Mutants de XSTAT3 EnR YFSA K49R
6. XSTAT3 interagit directement avec XDSCR6 et XEZH2 via son domaine carboxy-terminal
Un de nos objectifs était de confirmer l’interaction physique de XDSCR6 avec XSTAT3 et de caractériser le domaine permettant cette interaction. Nos résultats ont montré que XSTAT3, XDSCR6 et XEZH2 endogènes interagissent dans l’embryon au cours de la gastrulation. De plus, nos résultats ont montré que XDSCR6 et aussi XEZH2 interagissent directement avec XSTAT3 par la région carboxy-terminale de XSTAT3 contenant les domaines SH2 et TAD. Ce domaine SH2 est fondamental pour la phosphorylation, pour la dimérisation et pour l’activité transcriptionnelle des protéines STAT. Le domaine SH2 est privilégié pour l’interaction avec d’autres protéines, comme c’est le cas des kinases JAKs.
Nous avons également cherché à savoir si cette interaction pouvait avoir lieu avant la gastrulation, au stade 7 par exemple, au moment où STAT3 n’est pas encore activée ni transcriptionnellement active. Nos données de GST-pull down ont montré une interaction au stade 7 et au stade 11,5 (figure 40). Ces résultats suggèrent qu’indépendamment de l’activité de XSTAT3, XDSCR6 et XEZH2 sont capables d’interagir avec cette protéine. Ainsi, l’interaction de XSTAT3 avec ses deux partenaires n’est pas dépendante de son état de phosphorylation sur la tyrosine 705, ni de son activité transcriptionnelle. De plus, comme j’ai décrit précédemment, au stade 7 la protéine XSTAT3 ne semble pas être méthylée sur les résidus lysine. Ainsi, cette interaction ne semble pas non plus être dépendante de la méthylation de STAT3 sur les résidus lysine.
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7. XEZH2 et XSTAT3 sont présentes dans les mêmes feuillets
embryonnaires
Le profil d’expression spatio-temporel de XSTAT3 a montré que cette protéine endogène est présente dans le cytoplasme et dans les noyaux des trois feuillets embryonnaires au cours de la gastrulation.
En ce qui concerne XEZH2, j’ai montré par Western Blot que cette protéine est détectée de manière constante tout le long du développement, dès le début de la segmentation jusqu’à l’organogenèse (figure 41A), comme XSTAT3. J’ai confirmé ces résultats par immunodétection. De plus, j’ai montré que XEZH2 est présente dans les trois
Figure 42 – Profil d’expression spatio-temporel de la protéine XDSCR6 endogène et spécificité de l’anticorps anti-XDSCR6. (A) Des expériences d’immunodétection sur des coupes d’embryons au stade 7, 8, 9, 10 et 11 en utilisant l’anticorps anti-XDSCR6. (B) Expériences d’immunodétection sur des cellules NIH/3T3 transfectées avec le plasmide codant pour 6-Myc-XDSCR6. (C) Expériences d’immunodétection sur des coupes d’embryons injectés avec l’ARNm de 6-myc-Xdscr6. Les anticorps anti-Myc et anti-XDSCR6 ont été utilisés en B et en C. (D) Expériences d’immunodétection sur des embryons injectés avec le Morpholino-Xdscr6 (MO). Le signal RLDX montre la région injectée. (E) Quantification de l’intensité de la fluorescence détectée sur le côté injecté (MO) et du côté non injecté (Contrôle) (p-value = 0,78). Barre d’échelle : 100 µm. (PA : pôle animal ; PV : pôle végétatif ; V : ventral ; D : dorsal).
feuillets embryonnaires du stade 7 au stade 12. En ce qui concerne la forme phosphorylée sur le résidu S21, elle n’est détectée qu’à partir de la fin de la segmentation et au cours de la gastrulation (figure 41B). Cette cinétique d’activation correspond à celle observée pour XSTAT3. Ceci renforce l’hypothèse dans laquelle EZH2 devrait être spécifiquement phosphorylée sur le résidu S21 pour méthyler STAT3 et stimuler ainsi son activité transcriptionnelle.
J’ai également dressé le profil spatio-temporel de la protéine XDSCR6. Dans le commerce, il n’y a pas d’anticorps conçu pour reconnaître cette protéine chez l’amphibien. Dans un premier temps, nous avons testé un anticorps commercial conçu pour reconnaître la protéine humaine. Malgré tous mes essais sur les coupes d’embryons, nous n’avons pas pu détecter de signal endogène spécifique pour XDSCR6. Ces résultats étaient relativement prévisibles dans la mesure où il y a très peu d’homologie pour ces protéines entre ces deux espèces. Pour cette raison, nous avons fait produire un anticorps anti-XDSCR6 spécifique de la protéine chez le xénope. J’ai mis au point tous les protocoles et j’ai pu montrer que cet anticorps détecte cette protéine en immunoprécipitation. Malheureusement, malgré tous mes essais, cet anticorps ne semble pas fonctionner en Western Blot. En revanche, en immunodétection, cet anticorps semble détecter la protéine. Comme nous pouvons voir dans la figure 42A, au stade 7 XDSCR6 ne semble pas être présente dans l’embryon. Elle ne serait détectée qu’à partir de la fin de la segmentation jusqu’à la gastrulation dans les trois feuillets embryonnaires. D’après mes résultats, XDSCR6 aurait une localisation cytoplasmique et nucléaire. Pour confirmer la spécificité de ce signal, j’ai transfecté des cellules fibroblastiques embryonnaires de souris, NIH/3T3, avec le plasmide 6myc-XDSCR6 et j’ai réalisé des expériences d’immunodétection. Dans les cellules transfectées, notre anticorps détecte XDSCR6, tandis que dans les cellules non transféctées, le signal est négatif (figure 42B). De plus, des expériences dans l’embryon de surexpression de 6myc-XDSCR6 suivies d’une double immunodéctection anti-6myc-XDSCR6 et anti-myc montrent que le signal obtenu avec le marquage anti-XDSCR6 semble être plus important dans les cellules qui surexpriment une version étiquettée avec le polypeptide 6myc-XDSCR6 (figure 42C). Le dernier contrôle de spécificité était l’injection du morpholino ciblant Xdscr6. Nous avons analysé le signal anti-XDSCR6 en immunodétection sur les cellules injectées et nous n’avons pas observé de différence avec les cellules non injectées (figure 42D et E). L’ensemble de ces observations suggère qu’effectivement cet anticorps serait capable de détecter la protéine XDSCR6 endogène, mais nous ne
pouvons pas être sûrs qu’il détecte uniquement cette protéine. Pour cette raison, nous n’avons pas inclus ces résultats dans la publication en préparation.