VARIANT RECORDS

A análise qualitativa do tecido adiposo visceral perirrenal mostrou, de modo geral, características similares entre os grupos, destacando-se a predominância de adipócitos uniloculares, escassas áreas de adipócitos multiloculares, presença de canais de lipólise e zonas de hiperemia (Fig. 9). A análise semi-quantitativa foi mais sensível a diferenças entre os grupos. A análise do tecido adiposo visceral mostrou que para a pesquisa de adipócitos uniloculares, não houve diferenças significativas entre os grupos. Todas as lâminas foram classificadas com escore 4, relativo à presença dessa característica em 75% a 100% da lâmina analisada (Fig. 10A). Já a presença de adipócitos multiloculares foi detectada em todos os grupos em um percentual semelhante, inferior a 25% (Fig. 10B). Um maior percentual de lipólise foi observado nos grupos cuja condição de obesidade foi induzida com o uso da dieta HGLI em relação aos animais eutróficos (controle), com diferença significativa entre esse e o de animais com obesidade tratados com o inibidor (grupo ITTp) (p = 0,037) (Fig. 10C). Foi detectada a presença de infiltrados inflamatórios leves (referentes a 3

focos por campo) no grupo controle e grupo dieta HGLI. No grupo ITTp não foi detectada a presença desses infiltrados (Fig. 10D). Já a presença de fibrose foi detectada apenas no grupo ITTp (Fig. 10E).

Figura 9. Análise histopatológica de de tecido adiposo perirrenal de ratos Wistar (n=5), após o tratamento por 10 dias. (A) Grupo controle, alimentado com dieta padrão (Labina®) por todo experimento; (B) Grupo HGLI, alimentado com mistura composta de Labina®, leite condensado e açúcar (1:1: 0,21) por todo experimento; (C) Grupo ITTp, alimentado com dieta HGLI e tratado com ITTp por dez dias de experimento. Legenda: canais de lipólise (estrela); adipócitos multiloculares (oval); hiperemia (cabeça de seta azul). Barras de escala: 200 µm. Ampliação: 4x.

Figura 10. Análise semi-quantitativa de tecido adiposo perirrenal de ratos Wistar (n=5), após o tratamento por 10 dias. Grupo controle, alimentado com dieta padrão (Labina®) por todo experimento; Grupo HGLI, alimentado com mistura composta de Labina®, leite condensado e açúcar (1:1: 0,21) por todo experimento; Grupo ITTp, alimentado com dieta HGLI e tratado com ITTp por dez dias de experimento. (A) Percentual de adipócitos uniloculares; (B) Percentual de adipócitos multiloculares; (C) Percentual de lipólise; (D) Presença de infiltrado inflamatório; (E) Presença de fibrose. Para avaliar as diferenças entre os grupos utilizou-se o teste ANOVA e pós-teste Tukey, com p < 0,05.

3.4 Discussão

A prospecção de proteínas para emprego no campo da biotecnologia tem levado à descoberta de uma gama de moléculas. Seu emprego em modelos experimentais tem exposto mamíferos a riscos ainda pouco avaliados. Embora os benefícios das proteínas superem substancialmente os potenciais efeitos prejudiciais, não se pode garantir que seu emprego seja isento de riscos. De fato, foi demonstrado que existe um bom equilíbrio entre a capacidade dos peptídeos de induzir efeitos desejáveis, ou seja, sua bioatividade, e os potenciais efeitos tóxicos

associados as suas propriedades de penetração celular ou interação com receptores de superfície (BARKIA et al., 2019).

Neste estudo pôde-se observar que o ITTp apresentou-se seguro, considerando, as avaliações e análises realizadas e apresentou potencial efeito anti- inflamatório. O processo de obtenção do inibidor mostrou um perfil cromatográfico correspondente ao obtido no estudo de Medeiros et al. (2018), confirmando a purificação e atividade anti-tríptica pelo ensaio de inibição para tripsina. A alegação de segurança justifica-se pela ausência de danos significativos em tecido hepático, pancreático, com melhor aspecto nas vilosidades intestinais e pela redução de indícios inflamatórios em tecido adiposo perirrenal.

O Inibidor de Tripsina de Tamarindo isolado (ITT) já vem sendo amplamente estudado, não apenas quanto as suas funções bioativas, mas também quanto a sua capacidade em gerar efeitos deletérios. Em seu trabalho, Ribeiro et al. (2015) observaram que a administração de 25 mg/kg de ITT não causou alteração nas enzimas hepáticas e proteínas séricas de ratos Wistar, além de não ter afetado os aspectos histológicos do fígado, estômago, intestino e pâncreas. Além disso, ITT não causou efeitos deletérios clássicos à digestão proteica e, consequentemente, desnutrição, nas doses de 25 mg/kg e 50 mg/kg, como demonstrado por meio da dosagem de proteínas séricas. Porém, o processo de purificação pode potencializar as propriedades funcionais de uma molécula, tornando-se necessário reavaliar a segurança de seu uso.

Após sua purificação, ITTp foi reavaliado quanto a seus efeitos biológicos. Os estudos mostraram que o inibidor purificado desempenha efeitos biológicos na dose de 730 µg/kg (MEDEIROS et al., 2018; CARVALHO et al., 2019). De fato, em uma dose cerca de trinta vezes menor que ITT, ITTp desempenhou as mesmas atividades biológicas, ressaltando a necessidade de avaliar se seu uso gerava efeitos deletérios no fígado, tecido alvo clássico em estudos de toxicidade, no pâncreas, um órgão classicamente afetado por inibidores de tripsina, no tecido adiposo, onde ITTp, em estudos prévios, tem apresentado efeitos anti-inflamatórios (RIBEIRO et al., 2015; CARVALHO et al., 2016), e intestino, um potencial sítio de atuação ainda não estudado.

Apesar de outros protocolos de estudos de toxicidade pré-estabelecerem a duração do acompanhamento e a dose utilizada, este estudo objetivava avaliar a segurança de ITTp utilizando tempo e dose condizentes com sua atividade biológica.

Ademais, o tempo de uso de ITTp está em consonância com alguns outros estudos com enfoque em toxicidade de outras moléculas bioativas (MEHRZADI et al., 2018; BARKIA et al., 2019). Outros efeitos colaterais passíveis de serem avaliados em estudos de toxicidade como alteração comportamental e morte do animal, neste estudo, não foram detectados na administração de ITTp.

O fígado é um dos melhores marcadores de status fisiológico e patológico em estudos em humanos e animais. Os exames histopatológicos de órgãos envolvidos no metabolismo da desintoxicação, como fígado, permitem uma fácil detecção de anormalidades em caso de toxicidade. Neste experimento, grupo de animais com obesidade tratados com ITTp, quando comparado ao controle, composto por animais eutróficos não tratados, não apresentou alterações hepáticas importantes, nem na análise histopatológica, nem em relação ao volume total de hepatócitos. Esses resultados são reforçados pela ausência de alterações de enzimas hepáticas, quando em comparação ao controle. Alterações semelhantes, como necrose e picnose e a presença de sinais leves de inflamação foram observadas em estudo com ratos Wistar eutróficos alimentados com hidrolisados proteicos da microalga

Bellerochea malleus e foram considerados menos importantes (BARKIA et al.,

2019).

O pâncreas é um órgão classicamente envolvido no metabolismo de inibidores de serinoproteases e há na literatura um amplo relato sobre efeitos deletérios que estas proteínas podem causar nesse tecido, principalmente a hipertrofia celular (SAMTIYA; ALUKO; DHEWA, 2020; WEDEKIND, 2020). No presente estudo, na avaliação do parênquima pancreático no grupo que recebeu ITTp, percebeu-se que as alterações apresentadas foram também encontradas no grupo de animais que não receberam tratamento. Ainda, a análise estereológica não diferiu entre os grupos, nem para parênquima acinar, nem especificamente para as ilhotas. Luz et al. (2018) avaliaram o efeito da HGLI em pâncreas de ratos Wistar e observaram acúmulo interlobular de adipócitos no parênquima do grupo de animais alimentados com essa dieta experimental. Desse modo, essas alterações podem ser oriundas de efeito decorrente da dieta de indução de obesidade, já que o achado se repetiu nesses grupos. Tendo sido a fibrose um achado comum aos três grupos de ratos Wistar, inclusive no grupo controle, eutrófico que recebeu a dieta padrão durante o experimento.

No estudo de Ku et al. (2016) o inibidor da proteinase II (PI2), um composto derivado de batata, e utilizado em humanos para controle de peso, foi avaliado em porcos e, dentre os parâmetros avaliados, a morfologia do tecido pancreático foi analisada. Os autores observaram que aglomerados de células basofílicas eram mais ou menos proeminentes em alguns animais do que a maioria das seções examinadas, e consideraram normal essa variação morfológica observada no pâncreas da maioria dos animais. Essas alterações foram distribuídas por todos os grupos de tratamento, indicando que essas diferenças são devidas a variações biológicas normais.

A obesidade possui estreita relação com a perda da competência da barreira intestinal, a qual é um importante mecanismo fisiopatológico do processo inflamatório na mucosa. O aumento da permeabilidade das junções oclusivas facilita a difusão de pequenos antígenos e toxinas bacterianas, que por sua vez podem exacerbar ou perpetuar o processo inflamatório. TNF-α é uma citocina que desencadeia a sinalização pró-inflamatória nas células epiteliais intestinais, induzindo aumentos acentuados na permeabilidade intestinal independentemente da morte dessas células (MASHUKOVA; WALD; SALAS, 2011).

A análise semiquantitativa do intestino, no presente estudo, mostrou que para os parâmetros percentual de vilosidades íntegras, percentual de vilosidades ulceradas, percentual de ausência de vilosidades, percentual de necrose em vilosidades, percentual de integridade em glândulas intestinais e a contagem de células caliciformes, não foram observadas diferenças significativas entre os grupos, evidenciando que ITTp não trouxe efeitos deletérios adicionais a esse tecido. Ao contrário disso, a análise do comprimento das vilosidades mostrou que o grupo ITTp e o grupo controle (eutrófico) diferiram do grupo com obesidade sem tratamento (dieta HGLI), mostrando que além de não causar dano, a molécula pode ter gerado um efeito regenerador adicional. Apesar da ausência de significância estatística quanto à análise semiquantitativa, as médias dessas análises parecem corresponder à análise qualitativa do epitélio intestinal.

O crescimento intestinal e o aumento da cripta implicam no aumento das células epiteliais intestinais e maior absorção. Já a redução da área da mucosa pode resultar em danos à absorção intestinal (HERMES et al., 2008). A dieta de indução da obesidade, também utilizada no grupo tratado com ITTp é um potente indutor da desorganização da arquitetura da mucosa, com visível redução das vilosidades

intestinais, como observado no estudo prévio de Luz et al. (2018), que avaliaram os efeitos da dieta HGLI.

O modelo de obesidade foi inserido neste estudo devido a ser a condição metabólica em que o ITTp tem sido extensamente estudado. Na obesidade, a morfologia e a função dos adipócitos individuais e do tecido adiposo branco são alteradas, levando a um processo de remodelação. Quando ocorre um balanço energético positivo crônico, os adipócitos armazenam energia excedente como triacilgliceróis, expandindo em tamanho (hipertrofia) e em número (hiperplasia) como consequência (PARLEE et al., 2014).

As variáveis volume total, densidade de volume e área seccional média de adipócitos são indicadores do processo de hipertrofia e hiperplasia celular. Neste estudo, a alteração de alguns destes parâmetros em relação ao controle eutrófico era esperada, devido à oferta da dieta HGLI. Outros estudos também relatam aumento do tecido adiposo visceral, bem como no tamanho das células em resposta ao consumo de uma dieta hipercalórica (LEE et al., 2018; PORET et al., 2018).

Porém, em estudo anterior em que o desempenho de ITTp foi avaliado quanto à perda de peso em animais com obesidade, alterações de peso não foram consideradas significativas, apesar de redução do consumo alimentar (CARVALHO

et al., 2019). A perda de peso em experimento de toxicidade é um indicador de dano

causado pela molécula ou substância avaliada, sendo a magnitude da perda tão maior quanto a exposição (WANG et al., 2019). A não perda de peso observada por Carvalho et al. (2019) pode ser considerada um indicador de baixa toxicidade do ITTp.

A composição corporal e a deposição regional de gordura, particularmente o acúmulo de gordura visceral, são importantes mediadores no desenvolvimento da obesidade e suas comorbidades relacionadas, uma vez que se relacionam com aumento da secreção de adipocinas/citocinas inflamatórias e proteínas de fase aguda e diminuição da secreção de adipocinas/citocinas anti-inflamatórias (PORET

et al., 2018).

O tecido adiposo visceral perirrenal foi analisado devido a recentes descobertas sobre a atuação de ITTp em parâmetros inflamatórios nesse tecido. Carvalho et al. (2019), trabalhando com o mesmo modelo experimental, observaram que as concentrações plasmáticas e a expressão de mRNA de TNF-α no tecido adiposo visceral perrirenal foram reduzidas em animais com obesidade tratados com

ITTp. Além dessa redução, ITTp levou a melhora do perfil lipídico. Essas reduções ocorreram de forma independente da perda de peso possivelmente induzida por saciedade, podendo, assim, esse efeito estar relacionado a uma ação direta sobre a morfologia ou histologia, e consequente funcionalidade, do tecido adiposo.

Em consonância com o estudo Carvalho et al. (2019), a análise histopatológica do tecido adiposo perirrenal neste experimento demonstrou que houve ausência de infiltrados inflamatórios nas lâminas analisadas. A expansão do tecido adiposo na obesidade está ligada a um suprimento inadequado de oxigênio e desenvolvimento de hipóxia. O crescimento do tecido adiposo é limitado e o excesso de triglicerídeos é armazenado nos tecidos ectópicos. Os adipócitos estressados e a hipóxia contribuem para a imigração e ativação de células imunes (DATTA et al., 2018). Células imunes infiltrando o tecido adiposo contribuem extensivamente para a produção e secreção dos mesmos mediadores inflamatórios e promovem o estado inflamatório sistêmico, figurando o TNF-α como um dos principais promotores desse evento (BLÜHER, 2016).

Contudo, nos resultados aqui apresentados também foi observada a presença de fibrose apenas no tecido adiposo de animais tratados com ITTp. A fibrose do tecido adiposo tem múltiplos efeitos potenciais nos adipócitos. Ao fornecer uma matriz extracelular rígida, a fibrose pode impedir o aumento excessivo de adipócitos. A fibrose pode exercer estresse de cisalhamento na membrana adipocitária, opondo- se ao estresse mecânico exercido por gotículas lipídicas aumentadas dentro da célula. A fibrose do tecido adiposo também pode ativar eventos de sinalização secundários aos ligantes da matriz extracelular nos receptores da superfície celular de ligação ao tecido fibrótico. É discutível se a fibrose do tecido adiposo é benéfica ou deletéria em relação à homeostase metabólica, com estudos apoiando ambas as possibilidades (DATTA et al., 2018).

A análise histopatológica também mostrou a predominância de adipócitos uniloculares. Essas células possuem grandes gotículas lipídicas, características de tecido adiposo branco, e baixa concentração de adipócitos multiloculares, com citoplasma contendo gotículas lipídicas numerosas e menores, típicos de tecido adiposo marrom, em todos os grupos (HAUGEN, DREVON, 2007). A lipólise foi mais presente nos grupos em que a obesidade foi induzida, possivelmente uma resultante da expansão do tecido adiposo.

Apesar do conhecimento bem fundamentado sobre a presença de um estado inflamatório crônico provindo da obesidade, ainda se discute as principais gêneses desse processo, o que pode ser fundamental para entender a atuação de moléculas com potencial anti-inflamatório. A evolução dos estudos em epigenética e das modificações que alteram a expressão diferencial de genes independente da sequência de DNA têm fornecido ferramentas para esse entendimento. As desacetilases de histonas são enzimas importantes em uma variedade de condições fisiológicas e patológicas e em tecido adiposo de indivíduos com obesidade, seus genes encontram-se mais expressos (EVANS; STRATTON; FERGUSON, 2020).

Estudos recentes relacionam desregulação inflamatória a modificações epigenéticas. Na inflamação, o controle sistêmico sobre os processos metabólicos diminui. Alguns fatores como o envelhecimento e a obesidade aceleram essa diminuição, afetando a função dos tecidos adiposo, hepático, pâncreas e muscular esquelético. Compostos fitoquímicos de origem vegetal ou a produção de ácidos graxos de cadeia curta podem atuar como modificadores epigenéticos de proteínas de DNA e histonas. Modificações epigenéticas podem ser reguladas dinamicamente e, como tal, servem como alvos terapêuticos em potencial (SHANAKI et al., 2020).

Desse modo, estudos que avaliem os mecanismos de ação do ITTp frente ao seu efeito anti-inflamatório, seja em células intestinais ou no tecido adiposo, ainda parecem ser um desafio, no entanto, com potencial enorme para ser explorado diante dos resultados aqui revelados.

Os achados em tecido adiposo aqui apresentados foram consonantes com a ação anti-inflamatória de ITTp em outro estudo (CARVALHO et al., 2019), além do efeito protetor na mucosa do intestino delgado, uma atividade biológica ainda desconhecida. Tais achados levam a crer que ITTp, além de potente atividade anti- inflamatória confirmada em adipócitos e revelada no intestino no presente estudo, apresenta segurança quanto ao uso como adjuvante no tratamento de doenças metabólicas e inflamatórias.

3.5 Conclusão

O Inibidor de Tripsina Purificado de Tamarindo mostrou que, em sua dose bioativa empregada em outros modelos de obesidade e inflamação crônica, não

causou sinais ou sintomas de toxicidade gerais, além de danos potenciais ao tecido hepático e pancreático de ratos Wistar com obesidade. Para além desses efeitos, para os animais tratados com ITTp observou-se um melhor aspecto no intestino desses animais, reduzindo a perda das vilosidades intestinais, um dano já bem caracterizado em modelos de obesidade. Também, os animais tratados com ITTp apresentaram redução de infiltrados inflamatórios em tecido adiposo perirrenal. Portanto, podendo seu uso, nos modelos em questão, ser potencialmente seguro e interessante, considerando o seu efeito anti-inflamatório, e futuramente ser inserido na terapia adjuvante de obesidade ou outras condições que envolvam desenvolvimento de resposta inflamatória.