L’observation des premières structures révèle que la conformation des acides aminés est limitée par des contraintes stériques ( ) (157). Ramachandran et coll. observent aussi que les propriétés de la chaîne latérale d’un acide aminé telles que sa ramification et la nature des atomes dont il est composé influent sur les combinaisons d’angles permises. Malgré la limitation du nombre de conformations, les possibilités combinatoires de celles-ci demeurent innombrables.
Figure 3
À partir d’une argumentation logique, Cyrus Levinthal énonce lors d’une conférence, ce qui est maintenant connu sous le nom du paradoxe de Levinthal (traduction libre de la transcription par A. Rawitch d’un séminaire présenté par Cyrus Levinthal) (158):
« Si l’on prend une protéine de 100 résidus et que l’on suppose que chaque résidu peut adopter trois conformations (angle φ et ψ typique d’une hélice-α, d’un feuillet-β ou bien d’une région désordonnée), on peut donc dire qu’il y a 3100 ou 1x1048 états possibles. Si l’on suppose que la protéine peut explorer 1 état par vibration moléculaire, et que celles-ci se produisent à un taux d’une par femtoseconde, on en déduit que l’exploration de tous les états possibles prendra 1x1048 femtosecondes ou 1x1033 secondes. Comme, il y a 1x108 secondes dans une année, l’exploration de tous ces états prendraient 1x1025 années, soit plus d’années qu’en compte l’univers ».
La conclusion triviale tirée de ce raisonnement logique est donc que les protéines se replient vers la structure native par un phénomène qui permet d’éviter une recherche exhaustive de toutes les conformations possibles. Cela concorde avec les résultats expérimentaux de l’époque qui suggèrent que les protéines puissent se replier en quelques minutes (11;159;160), une constatation qui ne s’est que renforcée avec la découverte des protéines ou des domaines se repliant en deux-états (voir section L’état de transition). Il faut alors déterminer les mécanismes de la coopérativité qui permettent de passer outre cette recherche exhaustive.
Ces arguments mènent logiquement à la naissance de ce concept nommé voies de repliement (« folding pathways »). Dans un article fréquemment cité, Levinthal expose une théorie du repliement qui impliquerait la formation progressive de la structure native par la consolidation de structures locales, qui pourraient débuter à se structurer dès l’émergence du ribosome de la chaîne polypeptidique naissante. Ainsi, la condensation ou l’initiation de la formation de structures dans un segment de séquence entraînerait à son tour des changements du même genre dans une autre région du polypeptide et ainsi de suite jusqu’à l’obtention de la structure native (161). Pousser à son extrême le principe de voie de repliement prédit que la structure native d’une protéine est formée par la formation d’une série d’états intermédiaires suivant un ordre déterminé.
Les premières études de dénaturation et de renaturation de protéines (i.e., ferrihémoglobine et lysozyme entre autre) ont été réalisées dans les années 50 et 60 en utilisant des variations du pH ou de température (réviser dans (75)). Les protéines dénaturées dans ces conditions subissent souvent une seconde transition lorsqu’elles sont transférées dans des dénaturants plus forts tels que le Gdm-HCl ou l’urée. Par conséquent, les espèces obtenues en conditions douces de dénaturation possèderaient des caractéristiques à la fois de l’état natif et de l’état dénaturé. L’hypothèse est donc qu’elles partageraient des similarités avec des états intermédiaires formés au cours de la réaction, i.e. sur la voie de repliement.
L’amélioration des appareils et des techniques de mixage rapide en permettant de réduire le laps de temps qui s’écoule entre le mixage et le début de la mesure du repliement ainsi que son couplage avec diverses méthodes spectroscopiques de détection telles que le DC dans l’ultraviolet (UV) et la fluorescence ont permis la découverte d’intermédiaires cinétiques. Durant les années 1970-80, une série d’observations sur la cinétique du repliement de la β-lactamase, de la ribonucléase-A et de l’anhydrase carbonique-B avait suggéré la formation rapide d’intermédiaires possédant des éléments de structures secondaires natifs, mais peu de contacts à longue distance qui sont plutôt le propres de la structure native des protéines globulaires.
Intermédiaires
Comme je l’ai souligné plus haut une conséquence de la théorie des voies de repliement est que la formation de l’état natif à partir de l’état dénaturé nécessiterait la formation d’intermédiaires à la structure de plus en plus semblable à l’état natif:
U⇔Ih⇔…⇔It⇔F (3)
Une conclusion triviale qui peut être tirée de l’équation (3) est que les intermédiaires devraient démontrer des caractéristiques à la fois des états dénaturé et natif, la similarité supérieure avec l’un ou l’autre de ceux-ci dépendant de la position de l’intermédiaire en question sur le profil de la réaction. Mais quelle pourrait bien être la nature de ces intermédiaires? La préséance de la formation des structures locales dans cette théorie prédit que l’intermédiaire hâtif (Ih) devrait former des éléments de structures secondaires dans certaines régions, mais il serait largement dépourvu de tout contact à longue distance. D’autre part, l’intermédiaire tardif (It) typique adopterait une version légèrement dégénérée de la structure native qui démontrerait comme distinctions principales des fluctuations supérieures des chaînes latérales des acides aminés et un plus grand accès du solvant au cœur hydrophobe. Ces descriptions très brèves permettent d’introduire les prochaines sections qui présenteront les preuves de la présence de divers types d’intermédiaires. Par ailleurs, cette vision de la voie de repliement est tombée en désuétude, car elle a peu ou pas du tout été confortée par des données expérimentales. En effet, un nombre élevé de protéines se replie en deux-états et de toute évidence ne rencontrent pas d’intermédiaires majeurs successifs sur leur voie de repliement. Généralement, la littérature est plus en accord avec la présence d’un nombre restreint d’intermédiaires, si ce n’est aucun, au cours du processus de repliement.
Par ailleurs, même dans le contexte où il y a présence d’intermédiaires, il reste à vérifier qu’ils se trouvent vraiment sur la voie de repliement afin de démontrer leur nécessité à la formation de la structure native. Pour accomplir cette démonstration, ce type d’intermédiaires doit être distingué de ceux qui sont contre-productifs à la réaction de
repliement et conséquemment ne se retrouvent pas sur la voie de repliement (i.e., entre l’état dénaturé et l’état natif) ou de formes distinctes de l’état dénaturé qui pourraient se replier à des taux différents :
I⇔U⇔F (4) UR⇔F (5) UL⇔F
U⇔I⇔F (6)
où UR et UL sont des conformations de l’état dénaturé se repliant rapidement et lentement, respectivement. Une cause courante de ce dernier phénomène (équation (5)) est la présence de l’isomère non-natif d’une ou plusieurs prolines. Le cas de figure décrit à l’équation (4) évoque la présence de structures non-natives dans les conditions initiales de l’expérience de repliement. La déstabilisation de ce type d’intermédiaires par l’ajout de dénaturant devrait provoquer une accélération du repliement. La démonstration de la présence d’intermé-
Figure 13. Modèle de diagramme d’énergie de réactions de repliement comportant un intermédiaire.
A, Diagramme d’énergie d’une réaction de repliement de type trois-états avec formation d’un intermédiaire cul-
de-sac. B, Diagramme d’énergie d’une réaction de repliement de type trois-états avec formation d’un intermédiaire. C, Diagramme d’énergie d’une réaction de repliement avec formation d’un intermédiaire de haute énergie. Le dernier type d’intemédiaires (C) est moins stable que l’état dénaturé contrairement aux exemples présentés dans les deux panneaux précédents. Cela signifie que ces intermédiaires seront formés de manière plus transitoire et devraient être plus difficiles à observer. La stabilité de ce type d’intermédiaires dépendra aussi de la hauteur de la barrière d’activation de la transition I→F.
diaires authentiques (i.e. différent des cas de figure décris ci-dessus) sur la voie de repliement indique que la réaction de repliement analysée est de type trois-états ou plus en fonction du nombre d’intermédiaires détectés (équation (3) et (6)). Pour ces raisons, à chaque fois qu’un nouvel intermédiaire est découvert, il est de prime importance de
déterminer s’il se trouve sur (équation (6)) ou bien hors de la voie de repliement (équation
(4)). Les intermédiaires sur la voie de repliement correspondant au modèle de l’équation (6) peuvent être plus ou moins stables, soit respectivement de faible ou de haute énergie relativement aux états fondamentaux (Figure 13 et les sections ci-dessous). Par ailleurs, le rôle, la présence généralisée, voire la nécessité des intermédiaires aux mécanismes de repliement ou à leur processivité – à savoir si les intermédiaires sont généralement productifs, contre-productifs, un artéfact de certaines réactions de repliement ou bien s’ils se forment généralement avant ou après l’état de transition – sont toujours le sujet d’âpres débats.
Présences d’intermédiaires : preuves thermodynamiques et cinétiques
La présence d’intermédiaires peut être suspectée lorsque les courbes de dénaturation démontrent plus d’une transition coopérative ou qu’elles divergent en fonction des paramètres mesurés pour suivre la réaction de dénaturation d’une protéine donnée. Dans le premier cas, c’est un indice de la présence d’un intermédiaire stable à certaines conditions à l’équilibre. En second lieu, les courbes de dénaturation de la β-lactamase obtenues par la mesure de la fluorescence ou du DC dans l’UV de haute longueur d’onde montre une transition à plus faible concentration que celle réalisée par DC dans l’UV de basse longueur d’onde (162). Ces deux types de sondes permettant respectivement d’estimer le changement au niveau des structures tertiaires et secondaires d’une protéine dans un contexte donné, les résultats contradictoires obtenus dans le cas mentionné ci- dessus indiquent donc un découplage dans la formation de la structure native, qui suggère la présence d’un état intermédiaire comprenant des structures secondaires, mais au sein duquel il y aurait quasi absence des contacts à longue distance typiques de la structure tertiaire. Notez que la microcalorimétrie est une autre approche qui permet de confirmer à l’équilibre thermodynamique la validité du modèle de repliement deux-états pour une protéine donnée (163;164).
En second lieu, la présence d’un intermédiaire peut être suspectée dans le cas où les paramètres thermodynamiques obtenus à l’équilibre et calculés à partir des paramètres cinétiques diffèrent significativement. Advenant le cas que ce critère d’équivalence soit rempli cela ne signifie pas nécessairement qu’il y a absence d’intermédiaires, mais cela suggérerait à tout le moins que les intermédiaires potentiels présents dans ce contexte seraient instables, ce qui expliquerait la difficulté de les identifier.
La présence d’intermédiaires cinétiques peut être suspectée dès le moment que plusieurs phases exponentielles sont observées dans la réaction de repliement. Les intermédiaires peuvent fréquemment être reliés à la présence de ponts dissulfures ou de prolines dans les protéines. Les intermédiaires les plus intéressants sont ceux qui peuvent être reliés à d’autres phénomènes que ce soit la formation de structures locales ou des contraintes topologiques. Ceux-ci peuvent être révélés par des déviations dans la linéarité de la relation entre le taux de repliement ou de dépliement et la concentration de dénaturant, (voir section Ingénierie des protéines et Chapitre 1 : bases théoriques). Il pourrait s’agir d’intermédiaire de haute énergie, donc marginalement stables, dans le cas où les autres indicateurs de la présence d’intermédiaires mentionnés ci-dessus sont négatifs.
Intermédiaire hâtif
Il a été démontré que des segments de la structure primaire de certaines protéines qui correspondaient à des éléments de leur structure secondaire (i.e. hélice-α, épingle à cheveux) ainsi que des polypeptides modèle tel que des poly-alanine ou -valine pouvait se replier de manière autonome (réviser dans (165;166)). À cause de la nature strictement locale des ponts hydrogène impliqués dans la stabilisation des hélices-α, celles-ci devraient être particulièrement promptes à se replier indépendamment. Le peptide C de la ribonucléase-A a été le premier exemple d’une hélice-α se repliant isolément. Plusieurs autres cas, où il a été démontré que des hélices-α sont partiellement formées dans des conditions dénaturantes, ont été divulgués depuis ces premières études (par exemple (96;167;168)). Un autre motif, l’épingle à cheveux, peut se replier seul (169), j’y reviendrai
ci-dessus, dans un cas d’espèce chez ubiquitine. Ces observations cadrent bien avec l’hypothèse de la formation d’intermédiaire hâtif (« fast » ou « early intermediate ») comportant la formation de structures locales, en particulier de structures secondaires dès le tout début de la réaction. Les acides aminés affichent des propensions variables pour les divers types de structures secondaires, qui sont dues à des préférences dans l’adoption de leur conformation, soit plus précisément leurs angles φ et ψ (voir section Nature du lien
peptidique). Par conséquent, les segments de la structure dépendamment de leur séquence ont des propensions diverses à former la structure secondaire native correspondante ou d’autres non-natives. Une méthode informatique prenant en compte ces diverses propensions a été développée et permet de calculer les éléments de structures secondaires les plus aptes à se replier de manière isolée (170). Par exemple, en ce qui concerne l’ubiquitine cette méthode prévoit que le motif épingle à cheveux en amino-terminal serait le segment possédant la tendance la plus forte à se replier de manière indépendante. Dans les faits, des peptides correspondant au motif épingle à cheveux en amino-terminal d’ubiquitine ou à des peptides plus longs, incluant aussi l’hélice-α, ont la capacité de se former de manière autonome (171-175). De plus, le motif épingle à cheveux en amino- terminal d’ubiquitine se replie à un taux supérieur à celui de la protéine complète, ce qui rend vraisemblable que le repliement de ce segment précède celui du reste du cœur hydrophobe (166) (voir la Figure 14 pour un schéma de la structure du motif épingle à cheveux d’ubiquitine ou du dimère formé par les résidus 1-51 d’ubquitine).
Cependant, la plupart des éléments de structures secondaires isolés sont incapables de se replier. La véritable question est donc de savoir si la formation/déformation fluctuante de certaines structures secondaires, telles que des segments hélicoïdaux ou des tours-β, au tout début de la réaction de repliement pourrait limiter la recherche de la structure native parmi toutes les conformations accessibles (176). Il est difficile de vérifier expérimentalement une telle hypothèse, mais un détail important qui est toujours le sujet d’argumentations est le rôle joué respectivement par les ponts hydrogène et les interactions hydrophobes dans la formation de ces intermédiaires hâtifs.
Modèle de la charpente
Le modèle de la charpente (« framework ») est en accord avec une vision séquentielle du mécanisme de repliement. Il postule donc la formation de la structure native par la formation d’une série d’intermédiaires à la structure de plus en plus complexe. Par conséquent, ce modèle accorde beaucoup d’importance précisément à ces interactions locales, qui à partir de structures fluctuantes dans les stages initiaux de la voie de repliement, mèneraient à la formation des éléments de structures secondaires. L’établissement des contacts à longue distance serait ensuite facilité par l’arrimage d’éléments de structures secondaires préformés (165;177). Ce modèle s’appuie sur la formulation mathématique présenté par Karplus et coll. (178), sous le nom de la théorie de diffusion-collision. Celle-ci fait une description satisfaisante de la formation extrêmement rapide de la structure native de certaines protéines, pour lesquelles la limite théorique du taux de repliement est établie par la vitesse limite de la diffusion d’un polypeptide dans l’eau, et telle qu’elle a été observée chez des domaines strictement composés d’hélices-α. Par contre, il a été démontré qu’en dehors de ces cas limites, cette théorie demeure inapplicable.
Accrétion hydrophobe
L’accrétion hydrophobe (« hydrophobic collapse ») est le phénomène par lequel la chaîne polypeptidique se contracte par la formation d’interactions plus ou moins spécifiques impliquant des chaînes latérales hydrophobes. Ce processus se produirait pratiquement instantanément au moment du transfert de la chaîne polypeptidique d’un environnement permettant la solvatation des chaînes latérales hydrophobes à un autre la défavorisant, comme c’est le cas par exemple lors du transfert du ribosome au cytoplasme ou bien au moment de la dilution d’un échantillon de protéine dénaturé dans une solution renaturante. Cette désolvatation partielle des chaînes latérales hydrophobes pourrait favoriser la formation des ponts hydrogène essentiels à la formation des structures secondaires.
Originellement, l’accrétion hydrophobe est une théorie élaborée afin d’expliquer le mécanisme de repliement de la chaîne polypeptidique (143;179;180), qui a été échafaudée à partir de simulations informatiques soulignant l’importance du rôle des chaînes latérales hydrophobes (i.e. en particulier leur nombre relatif, leur fréquence et leur dispersion sur la chaîne d’acides aminés) à l’acquisition et à la conservation de la propriété de se replier, la caractéristique primordiale des protéines globulaires. Fondamentalement, ce mécanisme signifie que la réaction de repliement s’effectue à partir d’une conformation de la chaîne polypeptidique ramassée sur elle-même, donc dans un volume restreint. Cela pourrait mener à l’imposition de contraintes stériques qui peuvent limiter initialement le nombre de conformations accessible à une chaîne polypeptidique (d’après ces contraintes, 1x10-44 des conformations possibles sont réellement accessibles à une chaîne polypeptidique de 100 acides aminés (179); voir aussi Y-a-t-il des voies de repliement ou le mécanisme de
repliement est-il séquentiel : introduction aux intermédiaires). Bien qu’elle ne fournisse pas un modèle détaillé du mécanisme de repliement, la théorie de l’accrétion hydrophobe contribue à aplanir le paradoxe de Levinthal. En effet, la formation de liens locaux d’origine native qui impliquent des chaînes latérales hydrophobes permettrait d’expliquer comment des contacts entre des résidus éloignés, mais à proximité des premiers peuvent alors être favorisés, et via ce phénomène introduirait une certaine forme de coopérativité au processus de repliement (143) (cette description est en quelques sorte précurseur de la vision dans laquelle la topologie de la structure native définit le mécanisme de repliement; voir la section Les protéines partageant la même topologie se replient-elles par un
mécanisme identique : oui et non). Il demeure que plusieurs éléments reste à clarifier autour de cette théorie comme la préséance de l’accrétion sur la formation des structures secondaires ou vice-versa et de la spécificité des interactions hydrophobes formées initialement (181;182). Aussi, il n’est pas clair que le phénomène d’accrétion, particulièrement celui qui est relié à ce qui est appelé l’intermédiaire d’accrétion hydrophobe de la phase d’impulsion (« burst phase hydrophobic collapse intermediate »; voir le Chapitre 1 : Bases Théoriques) ne serait pas un artéfact des études de repliement
Intermédiaire tardif : le globule fondu
Le terme de globule fondu s’applique à des intermédiaires plus structurés et en quelques sortes plus tardifs selon le schéma général de l’équation (3). Plusieurs études expérimentales, portant entre autre sur l’α-lactalbumine, le cytochrome c et l’apomyoglobine, permettent de proposer un portrait-robot du globule fondu. Typiquement, ce type d’état intermédiaire démontre une rétention très forte des structures secondaires et du niveau de compaction de l’état natif. Par contre, l’empaquetage des chaînes latérales hydrophobes et aliphatiques en particulier ne serait pas terminé, suggérant que les contacts de nature tertiaire seraient non-formés ou à tout le moins qu’ils n’auraient pas encore acquis le niveau de rigidité cristalline attendu du cœur hydrophobe. Cela mènerait à l’exposition en surface de chaînes latérales hydrophobes ordinairement enfouies et à l’établissement de contacts potentiellement non-natifs (183;184). Ce type d’intermédiaire est l’espèce dominante chez plusieurs protéines dans des conditions de pH acide (ordinairement de pH 2 à 4 selon les protéines).
Est-ce que la détection d’états possédant les caractéristiques du globule fondu dans ces conditions expérimentales à l’équilibre thermodynamique est suffisante afin de proposer leur présence au cours du processus de repliement (i.e. dans les traces cinétiques du repliement)? Il est difficile de répondre succinctement à cette question. Par exemple, les traces de la cinétique de repliement de plusieurs protéines obtenues en présence de 1- anilino-8-naphtalènesulfonate (ANS)15 révèlent deux phases exponentielles, une première ascendante et une seconde descendante, qui correspondraient respectivement à la transition de l’état dénaturé vers le globule fondu et de ce dernier à l’état natif. La présence généralisée de cet intermédiaire reste à démontrer en particulier pour les petites protéines