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A estrutura desta dissertação ao incluir um artigo aceite para publicação, um artigo submetido para publicação e um artigo publicado envolve a discussão em detalhe dos resultados experimentais obtidos em cada uma das publicações. Assim neste capítulo pretendo apresentar uma discussão geral integrando as várias observações e conclusões obtidas nos diversos trabalhos.
Streptococcus agalactiae é um agente patogénico contagioso causador de
mastite bovina, que na maioria dos casos é sub-clínica e com baixa taxa de cura espontânea (Keefe 1997, Wilson et al. 1997). Apesar dos progressos conseguidos no controlo da mastite induzida por esta bactéria continuam a verificar-se nas explorações casos de animais que não são detectados ou não respondem à terapêutica, com um impacto substancial na quantidade e qualidade do leite produzido. Actualmente, a prevalência de mastite induzida por S. agalactiae varia de 1-8% (Almaw et al. 2008, Ferguson et al. 2007, Gianneechini et al. 2002, Kivaria et al. 2006, Tenhagen et al. 2006). Apesar de não existirem dados oficiais sobre a prevalência de S. agalactiae como causador de mastite em Portugal este agente continua a ser isolado das explorações, nomeadamente na região norte (Trigo et al. 2008).
A diminuição da prevalência da mastite por S. agalactiae, após a implementação da terapia antibiótica pode explicar a escassez de estudos relativamente à caracterização desta patogenia. No entanto, continuam a ser publicados estudos referentes à prevalência, caracterização de estirpes (Daignault et
al. 2003, Dogan et al. 2005, Duarte et al. 2004) e susceptibilidade aos antibióticos
(Dogan et al. 2005, Duarte et al. 2005, Ebrahimi et al. 2008), reforçando o facto de S.
agalactiae continuar a ser uma importante causa de mastite nas explorações.
Adicionalmente, a crescente preocupação com a introdução de antibióticos na cadeia alimentar humana (Andrew et al. 2008) torna pertinente toda a investigação que possa abrir novas perspectivas no desenvolvimento das áreas de controlo, prevenção e diagnóstico da mastite induzida por S. agalactiae. Todavia, apesar destes factos, não se encontram, na literatura recente, referências a estudos quer em bovinos quer em ratinhos que permitam uma compreensão detalhada da mastite induzida por S.
agalactiae.
À semelhança do que tem vindo a ser realizado com outros agentes patogénicos causadores de mastite, como por exemplo Staphylococcus aureus e
Escherichia coli, (Notebaert and Meyer 2006), estabelecemos um modelo experimental
de mastite por S. agalactiae em ratinhos BALB/c. Este modelo permitiu-nos determinar a cinética de crescimento da bactéria e a resposta da glândula mamária à infecção e
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colonização por S. agalactiae. O estabelecimento da infecção intramamária, por uma estripe de S. agalactiae isolada de um caso de mastite bovina, foi observado pela presença e multiplicação da bactéria na glândula mamária de ratinho 24 horas após a infecção, mantendo-se a colonização da glândula mamária até 15 dias após a infecção (Trabalho 1). Estes resultados indicam que foi possível estabelecer uma cinética de infecção por S. agalactiae na glândula mamária de ratinhos BALB/c, à semelhança do descrito para outros agentes causadores de mastite, como por exemplo
Staphylococcus aureus, Campylobacter coli e Candida krusei (Brouillette et al. 2004,
Diker et al. 1992, Guhad et al. 1995).
Os nossos resultados mostram que a multiplicação da bactéria foi acompanhada por uma resposta inflamatória caracterizada por um aumento de citocinas pró-inflamatórias, como a IL-1β e TNF-α, na glândula mamária dos animais infectados (Trabalho 1). A produção de citocinas pró-inflamatórias por macrófagos, após o reconhecimento do microrganismo (Rainard and Riollet 2006), é um factor importante para o recrutamento de PMN a partir do sangue para a glândula mamária, um passo crucial para a defesa da glândula mamária durante as infecções bacterianas (Rainard and Riollet 2003). De facto, nos cortes histológicos da glândula mamária, foi observada a presença de um infiltrado neutrofílico nas primeiras horas após a infecção intramamária (Trabalho 1), à semelhança do que se verifica com outros microrganismos causadores de mastite em modelos experimentais de ratinho (Brouillette et al. 2005a, Diker et al. 1992, Guhad et al. 1995). Assim, durante as primeiras 24 horas observámos que a infecção intramamária com S. agalactiae induziu um processo inflamatório agudo, com focos de necrose no parênquima mamário associado a infiltrado inflamatório neutrofílico. Adicionalmente, foi observada a presença de bactérias no interior de PMN à semelhança do que tinha sido descrito em mastite por S. aureus (Brouillette et al. 2004). Estes resultados evidenciam a função dos PMN na fagocitose de S. agalactiae (Rainard et al. 1991b). Como observado no nosso modelo, na fase inicial da infecção a resposta imune inata predomina. No entanto também o reconhecimento e controlo de S. agalactiae na glândula mamária é mediado por diferentes populações linfóides, nomeadamente linfócitos T e B. Estes dois tipos de imunidade actuam em coordenação e são essenciais na modelação da resistência e susceptibilidade da glândula mamária (Oviedo-Boyso et al. 2007, Rainard and Riollet 2006, Sordillo and Streicher 2002).
Os nossos resultados mostram uma activação precoce de linfócitos T CD4+ e CD8+, observada pelo aumento da expressão do marcador CD69 à superfície das células nos nódulos linfáticos mamários (Trabalho 1), após a infecção intramamária por S. agalactiae. Isto parece estar de acordo com o descrito por Soltys et al. (1999)
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que verificaram um aumento das duas populações linfocitárias na mastite provocada por Streptococcus em bovinos, não especificando no entanto, qual a espécie de Streptococcus. Numa fase posterior da infecção, a proliferação das populações linfocitárias é mais evidente, sobretudo no aumento de linfócitos B indicando que estas células também têm um papel na resposta immune contra S. agalactiae na glândula mamária. Também a presença de células expressando MHC classe II indica o processamento e posterior apresentação do antigénio às células T (Trabalho1).
A IL-10 além de diminuir a expressão de citocinas pró-inflamatórias (Cassatella
et al. 1993), estimula a proliferação e diferenciação de linfócitos B (Abbas et al. 2007).
Os nossos resultados mostram que existe um pico na produção desta citocina que antecede a proliferação de linfócitos B, podendo este facto estar relacionado com o aumento dos níveis de IL-10 na glândula mamária dos animais infectados com S.
agalactiae (Trabalho1). Efectivamente, verifica-se um aumento significativo na
produção de anticorpos específicos contra S. agalactiae na glândula mamária dos animais, 10 e 15 dias após a infecção intramamária com a bactéria (Trabalho 1). Os anticorpos da classe IgG2 apresentam uma elevada capacidade de opsonização, estimulando desta forma a fagocitose das bactérias opsonizadas pelos PMN (Burton and Erskine 2003). O aumento significativo de anticorpos IgG2 verificado após a infecção intramamária com S. agalactiae (Trabalho 1) pode também estar relacionado com a diminuição e erradicação da bactéria da glândula mamária como referido por Rainard et al (1988).
Em ensaios in vitro, usando anticorpos IgA contra S. agalactiae provenientes de leite de bovinos experimentalmente infectados com a bactéria, foi observado que estes anticorpos contribuem para a opsonização desta bactéria pelos PMN (Mackie et
al. 1986). Os nossos resultados também demonstram uma produção de IgA durante a
resposta inflamatória à infecção intramamária por S. agalactiae para possivelmente impedir a disseminação da bactéria pelo tecido mamário (Trabalho 1).
Também no nosso modelo animal existe uma produção de anticorpos da classe IgG específicos contra a bactéria no soro dos animais infectados por via intramamária (Trabalho 1) sugerindo uma origem sistémica de anticorpos e não só uma produção local, o que também foi descrito em mastite provocada por S. agalactiae e S. aureus em bovinos (Leitner et al. 2000, Logan et al. 1984).
A análise histológica permitiu também observar a progressiva substituição dos PMN por macrófagos, linfócitos e plasmócitos no tecido mamário após a infecção por
S. agalactiae, reflectindo a evolução da reacção inflamatória aguda para um processo
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Nas infecções naturais em bovinos a presença de microrganismos está associada com os danos no tecido mamário (Zhao and Lacasse 2008). Estudos com
S. aureus demonstram que a infecção por esta bactéria provoca necrose do tecido
secretor e a sua substituição por tecido não secretor na glândula mamária bovina (Nickerson and Heald 1981, Trinidad et al. 1990). Também na infecção intramamária experimental com S. agalactiae, na análise histológica da glândula mamária, observa- se um processo inflamatório crónico que leva a uma atrofia severa do parênquima mamário, que é substituído por tecido fibroso e adiposo após 15 dias de infecção (Trabalho 1). Assim, após a infecção com S. agalactiae conseguiu-se estabelecer na glândula mamária um processo inflamatório agudo com uma evolução para um processo inflamatório crónico em analogia ao que se passa na infecção natural em bovinos (Jubb and Nigel 2007). Algumas diferenças, no entanto, devem ser levadas em conta como a formação de piogranulomas observados no modelo experimental de ratinho e não descrito nos bovinos naturalmente infectados, o que pode dever-se ao número inicial de bactérias usado na infecção intramamária experimental ser superior ao da infecção natural.
Apesar de ser aceite que S. agalactiae é um parasita obrigatório da glândula mamária (Keefe 1997) os nossos resultados demonstraram uma disseminação da bactéria nos tempos iniciais da infecção para os órgãos sistémicos (Trabalho 1) semelhante ao que está descrito para S. aureus em modelos experimentais de mastite (Anderson 1987, Brouillette et al. 2004). Não sendo do nosso conhecimento que esta disseminação aconteça nos bovinos infectados com S. agalactiae, podemos especular que esta disseminação ocorrerá nas fases iniciais da infecção sendo depois controlada.
Durante toda a cinética da infecção os animais mantiveram-se sem sinais clínicos de infecção (Trabalho 1) confirmando que a natureza da infecção por S.
agalactiae é essencialmente sub-clínica (Keefe 1997). Os nossos resultados
demonstram uma produção de imunoglobulinas, citocinas e estimulação de linfócitos em resposta à infecção intramamária por S. agalactiae na glândula mamária (Trabalho 1).
O leite não é só uma fonte de nutrientes para os recém-nascidos mas tem um efeito protector nas primeiras semanas de vida (Van de Perre 2003) e no desenvolvimento do sistema imune neonatal (Reber et al. 2008a, b). Ao comparar a infecção intramamária com S. agalactiae na idade adulta, em animais que foram amamentados por mães infectadas com a bactéria, verificamos que estes apresentavam uma diminuição significativa na colonização intramamária comparativamente a animais que foram amamentados por mães não infectadas
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(Trabalho 2). No entanto, verificamos que existe paralelamente uma elevada destruição do tecido mamário nos animais que foram amamentados por mães infectadas com a bactéria. Assim, na análise histológica da glândula mamária dos animais amamentados por mães infectadas, observa-se uma exacerbação dos fenómenos vasculares (congestão vascular e edema intersticial, associados à fase aguda do processo inflamatório e uma necrose mais extensa do parênquima mamário comparativamente aos animais amamentados por mães não infectadas (Trabalho 2).
Adicionalmente, esta reacção inflamatória é acompanhada por uma elevada produção de citocinas pró-inflamatórias iniciando a resposta inflamatória e promovendo o recrutamento de células para o local de infecção (Trabalho 2). Os nossos resultados demonstram que há uma produção preferencial de TNF-α nestes animais (Trabalho 2). Durante a inflamação o TNF-α é uma das citocinas responsáveis pela acumulação dos PMN na glândula mamária (Rainard and Riollet 2006). Foi demonstrado que a infusão intramamária de TNF-α induziu uma acumulação de PMN no úber dos ruminantes (Watanabe et al. 2000). Também num modelo experimental de ratinho, o pré-tratamento com TNF-α recombinante promove o recrutamento de PMN para a glândula mamária e a redução de S. aureus após a infecção (Sanchez et al. 1994). A produção preferencial de TNF-α, após a infecção intramamária com a bactéria nos animais que foram amamentados por mães com infecções intramamárias por S. agalactiae (Trabalho 2), pode ser responsável pela acumulação de PMN na glândula mamária destes animais o que está de acordo com o descrito anteriormente. Paralelamente, os nossos resultados mostram também que existe um aumento de outras citocinas proinflamatórias, IL-1β e IL-6 nos animais amamentados por mães com infecções intramamárias reforçando o papel destas citocinas na resposta inflamatória. Curiosamente, sendo a IL-1β também um importante mediador da resposta inflamatória (Bannerman et al. 2004), o aumento da sua produção nos animais amamentados por mães com infecções intramamárias é mais significativo nos tempos mais tardios da infecção (Trabalho 2). Esta elevada produção de citocinas pró- inflamatórias verificada nos animais amamentados por mães infectadas por S.
agalactiae pode contribuir para os severos danos verificados no tecido mamário destes
animais (Trabalho 2).
Embora a pesquisa de S. agalactiae nos animais amamentados com leite infectado não tenha revelado a presença da bactéria em nenhum órgão analisado durante o período de lactação, torna-se claro que a amamentação teve um efeito significativo na resposta à infecção nestes animais na idade adulta. Aliás, está descrito que a transferência de células maternas através do leite, em diversas espécies, incluindo os ruminantes, é importante no desenvolvimento do sistema imune neonatal
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(Reber et al. 2008a, b). Assim, as infecções intramamárias sub-clínicas com S.
agalactiae não só têm consequências nestes animais (Trabalho 1) como vão ter
importantes implicações na sua descendência (Trabalho 2). Se considerarmos que o mesmo pode ocorrer nas explorações leiteiras estes resultados reforçam o facto de que a detecção de infecções sub-clínicas e implementação de medidas de controlo eficazes são também essenciais para evitar a amamentação por animais infectados por S. agalactiae com evidentes consequências na sua descendência incluindo o tratamento e o abate prematuro destes animais.
A detecção da resposta humoral do hospedeiro contra proteinas extracelulares libertadas pelos microrganisnos durante o seu crescimento (Rosseels et al. 2006, Tollefsen et al. 2003, Willemsen et al. 2006) tem sido usada para desenvolver métodos de diagnóstico (Cho et al. 2006, Shin et al. 2008). Também na mastite por S.
agalactiae em bovinos naturalmente infectados com a bactéria foi detectada uma
resposta humoral específica contra as proteinas extracelulares libertadas pela bactéria (Trabalho 3). Os nossos resultados comprovaram que existe uma produção de anticorpos IgG1 específicos, contra as proteinas extracelulares de S. agalactiae no leite de bovinos infectados, comparativamente com animais não infectados com S.
agalactiae. Esta resposta humoral é específica para a infecção por S. agalactiae uma
vez que a produção de anticorpos IgG1 específicos contra as proteinas extracelulares de S. agalactiae é significativamente inferior no leite de animais infectados por outros microrganismos, tais como Bacillus spp. ou Streptococcus spp. Adicionalmente, observamos também uma resposta humoral específica no soro dos animais infectados com S. agalactiae contra as proteinas extracelulares da bactéria (Trabalho 3). Estes resultados sugerem uma origem sistémica dos anticorpos presentes na glândula mamária dos ruminantes e não só uma produção local (Trabalho 1 e 3) (Logan et al. 1984), o que pode explicar o facto de se detectarem anticorpos específicos contra as proteínas extracelulares nos quartos mamários infectados e não infectados com S.
agalactiae no mesmo animal infectado. Isto é particularmente interessante uma vez
que um único quarto mamário pode ser utilizado para a detecção de um animal infectado por S. agalactiae incluindo os que apresentam uma menor contagem de células somáticas (Trabalho 3). Estes resultados sugerem a possibilidade de usar estas proteínas extracelulares para o desenvolvimento de um método de diagnóstico de bovinos infectados com S. agalactiae. Tal como foi descrito para Mycoplasma bovis (Brank et al. 1999) por exemplo, a detecção da resposta humoral do hospedeiro poderá servir para identificar animais infectados mesmo na ausência de excreção da bactéria no leite, independentemente das manifestações clínicas, localização geográfica e história clínica do animal.
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No conjunto das proteínas extracelulares produzidas por S. agalactiae foi identificado um perfil de proteínas especificamente reconhecidas por anticorpos presentes no leite dos animais infectados com S. agalactiae, claramente distinto de animais não infectados ou infectados com outros microrganismos. Estas proteínas foram identificadas, uma com 105 KDa, foi reconhecida como uma proteína BPS (protectora de superfície do grupo B) e a outra, com 69 KDa, foi reconhecida como uma proteína da família 5’-nucleotidase.
A proteína BPS está descrita como sendo uma proteína R de superfície do GBS expressa em diferentes serótipos (Erdogan et al. 2002). Estas proteínas são usadas para caracterizar estirpes de GBS, à semelhança dos antigénios polissacarídeos (Flores and Ferrieri 1989). Adicionalmente, Erdogan et al (2002) demonstraram que a proteína BPS é um antigénio proteico capaz de conferir imunidade contra o grupo GBS.
Enzimas como a 5’- nucleotidase estão normalmente envolvidas no metabolismo energético celular. No entanto, está descrito que algumas bactérias são capazes secretar estas proteínas com funções na modelação do nível de ATP nos macrofagos e assim promover a sua morte (Punj et al. 2003).
Assim, tendo em conta os nossos resultados (Trabalho 3) e as referências na literatura fomos pesquisar a importância das proteínas extracelulares de S. agalactiae na indução de mastite (Trabalho 4).
A activação precoce in vitro de células T e B nos nódulos linfáticos intramamários indicaram, que estas proteínas poderiam estar relacionadas com uma resposta inflamatória na glândula mamária (Trabalho 4) à semelhança do descrito para exoproteínas de S. aureus (Leitner et al. 2002).
Durante as infecções mamárias, os danos causados no tecido da glândula são devidos quer aos componentes da resposta imune por parte do hospedeiro quer aos factores bacterianos (Zhao and Lacasse 2008). A produção e libertação destes produtos bacterianos vai provocar um recrutamento de células para a glândula mamária, nomeadamente PMN que vão contribuir para os danos no tecido mamário. Efectivamente, a análise histológica da glândula mamária de animais injectados com as proteínas extracelulares de S. agalactiae (Trabalho 4) demonstrou a presença de um processo inflamatório semelhante ao observado em animais infectados com S.
agalactiae (Trabalho1). No entanto, 6 horas após a injecção das proteínas
extracelulares observa-se congestão vascular e edema interstiticial mais intensos do que nos animais infectados com S. agalactiae, bem como hemorragias multifocais. Por outro lado, embora os animais injectados com as proteínas extracelulares apresentem necrose multifocal do parênquima mamário, esta não é tão severa como nos animais
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infectados com S. agalactiae, não assumindo um padrão coalescente ou localmente extenso (Trabalhos 1 e 4). O infiltrado celular inflamatório intersticial é idêntico em ambos os grupos (Trabalhos 1 e 4), embora o exsudado neutrofílico se apresente de forma moderada nos animais injectados com as proteínas extracelulares e desapareça nos 5 dias após a injecção (Trabalho 4), enquanto nos animais infectados é intenso e mantém-se assim pelo menos durante 5 dias (Trabalho 1).
Essa menor chamada de PMN pode estar relacionada com uma menor produção de citocinas pró-inflamatorias após a injecção das proteínas extracelulares de S. agalactiae. A IL-10 apresenta um aumento logo nas 6 horas após a injecção intramamária das proteínas extracelulares de S. agalactiae, atingindo um pico na concentração às 12 horas e mantendo-se constante durante todo o estudo, promovendo, provavelmente uma diminuição da produção das citocinas pró- inflamatórias (Trabalho 4). Os elevados níveis de IL-10 podem contribuir também para uma contínua tentativa de diminuir a extensão dos danos causados no tecido mamário após a injecção intramamária das proteínas extracelulares de S. agalactiae. No entanto, a análise histológica revelou que a injecção intramamária das proteínas extracelulares de S. agalactiae (Trabalho 4) também promoveu a atrofia do parênquima mamário, que é substituído por tecido fibroso e adiposo, de modosimilar ao que foi verificado com a infecção por S. agalactiae (Trabalho 1).
Os nossos resultados (Trabalhos 3 e 4) demonstram que estas proteínas extracelulares de S. agalactiae exercem um papel relevante na resposta imune do hospedeiro à infecção por esta bactéria, podendo, por isso, ter um papel relevante no estabelecimento da patogénese da mastite provocada por S. agalactiae.