Viabilité des cellules microbienne dans l’eau du nuage

Un aperçu des méthodes d’estimation de la « viabilité » des cellules microbiennes utilisées dans les études sur l’eau nuageuse est présenté ci-dessous.

Auparavant, la méthode la plus fréquemment utilisée pour déterminer la viabilité d’une cellule issue de l’air (études majoritaires en atmosphère sèche) consistait à observer sa capacité à croître sur un milieu nutritif, et à comptabiliser les unités formant une colonie microbienne (UFC⁸) sur un milieu nutritif solide. Cette méthode à l’avantage d’être facilement utilisable et de permettre d’isoler des souches microbiennes récoltées de l’environnement. Son inconvénient majeur est qu’elle entraine la sélection des souches microbiennes les plus adaptées aux conditions de culture utilisées: milieu solide ou liquide, composition chimique, composition de l’air, température et hygrométrie pendant l’incubation, présence de lumière, durée de l’incubation, etc. De plus la présence de microcolonies et d’ultramicrocolonies peut-être ignorée (Torrella and Morita, 1981). Enfin cette technique ne permet pas de recenser les cellules se trouvant dans un état viable non cultivable (VBNC), la perte de cultivabilité apparait chez des bactéries normalement cultivables lorsqu’elles sont

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soumises à un facteur stressant (comme le passage d’un milieu liquide pauvre en nutriments à un miilieu de culture gélosé).

Le dénombrement des cellules viables peut également être réalisé par des techniques d’observation microscopique ou de cytométrie en flux⁹ (Davey et al., 2001) en utilisant des marqueurs chimiques et/ou biologiques (colorants ou fluorochromes). Certaines cellules sont observables par les techniques utilisant la fluorescence, sans l’ajout de marqueur, c’est le cas des particules auto-fluorescentes comme la plupart des cellules chlorophylliennes : débris végétaux, cyanobactéries, microalgues etc.

La mesure de la concentration en ATP¹⁰ dans un échantillon contenant des cellules permet d’estimer en partie la viabilité cellulaire via l’activité métabolique. La mesure de l’ATP est réalisée par bioluminescence, la réaction entre la luciférase (enzyme extraite des lucioles) et l’ATP produit des photons dont l’intensité est proportionnelle à leur concentration dans le milieu (Stanley and Williams, 1969 ; Lundin et al., 1986).

A partir d’échantillons d’eau nuageuse prélevés au mont Rax (1644 m.a.s.l, Autriche), Bauer et al. (2002) ont observé des fractions de cellules cultivables de 2,2% pour les bactéries et de 3,2% pour les champignons (voir Tableau I-5 pour les concentrations en microorganismes totaux). Des duplicats de ces échantillons ont été marqués (après décongélation de l’échantillon d’eau nuageuse) par une combinaison de fluorochromes (kit commercial de viabilité bactérienne LIVE/DEAD^®) permettant d’observer les cellules viables par microscopie à épifluorescence. Pour deux échantillons testés, ils ont observé que 72% et 95% des cellules bactériennes sont viables dans ces échantillons d’eau nuageuse.

Dans l’étude d’Amato et al. (2007b) la fraction de cellules cultivables (à 15 et 27°C) est d’environ 10% pour les champignons (dont levures) et de moins de 1% pour les bactéries (milieu R2A préférentiellement pour la culture des bactéries (Reasoner and Geldreich, 1985) et Sabouraud pour les champignons). En considérant des concentrations en ATP théoriques pour des microorganismes viables (3 ×10^-6 pmol ATP bactérie^-1 et 3 ×10^-5 pmol ATP spore de champignon^-1) et le nombre total de microorganismes dans ces échantillons d’eau nuageuse, ils estiment à 0,37 pmol mL^-1 la concentration médiane en ATP. Sachant que la concentration médiane mesurée est de l’ordre de 0,40 pmol mL^-1, ils supposent que la majorité des cellules

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La cytométrie en flux (CMF) est une technique consistant à détecter par réflexion laser, des cellules passant dans un flux rapide (liquide ou gazeux).

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Adenosine Tri-Phosphate, molécules nucléotidiques présentes dans les cellules vivantes, et impliquées dans le transfert d’énergie au sein de la cellule

Synthèse bibliographique

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sont dans un état viable, cela confirme les observations précédemment effectuées par Bauer et al. (2002).

La capacité de survie et de multiplication des microorganismes dans de l’eau de nuage incubée à une température de 0°C a été observée dans l’étude de Sattler et al. (2001). Dans ces expériences, deux marqueurs radioactifs, une base azotée marquée : la [³H] thymidine (entrant dans la constitution des acides nucléiques (ADN)) et un acide aminé : la [¹⁴C] leucine (entrant dans la composition des protéines) sont ajoutés aux échantillons d’eau nuageuse, la vitesse d’incorporation de ces molécules au sein de la cellule permet d’estimer un taux de croissance bactérienne (Simon and Azam, 1989 ; Simon, 1990). La multiplication effective des cellules microbiennes a été observée dans ces conditions de température (0°C) et nutritionnelles (eau de nuage sans adjonction de nutriments), les temps de génération¹¹ varient de 3,6 à 19,5 jours pour les 12 échantillons nuageux concernés.

Une autre étude en eau nuageuse montre la capacité des cellules microbiennes à s’y développer (Amato et al., 2007a). Un échantillon d’eau nuageuse est incubé à 17°C sous agitation en présence d’air ambiant (l’échantillon est placé dans un erlenmeyer pré-stérilisé avec un bouchon cotonné, assurant le transfert de gaz sans contamination), l’évolution de la concentration totale en ATP au cours du temps est présentée dans la Figure I-4.

Figure I-4 : Evolution de la concentration en ATP dans l’eau nuageuse au cours du temps d’incubation (200 rpm, 17°C) et les valeurs initiale et finale de la concentration totale en bactéries (Amato et al., 2007a).

Durant cette incubation d’eau nuageuse, la concentration en ATP diminue sur les premières 45 h d’incubation, puis augmente jusqu’à 90 h d’incubation (d’un facteur 7 par rapport à la

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concentration initiale). La concentration totale en bactéries évolue d’environ 8 ×10⁴ cellules mL^-1 à ~1 ×10⁶ cellules mL^-1 après 97 h d’incubation, ce résultat est en accord avec l’augmentation de la concentration en ATP. Le temps de latence avant l’augmentation de la concentration en ATP peut se justifier par une modification qualitative et quantitative du contenu microbien, dans le sens de la sélection de souches adaptées aux conditions de culture et aux contraintes nutritionnelles de l’eau du nuage (Amato et al., 2007a).