum possuem seqüências ricas em GC (figura 3e e 5c). Em D. irroratum os
cromossomos difásicos e o X e Y também apresentaram blocos de HC ricos em GC (figura 3a e 5a). Enquanto em D. morbillosum, a coloração com CMA3 marcou apenas as regiões terminais de
dois pares autossômicos e do cromossomo X, não possuindo riqueza específica no restante da HC (figura 3c e 5b). A FISH identificou sítios de DNAr 45S nos pares 1 e 2 e no cromossomo X das três espécies (figura 4a-c e 5a-c). Em D. morbillosum e D. irroratum os sítios de DNAr estão licalizados nas regiões terminais dos cromossomos e coincidem com os blocos CMA3+, revelando
que estes são ricos em seqüências GC (figura 4a, b e 5a, b). Enquanto em D. verruciferum os sítios se localizam na região proximal do braço longo dos pares 1 e 2 e do braço curto do X (Figura 4c e 5c).
Discussão
As três espécies analisadas neste trabalho apresentaram cariótipos distintos do considerado modal e primitivo para a família Scarabaeidae, 2n=20,Xyp. A presença de número
diplóide reduzido e do mecanismo de determinação sexual quiasmático neo-XY em Deltochilum
irroratum e D. morbillosum, surgiram provavelmente a partir de rearranjos cromossômicos do
tipo inversões pericêntricas, gerando cromossomos acrocêntricos, seguidas de fusões cêntricas entre autossomos e fusão autossomo-X. A ocorrência de reduções cromossômicas devido à fusão cêntrica tem sido observada em outras espécies de Scarabaeidae. Estes rearranjos podem envolver os cromossomos sexuais gerando o mecanismo quiasmático neo-XY, como observado em D.
valgum (Vidal 1984) com 2n=14,neo-XY ou envolver apenas cromossomos autossômicos,
conservando o mecanismo primitivo Xyp, como em Isocopris inhiata (Bione et al. 2005a),
Macraspis festiva (Bione et al. 2005b) e algumas espécies do gênero Dichotomius, todas com
2n=18,Xyp (Vidal 1984). Segundo Yadav & Pillai (1979) além de fusões e inversões, as fissões
cêntricas e a perda do cromossomo y estão envolvidos na diferenciação cariotípica de diferentes espécies desta família.
Deltochilum verruciferum possui o número diplóide modal descrito para Scarabaeidae,
assim como para ordem Coleoptera (2n=20); entretanto, o mecanismo sexual pára-quedas registrado nesta espécie difere do mais comum para o grupo por apresentar os cromossomos sexuais X e Y de tamanhos similares (XYp). Este mecanismo é incomum em Coleoptera, tendo
sido registrado em Scarabaeidae na espécie Phyllophaga (Phyllophaga) aff. capillata (Moura et
al. 2003). Segundo Mesa & Fontanetti (1985) existem duas possibilidades para a ocorrência do
tamanhos similares ou (2) este sistema tem origem a partir de um Xyp por adição de HC no
cromossomo y.
A presença de cromossomos difásicos nas três espécies sugere a ocorrência de amplificação da HC através de múltiplas duplicações de um pequeno segmento de DNA repetitivo e/ou por transferência de heterocromatina entre os cromossomos não homólogos ao longo da diferenciação cariotípica das mesmas. Este mecanismo de evolução de seqüências de DNA repetitivo é comum em diversos grupos de organismos, gerando polimorfismos intra e interespecíficos (White 1973, Schweizer & Loidl, 1987, Mantovani et al. 2000, Sumner 2003, Loreto et al. 2005, Fregonrzi et al. 2006).
Grandes quantidades de HC nos genomas de coleópteros foram registradas em espécies pertencentes à família Tenebrionidae e em algumas espécies de Scarabaeidae. Bione et al. (2005a) relataram a presença de cromossomos difásicos nas espécies Isocopris inhiata e
Diabroctis mimas. Em Jumnos ruckeri, espécie que possui redução do número diplóide para
2n=14 e mecanismo sexual neo-XY, Macaisne et al. (2006) observaram grandes blocos de heterocromatina representando cerca de 60% de todo seu cariótipo. Helicopris giga, estudada por Angus et al. (2007), apresentou HC distribuída nos braços longos e parte dos braços curtos de todos os autossomos, enquanto o cromossomo X é quase completamente heterocromático e o y é inteiramente heterocromático. Apesar desta variabilidade quanto ao padrão, quantidade e localização dos blocos de heterocromatina nas espécies relatadas acima, em Scarabaeidae, assim como em Coleoptera, é comum a presença de blocos de HC restritos a regiões centroméricas dos cromossomos (Juan & Petitipierre 1989, Moura et al. 2003, Wilson & Angus 2004, Rozek et al. 2004, Bione et al. 2005b, Angus et al. 2007).
A presença de apenas um quiasma no pareamento dos cromossomos autossômicos difásicos na metáfase I das espécies analisadas neste trabalho pode estar diretamente relacionada à presença de grandes blocos de HC em um dos braços cromossômicos. No gênero Chilocorus, que também apresenta espécies com cromossomos difásicos, foi observada uma distribuição de quiasma similar (Smith & Virkki 1978). Segundo John (1990) em geral o crossing-over é ausente nas regiões de heterocromatina, estando esta ausência associada à não formação dos complexos sinaptonêmicos nestas regiões. Virkki & Santiago-Blay (1993) sugeriram que em algumas espécies de Oedionychina (Chrysomelidae) a ausência de quiasmas em um dos braços cromossômicos ocorre devido a diferentes rearranjos estruturais nos mesmos.
A coloração com nitrato de prata em representantes de Scarabaeidae não tem sido eficiente na identificação das RONs. Neste grupo de organismos o íon de prata marca seqüências de HC, como descrito em representantes das subfamílias Rutelinae (Geniates borelli; Bione et al. 2005b), Dynastinae (Lygirus ebenus; Bione et al. 2005b), Melolonthinae (Lyogenes fuscus; Moura et al. 2003) e Scarabaeinae (Bubas bison; Colomba et al. 1996, 2000). Além disso, em Coleoptera, o lúmen do bivalente sexual Xyp é fortemente marcado pela coloração AgNO3,
mesmo após a desintegração do material remanescente nucleolar e independente da presença de sítios de DNAr neste bivalente, como evidenciado em algumas espécies de curculionídeos estudadas por Virkki et al. (1990, 1991). Foi proposto que esta marcação ocorre devido à presença de proteínas semelhantes às presentes no citoesqueleto cromossômico, estando relacionadas à associação e correta segregação do Xyp na meiose.
A marcação de seqüências de heterocromatina, assim como a marcação do bivalente sexual XYp observados neste trabalho após a coloração com AgNO3 estão de acordo com
marcação distinto observado pelo nitrato de prata sugere a presença de blocos de HC com estrutura molecular diferente no cariótipo das mesmas e, além disso, indica origem independente do sistema sexual neo-XY nestas espécies. Em D. verruciferum a marcação do lúmen do XYp
juntamente com o braço longo do cromossomo Y totalmente heterocromático sugerem a origem deste sistema sexual a partir do sistema pára-quedas primitivo (Xyp), no qual o cromossomo y é
puntiforme. Isto ocorreu provavelmente a partir da amplificação da HC neste cromossomo, corroborando uma das hipóteses propostas por Mesa & Fontanetti (1985) para origem do sistema sexual XYp.
O uso dos fluorocromos base específicos CMA3 e DAPI em representantes de
Scarabaeidae tem revelado ampla heterogeneidade da HC neste grupo de organismos. Têm sido descritas espécies com blocos de HC ricos em AT, como em Bubas bison (Colomba et al. 2006), GC em Geniates borelli (Bione et al. 2005b), AT e GC em Phyllophaga (Phytalus) vestita (Moura et al. 2003) ou neutros em Macraspis festiva (Bione et al. 2005b). Apesar da predominância de blocos de HC ricos em pares de bases GC em D. irroratum, D. morbillosum e
D. verruciferum os padrões de marcação são distintos nas três espécies. A presença de blocos de
HC neutros e ricos em GC nas espécies D. irroratum e D. morbillosum indicam a presença de famílias de DNA satélite distintas em seus genomas. Estas seqüências podem ter se originado a partir de uma seqüência única em uma espécie ancestral que se diferenciou a partir do acúmulo de mutações, como proposto na Library hypothesis (Fry & Salser 1977, Ugarkovic and Plohl 2002). Em D. verruciferum a ocorrência de toda heterocromatina rica em pares GC não exclui a possibilidade da presença de diferentes famílias de DNA satélite em seu genoma. Diferentes espécies de tenebrionídeos possuem blocos de HC ricos em pares de bases AT com a presença de
diversos DNAs satélites, como em espécies dos gêneros Pimelia, Palorus, Tribolium e Tenebrio (Juan et al. 1993, Mravinac et al. 2002, Pons 2004).
As três espécies analisadas apresentaram o mesmo padrão de quantidade de sítios de DNAr observados através da FISH. Entretanto, apesar destes sítios estarem localizados nos pares 1, 2 e no X estes se encontram em posições distintas nos mesmos. Este padrão é diferente do mais frequentemente encontrado em Coleoptera, que consiste em apenas um par autossômico organizador nucleolar. Nas três espécies de Deltochilum analisadas, possivelmente ocorreram processos de amplificação, fissão, translocação e inversão envolvidos na dispersão das seqüências de DNAr. Este mecanismo pode ter sido favorecido pela formação de cromocentros nestas espécies, assim como observado em Diabroctis mimas (Bione et al. 2005a).
Os resultados do presente estudo compreendem as primeiras análises detalhadas de cariótipos de representantes de Deltochilum, os quais mostram que apesar de pertencerem ao mesmo gênero às três espécies mostraram peculiaridades em seus cariótipos quando analisadas a partir de diferentes marcadores cromossômicos, indicando a ocorrência de distintos mecanismos de diferenciação cromossômica. Os padrões cromossômicos apresentados nestas espécies não são frequentemente encontrados em representantes da familia Scarabaeidae. Entretanto a marcação da HC através da coloração AgNO3 tem sido comumente relatada nos representantes da família,
indicando a presença de uma classe específica de heterocromatina. Portanto são necessários estudos mais detalhados destas seqüências visando uma melhor compreensão de sua composição molecular e dos processos envolvidos na origem e diferenciação deste componente genômico.
Agradecimentos
Os autores são gratos ao Msc. Fernando Augusto Barbosa Silva, pela identificação taxonômica das espécies analisadas neste trabalho. O estudo foi apoiado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Amparo a Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco (FACEPE).
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