Existem diversos métodos para detectar e quantificar as cianotoxinas, porém esses métodos apresentam diferenças entre si, tanto no grau de sofisticação quanto com relação ao tipo de informação que fornecem. Os métodos analíticos se baseiam nas propriedades físico- químicas das cianotoxinas, como o peso molecular, cromóforos e reatividade devido à presença de certos grupos funcionais nas moléculas.(CUNHA, 2004). Além disso, a
seletividade e a sensibilidade são parâmetros importantes que devem ser levados em consideração na escolha de métodos para análise de cianotoxinas. (HARADA et al., 1999).
O método mais usual proposto pela Organização Mundial da Saúde - "Toxic Cyanobacteria in Water: A Guide to Their Public Health Consequences, Monitoring and Management", Editado por Chorus & Bartram (WHO, 1999) - para a determinação da concentração de saxitoxinas é o da cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), com derivatização pós-coluna e detecção por fluorescência, o qual foi descrito por Oshima et al. (1995) e WHO (1999).
O método foi desenvolvido inicialmente para análises de saxitoxinas no ambiente marinho, particularmente em mariscos, mas posteriormente se mostrou também adequado para amostras dessa toxina produzida por cianobatérias. Apesar de ser o método mais difundido no momento, a disponibilidade de padrões analíticos para todas as variantes de saxitoxina é limitada.(CUNHA, 2004).
3.1.6.1.3 Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC/CLAE)
A cromatografia líquida de alta eficiência se tornou a técnica mais utilizada para separação e detecção das saxitoxinas, visto os excelentes níveis de sensibilidade e de reprodutibilidade apresentados. (CUNHA, 2004). As toxinas são detectadas por fluorescência após passarem por processo de oxidação, antes da separação cromatográfica, dito derivatização pré-coluna ou após a passagem na coluna, método de derivatização pós-coluna. É considerada uma importante técnica de separação, constituindo-se por instrumentos bastante sofisticados. A fase móvel é eluída sob altas pressões em pequenas colunas recheadas, podendo separar diversos compostos presentes em diferentes tipos de amostras, em até poucos minutos, com alta resolução, eficiência e sensibilidade. Uma das vantagens é que independe da volatilidade ou estabilidade térmica, diferente da cromatografia gasosa, sendo necessário apenas que a amostra seja solúvel na fase móvel. As variedades de detectores que podem ser acoplados possibilitam que uma ampla variedade de compostos seja determinada, fornecendo um registro da composição do efluente saída da coluna. (CUNHA, 2004).
O detector de fluorescência é um dos mais sensíveis atualmente, podendo detectar quantidades da ordem de picograma (10-12 g). Possui um filtro primário que deixa passar somente o comprimento de onda definido para excitação, e um filtro secundário para eliminar
o comprimento de onda excitante e deixar passar o comprimento de onda emitido pela amostra. (CUNHA, 2004).
Dois métodos baseados na técnica de CLAE com separação por fase-reversa são bastante utilizados para análise de saxitoxinas e detectam as toxinas após derivatização por oxidação. (CUNHA, 2004). O objetivo da derivatização é formar uma estrutura molecular a qual o detector tenha alta sensibilidade ou ainda para aumentar a seletividade deste. Para detectores de fluorescência, a derivatização está baseada em reação com compostos não- fluorescentes, gerando derivados fluorescentes. (JEFFERY et al., 1989;CUNHA, 2004). Os métodos em questão envolvem a derivatização das toxinas antes da separação na coluna cromatográfica (FLYNN & FLYNN, 1996; LAWRENCE et al., 1995) ou pós-coluna (OSHIMA 1995):
• método de derivatização pré-coluna - a derivatização pré-coluna consiste em derivatizar os compostos de interesse antes da injeção no sistema cromatográfico. Possíveis interferências devido ao excesso de reagentes e subprodutos da reação são apontadas como as principais desvantagens desse método. (JEFFERY et al., 1989). Ainda, os reagentes utilizados para derivatização podem causar a diminuição do tempo de vida útil da coluna cromatográfica .(CUNHA, 2004);
• método de derivatização pós-coluna - a derivatização pós-coluna ocorre após a eluição dos compostos de interesse da coluna cromatográfica. A reação precisa ser rápida e não deve haver resposta do detector a qualquer excesso do derivatizante. A desvantagem seria a necessidade de outros equipamentos associados à linha cromatográfica para adição dos reagentes derivatizantes. (CUNHA, 2004).
Lawrence & Ménard (1991) desenvolveram um trabalho comparativo dos métodos de pré e pós-derivatização de saxitoxina, no qual concluíram que a pós-derivatização forneceu melhor resposta, devido à sensibilidade deste em detectar inclusive as N-1-hidroxitoxinas (Neo-STX, GTX 1 e GTX 4). Com isso, a escolha da técnica cromatográfica ideal para separação de determinada amostra tem que levar em consideração as propriedades do composto de interesse, tais como a massa molecular, a solubilidade e a estrutura química.
Cunha (2004) apresenta uma conversão dos dados de cromatografia líquida em valores de toxicidade, preconizado pela Portaria 518/MS/04 para água de abastecimento
público. Como a Portaria 518 expressa o Valor Máximo Permitido (VMP) das saxitoxinas em microgramas por litro de equivalentes de saxitoxina (3µg/L eq. STX), faz-se necessária uma conversão dos resultados obtidos das toxinas individualmente por cromatografia, para um valor que represente a toxicidade total da amostra na forma da variante mais tóxica, ou seja, a saxitoxina. Para tanto, utiliza-se a toxicidade de cada variante em relação à da saxitoxina (Tabela 3), cujos valores foram obtidos através de bioensaio com camundongos, usando-se toxinas purificadas. (HALL et al, 1990, CUNHA, 2004). O valor obtido por cromatografia (Ci) deve ser utilizado na equação:
eq. STX = ∑ni=1 Ci * Ti (µg/L)
Onde: Ci = concentração da toxina em microgramas por litro (µg/L) Ti = toxicidade relativa da toxina
Tabela 3 Valores em ordem decrescente de toxicidade relativa das saxitoxinas
Toxina Toxicidade relativa
Concentração equivalente a 3 µg/L eq. STX/L (µg/L) STX 1,0000 3 GTX1 0,9940 3,02 Neo-STX 0,9243 3,25 GTX 4 0,7261 4,13 GTX3 0,6379 4,70 dc-S'I'X 0,5131 5,85 dc-GTX 3 0,3766 7,97 GTX 2 0,3592 8,35 dc-GTX2 0,1538 19,51 C2 0,0963 31,15 GTX 6 (B2) 0,0644 46,58 GTX 5 (B1) 0,0644 46,58 C4 0,0576 52,08 C3 0,0133 225,56 C1 0,0060 500,00
Fonte: Adaptado de Hall et al (1990), Melo Filho (2006).
Dessa forma, pode-se observar a importância de um método de análise sensível e seletivo para a avaliação da presença das saxitoxinas, vista a disparidade entre os valores de potencial tóxico de cada variante. (CUNHA, 2004). Os métodos de detecção das saxitoxinas CLAE se encontram limitados pela indisponibilidade de aquisição dos padrões das diferentes variantes, permitindo a verificação de apenas algumas saxitoxinas, porém as mais potentes.
3.2 REMOÇÃO DE CIANOBACTÉRIAS E CIANOTOXINAS NO TRATAMENTO