Análises moleculares revelaram que os microsporídios são organismos eucariotas com um genoma muito reduzido com a amplitude de 2,3 Mb para a espécie Encephalitozoon
intestinalis e 19,5 Mb em Glugea atherinae, chegando a ser inferior ao da bactéria E. coli
(4,6 Mb) (Keeling & Slamovits 2004). A redução genómica terá implicado o desenvolvido de estratégias de compactação da informação genética ou, então, os microsporidios, no decurso da evolução, perderam informação genética correspondente a vias metabólicas
dependo assim dos recursos dos seus hospedeiros (Keeling et al. 2005). Sabe-se também que o genoma está organizado sob a forma de múltiplos cromossomas lineares (8 a 18) com as extremidades organizadas em telómeros (Weiss & Vossbrinck 1999, Keeling & Fast 2002). Em 2001, Katinka e colaboradores, com a sequenciação na íntegra do genoma de E. cuniculi, observaram a existência de somente 1997 genes codificantes para proteínas. Entre elas, as envolvidas nos processos de replicação de DNA, formação dos ribossomas e via da glicólise, bem como proteínas mitocondriais. Por outro lado, verificaram a inexistência de genes correspondentes à biossíntese de vários componentes, tais como nucleótidos, ácidos gordos e alguns aminoácidos.
De todas as moléculas, o rDNA é a molécula “alvo” em muitos dos estudos filogenéticos devido à presença de regiões hiper-conservadas na sequência, tornando susceptível o seu uso para efeito de comparação entre organismos distantes (Weiss & Vossbrinck 1999). Além disso, a estrutura secundária do rRNA torna possível a realização de alinhamentos baseados na sua estrutura e, assim, assegurar a comparação de caracteres homólogos nas análises filogenéticas (De Rijk & Wachter 1997, Lom & Nilsen 2003). Há muito que se sabe que ribossomas dos microsporídios assemelham-se aos dos procariotas (Ishihara & Hayashi 1968), no entanto, apresenta também algumas particularidades dos eucariotas (Vossbrinck et al. 1987). A SSU possui uma molécula de rRNA de 16S, enquanto que a LSU uma molécula de rRNA de 23S. A sequência do rRNA de 5,8S individualizada, tal como se encontra nos eucariotas, não existe nos microsporídios, mas existem algumas sequências homólogas da região 5,8S contidas no início da subunidade 23S, em resultado da ausência, entre ambas, da região espaço transcricional interno 2 (ITS2) (Vossbrinck & Woese 1986, Vossbrinck et al. 1987, Cavalier-Smith 1993). Esta invulgar característica, igualmente reportada em bactérias, nunca foi descrita noutros grupos de eucariotas.
Apesar da sequenciação do gene para o SSU rRNA ser largamente utilizada como marcador molecular para muitas espécies, recentemente tem sido sugerida a sequenciação preferencial do espaço ITS e do gene para o LSU rRNA para efeitos de comparações filogenéticas entre espécies muito afins (Tsai et al. 2005), nomeadamente entre as espécies que ocorrem na ictiofauna (Cheney et al. 2000). Presentemente, é conhecida a região ITS e o LSU rDNA (parcialmente) para algumas espécies. Dos microsporídios presentes na ictiofauna, somente para a espécie Heterosporis
anguillarum, o gene LSU rDNA foi sequenciado na sua totalidade (Tsai et al. 2002). A
estrutura da unidade do rDNA na íntegra é conhecida unicamente para a espécie
Encephalitozoon cuniculi, parasita que ocorre em várias espécies de mamíferos, incluindo
Infelizmente, os caracteres que são, geralmente, usados na classificação dos microsporídios para diferenciar os níveis superiores, isto é, o número de núcleos/célula, a presença de uma membrana a rodear o parasita (vesícula esporófora ou vacúolo parasitóforo) e o tipo de divisão nuclear, são incoerentes ao nível dos taxa género e espécie (Vossbrinck & Debrunner-Vossbrinck 2005). Sabe-se que a sequenciação unicamente do gene para o SSU rRNA contribuiu para a posição basal dos microsporídios nos cladogramas dos eucariotas, posicionamento erróneo até finais do século XX, devido ao artefacto gerado pela atracção dos ramos longos (Van der Peer et
al. 2000, Fast et al. 2003). Contudo, a sequenciação do mesmo tem provado ser bastante
útil no estabelecimento das relações filogenéticas dentro do grupo dos microsporídios, nomeadamente, para os taxa superiores ao género (Lom & Nilsen 2003). Idealmente, quando se pretende inferir em termos filogenéticos, devem ser usadas várias diferentes moléculas. Contudo, a análise dos resultados obtidos por sequenciação dos genes que codificam as proteínas tem-se revelado ser mais difícil devido à presença de codões degenerados para muitos aminoácidos, bem como devido da existência de várias formas de genes codificantes de proteínas estarem presentes no genoma (parálogos) fazendo com que seja mais difícil a identificação de homólogos (Lom & Nilsen 2003).
Pela análise filogenética efectuada por Vossbrinck e Debrunner-Vossbrinck (2005) num total de 125 sequências do gene para o SSU rRNA, disponíveis em várias bases de dados (p. e. GenBank), verificou-se que os microsporídios agrupam em 5 clados principais correspondentes a 3 classes: classe Aquasporidia é um grupo parafilético constituído por 3 clados, maioritariamente formado por microsporídios, que têm como hospedeiro animais de água doce; classe Marinosporidia correspondente aos microsporídios que ocorrem em animais aquáticos marinhos, salvo algumas excepções, tais como parasitas que têm como hospedeiro peixes de água doce, bem como microsporídios pertencentes ao género Dictyocoela, que ocorrem em anfípodes de água doce. Adaptação do hospedeiro a um novo habitat, aparentemente, é a explicação mais provável. O mesmo poderá ter acontecido a 2 microsporídios do género Vavraia e à espécie Trachipleistophora hominis, respectivamente parasitas de insectos e de humanos. Por sua vez, a classe Terresporidia engloba microsporídios que têm como hospedeiro, maioritariamente, insectos, répteis, aves e mamíferos, inclusivamente, humanos. O microsporídio Vittaforma cornae é uma das excepções, levando a crer tratar- se de um falso microsporídio de humanos, uma vez que parasita pacientes imunodeficientes. Segundo Lom e Nilsen (2003), as análises filogenéticas para os microsporídios que ocorrem na ictiofauna, sugere a formação de 5 grupos. Excepto o grupo 5, os restantes encontram-se englobados na classe Marinosporidia, recentemente
designada por Vossbrinck e Debrunner-Vossbrinck (2005). Classificação segundo Lom & Nilsen 2003
Grupo 1
(Grupo correspondente a nenhum taxon): Loma, Ichthyosporidium e Pseudoloma. Grupo 2
(Família Glugeidae Thélohan, 1892): Glugea. Grupo 3
(Fam. Pleistophoridae Doflein, 1901): Pleistotphora, Heterosporis e Ovipleistophora. Grupo 4
(Família Spragueidae Weissenberg, 1976): Spraguea; (Família Tetramicridae Matthews & Matthews, 1980) Microgemma, Tetramicra e Potaspora. Inclui também o género
Kabatana.
Grupo 5
(Família Enterocytozoonidae Cali & Owen, 1990): Nucleospora.
A análise filogenética do gene SSU rRNA do microsporídio Myosporidium não permitiu agrupá-lo em nenhum dos grupos (Baquero et al. 2005). Para os géneros com uma única espécie, Amazonspora (Azevedo & Matos 2003a), Microfilum (Faye et al. 1991) e
Neonosemoides (Faye et al. 1996), não existe informação molecular disponível.
Grupo 1
Existe informação molecular referente ao gene SSU rRNA para 4 das 12 espécies pertencentes ao género Loma, tratando-se de um grupo parafilético em que a espécie tipo, Loma branchialis, não está sequenciada. Para além de Loma spp., este grupo engloba sequências referentes a parasitas dos géneros Pseudoloma (Matthews et al. 2001) e Ichthyosporidium (Sprague & Vernick 1974). Os caracteres morfológicos do ciclo de vida do género Ichthyosporidium diferem em muito dos restantes do grupo, entre eles inclui-se núcleo em diplocário e todo o desenvolvimento em directo contacto com citoplasma da célula hospedeira. Possivelmente, a sequência (GenBank L39110) referente ao Ichthyosporidium sp., corresponderá a um parasita erroneamente classificado.
Grupo 2
Grupo monofilético com um alto “bootstrap”, que reúne todas as espécies do género
Tuzetia weidneri (= Pleistophora), descrito num crustáceo, agrupa com a espécie tipo G. anomala. Em todos os cladogramas elaborados, a espécie descrita como Pleistophora finisterrensis, parasita do verdinho Micromesistius poutassou, não agrupa com as
restantes do género, mas sim com G. anomala, situação que, indiscutivelmente, carece de uma reclassificação.
Grupo 3
Este grupo apresenta uma heterogeneidade, na medida em que engloba representantes que parasitam diferentes hospedeiros. O bootstrap para as sequências de Heterosporis spp. e Ovipleistophora spp. é elevado, constituindo um grupo formado, exclusivamente, por microsporídios em que o hospedeiro é de água doce. Apesar do género Pleistophora ocorrer, simultaneamente, em espécies marinhas e de água doce, não é de estranhar bootstrap superiores a 98% em vários cladogramas, uma vez que todas as sequências disponíveis dizem respeito a microsporídios marinhos. Este grupo engloba também espécies dos géneros Dictyocoela e Vavraia, bem como a espécie Trachipleistophora
hominis.
Grupo 4
Grupo composto, exclusivamente, por microsporídios que parasitam peixes, que alberga 5 géneros estritamente relacionados, tendo em conta os carateres morfológicos. Entre eles incluem-se a ausência da diferenciação de uma vesícula esporófora/ vacúolo parasitóforo, bem como núcleo unicário (excepto uma das fases do microsporídio dimórfico Spraguea spp.) durante todo o ciclo de vida. Os géneros Tetramicra e
Microgemma, aparentemente, constituem um grupo monofilético em todos os
cladogramas. O mesmo não sucede ao género Kabatana, que se caracteriza por parasitar, exclusivamente, o tecido muscular esquelético de peixes de água doce e de água salgada, motivo pelo qual, muito possivelmente, explica a parafilia do género. Grupo 5
Nos cladogramas elaborados por Vossbrinck e Debrunner-Vossbrinck (2005), este grupo encontra-se excluído da classe Marinosporidia, onde se encontram agrupados todos os microsporídios que parasitam a ictiofauna, para se posicionar na classe Terresporidia, formando um clado com o microsporídio Enterocytozoon bieneusi, parasita de mamíferos, incluindo humanos. Não é de estranhar, que em todas as análises filogenéticas, o género
Nucleospora se posiciona agrupado com as sequências seleccionadas como “outgroup”
(Docker et al. 1997, Lom & Nilsen 2003), visto que possui a invulgar característica de parasitar o nucleoplasma, em vez do citoplasma, como sucede com os outros microsporídios (Lom & Dyková 2002).
1.3. Mixosporidioses
As mixosporidioses são doenças causadas pela acção de parasitas do grupo dos mixosporídios (= mixozoários, como também são designados). Estes parasitas são metazoários, pertencentes taxonomicamente ao filo Myxozoa Grassé, 1970, e representam um grupo de grande importância económica, devido aos seus efeitos nefastos na aquacultura e na natureza. São parasitas, quase exclusivamente, de vertebrados poiquilotérmicos, principalmente peixes de água doce e salgada, bem como de alguns invertebrados. Presentemente, conhecem-se mais de 2200 espécies, agrupadas em 16 famílias e 65 géneros, a parasitar vertebrados (Lom & Dyková 2006, Køie et al. 2007b, Prunescu et al. 2007). Apesar de se saber que têm um ciclo de vida indirecto, envolvendo um invertebrado como hospedeiro definitivo e um peixe como hospedeiro intermediário, estes parasitas são conhecidos, principalmente, por provocarem infecções em peixes, visto que somente 180 tipos (17 grupos) de actinosporos foram descritos em invertebrados (Lom & Dyková 2006). Algumas ocorrências em platelmintas, anfíbios, répteis, aves e mamíferos foram também documentadas (Friedrich et al. 2000, Kent et al. 2001, Duncan et al. 2004, Eiras 2005, Garner et al. 2005, Jirkù et al. 2006, Prunescu et al. 2007, Bartholomew et al. 2008). Em humanos verificaram-se esporádicas ocorrências, que indicam tratar-se de presenças acidentais. Em alguns trabalhos foram descritos esporos encontrados nas fezes de pacientes que, muito provavelmente, serão provenientes da ingestão de peixes infectados (McClelland et al. 1997, Boreham et al. 1998, Moncada et al. 2001). O estudo dos mixosporídios tem sido desenvolvido nas mais variadas vertentes de investigação, nomeadamente nos aspectos morfológicos do seu ciclo de vida, processo de transmissão, taxonomia e identificação filogenética.
1.3.1. Posição taxonómica
Os esporos de mixosporídios foram, pela primeira vez, identificados por Jurine (1825), tendo sido classificados, mais tarde, por Otto Bütschii (1882) e incluídos na subclasse Myxosporida, pertencente à classe designada de Sporozoa (consultar a publicação, Lom & Dyková 2006). Desde então, os mixosporídios foram considerados protistas, em parte devido ao tamanho e à forma dos esporos, apesar de na época lhes ter sido reconhecido o parentesco com os organismos do filo Cnidaria. Após alguma hesitação inicial, os mixosporídios acabaram por ser reconhecidos como organismos metazoários. Presentemente, constituem uma superclasse do infrafilo Metazoa dentro do filo Opisthoconta (Cavalier-Smith 1998, Hausmann et al. 2003), em que a morfologia e
ultrastrutura está bem documentada através das inúmeras publicações (Azevedo et al. 1989, 2005, Current et al. 1979, Desser et al. 1983, Lom & Puytorac 1965a, 1965b, Lom 1969, Lom & Dyková 1992b, Sitjà-Bobadilla & Álvarez-Pellitero 1992, 1993a, 1993b, 1995, 2001), Por outro lado, vários estudos de biologia molecular sugerem semelhanças filogenéticas com os metazoários (Siddall et al. 1995), nomeadamente com os que apresentam simetria bilateral (Smothers et al. 1994, Anderson et al. 1998, Okamura et al. 2002, Siddall & Whiting 1999, Zrzavý & Hypša 2003).
1.3.2. Classificação Taxonómica